CN117821398A

CN117821398A - 一种杂交瘤细胞株、抗人pten单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN117821398A
Application number: CN202410022584.6A
Authority: CN
Inventors: 张冉冉; 王晶晶; 叶露; 任琪; 付伟
Original assignee: Beijing Sino Fir Jinqiao Biological Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Sino Fir Jinqiao Biological Technology Co ltd
Priority date: 2024-01-08
Filing date: 2024-01-08
Publication date: 2024-04-05

Abstract

本发明提供了一种杂交瘤细胞株、抗人PTEN单克隆抗体及其应用，所述杂交瘤细胞株命名为OTI9B1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45714。所述抗人PTEN单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株OTI9B1分泌产生。本发明所述的一种杂交瘤细胞株OTI9B1可稳定分泌抗人PTEN单克隆抗体，且与PTEN蛋白特异性结合，显著提高了PTEN蛋白免疫检测的特异性、灵敏性、准确性和可靠性，可适用于各种组织中PTEN蛋白的标记。

Description

一种杂交瘤细胞株、抗人PTEN单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种杂交瘤细胞株、抗人PTEN单克隆抗体及其应用。

背景技术

PTEN基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsometen，PTEN)是1997年首次被报道的一种抑癌基因，是人类发现的第一个具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN蛋白由于具有磷酸酶的活性，可以通过去除磷酸基对其他蛋白进行修饰，阻止细胞生长、分裂的速度过快或者分裂不受控制，使细胞停止分裂进入凋亡，从而实现对细胞分裂周期的调控，进而抑制肿瘤的形成。

PTEN基因的缺失或突变与多种肿瘤的发生高度相关。纯合缺失PTEN基因的小鼠胚胎致死，杂合缺失PTEN基因的小鼠则自发形成多种类型的肿瘤，例如子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌、神经胶质瘤等。胞浆中PTEN蛋白的主要功能是通过其脂质磷酸酶活性，调节第二信使PIP3的磷酸化水平，阻断Akt/PKB通路，PTEN的失活将导致PI3K/Akt通路处于持续性活化状态。核内PTEN蛋白可以与p53形成核内复合体，抑制p53降解并增强p53的转录活性；核内PTEN蛋白的缺失会促进肿瘤的发生发展，表明核内PTEN也主要发挥抑癌功能。

子宫内膜癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，PTEN表达缺失在该病的发病中起着重要作用。研究表明，PTEN表达缺失可见于30-50％的子宫内膜癌患者，同时约25％的伴非典型复杂增生的子宫内膜也会发生PTEN表达缺失。然而，PTEN表达缺失并不是恶性转化的特异性标记，其在正常增生期子宫内膜组织中也会有所表达。在正常增生期子宫内膜组织中，PTEN主要表达于子宫内膜腺上皮及间质的胞浆及胞核，其表达水平可表现为弱且略有强度的变化。然而，当PTEN发生突变或缺失时，会导致蛋白表达异常，其特征是腺体中完全没有核和细胞质表达，但腺体内白细胞仍可表达。这种异常的PTEN表达与子宫内膜癌的发生和发展密切相关。所以开发识别PTEN蛋白的高特异性、高灵敏度的单克隆抗体对于子宫内膜癌等多种肿瘤组织的鉴别诊断至关重要。

发明内容

本发明旨在提供一种杂交瘤细胞株、抗人PTEN单克隆抗体及其应用，以提供一种与PTEN蛋白特异性结合的单克隆抗体，提高PTEN蛋白免疫检测的特异性和灵敏性。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种杂交瘤细胞株，命名为OTI9B1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45714，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2023年09月06日。

抗人PTEN单克隆抗体，由所述的一种杂交瘤细胞株OTI9B1分泌产生。

本发明所述一种杂交瘤细胞株的筛选方法及单克隆抗体制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据PTEN的氨基酸序列特征，设计PTEN的第250-403位氨基酸片段为免疫原(其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示)，设计引物，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pET23a-N-His，构建重组表达质粒pET23a-rPTEN。

(2)重组PTEN蛋白的表达与纯化：将构建的PTEN重组表达质粒转化E.coli细胞，裂解离心获得上清，镍亲和层析柱纯化，获得纯化的重组PTEN蛋白。

(3)单克隆抗体杂交瘤细胞株筛选及其分泌的单克隆抗体制备：采用上述重组PTEN蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞分别与sp2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗人PTEN蛋白的特异性抗体杂交瘤细胞株，并进行亚型鉴定；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得抗人PTEN单克隆抗体。

进一步地，所述抗人PTEN单克隆抗体，其轻链可变区含111aa，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示；其重链可变区含115aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步地，所述抗人PTEN单克隆抗体，其中轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，相应地分别为27aa-38aa，56aa-58aa和95aa-100aa，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示。

进一步地，所述抗人PTEN单克隆抗体，其中重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，相应地分别为26aa-33aa，51aa-58aa和97aa-104aa，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8-10所示。

进一步地，所述抗人PTEN单克隆抗体可以与PTEN蛋白高特异性结合，通过免疫检测方法，如免疫组织化学实验(IHC)，验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

进一步地，所述抗人PTEN单克隆抗体在制备免疫检测工具中的应用；优选地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

进一步地，所述抗人PTEN单克隆抗体在制备免疫检测工具中的应用；优选地，免疫检测工具用于检测PTEN蛋白。

进一步地，所述抗人PTEN单克隆抗体在制备用于标记各种组织试剂盒中的应用；优选地，所述组织包括子宫内膜癌、肠癌、胰腺。

一种免疫组织化学检测试剂盒，包括如上所述的抗人PTEN单克隆抗体，可检测各种组织中PTEN蛋白的表达状况。

相对于现有技术，本发明所述的一种杂交瘤细胞株OTI9B1、抗人PTEN单克隆抗体及其应用具有以下优势：

本发明所述的一种杂交瘤细胞株OTI9B1可稳定分泌抗人PTEN单克隆抗体，且与PTEN蛋白特异性结合，显著提高了PTEN蛋白免疫检测的特异性、灵敏性、准确性和可靠性，可适用于各种组织中PTEN蛋白的标记。。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明实施例2所述的重组PTEN蛋白Western blot检测结果图，以anti-HIS抗体检测重组PTEN蛋白在E.coli细胞中的表达，其中泳道L为转染空载体的E.coli细胞裂解液为抗原的检测结果，泳道R为转染pET23a-rPTEN质粒的E.coli细胞裂解液为抗原的检测结果；

图2为本发明实施例2所述的PTEN蛋白SDS-PAGE结果图，用镍亲和层析柱纯化重组PTEN蛋白，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色；

图3为本发明实施例5所述的抗人PTEN单克隆抗体IHC检测子宫内膜癌的结果示意图；

图4为本发明实施例5所述的抗人PTEN单克隆抗体IHC检测肠癌的结果示意图；

图5为本发明实施例5所述的抗人PTEN单克隆抗体IHC检测胰腺的结果示意图；

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

实施例1：PTEN蛋白重组表达质粒的构建

从Genebank中选调PTEN基因NM_000314，根据PTEN的氨基酸序列特征，设计PTEN的第250-403位氨基酸片段为免疫原(其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，设计引物，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pET23a-N-His，构建重组表达质粒pET23a-rPTEN。

实施例2：重组PTEN蛋白的表达与纯化

1.实验方法

(1)转化E.coli细胞：将100μl感受态细胞置于冰上融化后加入重组质粒DNA轻混匀，冰浴30min后42℃热激90sec，然后将其继续冰浴1-2min。在超净台内加入500μl新鲜无抗LB培养基，于37℃摇床孵育45min后取适量菌液均匀涂布于含抗生素的平板上，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。

(2)裂解细胞：挑取单克隆于新鲜培养基中，37℃、200rpm培养至OD值达到0.4～0.6时加入IPTG(终浓度1mM)诱导培养7hrs。离心收集菌体，然后用裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎20min后于4℃下12000rpm离心20min，收集上清。取少量上清蛋白用anti-His抗体做WB鉴定，见图1。

(3)镍亲和层析柱纯化：用缓冲液平衡镍柱，将上清用0.45μm滤膜过滤后上样并收集流出，用缓冲液淋洗去除未结合的蛋白，最后用含不同浓度咪唑的洗脱液洗脱，分别收集后，将符合要求的洗脱蛋白合并后加入10％甘油，纯化后的重组PTEN蛋白用SDS-PAGE电泳鉴定，见图2。

2.实验结果

(1)由图1结果可见，转染pET23a-rPTEN质粒的E.coli细胞裂解液位于R泳道，在25kD处有明显的特异条带，而转化空载体的对照裂解液泳道L中则没有相应大小的条带。表明细胞特异表达了重组PTEN蛋白。

(2)由图2结果可见，纯化的蛋白在SDS-PAGE电泳胶图的25kD处有明显的特异条带，表明已获得了纯度较好的重组PTEN蛋白。

实施例3：杂交瘤细胞株OTI9B1分泌产生抗人PTEN单克隆抗体的制备与筛选

根据标准方法用纯化的重组PTEN蛋白(以下简称PTEN抗原)用于对BALB/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

(1)动物免疫：经过纯化的PTEN抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为60μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为30μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

(2)细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃预热的50％ PEG(pH 8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。

(3)筛选和克隆：融合7-10天内挑选杂交瘤细胞克隆，使用纯化的重组PTEN蛋白进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株，其对应融合板细胞株为OTI9B1。

(4)细胞上清单抗的制备与纯化：将杂交瘤细胞株OTI9B1用含15％血清的DMEM培养基培养于10cm培养皿中培养，扩培至约4×10⁷个细胞时，800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×10⁵个/ml。继续培养1-2周后，当细胞死亡率达到60％-70％时(此时细胞密度大概为1-2×10⁶个/ml)，收取细胞悬液6000rpm高速离心20min，取上清，亲和层析法进行上清纯化，据抗体亚型选择相应柱料进行纯化(亚型为IgG1，采用protein G柱料进行纯化)。对纯化后的单抗浓度测定，冻干和分装(100μg/管)，最后保存在-20℃。

实施例4：抗人PTEN单克隆抗体可变区基因与氨基酸序列分析

从Takara Bio USA公司采购RACE 5’/3’试剂盒，采用5’RACE(RapidAmplification of cDNA Ends，快速扩增cDNA末端)技术扩增杂交瘤细胞功能性抗体的可变区轻链与重链基因序列。具体实验过程参见Takara Bio USA公司/>RACE 5’/3’Kit使用者手册。

根据所述的抗人PTEN单克隆抗体为IgG1亚型，设计针对其Ig和Kappa恒定区3’端的特异性基因引物pRace-H-GSP和pRace-K-GSP，引物序列如下：

pRace-H-GSP：CATCDGTCTATCCACTGGCCCCTG

pRace-K-GSP：CTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTT

从杂交瘤细胞株OTI9B1中分别提取mRNA，逆转录为cDNA，RACE扩增抗体重链和轻链的DNA片段。分别将扩增的轻链与重链通过酶切连于克隆载体PUC119，通过蓝白斑挑取阳性克隆，纯化阳性质粒进行测序，采用测序仪ABI 3730，测序引物为通用引物M13f和M13r。

利用互联网，在http://www.imgt.org上使用IMGT/V-QUEST分析软件，分别将轻链与重链的核苷酸序列进行测序结果数据分析，得到抗人PTEN单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。轻链可变区全长为111个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为26、17、36和11，CDR的3个结构域氨基酸数分别为12、3和6，CDR1、CDR2和CDR3的区域相应地分别为27aa-38aa，56aa-58aa和95aa-100aa，其氨基酸序列分别为：HSLLNRSNQKNY、LAS、LQHYST。通过分析，所述抗人PTEN单克隆抗体重链可变区全长为115个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为25、17、38和11，CDR的3个结构域氨基酸数分别为8、8和8，CDR1、CDR2和CDR3分别为26aa-33aa，51aa-58aa和97aa-104aa，其氨基酸序列分别为：GYSFTDYH、FYPYNGSI、ARGGGLRG。

实施例5：抗人PTEN单克隆抗体为一抗的免疫组化检测

1.实验方法：

(1)取福尔马林固定的子宫内膜癌、肠癌、胰腺组织块进行石蜡包埋，使用Leica组织切片机进行切片，组织厚度为4μm。

(2)脱蜡与水化：分析纯二甲苯10min×3次，无水乙醇1min×3次，95％乙醇1min，85％乙醇1min，75％乙醇1min，去离子水浸泡2min×3次。

(3)修复抗原：加入抗原修复液[1mM EDTA,10mM Tris buffer(pH8.0)]高压锅高压热修复3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出切片，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡2min×3次。

(4)灭活：使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置15min，去离子水浸泡2min×3次。

(5)用免疫组化笔在组织外围画框，0.1％ PBST洗涤2min×1次。

(6)孵育一抗：加入稀释后的杂交瘤细胞株OTI9B1分泌的单克隆抗体(0.35μg/mL)200μl置于湿盒中，37℃孵育60min。用0.1％ PBST洗涤2min×3次。

(7)孵育二抗：加入二抗PV-8000 100μl，37℃孵育30min。用0.1％ PBST洗涤2min×3次。

(8)DAB显色：加入120μl DAB显色液，室温静置5min，自来水龙头水流下冲洗以终止显色，自来水漂洗3次。

(9)苏木素复染、分化及返蓝：在苏木素溶液中静置10-120s，自来水漂洗3次终止显色，于1％盐酸乙醇溶液中分化，自来水漂洗3次以终止，放入刚煮沸的pH8.0的Tris-EDTA二钠溶液中返蓝，再放入室温的pH9.0的Tris-EDTA二钠溶液中数秒，自来水漂洗3次。显微镜下观察染色，若正常则结束并回收苏木素染液；若分化过了，则需重复上述步骤直至染色合格。

(10)脱水和透明：75％乙醇1min，85％乙醇1min，95％乙醇1min，100％乙醇1min×3次，二甲苯1min×3次，中性树胶封片。

(11)镜检，如图3-图5所示。

2.实验结果：

杂交瘤细胞株OTI9B1分泌产生的抗人PTEN单克隆抗体以IHC法检测子宫内膜癌、肠癌、胰腺组织。在子宫内膜癌组织上的结果如图3中所示，三角形标记的肿瘤细胞的细胞核没有信号染色，显示阴性，表明肿瘤细胞没有表达PTEN蛋白；可作为内对照的血管内皮和浸润的炎性细胞的细胞核和细胞浆呈现阳性染色，说明该例子宫内膜癌是PTEN缺失表达的病例；在肠癌组织上的结果如图4所示，三角形标记的肿瘤细胞呈现阴性，箭头1和箭头2标记的为腺上皮细胞和间质细胞，均呈现阳性，染色结果显示该肠癌病例的PTEN蛋白表达缺失；在胰腺组织的结果如图5所示，胰腺腺泡上皮、胰岛细胞等均呈现阳性表达，符合PTEN的表达模式，所述单克隆抗体在0.35μg/mL浓度下，展现了良好的染色效果；实验结果表明本发明所述抗人PTEN单克隆抗体具有良好的特异性和灵敏性。

以上结果表明本发明所述的杂交瘤细胞株OTI9B1分泌产生的抗人PTEN单克隆抗体具有很高的特异性和灵敏性：在PTEN缺失表达的子宫内膜癌中肿瘤细胞阴性表达，作为内对照的间质细胞呈现阳性表达；在PTEN缺失表达的肠癌中肿瘤细胞阴性表达，腺上皮细胞和间质细胞均呈现阳性表达；在胰腺组织中，胰腺腺泡上皮、胰岛细胞等均呈现阳性表达，符合PTEN的表达模式。所以所述杂交瘤细胞株OTI9B1分泌产生的抗人PTEN单克隆抗体可用于免疫组织化学检测，用以鉴别与PTEN蛋白表达相关的各种组织。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而非对本发明进行限制，在本发明的精神和原则之内，对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株命名为OTI9B1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.45714。

2.抗人PTEN单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株OTI9B1分泌产生。

3.根据权利要求2所述的抗人PTEN单克隆抗体，其特征在于，所述抗人PTEN单克隆抗体与PTEN蛋白特异性结合。

4.根据权利要求2所述的抗人PTEN单克隆抗体，其特征在于，所述抗人PTEN单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；重链可变区包括如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求2所述的抗人PTEN单克隆抗体，其特征在于，所述抗人PTEN单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列如SEQ IDNO.4-6所示。

6.根据权利要求2所述的抗人PTEN单克隆抗体，其特征在于，所述抗人PTEN单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列如SEQ IDNO.8-10所示。

7.根据权利要求2-6任一项所述的抗人PTEN单克隆抗体在制备免疫检测工具中的应用；优选地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

8.根据权利要求7所述的抗人PTEN单克隆抗体在制备免疫检测工具中的应用，其特征在于，所述免疫检测工具用于检测PTEN蛋白。

9.根据权利要求2-6任一项所述的抗人PTEN单克隆抗体在制备用于标记各种组织试剂盒中的应用；优选地，所述组织包括子宫内膜癌、肠癌、胰腺。

10.一种免疫组织化学检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2-6任一项所述的抗人PTEN单克隆抗体。