CN102643786B - 抗耐草甘膦蛋白G2-aroA的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
抗耐草甘膦蛋白G2-aroA的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗耐草甘膦蛋白G2-aroA的单克隆抗体及其应用。本发明所提供的单克隆抗体由杂交瘤细胞株AntiG2-5F11产生。所述杂交瘤细胞株AntiG2-5F11在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.5772。本发明所提供的单克隆抗体对耐草甘膦蛋白G2-aroA具有较高的亲和力和特异性；本发明所提供的单克隆抗体可用于检测玉米等转基因植物中耐草甘膦蛋白G2-aroA的表达情况，具有快速、灵敏、特异性强的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗耐草甘膦蛋白G2-aroA的单克隆抗体及其应用。
背景技术
草甘膦类除草剂是一种广谱性、非选择性除草剂，它通过抑制EPSPS(5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶，是植物体内芳香族氨基酸合成途径中的一个重要酶)的活性，阻断了植物莽草酸途径的生物合成，强烈抑制细胞分裂，对许多一年生和多年生杂草都具有强烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中无残毒，对动物无毒害，自从1976年Roundup研制成功以来，得到了广泛的应用。但是，由于玉米等禾本科作物对草甘膦敏感，使其应用受到限制。因此，将耐草甘膦基因转入作物，不但可以扩大草甘膦的使用范围，而且可降低生产成本，保护作物免受药害，最终达到增产增收的目的。
目前，国际上在耐草甘膦转基因植物的研究方面，已经取得了突破性进展。美国孟山都(Mosanto)和Calegene等公司在基于对EPSP合成酶的编码基因aroA的研究，已获得耐草甘膦转基因大豆、玉米、油菜和棉花等作物系列品种，其中大豆、玉米等多种转基因作物已经进入商品化生产。Mosanto公司生产的耐草甘膦二型转基因玉米在2007年的播种面积预计超过3200万英亩，相当于美国玉米播种面积的40％。2004年，中国农业科学院生物技术研究所发现了一个新的耐草甘膦基因G2-aroA(中国专利，申请号03826892.2，授权公告号CN 100429311C)。目前尚没有抗G2-aroA蛋白的单克隆抗体，也未见利用G2-aroA蛋白单克隆抗体鉴别转G2-aroA基因植物的相关报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种抗耐草甘膦蛋白G2-aroA的单克隆抗体。该单克隆抗体由杂交瘤细胞株AntiG2-5F11产生。所述杂交瘤细胞株AntiG2-5F11在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.5772。
由所述杂交瘤细胞株AntiG2-5F11 CGMCC No.5772产生的单克隆抗体为抗耐草甘膦蛋白G2-aroA的单克隆抗体；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列1。
本发明所提供的单克隆抗体的重链恒定区为IgG1型，轻链恒定区为κ型。
含有所述单克隆抗体的鉴别或辅助鉴别转G2-aroA基因植物的Western blot试剂盒也属于本发明的保护范围。所述G2-aroA基因编码氨基酸序列为序列表中序列9的蛋白质。
所述单克隆抗体或所述Western blot试剂盒在检测或辅助检测所述G2-aroA蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。
所述单克隆抗体在制备检测或辅助检测所述G2-aroA蛋白的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。所述试剂盒为Western blot试剂盒。
所述单克隆抗体或所述Western blot试剂盒在鉴别或辅助鉴别转G2-aroA基因植物中的应用也属于本发明的保护范围；所述G2-aroA基因编码氨基酸序列为序列表中序列9的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别转G2-aroA基因植物的方法。
该方法包括如下步骤：用所述单克隆抗体对待测植物蛋白样品进行Western blot，按照如下方法确定所述待测植物蛋白是否为转G2-aroA基因植物：若所述待测植物蛋白样品与所述单克隆抗体杂交产生大小为46KD的特异性条带，则所述待测植物蛋白为转G2-aroA基因植物或候选为转G2-aroA基因植物，若所述待测植物蛋白样品与所述单克隆抗体杂交未产生大小为46KD的特异性条带，则所述待测植物为非转G2-aroA基因植物或候选为非转G2-aroA基因植物；所述G2-aroA基因编码氨基酸序列为序列表中序列9的蛋白质。
在本发明的一个实施例中，所述待测植物具体为玉米，如玉米品种综31。
本发明所提供的单克隆抗体对耐草甘膦蛋白G2-aroA具有较高的亲和力和特异性；本发明所提供的单克隆抗体可用于检测玉米等转基因植物中耐草甘膦蛋白G2-aroA的表达情况，具有快速、灵敏、准确、特异性强、成本低的优点。
保藏说明
参椐的生物材料(株)：AntiG2-5F11
科学描述：小鼠杂交瘤细胞
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2012年2月7日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5772
附图说明
图1为纯化后G2-aroA蛋白SDS-PAGE电泳鉴定图。其中，泳道1为蛋白Marker，自上到下依次为72KD、45KD、32KD、14.4KD；泳道2-4均为原核重组表达载体pET-28a-G2-aroA中表达后纯化所得的G2-aroA蛋白，上样量分别为5μl、10μl、15μl。
图2为SDS-PAGE检测纯化后单克隆抗体的纯度。其中，泳道1为蛋白Marker；泳道2为纯化后的单克隆抗体，较大的目的条带为重链，较小的目的条带为轻链。
图3为重组表达载体pS3300-UMG2的质粒图谱。
图4为载体pS3300-UG0的质粒图谱。
图5为转G2-aroA基因玉米的PCR鉴定图谱。其中，泳道1为阳性对照；泳道2为DNA Marker(D2000)；泳道3为空白对照组；泳道4为阴性对照组；泳道5-24为20株转G2-aroA基因玉米植株。
图6为转G2-aroA转基因玉米植株的草甘膦耐性田间鉴定图。其中，1所示一行玉米为mG2-aroA转基因玉米植株；2所示一行玉米为空载体转基因玉米植株；3所示一行玉米为未转基因的玉米植株。
图7为转基因玉米植株的Western blot鉴定图。其中，泳道1为蛋白Marker，自上到下依次为120KD、85KD、60KD、40KD、22KD；泳道2为原核重组表达载体pET-28a-G2-aroA中表达后纯化所得的G2-aroA蛋白；泳道3和泳道4分别为未转基因玉米的种子和叶片提取液；泳道5和泳道6分别为转G2-aroA基因玉米的种子和叶片提取液。
图8为载体pUC19-UG2的质粒图谱。
图9为载体pCAMBIA3300的质粒图谱。
图10为载体pS3300的质粒图谱。
图11为重组表达载体pS3300-UG2的质粒图谱。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
PCR鉴定所用Taq酶、dNTP购自宝日医生物技术有限公司
Western blot所用二抗购自北京纽朴生物技术有限公司
弗氏完全佐剂：北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM001；
弗氏不完全佐剂：北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM002；
HAT：北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM003；
PEG4000：北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM005；
RPMI 1640培养基：北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM006；
胎牛血清(FBS)：北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM007；
山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP：北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CW0102；
K8：孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810的提取液。
实施例1、杂交瘤细胞株的获得及抗G2-aroA蛋白单克隆抗体的制备
Balb/C小鼠：北京维通利华实验动物有限公司
Sp2/0：北京康为世纪生物科技有限公司
一、免疫原S780的制备
将序列1所示的DNA片段连接到原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中，得到表达G2-aroA蛋白的原核表达载体pET-28a-G2-aroA。将pET-28a-G2-aroA转化大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导其表达G2-aroA蛋白，收集菌体后，将菌体通过超声波破碎，将所表达蛋白释放到提取液中，后用His标签蛋白纯化试剂盒(购自北京康为世纪生物科技有限公司，目录号CW0009A)纯化，G2-aroA蛋白经纯化后进行SDS-PAGE电泳检测。
SDS-PAGE电泳鉴定结果如图1所示。经page胶鉴定，纯度能够达到95％，经eppendorf蛋白核酸测定仪biophotometer plus测定浓度为1.3mg/ml，将纯化后的G2-aroA蛋白作为免疫原S780。
G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9。
二、动物免疫
以5只6周龄的雌性Balb/C小鼠为试验动物，按照如下免疫程序及流程进行免疫：
1、免疫前：采用断尾采血法采集血清，用作阴性对照。
2、初次免疫：将浓度为0.64μg/μl的G2-aroA蛋白溶液经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散，得到免疫原。用乳化好的免疫原采用背部皮下多点注射的方法免疫Balb/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射80μg的G2-aroA蛋白(250μl乳化好的免疫原)。
3、第一次加强免疫：初次免疫21天后，将浓度为0.32μg/μl的G2-aroA蛋白溶液经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏不完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散，得到免疫原。用乳化好的免疫原采用背部皮下多点注射的方法免疫Balb/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射40μg的G2-aroA蛋白(250μl乳化好的免疫原)。
4、第二次加强免疫：第一次加强免疫14天后，进行第二次加强免疫。具体方法同步骤3的第一次加强免疫。
5、终加强免疫：第二次加强免疫14天后，将浓度为0.8μg/μl的G2-aroA蛋白溶液经无菌过滤器过滤后，得到免疫原。用所得免疫原脾内注射加强免疫Balb/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射80μg的G2-aroA蛋白(100μl的免疫原)。
三、细胞融合和克隆化
在第二次加强免疫14天后，断尾采血法采集血清，并用间接ELISA法(以S780为包被抗原)测定血清效价。在上述步骤一终加强免疫后第3天，选择上述间接ELISA法测定血清效价最佳的小鼠(效价为1∶720000)取脾细胞，再将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按9∶1(数量配比)的比例，用PEG(PEG4000)常规融合方法进行细胞融合。
融合后的第3天和第6天进行换液处理，第7天采用间接ELISA法(以S780为包被抗原)对融合细胞上清进行筛选，选取阳性细胞孔，将孔内细胞分别转入24孔培养板扩增培养。待细胞长至显微镜视野1/3时，收集细胞上清液，采用间接ELISA法(分别以S780、K8(孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810提取液)、阳性(耐草甘膦材料提取液)、阴性(非转基因材料提取液)作为包被抗原)进行复筛，从中选择与S780及阳性反应均较强，同时与K8和阴性均未反应的细胞(表1中的粗体的5F11)，应用有限稀释法进行亚克隆。经过3次亚克隆最终获得稳定分泌抗G2-aroA蛋白的单克隆杂交瘤细胞株，命名为AntiG2-5F11。该杂交瘤细胞株已于2012年2月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.5772。
上述作为包被抗原的K8(孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810提取液)、阳性(我公司耐草甘膦材料提取液)、阴性(非转基因材料提取液)具体按照如下方法制备得到：取0.3g样品材料(孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810，或实施例2所获得的T6代mG2-aroA转基因玉米，或未转基因的玉米品种综31)，液氮磨碎后，转入2ml离心管中加入1ml样品提取液，剧烈震动，4℃提取1h，12000转/分离心10分钟后取上清进行样品测定。其中，样品提取液配方为：Tris-Cl(pH8.0)25mm；KCl 10mm；MgCl2·6H2O 20mm；DTT 1mm；PMSF 1mm(用前加)。
上述间接ELISA法的步骤具体如下：
1)包被：在96孔酶标板中加入100μL的2μg/mL的抗原溶液，同时设置不包被抗原的对照，4℃包被过夜，用PBS缓冲液洗涤3次。
上述抗原溶液可为S780、K8、阳性和阴性溶液。
2)封闭：加入150μL/孔的封闭液(3％牛血清蛋白)，在37℃孵育2h，弃封闭液，洗涤3次，拍干。置于4℃冰箱保存备用。
3)加待测样品：
a.对于血清效价检测，第一个孔1∶1000稀释，往下以1∶3的梯度倍比稀释，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。
b.对于细胞上清检测，吸取细胞上清100μl，加入对应的酶标板中，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。
同时设置未经免疫的小鼠血清/抗体/腹水/细胞上清的对照；以PBS代替待检测样品的对照(阴性对照孔)。
4)加酶标二抗：取山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP，按1∶5000倍稀释后，100μl/孔，37℃孵育20至30min，洗涤4次，拍干。
5)显色：将20×TMB稀释至1×TMB，按100μl/孔加入，37℃显色15-30min。
6)终止：加入终止液(2M H2SO4)50μl/孔。
7)读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔(以PBS代替待测样品的对照)OD值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。
ELISA结果判定方法：(1)筛选阳性细胞时，若P/N＞2.1，则判别为阳性细胞；若1＜P/N＜2.1，则加大包被浓度后再次检测，P/N＞2.1的仍判为阳性。(2)测定效价时，以P/N＞2.1的血清(或是腹水或是抗体)最大稀释倍数表示。
表1采用间接ELISA法对融合细胞上清进行复筛的结果
| 包被抗原 | 1C2 | 1C11 | 1E6 | 2C1 | 2F7 | 3D12 | 3F9 | 4B11 | 5B2 | 5F11 | PBS | 阳性 |
| S780 | 2.398 | 2.463 | 2.655 | 2.232 | 2.067 | 2.332 | 3.431 | 3.400 | 3.474 | 3.452 | 3.489 | 3.470 |
| K8 | 0.048 | 0.057 | 0.044 | 0.049 | 0.041 | 0.053 | 0.048 | 0.045 | 0.050 | 0.046 | 0.053 | 0.104 |
| 阳性 | 0.297 | 0.162 | 0.398 | 0.289 | 1.424 | 0.245 | 1.762 | 0.920 | 0.393 | 2.427 | 0.068 | 1.291 |
| 阴性 | 0.050 | 0.046 | 0.041 | 0.045 | 0.043 | 0.045 | 0.067 | 0.043 | 0.045 | 0.044 | 0.057 | 0.052 |
注：1C2-5F11分别代表细胞融合后第7天采用间接ELISA法(以S780为包被抗原)
所筛选的阳性细胞。吸光值越大，说明抗体对抗原的亲和力越高。
四、单克隆抗体的制备与纯化
1、增量培养法
将杂交瘤细胞株AntiG2-5F11CGMCC No.5772置于RPMI 1640培养基中，37℃培养3天，收集细胞上清。采用protein G亲和柱(Pharmacia)进行纯化。具体操作如下：
(1)平衡：用结合缓冲液平衡protein G亲和柱至基线平稳。
(2)上样：将收集的细胞上清上柱，收集流穿液；将流穿液再次上柱，继续平衡至基线平稳。
(3)洗脱：加入洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰。
(4)用0.01M的PBS(pH7.2)透析收集的洗脱峰，使纯化后的抗体保存在0.01M的PBS(pH7.2)中。
(5)用蛋白定量检测仪(Amersham Biosciences)测定纯化后单克隆抗体的浓度。
(6)SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度，抗体上样量：8μg。
2、腹水制备
取2只BALB/C小鼠，每只注射0.5ml石蜡油，7天后取杂交瘤细胞株AntiG2-5F11 CGMCC No.5772重悬于无血清培养基中，按1×106个细胞/0.5ml/只量注射石蜡小鼠，注射细胞14天后收集腹水。采用间接ELISA法(包被抗原为S780)进行腹水效价检测，具体操作及结果判定方法同步骤三中所述(步骤3)按照a进行)，结果表明其效价为1∶81000。采用protein G亲和柱(Phamacia)对腹水进行纯化。具体操作同步骤1所述。
五、单克隆抗体的鉴定
1、单克隆抗体亚型的鉴定
利用Southern Biotech公司生产的亚型检测试剂盒套装(包括Goat anti MouseIgG1-HRP(1070-50)、Goat anti Mouse IgG2a-HRP(1080-05)、Goat anti MouseIgG2b-HRP(1090-05)、Goat anti Mouse IgG3-HRP(1100-05)、Goat anti Mouse IgA-HRP(1040-05)、Goat anti Mouse IgM-HRP(1020-05)、Goat anti Mouse kappa-HRP(1050-05)和Goat anti Mouse Lambda-HRP(1060-05)共8种组分)对上述步骤四制备的单克隆抗体进行抗体亚型的检测，包被抗原为S780，浓度为2μg/ml，包被量为100μl，检测波长为450nm。具体操作过程按照试剂盒说明书进行。检测结果如表2所示，单克隆抗体的重链恒定区为IgG1型，轻链恒定区为Lamda型
表2单克隆抗体亚型的鉴定
| IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | IgM | IgA | Kappa | Lamda | |
| 单抗 | 2.252 | 0.051 | 0.048 | 0.058 | 0.055 | 0.056 | 0.065 | 0.461 |
2、单克隆抗体效价的检测
采用间接ELISA法(包被抗原为S780、K8、阳性和阴性，具体同步骤三)对步骤四所得纯化后单克隆抗体进行效价检测，以PBS溶液替代待测样品作为阴性对照。具体操作及结果判定方法同步骤三中所述(步骤3)按照a进行)。
检测结果如表3所示，以阳性作为包被抗原，腹水纯化的单克隆抗体的效价为1∶81000(0.292/0.083＝3.518＞2.1)。
表3单克隆抗体效价检测结果
3、单克隆抗体的SDS-PAGE胶鉴定其纯度
通过SDS-PAGE凝胶对步骤四所得纯化后单克隆抗体进行纯度检测，结果如图2所示，凝胶上显示两个目的条带，上面较大的一条为重链，下面较小的一条为轻链，目的条带清晰，无杂带，可见，经过步骤四的纯化后单克隆抗体已经达到一定纯度。
实施例2、抗G2-aroA蛋白的单克隆抗体的应用
一、实验材料
1、转G2-aroA基因玉米
按照如下方法制备所得：
(1)玉米转化起始材料：玉米品种综31(优良玉米自交系展示综3和综31.玉米科学，2009(5))授粉后9～13天的幼穗，剥去苞叶，进行表面消毒。从消毒后的幼穗中剥取幼胚，将其放入感染培养液(配方参考：Methods in Molecular Biology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1)中清洗一到两次，备用。
(2)重组表达载体PS3300-UMG2转化农杆菌：将携带有mG2-aroA序列重组表达载体pS3300-UMG2(质粒图谱如图3所示，具体构建方法见文章末尾处)。mG2-aroA序列为根据G2-aroA蛋白的编码基因(中国专利，申请号03826892.2，授权公告号CN100429311C)的氨基酸序列(核苷酸序列如序列表中序列1所示)，在保证氨基酸序列不变的前提下，采用玉米偏好密码子对其进行人工优化改造所得(mG2-aroA序列如序列2所示)。这样改造是为了提高G2-aroA蛋白在转基因玉米中的表达水平。将重组表达载体pS3300-UMG2转化农杆菌LBA4404(参考文献：Methods in MolecularBiology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1)。同时设置转入pS3300-UG0空载体(质粒图谱如图4所示，具体构建方法见文章末尾处)的对照。将经过上述鉴定证实转入了重组表达载体pS3300-UMG2的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pS3300-UMG2。将转入pS3300-UG0空载体的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pS3300-UG0。
(3)农杆菌转化玉米幼胚：将上述步骤(1)经感染培养液清洗过的幼胚放入OD600为0.3-0.5左右的步骤(2)的两种农杆菌的菌液中，放置5分钟，然后将幼胚置于共培养培养基(参考文献：Methods in Molecular Biology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1)上，在20℃左右黑暗条件下共培养3天。
(4)转G2-aroA基因玉米再生苗的获得：将上述步骤(3)共培养后的幼胚转入选择培养基(参考文献：Methods in Molecular Biology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1)，在选择培养基中加入终浓度为1mM的草甘膦作为选择压力，对被转化的材料进行筛选培养，每两周继代一次，直至生长出松脆，颜色鲜黄且生长旺盛的抗性愈伤组织。
将所得抗性愈伤转入诱导培养基(参考文献：Methods in Molecular Biology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1)进行诱导分化，一个月后即可获得成熟的胚状体。再将胚状体放到MS培养基上生根，即得到转基因玉米的再生苗。
(5)转G2-aroA基因玉米植株的PCR鉴定：提取转基因玉米植株(转入mG2-aroA基因的植株以及转入pS3300-UG0空载体的植株)的基因组DNA。以其为模板，进行PCR鉴定。正向引物：CCACCTGGCTCCAAGTCTATCA；反向引物：GCGTCAACCTGTGCTCCAAA。反应体系(20μL)：DNA 1μL(20-50ng)；10×缓冲液2μL；MgCl2(2.5mM)2μL；dNTP(2.5mM)2μL；Taq酶0.2μL；引物10μM；加无菌水至20μL。反应条件：94℃5分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃1分钟，35个循环；72℃延伸5分钟。同时设置未转基因的玉米植株对照。检测结果表明转G2-aroA基因玉米植株均扩增得到大小为610bp的目的条带；而未转基因植株以及转入空载体的玉米植株均没有扩增出目的条带(图5)。这一结果说明G2-aroA基因已经整合进转G2-aroA基因玉米的基因组中。
(6)转G2-aroA基因玉米植株的田间除草剂耐性检测：按照800ml/亩的用量对大田种植的转G2-aroA基因玉米植株(5-6叶期)喷施农达(Roundup，含41％的草甘膦，田间推荐使用剂量为150-250ml/亩)。同时设置转入pS3300-UG0空载体的植株对照和未转基因的玉米植株对照。结果如图6所示：转G2-aroA基因玉米植株在800ml/亩农达处理后，无明显的药害，表现正常，后期的生长期内均无药害反应。转入pS3300-UG0空载体的植株和未转基因的玉米植株均在短时间内(15天内)全部死亡。这一结果表明，转G2-aroA基因玉米对草甘膦具有极强的耐受性。
叶片(或种子)提取液的制备方法：将叶片(或种子)于研钵中研磨，用样品提取液(Tris-Cl(ph8.0)25mM，KCl 10mM，MgCl2·6H2O 20mM，DTT 1mM，PMSF1mM(用前加))于4℃提取12小时，8000r/min 4℃离心取上清，得到提取液。
2、经原核表达并纯化后的G2-aroA蛋白
其制备方法及步骤具体同实施例1步骤一。
二、实验方法
以步骤一所得的转G2-aroA基因玉米的叶片(或种子)提取液为材料，经原核表达并纯化后的G2-aroA蛋白作阳性对照，未转基因的玉米的叶片(或种子)的取液为阴性对照，进行G2-aroA蛋白表达的Western blot分析：将上述各样品SDS-PAGE电泳后转膜，3％牛血清蛋白封闭过夜，加入实施例1制备的纯化后的抗G2-aroA蛋白的单克隆抗体(1∶10000)，37℃，2小时后倾去一抗，洗膜后加入碱性磷酸酶标记马抗小鼠二抗(1∶2000)(购自北京纽朴生物技术有限公司，货号NP-2310)，37℃孵育2小时。倾去二抗，洗膜后加入CSPD碱性磷酸酶化学发光底物(购自罗氏公司目录号11655884001)到膜上，用杂交袋封闭，37℃孵育10分钟后，用x光胶片进行信号检测。
检测结果如图7所示：经原核表达并纯化后的G2-aroA蛋白所在泳道(泳道2)出现大小为52KD(G2-aroA蛋白大小为46KD，原核表达过程中加上HIS标签后大小为52KD)的目的条带，这表明应用实施例1制备的单克隆抗体能够与G2-aroA蛋白发生杂交反应，进而说明利用实施例1制备的抗G2-aroA蛋白的单克隆抗体对转G2-aroA基因玉米在Western blot水平上的鉴定结果可信。对转基因玉米的鉴定结果显示：转G2-aroA基因玉米的叶片和种子均能杂交出大小为46KD的特异性目的条带，表明mG2-aroA基因已在转基因玉米得到表达。
实施例2中重组表达载体pS3300-UMG2的pS3300-UG0的构建方法如下：
1、中间载体pUC19-UG2的构建
a.人工合成Ubi启动子(序列5)，并在两端添加Pst I酶切位点；Pst I酶切pUC19质粒(购自北京天恩泽基因科技有限公司，产品编号90202)，去磷酸化后，与Ubi启动子片段连接，得到pUC19-Ubi。
b.人工合成G2-aroA基因(序列1)，并在两端添加BamH I和Kpn I酶切位点；连入经BamH I和Kpn I酶切的上述步骤1a所得的pUC19-Ubi，得到pUC19-Ubi-G2。
c.人工合成PolyA+T-NOS终止序列(序列8)，并在两端添加Kpn I和EcoR I酶切位点；连入经Kpn I和EcoR I酶切的上述步骤1b所得的pUC19-Ubi-G2，得到pUC19-Ubi-G2-polyA-T-NOS。
d.人工合成OMK序列(序列6)+CTP序列(序列7)，并在两端添加BamH I位点；BamH I酶切上述步骤1c所得的pUC19-Ubi-G2-polyA-T-NOS，去磷酸化后连接OMK-CTP(序列6和序列7之间直接连接)，得到pUC19-UG2(质粒图谱见图8)。
2、改造pCAMBIA3300载体获得pS3300载体
a.表达载体pCAMBIA3300(质粒图谱见图9)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司(CA：MCV038)，用限制性内切酶Sph I、Sac II双酶切，回收纯化大片段。
b.人工合成序列表中序列4所示基因片段(自5’端由T-Border的右边界序列，连接序列和T-Border的左边界序列组成，所述连接序列中自5’端含有Hind和EcoR I酶切位点的识别序列)，用限制性内切酶Sph I、Sac II酶切后，与步骤a回收的大片段连接，得到pS3300载体(质粒图谱见图10)。
3、携带mG2-aroA基因的重组表达载体pS3300-UMG2的构建
a.将步骤2b所得pS3300载体用Hind III和EcoR I双酶切，回收纯化。
b.将表达载体pUC19-UG2(质粒图谱见图8)用Hind III和EcoR I双酶切后回收小片段(Ubi-OMK-CTP-G2-polyA-T-NOS)，与步骤3a所得回收产物连接，得到携带有G2-aroA基因的重组表达载体pS3300-UG2(质粒图谱见图11)。
c.用BamH I与Kpn I双酶切上述步骤b所得的pS3300-UG2载体，分别回收片段pS3300-Ubi-polyA-T-NOS及OMK+CTP。
d.将新合成的两端分别带有带有BamH I与Kpn I酶切位点的mG2-aroA基因(序列3，在序列2的5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入Kpn I酶切酶切位点)经BamH I与Kpn I酶切后，与上述步骤c得到的大片段pS3300-Ubi-polyA-T-NOS相连，得到重组载体pS3300-Ubi-mG2-polyA-T-NOS。
e.用BamH I酶切上述步骤d得到的重组载体pS3300-Ubi-mG2-polyA-T-NOS，之后进行去磷酸化处理，再与上述步骤d回收的OMK+CTP序列连接，得到携带mG2-aroA基因完整阅读框的重组表达载体pS3300-UMG2(质粒图谱见图3)。
4、pS3300-UG0空载体(对照)的构建
a.以上述步骤3e所得的pS3300-UMG2载体为模板，利用如下引物重新扩增OMK+CTP：
OMK+CTP_F：5′-GGATCCTATTTTTACAACAATTA-3′(下划线部分为BamHI酶切位点识别序列)；
OMK+CTP_R：5′-GGTACCTTCCGCCGTTGCTGAC-3′(下划线部分为Kpn I酶切位点识别序列)。
b.扩增产物经BamH I和Kpn I双酶切后与步骤3c所得pS3300-Ubi-polyA-T-NOS大片段连接，得到空载体pS3300-UG0(质粒图谱见图4)。
Claims (8)
1.杂交瘤细胞株AntiG2-5F11，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.5772。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株AntiG2-5F11CGMCC No.5772产生的单克隆抗体。
3.含有权利要求2所述单克隆抗体的鉴别或辅助鉴别转G2-aroA基因植物的Western blot试剂盒；所述G2-aroA基因编码氨基酸序列为序列表中序列9的蛋白质。
4.权利要求2所述的单克隆抗体或权利要求3所述的Western blot试剂盒在检测或辅助检测G2-aroA蛋白中的应用；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9。
5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测或辅助检测G2-aroA蛋白的试剂盒中的应用；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述试剂盒为Western blot试剂盒。
7.权利要求2所述的单克隆抗体或权利要求3所述的Western blot试剂盒在鉴别或辅助鉴别转G2-aroA基因植物中的应用；所述G2-aroA基因编码的氨基酸的序列为序列表中序列9。
8.一种鉴别或辅助鉴别转G2-aroA基因植物的方法，包括如下步骤：用权利要求2所述的单克隆抗体对待测植物蛋白样品进行Western blot，按照如下方法确定所述待测植物是否为转G2-aroA基因植物：
若所述待测植物蛋白样品与所述单克隆抗体杂交产生大小为46KD的特异性条带，则所述待测植物为转G2-aroA基因植物或候选为转G2-aroA基因植物，若所述待测植物蛋白样品与所述单克隆抗体杂交未产生大小为46KD的特异性条带，则所述待测植物为非转G2-aroA基因植物或候选为非转G2-aroA基因植物；
所述G2-aroA基因编码的氨基酸的序列为序列表中序列9。
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