CN111004812A - 溶血性曼氏杆菌lkta蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒 - Google Patents

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CN111004812A CN201910068476.1A CN201910068476A CN111004812A CN 111004812 A CN111004812 A CN 111004812A CN 201910068476 A CN201910068476 A CN 201910068476A CN 111004812 A CN111004812 A CN 111004812A
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Abstract

本发明提供了溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒，属于基因工程技术领域，包括以下步骤：1)以lkta‑F、lkta‑R为引物，以溶血性曼氏杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增；2)将PCR扩增产物和质粒载体分别进行酶切，得到LKTA蛋白编码基因酶切片段和质粒载体酶切片段；3)将所述LKTA蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段连接，得到重组质粒；4)将所述重组质粒转化至大肠杆菌的感受态中，得到溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体。本发明提供的溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白具有良好的特异性，能够用来作为抗原标志物检测溶血性曼氏杆菌。

Description

溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶 血性曼氏杆菌的试剂盒
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒。
背景技术
溶血性曼氏杆菌原名溶血性巴氏杆菌，是一种革兰氏阴性，不运动，无芽孢，氧化酶阳性，瑞士染色两极着色的兼性厌氧球杆状菌。在血液琼脂上，新分离的菌落呈微弱的β溶血。基于发酵阿拉伯糖和海藻糖的能力进一步分为两个不同的生物型(A，T)。十二个A生物型(血清型1、2、5、6、7、8、9、12、13、14、16、17)和四个T生物型(血清型3、4、10、15)已被鉴定。溶血性曼氏杆菌是一种严重危害家畜养殖业的人畜共患病，临床上可以导致牛羊出血性败血症等危害严重的病症。一般认为它是家畜家常带内源性病菌，当饲养环境不卫生，加上由于天气的突变、寒冷、闷热、潮湿拥挤、饲养营养缺乏、饲料突变、长途运输等诱因，动物产生应激反应，机体抵抗力降低，病菌可乘机侵入机体内，经淋巴进入血液，发生内源性感染。
目前对于溶血性曼氏杆菌的检测多采用PCR扩增的方法，例如中国专利CN201810149979.7，一种用于检测溶血性曼氏杆菌实时荧光PCR引物，公开了采用荧光PCR的方法检测血性曼氏杆菌。但是目前现有技术中没有能够有效的检测溶血性曼氏杆菌的抗原标志物，尚没有检测溶血性曼氏杆菌的免疫学方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒；所述LKTA蛋白原核表达载体能够表达高免疫活性的LKTA蛋白，能够实现溶血性曼氏杆菌的免疫检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法，包括以下步骤：
1)以lkta-F、lkta-R为引物，以溶血性曼氏杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到LKTA蛋白编码基因的PCR产物；
所述lkta-F具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
所述lkta-R具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
2)将所述LKTA蛋白编码基因的PCR产物和质粒载体分别进行NdeI和XhoI酶切，得到LKTA蛋白编码基因酶切片段和质粒载体酶切片段；
3)将所述LKTA蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段连接，得到重组质粒；
4)将所述重组质粒转化至大肠杆菌的感受态中，得到溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体。
优选的，所述步骤1)中PCR扩增的程序如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，30循环；72℃7min。
优选的，步骤1)中PCR扩增的体系以50μl计，包括如下组分：
Figure BDA0001956493600000021
优选的，所述步骤3)中连接采用无缝克隆法进行。
优选的，所述连接的体系以20μl计，包括如下组分：
Figure BDA0001956493600000022
优选的，所述连接的温度为48～52℃，所述连接的时间为55～65min。
本发明提供了溶血性曼氏杆菌的检测抗原，所述抗原为所述的方法构建的溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体经诱导表达的抗原。
本发明提供了一种基于间接ELISA法检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒，包括以下组成：
包被有所述抗原的检测板；
抗血清；所述抗血清由所述抗原免疫动物得到；
酶标-山羊抗小鼠Ig G；
样品稀释液；
底物显色液；
洗涤液。
优选的，所述抗原的包被浓度为450～650ng/mL。
优选的，所述试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为质量浓度为5％的脱脂乳。
本发明的有益效果：本发明提供了溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法，本发明首次将溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白构建入原核表达载体中，得到溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白的原核表达载体，通过重组表达得到检测溶血性曼氏杆菌的抗原标志物-LKTA蛋白，且表达的LKTA蛋白经Western Blot分析得到30KDa的目的条带。实验表明，以LKTA蛋白为抗原与大肠杆菌、链球菌、肺炎支原体三种细菌阳性血清进行免疫反应，结果均为阴性。这说明本发明提供的溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白具有良好的特异性，能够用来作为抗原标志物检测溶血性曼氏杆菌。
本发明提供了一种基于间接ELISA法检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒，所述试剂盒是采用间接ELISA法进行检测。实验表明，与间接血凝试验检检测结果表明，相对于间接血凝试验检而言，该本发明所述的试剂盒检测溶血性曼氏杆菌的特异性为96％，敏感性为100％，符合率为97.6％。因此，本发明提供的试剂盒能够用于溶血性曼氏杆菌的检测，并且检测速度快，结果准确。
附图说明
图1为实施例1中Lkta片段电泳图；
图2为实施例1中载体pET28b(+)酶切琼脂糖电泳图；
图3为实施例1中融合蛋白小试SDS-PAGE分析图，其中M：Protein Marker；1：诱导前总蛋白；2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀；
图4为实施例1中目的蛋白镍琼脂糖亲和层析SDS-PAGE分析图，其中M：Proteinmarker；1：上样；2：流出；3：20mM Imidazole洗脱组分；4-6：500mM Imidazole洗脱组分；
图5为实施例2中目的蛋白SDS-PAGE分析图，其中M：Protein marker；1：目的蛋白；
图6为实施例2中目的蛋白最终纯化Western Blot分析图；其中M：Proteinmarker；1：目的蛋白；
图7为实施例2中目的蛋白浓度测定标准曲线；
图8为实施例3中溶血性曼氏杆菌阴性血清S/P值分布图。
具体实施方式
本发明提供了溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法，包括以下步骤：
1)以lkta-F、lkta-R为引物，以溶血性曼氏杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到LKTA蛋白编码基因的PCR产物；
所述lkta-F具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
所述lkta-R具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
2)将所述LKTA蛋白编码基因的PCR产物和质粒载体分别进行NdeI和XhoI酶切，得到LKTA蛋白编码基因酶切片段和质粒载体酶切片段；
3)将所述LKTA蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段连接，得到重组质粒；
4)将所述重组质粒转化至大肠杆菌的感受态中，得到溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体。
本发明以lkta-F、lkta-R为引物，以溶血性曼氏杆菌的总DNA为模板进行PCR扩增，得到LKTA蛋白编码基因的PCR产物。
在本发明中，所述溶血性曼氏杆菌的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的溶血性曼氏杆菌来源即可。本发明对所述DNA提取的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的DNA提取方法即可。
在本发明中，所述PCR扩增的程序优选如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，30循环；72℃7min。
在本发明中，所述PCR扩增的体系以50μl计，优选的包括如下组分：
Figure BDA0001956493600000051
得到LKTA蛋白编码基因的PCR产物后，本发明将所述LKTA蛋白编码基因的PCR产物和质粒载体分别进行NdeI和XhoI酶切，得到LKTA蛋白编码基因酶切片段和质粒载体酶切片段。
在本发明中，所述PCR产物的酶切体系如下：
纯化回收好的片段 1μg(20μl)
10X FD缓冲液 5μl
NdeI 1μl(10U/μl)
XhoI 1μl(10U/μl)
ddH<sub>2</sub>O 23μl
在本发明中，所述PCR产物的酶切的程序为在37℃条件下反应2h。
在本发明中，所述质粒载体的酶切体系如下：
pET28b(+) 1μg
10X FD缓冲液 5μl
NdeI 1μl(10U/μl)
XhoI 1μl(10U/μl)
ddH<sub>2</sub>O 42μl
在本发明中，所述质粒载体的的酶切的程序为在37℃条件下反应2h。
本发明对所述NdeI和XhoI酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的酶来源即可。本发明中，质粒载体优选为pET28b(+)。所述质粒载体购自长沙优宝生物科技有限公司。
得到LKTA蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段后，本发明将所述LKTA蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段连接，得到连接产物。本发明中，所述连接优选的采用无缝克隆法进行。所述连接的体系以20μl计，优选的包括如下组分：
Figure BDA0001956493600000061
本发明中，所述连接的温度优选为48～52℃，更优选为50℃；所述连接的时间优选为55～65min，更优选为60min。本发明中，所述无缝克隆混合液优选的购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
得到连接产物后，本发明将所述连接产物转化至大肠杆菌的感受态中，得到溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体。
在本发明中，所述转化的方法优选为42℃热激法。大肠杆菌的感受态优选为oneshort菌株。本发明对所述大肠杆菌的感受态的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的大肠杆菌的感受态即可。在本发明实施例中，所述大肠杆菌的感受态购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
在本发明中，构建得到溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体后，为获得表达的抗原，还优选包括重组LKTA蛋白的诱导表达和分离纯化。
在本发明中，所述重组LKTA蛋白的诱导表达的方法优选包括以下步骤：
a.将溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体涂布含有终浓度为30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素的LB固体培养基上培养，长出单个菌落；
b.挑选单个菌落接种于添加30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素的液体LB培养基中，37℃，220rpm培养，得到菌液；
c.当所述菌液的OD值达到0.6时，向菌液中添加终浓度为0.5mmol/L的IPTG，在220rpm和20℃条件下诱导培养，得到菌体；以37℃诱导4h，未加IPTG诱导剂的作为阴性对照；
d.收集所述菌体，将所述菌体用PBS缓冲液悬浮，超声破碎，得到沉淀和上清液；
e.溶解所述沉淀后添加蛋白质下沉缓冲液混匀，将得到的混合物在沸水浴下保持10min，用SDS-PAGE检测重组表达蛋白。
在本发明中，所述溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白的分离纯化，优选包括以下步骤：
①将上述诱导表达方案中得到的上清液经镍琼脂糖亲和层析，收集洗脱液；
②将所述洗脱液透析和滤膜过滤，得到的滤液中包括纯化的蛋白。
本发明中，所述镍琼脂糖亲和层析时Binding buffer洗柱的流速5mL/min。所述上清液上柱的流速为2mL/min。
本发明提供了一种基于间接ELISA法检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒，包括以下组成：
包被有抗原的检测板；所述抗原为所述的方法构建的溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体表达的抗原；
抗血清；所述抗血清由所述抗原免疫动物得到；
酶标-山羊抗小鼠Ig G；
样品稀释液；
底物显色液；
洗涤液。
本发明提供的试剂盒包括包被有抗原的检测板，所述抗原为上述技术方案所述的方法构建的溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体表达的抗原。所述抗原包被浓度优选为450～650ng/mL，更优选为500ng/mL。本发明对所述包被方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的包被方法即可。所述包被有抗原的检测板进行封闭。所述封闭用封闭液优选为质量浓度为5％的脱脂乳。
本发明提供的试剂盒包括抗血清；所述抗血清由所述抗原免疫动物得到。所述抗血清的稀释倍数优选为10～100倍，更优选为50倍。所述抗血清的作用时间优选为60min；所述抗血清作为试剂盒的阳性对照品。
本发明提供的试剂盒包括样品稀释液。所述样品稀释液优选为pH值为9.6的碳酸盐缓冲液。
本发明提供的试剂盒包括酶标-山羊抗小鼠Ig G。所述酶标二抗的工作浓度为1:20000，作用时间为30min。
本发明提供的试剂盒包括底物显色液。当酶标-山羊抗小鼠Ig G中酶为HRP时，所述底物显色液为TMD显色液。所述底物显色液的作用时间优选为20min。
本发明提供的试剂盒包括洗涤液。所述洗涤液为PBST缓冲液；所述PBST缓冲液为包含体积浓度为含有0.1％Tween20的PBS溶液。
所述试剂盒的使用方法同常规的间接ELISA试剂盒的使用方法。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.目的片段lkta扩增
1.1引物
引物 序列
lkta-F: CGC<u>CATATG</u>GATGGTGCAGCAAGTTC
lkta-R: CCG<u>CTCGAG</u>AGCAAAATCAGCCTCTC
下划线为酶切位点NdeI和XhoI
1.2扩增体系
PCR反应采用的是pfu高温聚合酶。
PCR各个成分的用量：(引物浓度为1OD溶于400μl ddH2O)
Figure BDA0001956493600000081
1.3 PCR程序
Figure BDA0001956493600000082
Figure BDA0001956493600000091
1.4完成后进行电泳，如图1；
1.5回收纯化好的片段备用酶切；
所用为生工生物工程(上海)股份有限公司产的PCR纯化试剂盒
2.目的片段和载体的酶切
2.1将上述PCR产物进行酶切
1)、PCR产物片段酶切体系50μl
Figure BDA0001956493600000092
以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h
2)、载体的酶切体系：
Figure BDA0001956493600000093
以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h
载体酶切电泳图如图2。
2.2回收酶切的载体和片段
3.目的片段与载体连接(无缝克隆XO)
3.1将回收纯化好的目的DNA片段和载体进行连接。
Figure BDA0001956493600000094
Figure BDA0001956493600000101
上述连接混合液放在50℃PCR仪1h即可。
pET28b(+)购自长沙优宝生物科技有限公司，无缝克隆混合液购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
4.转化，筛选克隆
4.1转化
将上述连接液进行转化，转化采用42℃热激法进行，感受态菌株为oneshort。购自生工生物工程(上海)股份有限公司。获得重组的pET28b(+)质粒。
取1μl重组的pET28b(+)质粒转化Rosetta(DE3)菌株，42℃热击90s，冰上静置2min后涂平板(30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素)，37℃恒温箱培养过夜。LB Borth Agar，Rosetta(DE3)菌株，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。使用时4g粉末用100mL ddH2O溶解，高温高压蒸汽灭菌。
实施例2
LKTA重组蛋白的诱导表达和纯化
小试培养选择最佳的诱导条件
◆挑取表达菌株Rosetta(DE3)的单菌落于含2.5mL LB培养基(30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素)试管中，37℃，220rpm摇床培养过夜。LB Borth由生工提供，使用时25g粉末用1L dd H2O溶解，高温高压蒸汽灭菌。
◆将培养的菌液按体积比1:100的比例分别接种于2.5mL LB培养基中，所述LB培养基中添加30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素，37℃，220rpm培养约3h。
◆当OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，220rpm，分别20℃诱导过夜；37℃诱导4h，未加IPTG诱导剂的作为阴性对照。
◆4000rpm离心10min收集菌体，弃上清，菌体用500μL PBS(pH7.4)缓冲液悬浮，超声破碎6min，超0.5s停1.5s，分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500μL包涵体溶解液(8MUrea，50mM Tris-HCl，150mM NaCl，PH8.0)溶解，分别取40μL样品和10μL 5×proteinloading buffer混匀，沸水浴10min。
融合蛋白小试SDS-PAGE分析图，如图3所示，其中M：Protein Marker；1：诱导前总蛋白；2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀。
大量诱导
将活化过夜的菌液按体积比1:100比例接种于4L的LB液体培养基中，添加30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素，37℃，220rpm培养约3h，当OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5mMIPTG，28℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体。
目的蛋白的纯化
超声破碎菌体
◆将收集的细菌菌体用破碎Buffer(50mM Tris，300mM NaCl，pH8.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率400W，20min(超声2S，暂停6S为一个循环)。
◆超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，弃上清，沉淀用Buffer(8M尿素，50mMTris，300mM NaCl，0.1％TritonX-100，pH8.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率400W，20min(超声2S，暂停6S为一个循环)。
◆超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，收集上清进行下一步纯化。
镍琼脂糖亲和层析
◆取5mL Ni-IDA，用10倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。
◆上柱，流速为2mL/min，收集穿透液。
◆10倍柱床体积的Binding buffer清洗柱子，流速10mL/min。
◆Wash buffer洗杂，流速5mL/min，收集洗脱液。
◆Elution buffer洗脱，流速2mL/min，收集洗脱液。
注：Binding buffer(8M Urea，50mM Tris，300mM NaCl，pH＝8.0)
Wash buffer(8M Urea，50mM Tris，300mM NaCl，10/50mM Imidazole，pH＝8.0)
Elution buffer(8M Urea，50mM Tris，300mM NaCl，500mM Imidazole，pH＝8.0)
将收集到的组分进行SDS-PAGE检测，见图4，将纯度较好的3/5/6组分透析到1×PBS，pH＝7.4中，16h后换一次Buffer继续透析4h，0.45μm CA滤膜过滤分装1mL/tube，-80℃保存。
纯化蛋白的检测
SDS-PAGE检测：
准备12％的SDS-PAGE，Tris-Gly电泳缓冲液，上样量10μL，浓缩胶80V 20min，分离胶120V 60min，凝胶电泳结束后进行考马斯亮蓝染色20min，脱色。检测结果如图5所示。
Western blot检测
◆制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶：浓缩胶5％，分离胶12％。
◆制样：上样量：1μg。
◆电泳：浓缩胶80V，30min；分离胶120V，60min。
◆转膜：湿转，250mA 90min。
◆封闭：5％的脱脂奶粉，37℃缓慢振荡2h。
◆孵育一抗：一抗为兔抗his标签，抗体公司：Sangon Biotech，编号：D110002，1:500稀释，37℃缓慢振荡60min。
◆孵育二抗：二抗为羊抗兔，抗体公司：Sangon Biotech，编号：D110058，1:8000稀释，37℃缓慢振荡60min。
◆显色：TMB显色。
检测结果如图6所示。
蛋白浓度测定
用SK3071非干扰型蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白，测定融合蛋白浓度为0.454mg/ml，BSA浓度为2mg/ml，测定蛋白体积为20μl，蛋白浓度测定曲线如图7所示，结果如表1所示。
表1蛋白浓度测定结果
Figure BDA0001956493600000121
Figure BDA0001956493600000131
实验结论
经以上实验过程，成功纯化出目的蛋白。
实施例3
实验方案
1材料
1.1抗原
间接ELISA抗原A1血清型LKTA重组蛋白由本课题组表达和纯化。纯化后抗原浓度为1mg/mL。
1.2动物血清
溶血性曼氏杆菌大鼠标准阳性血清、标准阴性血清、大肠杆菌、链球菌、绵羊肺炎支原体3种羊阳性血清均为本课题组保存。
1.3其他试剂
HRP-山羊抗小鼠Ig G购于华美生物工程公司，四甲基联苯胺(TMB)购于天根生化科技有限公司，ELISA试验用96孔板条购于宝生物工程(大连)有限公司。
2方法
将ELISA重组抗原用0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释成50ng/ml，包被反应板，每孔100μL，置4℃冰箱过夜；次日甩掉包被液，用PBST洗涤反应板，再用8道移液器加入封闭液(质量浓度5％的脱脂乳)200μL/孔，37℃1小时；取出加PBST洗板；用稀释液按1:50倍数稀释血清，每孔加100μL，37℃作用60min，用洗液洗板；取稀释的二抗液，工作浓度为1:20000，,每孔100μL，37℃作用30min，洗涤同前；取TMB底物液每孔加100μL，室温作用20mon，用2mol/L H2SO4终止反应；用酶标仪在波长450nm处测定每孔内降解物的吸收值(A)值，每个样品每次平行2孔，取其平均值。
2.1包被抗原的制备
将含有质粒LKTA-PET-28b的大肠杆菌在含有100μg/mL卡那霉素的LB平板上划线，37℃培养过夜后挑取单个菌落，接种于100μg/m L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。将此菌作为菌种液，以1：100的比例接种于新鲜的100μg/m L卡那霉素的LB液体培养基中，置于摇床中37℃振摇培养至A600为0.6(大约4h)加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养4h，常规方法收集菌体，将沉淀悬浮于PBS中，经超声波裂解细胞，收集上清，将上清通过0.45μm滤膜，过滤去除杂质。然后将处理好的细菌诱导裂解样品经Glutathione Sepharose4B亲和层析柱纯化。分光光度仪测定纯化的蛋白浓度为1mg/mL。
判定标准
在已经确定的间接ELISA条件下，对经间接血凝试验检测抗体阴性的20份羊血清，用重组抗原包被的酶标板进行A450的测定，结果进行统计学分析，将x+3s作为溶血性曼氏杆菌阳性临界值，x+2s作为阴性临界值，确定判定标准。
取20份经间接血凝实验检测为阴性的羊血清，按间接ELISA步骤进行试验。以样品号为横坐标，以阴性血清S/P值为纵坐标，得到溶血性曼氏杆菌阴性血清的S/P数值分布图(图8)。可以观察到这些样品的S/P值主要分布在0-0.05之间，占血清样品的85％，数据分布合理，可以作为制定判定标准的依据。
这些数据经统计学处理，样品平均值和标准差分别为
Figure BDA0001956493600000141
与s＝0.079，得到置信区间上限
Figure BDA0001956493600000142
因而把0.399作为溶血性曼氏杆菌阴性血清的下限；
Figure BDA0001956493600000143
定为可疑界限，因而把0.32作为溶血性曼氏杆菌阴性血清的上限；根据统计学原理，
Figure BDA0001956493600000144
时，可以在99.9％的水平上判定为阳性。因此，确定间接ELISA判定标准，在标准阳性阴性血清之积差大于2.5时，即阴阳性对照成立的情况下，血清样品A值≥0.399者判为阳性，血清样品A值<0.32者判为阴性。介于0.399和0.32之间的血清样品重新检测。
S/P＝(样品血清A值－标准阴性血清A值)/(标准阳性血清A值－标准阴性血清A值)
特异性试验
交叉反应试验
用已建立的间接ELISA方法对大肠杆菌、链球菌、肺炎支原体3种羊阳性血清进行检测，每种血清做3个重复，同时做阴阳性对照，确定重组抗原与其它羊细菌阳性血清之间是否发生交叉反应。
阻断试验
取1份阳性血清和1份阴性血清，各作两份倍比稀释，其中一份的每个稀释度与最适工作浓度的重组抗原37℃作用1h，另一份稀释的阴阳性血清作为对照，按照所建立的间接ELISA方法进行试验。
敏感性试验
将标准阳性血清从1:200开始进行倍比稀释，按间接ELISA程序进行测定，依据已确定的判定标准，A450值判定为阳性时的最高稀释倍数即为抗体检出最低效价。
稳定性试验
批内重复试验
用同一批制备的重组蛋白分别在1周、2周、3周、4周、5周、6周时，包被反应板，检测4份溶血性曼氏杆菌抗体水平不同的血清，每份血样每个时间点做3个重复。在使用同一批蛋白包被的ELISA试验中，除包被时间点不同外，其余反应条件相同，按间接ELISA程序测定，对测定结果进行统计学分析。
保存期试验
用重组蛋白包被酶标板，用5％脱脂奶粉封闭液封闭并洗涤后，分成两份，分别保存于2℃-8℃和-20℃。标准阳性血清保存液、标准阴性血清保存液、酶标抗体保存液和它们各自的工作液保存于-20℃。20×PBST保存于2℃-8℃。分别于30d、60d、90d、120d、150d后取出一部分进行试验，与新包被板进行比较，每次试验重复8孔。得出的数值进行t检验。
对比试验
按已经建立的间接ELISA方法与间接血凝试验抗体检测结果分别平行测定48份血清样本，计算S/P值,确定检测结果并进行比较。计算建立的诊断方法对间接血凝试验的特异性、敏感性和符合率。
符合率＝(自制试剂盒检测已知阳性血清中阳性份数+自制试剂盒检测已知阴性血清中阴性血清份数)/(参照间接血凝检测阳性份数+参照间接血凝检测阴性份数)
敏感性＝自制试剂盒检测已知阳性血清中阳性份数/参照间接血凝检测阳性份数
特异性＝自制试剂盒检测已知阴性血清中阴性血清份数/参照间接血凝检测阴性份数
交叉反应试验结果
用已建立的间接ELISA方法对大肠杆菌、链球菌、肺炎支原体三种细菌阳性血清进行检测的结果见表2。结果表明：上述血清均为阴性，说明制备的溶血性曼氏杆菌抗原与上述病原无交叉反应，表现了很好的特异性。
表2交叉反应试验结果
Figure BDA0001956493600000161
阻断性试验结果
阻断性试验结果见表3，可以看出各稀释度的阳性血清与重组抗原反应后A值下降明显，与阴性血清逐渐相近；随着血清稀释倍数增加，阳性血清A值逐渐降低，而阴性血清处理前后A值几乎无变化，这表明表达抗原具有良好的特异性。
表3阻断性试验结果
Figure BDA0001956493600000162
Figure BDA0001956493600000171
敏感性试验结果
将标准阳性血清从1:200开始进行倍比稀释，进行间接ELISA测定，得出标准阳性抗体稀释1:3200时，结果为阴性，见表4，表明本方法敏感性较高。
表4敏感性试验结果
Figure BDA0001956493600000172
稳定性试验结果
批内及批间重复试验结果
4份血清进行6次重复性实验结果显示A450平均值稳定，经统计学分析，变异系数从1.1％-9.9％，均小于10％，显示同一批抗原具有良好的稳定性，ELISA试验批内重复性良好。
表5批内重复试验结果
Figure BDA0001956493600000173
保存期试验结果
包被好的酶标板、酶标二抗、血清等在-20℃条件下保存，5个月后与新包被的酶标板A450值无明显区别，而在2℃-8℃下保存，第4个月时保存的酶标板与新包被的酶标板相比，A450明显降低，呈现显著差异。
表6保存期试验结果
Figure BDA0001956493600000181
判定标准：P＜0.05为差异显著。
对比试验结果
重组蛋白建立的间接ELISA诊断方法与间接血凝试验检检测结果比较如表7。42份血清的检测结果表明，相对于间接血凝试验检而言，该诊断方法的特异性为96％，敏感性为100％，符合率为97.6％。
表7重组蛋白间接ELISA方法与间接血凝试验检测结果比较
Figure BDA0001956493600000182
间接ELISA方法的初步应用
应用建立的诊断方法对72份血清样品进行检测，结果发现72份血清样品中有13份阳性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 内蒙古自治区农牧业科学院
<120> 溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgccatatgg atggtgcagc aagttc 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgctcgaga gcaaaatcag cctctc 26

Claims (10)

1.溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法，包括以下步骤：
1)以lkta-F、lkta-R为引物，以溶血性曼氏杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到LKTA蛋白编码基因的PCR产物；
所述lkta-F具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
所述lkta-R具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
2)将所述LKTA蛋白编码基因的PCR产物和质粒载体分别进行NdeI和XhoI酶切，得到LKTA蛋白编码基因酶切片段和质粒载体酶切片段；
3)将所述LKTA蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段连接，得到重组质粒；
4)将所述重组质粒转化至大肠杆菌的感受态中，得到溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中PCR扩增的程序如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，30循环；72℃7min。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤1)中PCR扩增的体系以50μl计，包括如下组分：
Figure FDA0001956493590000011
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中连接采用无缝克隆法进行。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述连接的体系以20μl计，包括如下组分：
Figure FDA0001956493590000012
Figure FDA0001956493590000021
6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，所述连接的温度为48～52℃，所述连接的时间为55～65min。
7.溶血性曼氏杆菌的检测抗原，其特征在于，所述抗原为权利要求1～6任意一项所述的方法构建的溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体经诱导表达的抗原。
8.一种基于间接ELISA法检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒，其特征在于，包括以下组成：
包被有权利要求7所述抗原的检测板；
抗血清；所述抗血清由权利要求7所述抗原免疫动物得到；
酶标-山羊抗小鼠Ig G；
样品稀释液；
底物显色液；
洗涤液。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原的包被浓度为450～650ng/mL。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为质量浓度为5％的脱脂乳。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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