CN118028317A - 一种甘薯病毒g外壳蛋白cp及其编码基因、抗体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种甘薯病毒G外壳蛋白CP及其编码基因、抗体和应用，属于微生物检测和植物基因工程技术领域。本发明提供了一种编码甘薯病毒G外壳蛋白CP的基因、甘薯病毒G外壳蛋白CP，并通过免疫兔子制备甘薯病毒G外壳蛋白CP的多克隆抗体，并提供了该抗体在检测甘薯病毒G的应用。采用本发明所提供的抗体可以用于快速准备检测甘薯感病样品中的病毒，从而建立高效和高灵敏度的甘薯病毒G检测鉴定体系，对病毒的早期检测诊断和综合防控具有重要的应用价值，同时能够为脱毒种苗获得和繁育提供重要的参考依据。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测和植物基因工程技术领域，具体涉及甘薯病毒G的外壳蛋白CP及其编码基因、利用该蛋白制备的抗体和应用。
背景技术
甘薯是集饲料、粮食和工业原料于一体的多用途作物，是我国种植面积较大的作物之一，年产量仅次于水稻、小麦和玉米。面对未来对粮食日益增长的需求和甘薯自身的产量高、适应性广等特点将使甘薯置身于优越的竞争地位。受繁殖方式的影响，甘薯在生长和繁育过程中极易受到病毒感染，造成产量下降、品质受损和种性退化等问题，严重影响甘薯产业的发展。我国大多数甘薯田块植株病毒感染率达60-70%，有的甚至达90%，而我国每年因病毒病导致甘薯减产达29%，严重的可达50%以上。甘薯病毒病不但使该作物的育种工作大大受阻，而且使一些新育品种的优良种性也逐渐地丧失。甘薯病毒病已经成为威胁甘薯上第二重要的生物胁迫。
目前，全世界已鉴定到30余种病毒能够侵染甘薯，在我国发生的主要有甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）、甘薯羽状斑驳病毒（Sweetpotato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯病毒G（Sweet potato virus G，SPVG）和甘薯潜隐病毒（Sweet potato latent virus，SPLV）等。甘薯病毒G属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属，为甘薯上的重要病毒，发生广泛。甘薯病毒G靠蚜虫以非持久方式传播，在我国发生比较普遍，在南方、北方和长江中下游甘薯产区的16个省均有分布。目前，对SPVG的检测主要依赖于RT-PCR，该技术对实验设备和实验操作人员要求高，且实验成本相对抗原检测也更高，因此，建立针对SPVG的抗原检测体系将加快对SPVG的预测和防控，从而助推甘薯产业的良好发展。
发明内容
本发明为了克服上述现有技术存在的缺点，提供了一种编码甘薯病毒G外壳蛋白CP的基因、甘薯病毒G外壳蛋白CP，并通过免疫兔子制备甘薯病毒G外壳蛋白CP的多克隆抗体，以及该抗体在检测甘薯病毒G的应用。
本发明采用了以下技术方案来实现上述目的：
一种编码甘薯病毒G外壳蛋白CP的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
Tctgctgaagagatatacgatgcaggaaaaacaggaaacacaggaaggggaagaggacgaggcactgtgcctccgtcgccgccaccccctggagcaccaagaacaggtgacctgcctccagcagtgcagacaggaccattaccaccaggtgcagcctcaaaaccacctatcatcgaggaaattctgcaaccagagtcaccgagatcgaaggcattgcgggaagcgagagggaaagctccagcaacaatcccagatagtagaggggttgatacatcacaaataccgagttttacatcaggtggagaccaaacaatgacaccaacccctcaaagaacaagcactagagtgagagatagagatgtcaatgctggtacggttggaactttcacagtgccacgactccagataacacatagtaagaaaagagcaccaatggcaaatggaagaatagtagtcaatcttgaccacttgacagtctatgaccctgaacaaacaagtctttcaaatactcgagcaacacaggaacaatttaatgcttggtacgagggtgtaagggaagattatggagtaaatgatgagcaaatggggatattgctcaatgggttaatggtttggtgcatcgagaatggaacatccccgaatattaatggaatgtgggtcatgatggatggtgatgaacaagttacatatccaataaaacctctattggatcatgctgtccccacattcaggcagataatgacacactttagcgacatcgctgaagcgtatattgaaaagcgcaataggatcaaggcatacatgccgaggtatggtctacaacgaaacttgactgatatgagtcttgcgcgatatgcgttcgatttctatgagctgcactcgaacactcctattcgggccagagaagcacatatgcagatgaaagcagctgcacttaagaacgcacaaaatcggttgtttggtttggacggaaacgtctccacgcaggaagaagatacggagaggcacacaacgactgatgttacaaggaatatacataacctcttgggtatgaggggtgtgcag。
本发明提供由上述核苷酸序列编码得到的甘薯病毒G外壳蛋白CP，所述外壳蛋白CP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
SAEEIYDAGKTGNTGRGRGRGTVPPSPPPPGAPRTGDLPPAVQTGPLPPGAASKPPIIEEILQPESPRSKALREARGKAPATIPDSRGVDTSQIPSFTSGGDQTMTPTPQRTSTRVRDRDVNAGTVGTFTVPRLQITHSKKRAPMANGRIVVNLDHLTVYDPEQTSLSNTRATQEQFNAWYEGVREDYGVNDEQMGILLNGLMVWCIENGTSPNINGMWVMMDGDEQVTYPIKPLLDHAVPTFRQIMTHFSDIAEAYIEKRNRIKAYMPRYGLQRNLTDMSLARYAFDFYELHSNTPIRAREAHMQMKAAALKNAQNRLFGLDGNVSTQEEDTERHTTTDVTRNIHNLLGMRGVQ。
本发明提供含有上述核苷酸序列的重组载体、表达盒和重组菌。
本发明提供由上述甘薯病毒G外壳蛋白CP作为抗原制备获得的甘薯病毒G外壳蛋白CP的抗体。
本发明提供上述外壳蛋白CP抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，采用特异性引物对权利要求1所述的核苷酸序列扩增后构建到原核表达载体中，转化入大肠杆菌中诱导表达，收集表达蛋白并纯化，得外壳蛋白CP；
步骤2，以步骤1所得的外壳蛋白CP作为抗原免疫模式动物，收集免疫后的动物血清，得到所述的抗体。
进一步的，上述抗体制备方法步骤1中特异性引物包括引物SPVG/CP/F和引物SPVG/CP/R，原核表达载体为pET32a；其中，所述引物SPVG/CP/F的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，引物SPVG/CP/R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
具体的，
引物SPVG/CP/F核苷酸序列为CATGGCTGATATCGGATCCtctgctgaagagatatacgatgc；
引物SPVG/CP/R核苷酸序列为GGTGGTGGTGGTGCTCGAGctgcacacccctcataccc。
本发明提供利用上述甘薯病毒G外壳蛋白CP抗体检测甘薯病毒G的方法。
进一步的，所述检测甘薯病毒G的方法主要为Wesrern blot和ELISA。
更进一步的，所述Wesrern blot检测方法包括以下步骤：
步骤1，上样并电泳：将蛋白胶安装到电泳槽中，并在电泳槽中加入电泳缓冲液，然后将待测蛋白样品加入上样孔内；上样结束后，使用60-90V电压进行电泳；
步骤2，转膜：电泳结束后采用湿转的方式进行转膜，滤纸、蛋白胶与硝酸纤维素膜按照三层夹心的顺序置于转膜夹子中，并在电泳槽中加入转膜缓冲液，然后以300 mA恒定电流进行转膜；
步骤3，封闭：转膜完后将膜置于封闭液中封闭1 h；
步骤4，一抗孵育：以权利要求4中所述抗体作为一抗，用3%BSA按照1:1000-1:10000倍进行稀释后孵育膜，在4℃下摇动过夜；
步骤5，洗涤：一抗孵育后用洗涤液洗膜；
步骤6，二抗孵育：以HRP-羊抗兔IgG作为二抗，按照1:10000倍进行稀释后孵育膜，在室温下摇动1 h；
步骤7，洗涤：二抗孵育后用洗涤液洗膜，然后进行显色，检测。
更进一步的，所述ELISA检测方法包括以下步骤：
步骤1，点样：将甘薯样品用液氮磨碎后提取得到病毒粗提液；取病毒粗提液点样到硝酸纤维素膜上，室温干燥10-20 min ；
步骤2，封闭：将已点样的硝酸纤维素膜浸入到封闭液中，在37℃下封闭1 h ；
步骤3，加一抗：封闭完成后的硝酸纤维素膜放入含上述外壳蛋白CP抗体的一抗反应液中，在摇床上晃动混匀后，37℃下温育1 h；
步骤4，加二抗：弃一抗反应液，用洗涤液在摇床上摇晃洗涤，然后放入含AP-羊抗兔 Ig G的二抗反应液中，在摇床上摇晃混匀后，37℃下温育1 h；
步骤5，显色：弃二抗反应液，用洗涤液在摇床上摇晃洗涤，显色，检测。
本发明具有以下有益效果：1.本发明提供了一种甘薯病毒G外壳蛋白CP并提供了该蛋白的氨基酸序列，同时提供了可编码甘薯病毒G外壳蛋白CP的核苷酸序列；以该外壳蛋白CP为抗原制备得到一种CP蛋白抗体，利用该蛋白抗体可检测甘薯病毒G，可快速检测甘薯病毒G。
2.本发明提供的甘薯病毒G的检测方法中，通过克隆甘薯病毒G外壳蛋白CP的核苷酸序列，并将其构建到原核表达载体中，进一步诱导表达获得甘薯病毒G外壳蛋白CP，将其作为抗原免疫模式动物，从而获得特异性高的抗体。该抗体可以用于快速准备检测甘薯感病样品中的病毒，从而建立高效和高灵敏度的甘薯病毒G检测鉴定体系，对病毒的早期检测诊断和综合防控具有重要的应用价值，同时能够为脱毒种苗获得和繁育提供重要的参考依据。
附图说明
图1：实施例3中所得甘薯病毒G外壳蛋白CP电泳结果；
图2：实施例4 Western Blot检测方法结果；
图3：实施例5 ELISA检测田间甘薯样品结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请权利要求所保护的范围。
实施例1 一种编码甘薯病毒G外壳蛋白CP的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
Tctgctgaagagatatacgatgcaggaaaaacaggaaacacaggaaggggaagaggacgaggcactgtgcctccgtcgccgccaccccctggagcaccaagaacaggtgacctgcctccagcagtgcagacaggaccattaccaccaggtgcagcctcaaaaccacctatcatcgaggaaattctgcaaccagagtcaccgagatcgaaggcattgcgggaagcgagagggaaagctccagcaacaatcccagatagtagaggggttgatacatcacaaataccgagttttacatcaggtggagaccaaacaatgacaccaacccctcaaagaacaagcactagagtgagagatagagatgtcaatgctggtacggttggaactttcacagtgccacgactccagataacacatagtaagaaaagagcaccaatggcaaatggaagaatagtagtcaatcttgaccacttgacagtctatgaccctgaacaaacaagtctttcaaatactcgagcaacacaggaacaatttaatgcttggtacgagggtgtaagggaagattatggagtaaatgatgagcaaatggggatattgctcaatgggttaatggtttggtgcatcgagaatggaacatccccgaatattaatggaatgtgggtcatgatggatggtgatgaacaagttacatatccaataaaacctctattggatcatgctgtccccacattcaggcagataatgacacactttagcgacatcgctgaagcgtatattgaaaagcgcaataggatcaaggcatacatgccgaggtatggtctacaacgaaacttgactgatatgagtcttgcgcgatatgcgttcgatttctatgagctgcactcgaacactcctattcgggccagagaagcacatatgcagatgaaagcagctgcacttaagaacgcacaaaatcggttgtttggtttggacggaaacgtctccacgcaggaagaagatacggagaggcacacaacgactgatgttacaaggaatatacataacctcttgggtatgaggggtgtgcag。
实施例2 一种由实施例1所述核苷酸序列编码得到的甘薯病毒G外壳蛋白CP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
SAEEIYDAGKTGNTGRGRGRGTVPPSPPPPGAPRTGDLPPAVQTGPLPPGAASKPPIIEEILQPESPRSKALREARGKAPATIPDSRGVDTSQIPSFTSGGDQTMTPTPQRTSTRVRDRDVNAGTVGTFTVPRLQITHSKKRAPMANGRIVVNLDHLTVYDPEQTSLSNTRATQEQFNAWYEGVREDYGVNDEQMGILLNGLMVWCIENGTSPNINGMWVMMDGDEQVTYPIKPLLDHAVPTFRQIMTHFSDIAEAYIEKRNRIKAYMPRYGLQRNLTDMSLARYAFDFYELHSNTPIRAREAHMQMKAAALKNAQNRLFGLDGNVSTQEEDTERHTTTDVTRNIHNLLGMRGVQ。
实施例3 一种甘薯病毒G外壳蛋白CP的抗体，制备方法如下：
（1）基因获得
田间采样甘薯并通过转录确定甘薯病毒G感病，提取感病甘薯总RNA，利用以下特异性引物进行PCR扩增，获得编码外壳蛋白CP的基因片段；
引物SPVG/CP/F：CATGGCTGATATCGGATCCtctgctgaagagatatacgatgc；
引物SPVG/CP/R：GGTGGTGGTGGTGCTCGAGctgcacacccctcataccc；
PCR反应体系如下：
PCR扩增程序为：95℃，2min；95℃，15s，55℃，15s，68℃，15s，30个循环； 68℃，2min；
（2）将获得的外壳蛋白CP基因片段连接到pET32a原核表达载体
利用BamHI和XhoI两种内切酶对pET32a进行双酶切，双酶切反应体系如下：
将上述反应液混合后置于37℃反应1 h；
通过In-fusion的连接方式将上述扩增获得的外壳蛋白CP基因片段连接到上述所得pET32a原核表达载体上，In-fusion反应体系如下：
将上述反应液混合后置于37℃反应半小时；
（3）大肠杆菌转化
将上述In-fusion反应后的产物经热机转化入大肠杆菌DH5α或者购买的商业感受态TOP10，对菌落进行PCR和测序验证，选择正确的载体进行直立提取，并转化入原核表达菌株Rosetta；
（4）外壳蛋白CP小量诱导表达
将上述表达菌接种于含卡那霉素抗生素（50 μg/mL）的LB液体培养基中，37℃培养过夜，将过夜培养菌液以1:100转接于含卡那霉素抗生素（50 μg/mL）的新鲜LB培养基中，37℃继续培养至OD600=0.6左右时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5 mM，37 ℃诱导培养4 h；取1 000 μL诱导培养菌液离心收集菌体，加入2*SDS-PAGE样品缓冲液100 μL悬浮并于沸水中煮5 min，12000 rpm离心后取上清进行SDS-PAGE分析；其中不加入IPTG的菌液为对照；
（5）外壳蛋白CP大量诱导表达
1）将上述所得表达菌接种于3 mL含有卡那霉素抗生素（50 μg/mL）的LB液体培养基中，37℃过夜培养；
2）将过夜培养的大肠杆菌按照1：100转接到300 mL含卡那霉素抗生素（50 μg/mL）的LB液体培养基中，并加入0.5 mM IPTG进行诱导表达，16℃诱导过夜；
（6）外壳蛋白CP纯化
1）将上述大量诱导表达后的菌液在4℃静置15 min，12000 rpm离心10 min后弃上清；
2）在收集到的菌体中加入30 mL PBS，重新悬浮，并置于冰上10 min；
3）用细胞超声破碎仪裂解细胞；
4）4℃，12000 rpm离心20 min后弃上清；
5）用5 mL PBS再次悬浮沉淀；
6）在悬浮液中加入适量Ni2+-NTA Agarose，4℃孵育2-3 h；
7）将上述混合液转入层析柱进行过柱；
8）用含20 mM咪唑的缓冲液对层析柱洗脱5-10次，每次用1 mL洗脱液进行洗脱，共洗脱6 mL，得纯化后的外壳蛋白CP；
（7）免疫
用上述所得纯化的外壳蛋白CP免疫兔子，并每12天加强免疫；
（8）血清获得
在最后一次加强免疫后第七天取兔耳静脉血，分离血清，然后进行效价测定：将纯化的外壳蛋白CP稀释至1 μg/mL浓度后包被酶标板，将血清按照一系列倍比稀释后为一抗，AP-羊抗兔IgG为二抗，进行间接ELISA方法测定抗体的效价。
实施例4 利用上述外壳蛋白CP抗体进行甘薯病毒G检测（Western blot法）
Western blot实验步骤如下：
上样：将已制备好的蛋白胶安装到电泳槽中，并在电泳槽中加满电泳缓冲液（25mMTris， 192mM Glycine，0.1%SDS），然后将待测蛋白样品加入上样孔内；
电泳：上样结束后，使用60-90V电压进行电泳，待溴酚蓝迁移到蛋白胶底部时结束电泳；
转膜：电泳结束后采用湿转的方式进行转膜，滤纸、蛋白胶与硝酸纤维素膜按照三层夹心的顺序置于转膜夹子中，并在电泳槽中加入足量转膜液（25mM Tris，192mMGlycine，200ml甲醇，体积为1L），然后以300 mA恒定电流进行转膜；
封闭：将膜置于用1PBST（4.3 mM Na2HPO4，1.47 mM KH2HPO4，0.137 mM NaCl，2.7mM KCl，0.05%Tween-20）配制的5%脱脂牛奶中封闭1 h；
一抗孵育：以实施例3所得外壳蛋白CP抗体作为一抗，用3%BSA按照1:2000倍进行稀释，然后置于4℃孵育膜过夜；
洗涤：一抗孵育后用1PBST进行洗膜3-4次，每次15 min；
二抗孵育：以HRP-羊抗兔IgG作为二抗，按照1:10000倍进行稀释，室温孵育膜1 h；
洗涤：二抗孵育后用1PBST进行洗膜3-4次，每次15 min，然后进行显色，检测。
实施例5 利用上述外壳蛋白CP抗体进行甘薯病毒G检测（ELISA检测法）
ELISA检测实验步骤如下：
点样：将甘薯样品用液氮磨碎后按1：20（w/v，g/mL）加入磷酸缓冲液（0.01 M PBS，pH7.4），5000 rpm 离心3 min，得到病毒粗提液，取2.5μL病毒粗提液点到硝酸纤维素膜上，室温干燥10-20 min；
封闭：将硝酸纤维素膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST封闭液中，37℃封闭1 h ；
加一抗：硝酸纤维素膜放入含外壳蛋白CP抗体的5%脱脂奶粉稀释液中（抗体按1：5000 稀释），在摇床上晃动混匀后，37 ℃温育1 h；
加二抗：弃一抗反应液，用PBST在摇床上摇晃洗涤3次，每次5min，然后用含AP-羊抗兔 Ig G的5%脱脂奶粉抗体稀释液中（抗体按1：8 000倍稀释），在摇床上摇晃混匀后，37℃温育1 h；
显色：弃二抗反应液，用PBST在摇床上摇晃洗涤5次，每次5 min，最后用PBS摇晃洗涤1次，以去除膜表面的吐温-20，用10 mL 底物缓冲液（0.1 mol/L TrisCl、0.1 mol/LNaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5）加入 66 μL NBT 和 33 μL BCIP 的底物进行显色反应，肉眼观察结果，阳性为紫色，用自来水终止反应，拍照记录结果。
Claims (10)
1.一种编码甘薯病毒G外壳蛋白CP的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.一种甘薯病毒G外壳蛋白CP，其特征在于，所述外壳蛋白CP由权利要求1中所述核苷酸序列编码得到；所述外壳蛋白CP的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种含有权利要求1所述核苷酸序列的重组载体、表达盒和重组菌。
4.一种甘薯病毒G外壳蛋白CP的抗体，其特征在于，所述的抗体是由权利要求2所述的甘薯病毒G外壳蛋白CP作为抗原制备获得。
5.一种如权利要求4所述的外壳蛋白CP抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，采用特异性引物对权利要求1所述的核苷酸序列扩增后构建到原核表达载体中，转化入大肠杆菌中，诱导表达，收集表达蛋白并纯化，得外壳蛋白CP；
步骤2，以步骤1所得的外壳蛋白CP作为抗原免疫模式动物，收集免疫后动物的血清，得到所述的抗体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中特异性引物包括引物SPVG/CP/F和引物SPVG/CP/R，原核表达载体为pET32a；其中，所述引物SPVG/CP/F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，引物SPVG/CP/R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.一种利用权利要求4所述抗体检测甘薯病毒G的方法。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法为Wesrern blot和ELISA。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述Wesrern blot检测方法包括以下步骤：
上样并电泳：将蛋白胶安装到电泳槽中，并在电泳槽中加入电泳缓冲液，然后将待测蛋白样品加入上样孔内；上样结束后，使用60-90V电压进行电泳；
转膜：电泳结束后采用湿转的方式进行转膜，滤纸、蛋白胶与硝酸纤维素膜按照三层夹心的顺序置于转膜夹子中，并在电泳槽中加入转膜缓冲液，然后以300 mA恒定电流进行转膜；
封闭：转膜完后将膜置于封闭液中封闭1 h；
一抗孵育：以权利要求4中所述抗体作为一抗，用3%BSA按照1:1000-1:10000倍进行稀释后孵育膜，在4℃下摇动过夜；
洗涤：一抗孵育后用洗涤液洗膜；
二抗孵育：以HRP-羊抗兔IgG作为二抗，按照1:10000倍进行稀释后孵育膜，在室温下摇动1 h；
洗涤：二抗孵育后用洗涤液洗膜，然后进行显色，检测。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述ELISA检测方法包括以下步骤：
点样：将甘薯样品用液氮磨碎后提取得到病毒粗提液；取病毒粗提液点样到硝酸纤维素膜上，室温干燥10-20 min ；
封闭：将已点样的硝酸纤维素膜浸入到封闭液中，在37℃下封闭1 h ；
加一抗：封闭完成后的硝酸纤维素膜放入含权利要求4中所述抗体的一抗反应液中，在摇床上晃动混匀后，37℃下温育1 h；
加二抗：弃一抗反应液，用洗涤液在摇床上摇晃洗涤，然后放入含AP-羊抗兔 Ig G的二抗反应液中，在摇床上摇晃混匀后，37℃下温育1 h；
显色：弃二抗反应液，用洗涤液在摇床上摇晃洗涤，显色，检测。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20240514 |
|
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |