CN116535500B - 马铃薯x病毒单克隆抗体pvx-6及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了马铃薯X病毒单克隆抗体PVX‑6及其应用，单克隆抗体PVX‑6包括重链和轻链，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，该抗体能够与PVX的CP蛋白(PVX‑CP)和PVX病毒粒子发生特异性反应，不与PVY病毒粒子或健康植株发生反应。进一步通过DAS‑ELISA方法检测配对情况，PVX‑6为包被抗体时，能与其他抗体配对成功，如PVX‑1、PVX‑3和PVX‑6；经灵敏度检测结果表明，PVX单克隆抗灵敏度均可以达到1:10240(w/v，g/mL)倍稀释，能够作为检测马铃薯X病毒抗体和检测试剂盒。

Description

马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6，还涉及单克隆抗体PVX-6的应用。
背景技术
马铃薯(Solanum tuberosum L.)起源于南美洲安第斯山脉，茄科，一年生草本植物，无性繁殖、块茎可粮菜兼用，是全世界最重要的高产作物之一，仅次于小麦、水稻和玉米。我国是马铃薯第一生产大国，马铃薯种植面积及总产量均居世界首位，但单产水平远低于欧美等发达国家。
我国在2015年实施马铃薯主粮化战略以来，马铃薯战略地位得到进一步提升，而提高脱毒种薯质量及普及率成为产业健康发展的重要保障。而马铃薯作为无性繁殖作物，感染了病毒之后的马铃薯，由于连年种植，病毒将通过块茎世代传递，导致发病率逐年增加，产量迅速下降。在田间，马铃薯病毒可以通过汁液摩擦、蚜虫传毒等方式使无毒的马铃薯感染病毒，造成马铃薯的减产、退化。马铃薯感染病毒后会终生带毒，病情随着种植代数逐年加重，最后失去种植价值。
长期以来，病毒病一直困扰科研工作者，目前在马铃薯作物上发现的病毒种类有40多种，还包括一种类病毒。其中PVX是马铃薯X病毒属(Potexvirus)的成员，又称马铃薯普通花叶病毒或马铃薯轻花叶病毒，寄主范围较广，主要侵染茄科作物，PVX作为影响马铃薯种薯质量的主要有害生物之一，是判定马铃薯种薯质量是否合格的关键指标之一。
PVX单一侵染植株后，植株症状轻微花叶或潜隐，有时叶面稍有皱缩、叶缘波状，会造成少量的减产。但在田间种植时，常常发生复合侵染，当与PVY复合侵染马铃薯，症状加剧，使马铃薯产量大幅度降低，严重时可造成减产80％，导致严重的经济损失。
因此，建立简便、快速、灵敏、经济、准确的马铃薯病毒病检测技术，满足马铃薯种薯田间质量检测服务的需要，为马铃薯种薯质量检测认证工作的全面推进提供技术支持。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6；本发明的目的之二在于提供分泌抗马铃薯X病毒的单抗PVX-6的杂交瘤细胞；本发明的目的之三在于提供所述马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6在制备检测马铃薯X病毒的试剂盒中的应用；本发明的目的之四在于提供所述马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6在制备检测马铃薯X病毒的抗体中的应用；本发明的目的之五在于提供含有所述马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6的试剂盒。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6，所述单克隆抗体PVX-6包括重链和轻链，所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明优选的，编码所述单克隆抗体PVX-6的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码所述轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6。
2、分泌所述抗马铃薯X病毒的单抗PVX-6的杂交瘤细胞，其特征在于：所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2022279，分类命名为杂交瘤细胞株3D6D9B5。
3、所述马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6在制备检测马铃薯X病毒的试剂盒中的应用。
4、所述马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6在制备检测马铃薯X病毒的抗体中的应用。
5、含有所述马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6的试剂盒。
本发明优选的，所述试剂盒为ELISA试剂盒、免疫化学试剂盒、免疫荧光试剂盒或Western Blot检测试剂盒。
本发明的有益效果在于：本发明公开了马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6，PVX-6重链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。该抗体能够与PVX的CP蛋白(PVX-CP)和PVX病毒粒子发生特异性反应，不与PVY病毒粒子或健康植株发生反应。进一步通过DAS-ELISA方法检测配对情况，PVX-6为包被抗体时，能与其他抗体配对成功，如PVX-1、PVX-3和PVX-6；经灵敏度检测结果表明，PVX单克隆抗灵敏度均可以达到1:10240(w/v，g/mL)倍稀释，能够作为检测马铃薯X病毒抗体和检测试剂盒。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为PVX-CP基因片段扩增(M：2K plusII marker；1、2：PVX-CP基因片段(714bp))；
图2为PVX-CP表达(M：Marker；1：蛋白沉淀；2：蛋白上清；3：总蛋白；4：阴性对照)；
图3为PVX-CP纯化(A：不同浓度咪唑洗脱PVX-CP，M：marker，1:50mM咪唑洗脱，2:100mM咪唑洗脱，3：300mM咪唑洗脱。B：PVX-CP纯化结果，M：marker，4：浓缩后蛋白)；
图4为Western blot分析PVX单克隆抗体特异性(M：蛋白marker，1：健康马铃薯组培苗，2：感染PVX的马铃薯组培苗，3：感染PVY的马铃薯组培苗)；
图5为PVX单克隆抗体灵敏度分析。
生物保藏：
将分泌PVX-6和PVX-2抗体的杂交瘤细胞送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，分别命名为3D6D9B5、4C10F4F5；3D6D9B5保藏日为2022年9月1日，保藏号为CCTCC NO：C2022279，分类命名为杂交瘤细胞株3D6D9B5；4C10F4F5保藏日为2022年9月1日，保藏号为CCTCC NO：C2022280，分类命名为杂交瘤细胞株4C10F4F5。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、病毒CP蛋白表达
(1)表达载体构建
在生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)上检索PVX的基因序列，根据PVX的CP蛋白基因全长序列设计扩增CP蛋白基因全长的引物(表1)，将引物在NCBI上进行比对，比对后由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其中用PVX-CP-F与PVX-CP-R的引物扩增PVX-CP基因，扩增产物为714bp。
表1、PVX-CP扩增引物
以提取植物病毒总RNA为模板，按照试剂盒的说明进行操作合成cDNA，以合成的cDNA为模板，以表1中的引物进行扩增，反应体系为系为50μL，cDNA模板2μL，病毒上、下游引物(0.1μmol·L-1)各2μL，2×taq酶25μL，ddH2O补足至50μL。反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次，72℃延伸10min。
PVX-CP基因经PCR扩增后，利用琼脂糖凝胶电泳分析，检测到长度为714bp的DNA片段(图1)，通过胶回收得到PVX-CP基因片段，将其连接到pET28a载体上，并转入BL21感受态细胞中，37℃倒置平板过夜培养后，挑选单克隆菌斑送至生工进行测序，经过序列比对，选择测序结果正确的菌液进行蛋白表达。
(2)大肠杆菌中表达及纯化
大肠杆菌中表达目的蛋白的方法如下：
a.将测序正确的大肠杆菌菌液加入5mL的LB液体培养基中，放入37℃恒温振荡培养箱，250rpm/min过夜培养16-18h，作为种子液；
b.按1:100转接到新鲜的200mL LB培养基中，37℃，250rpm/min条件培养，当菌液OD600＝0.6时，补加IPTG诱导剂，分别于18℃继续诱导培养；
c.4℃，5000rpm/min，15min，收集菌体；
d.将菌体用裂解buffer(50mm Tris、0.5M NaCl，pH 8.0)重悬后进行超声破碎。超声条件为：work 3s，off 2s，时间15min，重复一遍；
e.超声后的样品，4℃，5000rpm/min，15min，分别取上清液和沉淀用SDS-PAGE胶进行蛋白分析，结果如图2所示。结果显示，重组蛋白PVX-CP可以表达。
病毒CP蛋白纯化的方法如下：
a.取培养后的菌体，加入裂解buffer(50mM Tris、0.5M NaCl，pH 8.0)重悬后进行超声破碎；超声条件为：work 3s，off 2s，时间15min，重复一遍；
b.将超声破碎后的菌液于低温离心机内离心，4℃，5000rpm/min，15min，收集上清，由于上清直接挂柱，为了使其不挂柱，故向上清中加入变性剂尿素，终浓度为8M，溶解后，于4℃静置1h，离心取上清；
c.将上述获得的上清液，用0.45μm滤膜过滤，通过Ni亲和层析柱进行蛋白纯化。步骤如下：
d.用5倍柱体积的去离子水洗涤，去除空气和20％乙醇；
e.5～10倍柱体积Buffer A平衡柱子，(Buffer A：50mM Tris、0.15M NaCl、8M尿素，pH 8.0)；
f.将样品以0.5mL/min的速度流穿Ni柱；
g.用Buffer A平衡柱子；
h.分别用50mM咪唑、100mM、300mM咪唑洗脱。
i.将洗脱下来的样品分别进行SDS-PAGE胶分析是否有目的蛋白，结果如图3中A所示。
结果显示，不同浓度的咪唑均能将病毒CP蛋白洗脱下来，且100mM、300mM洗脱下来的病毒CP蛋白纯度更高。因此选择100mM、300mM咪唑洗脱的蛋白收集后稀释透析后浓缩，并用SDS-PAGE胶检测目的蛋白纯度，结果如图3中B所示，结果显示纯度很高。
实施例2、马铃薯X病毒单克隆抗体血清制备
(1)免疫小鼠
以实施例1制备的重组病毒CP蛋白为免疫原，选取健康Balb/c小鼠3只。首次免疫分别使用抗原50μg，每只分别与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，腹部多点皮下注射免疫小鼠。第一次免疫后，每隔14d，用抗原50μg，每只和等体积的弗氏不完全佐剂乳化后，腹部多点皮下注射免疫小鼠，免疫3次。第三次免疫开始，每次免疫后7d进行小鼠眼眶静脉丛(或尾静脉)取血，通过间接ELISA测定小鼠血液抗体效价，检测方法如下：
(1)蛋白包被：实验组分别用ELISA包被液稀释PVX、PVY抗原蛋白至5μg/mL，对照组加ELISA包被液，100μL/孔，4℃包被过夜，PBST清洗2遍；
(2)封闭：配制3％脱脂奶粉，380μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；
(3)加样：取血清稀释至指定浓度，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；
(4)二抗：兔抗鼠IgG-HRP 1:1000,100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗3遍；
(5)显色：TMB显色液A液：B液＝1:1，100μL/孔，室温反应20min；
(6)终止：ELISA终止液，50μL/孔；
(7)读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果，结果如表2所示。
表2、小鼠血清效价
结果显示，2号小鼠的免疫效价最高。因此选择2号小鼠腹腔注射50μg抗原加强免疫，加强免疫3～7天，进行细胞融合实验。
(2)病毒单克隆杂交瘤细胞制备
细胞融合：
a.在生物安全柜中，收集生长旺盛、形态良好的骨髓瘤细胞(Sp2/0)约107个于50mL离心管中，不添加血清的DMEM(Glu 4.5g/L)培养基重悬，37℃培养箱预热；
b.加强免疫后3至7天的免疫合格小鼠，无菌条件下，取脾脏研磨过筛后离心收集脾细胞；
c.脾细胞与Sp2/0混匀离心后，用融合剂PEG1450进行化学融合，添加DMEM终止反应；
d.离心收集融合细胞，用添加NBS(新生牛血清)和HAT的高糖DMEM进行培养和筛选，约8天后用间接ELISA进行融合初筛，阳性细胞孔进行融合复筛；
e.选择稳定表达抗体的单克隆杂交瘤细胞，细胞扩大培养后，取细胞进行腹水生产，并冻存细胞。
细胞融合筛选
采用BSA竞争ELISA方法检测，步骤如下：
a.蛋白包被：分别用ELISA包被液稀释PVX抗原或X病毒研磨液至指定浓度，100μL/孔，4℃包被过夜，PBST清洗2遍；
b.封闭：配制3％脱脂奶粉，380μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；
c.加样：原倍加入细胞上清，80μL，室温孵育1h，PBST清洗2遍；
d.二抗：兔抗鼠IgG-HRP 1:1000，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗3遍；
e.显色：TMB显色液A液：B液＝1:1，100μL/孔，室温反应20min；
f.终止：ELISA终止液，50μL/孔；
g.读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果；
h.选择生活力良好，进行第一次亚克隆。
本次细胞融合获得20株阳性细胞，具体见表3：
表3、2号小鼠融合筛选
细胞亚克隆筛选：
用有限稀释法进行细胞克隆化。将阳性细胞重悬取细胞计数，以每200μL培养基含1个细胞为准则，按计数结果将阳性细胞稀释，每孔200μL加入96孔板中。7至9天后镜检观察，标记出现单一细胞簇孔。进行间接ELISA法检测阳性细胞。检测方法如下：
a.蛋白包被：实验组分别用ELISA包被液稀PVX或PVY抗原蛋白至1μg/mL，对照组加ELISA包被液，100μL/孔，4℃包被过夜，PBST清洗2遍；
b.封闭：配制3％脱脂奶粉，380μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；
c.加样：取原倍细胞上清，80μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；
d.二抗：兔抗鼠IgG-HRP 1:1000，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗3遍；
e.显色：TMB显色液A液：B液＝1:1，100μL/孔，室温反应20min；
f.终止：ELISA终止液，50μL/孔；
g.读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果；
h.选择稳定表达抗体的单克隆杂交瘤细胞，细胞扩大培养后，取细胞进行腹水生产，并冻存细胞。
经过2次细胞亚克隆，仅挑选镜检单克隆和二克隆进行检测，获得6株阳性单克隆杂交瘤细胞株(表4)，进行细胞扩大培养，取细胞进行腹水生产，并冻存细胞。
表4、亚克隆结果
(3)马铃薯病毒单克隆抗体制备
腹水制备：
腹腔注射致敏剂液体石蜡0.5mL/只，7天后腹腔注射阳性杂交瘤细胞，每株细胞打一只小鼠。每只小鼠注射105～106个细胞，离心收集的细胞用1×PBS缓冲液重悬后进行注射。直至第8天起可观察到小鼠腹腔微隆，继续饲养至腹腔涨圆到行动不便时，用引流法多次收集腹水，离心后于-80℃冻存。
腹水纯化：取腹水，用PBS稀释并过滤(0.22μm)，取过滤后的样品，通过Protein G柱进行蛋白纯化。步骤如下：
a)用5倍柱体积的去离子水洗涤，去除空气和20％乙醇；
b)5～10倍柱体积buffer平衡柱子，buffer：PB缓冲液；
c)将样品以0.5mL/min的速度流穿Protein G柱；
d)用上述buffer平衡柱子；
e)用甘氨酸洗脱，并用Tris中和。
f)收集上述甘氨酸洗脱的样品，于4℃透析(透析Buffer：PBS)过夜。
g)取透析后的样品，用超滤法(超滤管)浓缩，并用SDS-PAGE胶检测目的蛋白纯度。
h)对纯度达到要求的抗体进行性能检测。
单克隆抗体性能检测：
a)蛋白包被：用ELISA包被液分别稀释PVX-CP、X病毒研磨液、Y病毒研磨液、健康组织研磨液，100μL/孔，4℃包被过夜，PBST清洗2遍；
b)封闭：配制3％脱脂奶粉，380μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；
c)加样：取PVX单克隆抗体稀释至指定浓度，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；
d)一抗：兔抗鼠IgG-HRP 1:1000，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗3遍；
e)显色：TMB显色液A液：B液＝1:1，100μL/孔，室温反应20min；
f)终止：ELISA终止液，50μL/孔；
g)读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果，结果如表5所示。
表5、PVX单克隆抗体性能检测
结果显示，PVX-CP与X病毒吸光度均大于阴性对照2倍，并且Y病毒不与PVX单克隆抗体产生交叉反应，PVX单克隆抗体性能可用。
单克隆抗体特异性检测：
a)总蛋白提取：分别取0.1g植物组织，液氮研磨，加入250μL总蛋白提取液与5μL50×蛋白酶抑制剂；
b)13000rpm，4℃离心15min，吸取上清液；
c)上清液加入loading buffer后混匀，沸水煮10min，冷却5min，4℃13000rpm离心10min；
d)配制10％SDS-PAGE分离胶和5％浓缩胶，加样后180V电泳至loading buffer跑出；
e)电泳结束前将PVDF膜在甲醇中浸泡15s；
f)电泳结束后，将胶在转膜液中浸泡15min，进行转膜。100V转膜1～1.5h；
g)转好膜后用TBST清洗一次，用丽春红染色拍照，再用TBST清洗几次后，用TBST配制的5％脱脂奶粉进行封闭，室温封闭1h；
h)封闭完后加入1:5000稀释的一抗，4℃孵育过夜；
i)一抗反应完全后，用TBST进行洗膜，4次，每次15min；
j)加入1:5000稀释的二抗，室温孵育1h；
k)二抗反应完全后用TBST洗膜，4次，每次10min；
l)加入ECL显色液进行拍照，结果如图4所示。
结果显示，PVX-1、PVX-2、PVX-3、PVX-4、PVX-5和PVX-6单克隆抗体进均可以与感染PVX的马铃薯组培苗的蛋白提取液发生特异性免疫反应，不与感染PVY的马铃薯组培苗蛋白提取液发生特异性免疫反应，也不与健康的马铃薯组培苗蛋白提取液发生特异性免疫反应。
单克隆抗体配对检测：
a)蛋白包被：分别用ELISA包被液稀释PVX单克隆抗体至1μg/mL，100μL/孔，4℃包被过夜，PBST清洗2遍；
b)封闭：配制3％脱脂奶粉，380μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；
c)加样：PVX组织500倍稀释，阴性组织500倍稀释，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；
d)一抗：分别将标生物素的PVX、PVY抗体稀释至1μg/mL，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；
e)二抗：Avidin-HRP 1:10000，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗3遍；
f)显色：TMB显色液A液：B液＝1:1，100μL/孔，室温反应20min；
g)终止：ELISA终止液，50μL/孔；
h)读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果，结果如表5所示。
表5、PVX单克隆抗体配对结果
注：*为配对成功
单克隆抗体灵敏度检测：
a)蛋白包被：用ELISA包被液稀马铃薯病毒组培苗研磨液，1：10～1：163840倍梯度稀释，对照组加ELISA包被液，100μL/孔，4℃包被过夜，PBST清洗2遍；
b)封闭：配制3％脱脂奶粉，380μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；
c)加样：取血清稀释至指定浓度，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗2遍；
d)二抗：兔抗鼠IgG-HRP 1:1000，100μL/孔，室温孵育1h，PBST清洗3遍；
e)显色：TMB显色液A液：B液＝1:1，100μL/孔，室温反应20min；
f)终止：ELISA终止液，50μL/孔；
g)读值：酶标仪主波长450nm，副波长630nm测定结果，结果如图5所示。
结果显示，用PVX进行包被，应用直接ELISA方法检测，PVX单克隆抗体灵敏度可以达到1:10240倍稀释。
为确定各个单克隆抗体的灵敏度，按照上述方法，区别是分别使用不同浓度的PVX-1、PVX-2、PVX-3、PVX-4、PVX-5和PVX-6单克隆抗体的进行检测，结果如表6所示。
表6、PVX单克隆抗体灵敏度检测
PVX-1 PVX-2 PVX-3 PVX-4 PVX-5 PVX-6
1:10 0.6742 0.6383 0.5511 0.5731 0.6405 0.7742
1:20 0.6201 0.5983 0.5287 0.5289 0.6052 0.7435
1:40 0.6196 0.5719 0.4838 0.4908 0.5639 0.7275
1:80 0.5828 0.5311 0.4347 0.4399 0.5234 0.6452
1:160 0.5217 0.4707 0.3882 0.3932 0.468 0.5942
1:320 0.4679 0.407 0.328 0.3382 0.4113 0.4977
1:640 0.3621 0.3454 0.2788 0.2829 0.3297 0.403
1:1280 0.262 0.2466 0.2046 0.2053 0.2437 0.2977
1:2560 0.256 0.2462 0.2217 0.2191 0.2472 0.2897
1:5120 0.1839 0.2037 0.1614 0.166 0.1907 0.2351
1:10240 0.1525 0.2005 0.1604 0.1692 0.1836 0.2307
1:20480 0.1564 0.175 0.1344 0.1399 0.1633 0.2132
1:40960 0.162 0.1423 0.1635 0.1477 0.1497 0.2481
1:81920 0.1662 0.1512 0.1457 0.1402 0.1447 0.2009
1:163840 0.1587 0.1514 0.1615 0.1481 0.1415 0.2157
NT 0.141 0.1229 0.1314 0.1366 0.1259 0.1922
结果显示，PVX-6单克隆抗体的灵敏度最高，其次为PVX-2单克隆抗体，后续选择PVX-6和PVX-2。
对PVX-6和PVX-2进行测序，PVX-6的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码该氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，PVX-6的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码该氨基酸的和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。PVX-2的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码该氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，PVX-2的轻链氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示，编码该氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
选择产生PVX-6和PVX-2抗体的杂交瘤细胞送中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，分别命名为3D6D9B5、4C10F4F5；3D6D9B5保藏日为2022年9月1日，保藏号为CCTCC NO：C2022279，分类命名为杂交瘤细胞株3D6D9B5；4C10F4F5保藏日为2022年9月1日，保藏号为CCTCC NO：C2022280，分类命名为杂交瘤细胞株4C10F4F5。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (7)

1.马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6，其特征在于：所述单克隆抗体PVX-6包括重链和轻链，所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6的核酸，其特征在于：所述单克隆抗体PVX-6的核酸包括重链核酸序列和轻链核酸序列，所述重链核酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述轻链核酸序列如SEQ ID NO.6。
3.分泌权利要求1所述马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6的杂交瘤细胞，其特征在于：所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2022279，分类命名为杂交瘤细胞株3D6D9B5。
4.权利要求1所述马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6在制备检测马铃薯X病毒的试剂盒中的应用。
5.权利要求1所述马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6在制备检测马铃薯X病毒的抗体中的应用。
6.含有权利要求1所述马铃薯X病毒单克隆抗体PVX-6的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为ELISA试剂盒、免疫化学试剂盒、免疫荧光试剂盒或Western Blot检测试剂盒。
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