CN106318967A - 一种含有抗草甘膦基因的植物表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有抗草甘膦基因的植物表达载体。所述植物表达载体为含两个拷贝的抗草甘膦基因的环形载体：所述抗草甘膦基因编码氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列的蛋白质或氨基酸序列与SEQ ID NO.1相比有一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、且具有草甘膦抗性的蛋白质；所述两个拷贝的抗草甘膦基因分别被来自棉花的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶基因启动子和来自拟南芥激动蛋白基因的启动子驱动。本发明证明，导入本发明的植物表达载体的转基因棉花具有非常强的草甘膦抗性。本发明对于进一步培育高抗草甘膦植物及其应用具有非常重要的意义。

Description

一种含有抗草甘膦基因的植物表达载体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及含有抗草甘膦基因的植物表达载体。

背景技术

草甘膦是一种非选择性除草剂，具有理化性质稳定、高效、广谱、低毒、低残留、易于被微生物分解，不破坏土壤环境等优点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的农药品种。自从1976年美国孟山都公司的草甘膦类除草剂-农达(Roundup)研制成功并得到广泛应用以来，作物抗草甘膦转基因研究成为抗除草剂基因工程研究的热点。随着抗草甘膦基因克隆的发展，抗草甘膦转基因作物也相继问世并大面积推广应用，这些转基因作物具有如下优点：(1)减少除草剂总用量，使杂草防治费用下降，增加农产品的经济效益；(2)所用除草剂品种广谱、选择性强、对环境友好、使用方便，特别适用于保水，减轻土壤侵蚀及石油耗量少的少耕与免耕体系，减少机械耕作作业，大大节省能源；(3)解决了常规除草剂难以防治的特殊杂草问题，如稻田的野生稻、赤稻、宽叶臂形草、圆叶牵牛、大果田菁；小麦田的雀麦(Bromus spp)、莎草(Cyperus spp)；大豆田的鸭趾草、蓟、苣荬菜、纯叶决明以及寄生杂草。(6)解决土壤长残留性除草剂对后茬作物的伤害。转基因作物所使用的草甘膦无土壤残留，故对后茬作物十分安全。

草甘膦的作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。该酶是真菌、细菌、藻类和高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键性的酶。草甘膦是磷酸稀醇式丙酮酸(PEP)的类似物，是EPSPS竞争性抑制剂，草甘膦、EPSPS和三磷酸莽草酸(S3P)结合形成EPSPS-S3P-草甘膦复合体(此复合体非常稳定)，抑制EPSPS的活性导致分支酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，最终导致一些激素和关键性代谢物如类黄酮、木质素和酚类化合物代谢失调，从而扰乱了生物体正常的氮代谢而使其死亡。

棉花是全球最重要的植物纤维作物，主要种植于热带或亚热带的干旱地区。草害严重威胁着棉花的品质和产量。除草剂的推广使用，可大幅度减少棉田管理用工，降低劳动强度。目前推广的棉花品种对除草剂不具有抗性，经常出现药害现象，对棉花植株造成一定的损伤，培育抗除草剂作物品种是防止除草剂药害最有效的途径。因此，本领域持续需要培育更多的防止除草剂药害的抗除草剂作物品种。

发明内容

本发明利用抗草甘膦基因mc2-epsps，构建含该基因的植物双价表达载体，并利用不同启动子驱动目的基因的表达。通过植物遗传转化，可以获得高抗草甘膦的转基因植物。更具体而言，本发明人将抗草甘膦基因mc2-epsps基因用不同启动子驱动，构建出双价植物表达载体。

因此，在第一方面中，本发明的目的是提供一种植物表达载体，所述植物表达载体是含有两个拷贝的抗草甘膦基因mc2-epsps的环形载体。优选地，所述两个拷贝的抗草甘膦基因相同。

在一个实施方案中，所述抗草甘膦基因mc2-epsps编码的蛋白质可以为下述a1)或a2)：

a1)氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示序列的蛋白质；

a2)氨基酸序列与a1)的蛋白质的氨基酸序列相比有一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、且具有草甘膦抗性的蛋白质。

在一个实施方案中，在本发明的植物表达载体中，所述抗草甘膦基因编码序列为序列表中SEQ ID NO.2所示序列。

在本发明的植物表达载体中，所述两个拷贝的抗草甘膦基因优选分别在两个表达盒中，所述第一表达盒中启动抗草甘膦基因转录的启动子可以为来自拟南芥激动蛋白基因(ActinⅡ)的启动子，所述启动子序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；所述第二表达盒中启动抗草甘膦基因转录的启动子可以为来自棉花1,5-二磷酸核酮糖羧化酶基因(Rubisco)启动子，所述启动子序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

在本发明的植物表达载体中，所述启动子和抗草甘膦基因之间优选还包括来自矮牵牛5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因(epsps)的叶绿体导肽，所述叶绿体导肽序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。

在本发明的植物表达载体中，终止所述两个抗草甘膦基因表达的终止序列可以均为NosT；优选地，NosT的序列如序列表中SEQ ID NO.6中所示的第235-504位；优选地，所述两个抗草甘膦基因在两个表达盒中。

在本发明的植物表达载体中，所述抗草甘膦基因和终止子之间优选还包括用来促进剪切的PS(Processing&Splicing sequence)序列；优选地，其序列如序列表中SEQ ID NO.6中的第1-228位。

在第二方面中，本发明的目的在于提供一种含有本发明第一方面的植物表达载体的重组细胞系或转基因微生物，以及用本发明第一方面的植物表达载体转化的植物细胞、组织或植株。在一个具体的实施方案中，所述重组细胞系或转基因微生物为农杆菌，例如菌株LBA4404。

在第三方面中，本发明的目的在于提供本发明第一方面的抗草甘膦表达载体或本发明第二方面的重组细胞系或转基因微生物在抗草甘膦植物品种中的应用。优选地，本发明还提供了一种培育耐草甘膦转基因植物的方法，所述方法包括如下步骤：

1)向目的植物中导入本发明第一方面的植物表达载体或本发明第二方 面的重组细胞系或转基因微生物，得到同时表达本发明的植物表达载体中两个拷贝抗草甘膦基因的转基因植物；

2)从步骤1)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，草甘膦抗性增强的转基植物。

在一个具体的实施方案中，所述植物为棉花。

发明人利用农杆菌介导法将本发明的双价植物表达载体遗传转化至棉花，在转基因植物中获得增量表达。发明人还对获得转基因棉花分别在T0和T1代进行不同强度的草甘膦筛选，大部分转基因植株未有明显的药害症状，生长正常，而阴性对照全部死亡。以上结果表明构建的双价抗草甘膦植物表达载体可赋予棉花较好的草甘膦抗性，获得草甘膦抗性更强的转基因植物，从而提供了一种获得抗草甘膦除草剂转基因植物的优选方案。

附图说明

图1是中间载体p3质粒图谱，图中Kanamycin为卡那霉素。

图2是中间载体p4质粒图谱，图中inner为内，outer为外。

图3是基础植物表达载体pBIOT1011质粒图谱。

图4是中间载体pBS-ACTII-MC2质粒图谱。

图5是中间载体pBS-RUBP-MC2质粒图谱。

图6是中间载体pBIOT-ACTII-MC2质粒图谱。图中，inner为内，outer为外。

图7是双价植物表达载体pBIOT-ACTII-MC2-RUBP-MC2质粒图谱。图中，inner为内，outer为外。

具体实施方式

实施例1双价mc2-epsps植物表达载体构建

植物表达载体的改造：以pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)为模板，扩增卡那霉素耐药基因(aadA)至质粒复制原点(pVS1ori)的序列,在5’端添加EcoRⅠ和PvuⅠ酶切位点，在3’端添加ScaⅠ和EcoRⅠ酶切位点，引物序列为SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8，扩增得到的片段命名为片段A。利用EcoRⅠ酶切片段A，自边环化得到载体p3。合成LB至RB端序列，为了提高遗传转化中阳性植株比例、降低转基因植物基因组中载体骨架DNA的发生率、增加低拷贝转化事件频率，对LB和RB端进行修饰，在其内部增加识别切割元件，中间加入两个删除标记loxP位点(SEQ ID NO：9)，使转基因后代通过与转环化重组酶基因(cre)的植株杂交，删除标记基因的表达框，序列两端分别含Pvu I，Sca I酶切位点，命名为片段B，具体序列如SEQ ID NO：10所示。通过Pvu I和Sca I酶切载体p3和片段B，将片段B连入载体p3(图1)中，获得重组质粒p4(图2)。以植物表达载体pBI121(购自北京华夏远洋科技有限公司)为模板，扩增NPTII基因表达框，引物序列为SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12，所得片段两端分别带BamH I和Xho I位点，命名为片段C。利用BamH I和Xho I酶切片段C，Bgl II和Sal I酶切p4质粒，将片段C连入p4质粒中，得到优化的基础植物表达载体pBIO1011(图3)。

抗草甘膦基因mc2-epsps基因(下文简称mc2)由从陆地棉冀棉14中克隆，经人为修饰获的，具休修饰方法参考专利：PCT/CN/2013/082238，201380008110.6。构建mc2基因的双价植物表达载体。为了增加mc2基因在植物体内的表达量，预防相同启动子可能引起的基因沉默问题，分别利用来自拟南芥的激动蛋白基因的启动子(ActⅡ)和来自棉花的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶基因的启动子(RUBP)驱动mc2基因的表达。因EPSPS是在叶绿体中催化芳香族氨基酸的合成，因此在mc2基因的5端融合来自矮牵牛epsps基因的叶绿体导肽序列(ptp)，ptp序列如SEQ ID NO：5所示。构建过程如下：参考 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide，编号为GenBank:CP002686.1中的序列，从拟南芥中克隆启动子ActⅡ，使其5端带Spe I酶切位点，3端带Pst I酶切位点，引物序列如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14所示。克隆矮牵牛的epsps基因的叶绿体导肽序列，使其5端带Pst I酶切位点，3端带Nco I酶切位点，引物序列为SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16所示。设计mc2基因的引物，使其5端带Nco I酶切位点，3端带Xho I酶切位点，引物序列为SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18。合成PS序列(Processing&Splicing sequence，序列已在专利号为95119563.8中的中国专利中公开)，序列如SEQ ID NO.6中的第1-228位所示，在其5端加Xho I位点，3端加Sac I位点。以pBI121为模板扩增得到Tnos序列，其5端加Sac I位点，3端加EcoR I位点，引物序列为SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20。通过酶切拼接的方法，将ActⅡ-ptp-mc2-PS-Tnos克隆至pBluescriptⅡSK(+)，获得重组质粒pBS-ActⅡ-MC2(图4)。

参考http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide，编号为GenBank:DQ648074的序列，从棉花中克隆RUBP启动子，使其5端加Kpn I位点，3端加Pst I位点，引物序列为SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21。同上所述，通过酶切拼接的方法，将RUBP-ptp-mc2-PS-Tnos克隆至pBluescriptⅡSK(+)，获得重组质粒pBS-RUBP-MC2(图5)。

利用KpnⅠ和HindⅢ同时酶切pBS-ActⅡ-MC2和pBIO1101，将ActⅡ-ptp-mc2-PS-Tnos片段连入pBIO1101中，得到重组载体pBIO-ActⅡ-MC2。利用Spe I和Kpn I同时酶切pBS-RUBP-MC2和pBIOT-ActⅡ-MC2(图6)，将RUBP-ptp-mc2-PS-Tnos片段连入载体pBIOT-ActⅡ-MC2中，得到mc2基因双价植物表达载体pBIOT-RUBP-MC2-ActinⅡ-MC2(图7)。

实施例2转双价mc2-epsps基因棉花的获得

这里使用的农杆菌介导法是本领域技术人员熟知的植物遗传转化方法。具体操作程序为：

1.菌株培养

将所构建的抗草甘膦基因植物表达载体通过电击转化到农杆菌菌株LBA4404中，农杆菌单菌落接种于含卡那霉素(kanamycin，km)50mg/L、利福平(rifampicin，rif)25mg/L的LB(胰蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，氯化 钠10g/L，琼脂粉15g/L)或YEB(牛肉浸膏5g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，MgSO₄5ml/L)液体培养基中。28℃振荡暗培养过夜到细菌生长对数期。用LB或YEB液体培养基稀释菌液，再振荡培养4-6h，将菌液稀释至OD₆₀₀值0.3-0.35。

2.无菌苗制备

(1)棉花种子用硫酸(H₂SO₄)脱去短绒，自来水洗掉种子表面的硫酸，晾干后用70％乙醇对种子进行表面消毒1min，再用10％-15％过氧化氢(H₂O₂)处理2-4h，用无菌水冲洗2-3次；

(2)在无菌水中浸泡18-24h，待种子露白，再在无菌条件下剥去种皮，种入种苗培养基(1/2MS+琼脂6g/L，pH6.8)中；MS培养基(18.78mM KNO₃，1.25mM KH₂PO₄，20.6mM NH₄NO₃，1.5mM MgSO₄，3.0mM CaCl₂，50μM KI，100μM H₃BO₃，100μM MnSO₄，30μM ZnSO₄，1μM Na₂MoO₄，0.1μM CoCl₂，100μM NaEDTA，100μM FeSO₄)。

(3)25℃-28℃光培养3-5d备用。

3.棉花外植体与农杆菌的共培养

取步骤2制备的无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5-0.6cm小段，浸入步骤1得到的稀释好的菌液中5-10min，然后取出胚轴段，用灭菌滤纸吸干多余的菌液，放在共培养培养基上(MS+2.4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+葡萄糖30g/L+乙酰丁香酮200mg/L+琼脂6g/L，pH5.0，表面铺一层灭菌滤纸)，用封口膜封口。22℃-25℃共培养2天。

4.诱导愈伤组织

将步骤3得到的经共培养后的下胚轴段放入愈伤组织诱导培养基中(MS+2,4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+MgCl2 0.91g/L+Gelrite 2.0g/L+Km50100mg/L+Cef 500mg/L+葡萄糖30g/L，pH5.8)，在常规条件下(25℃)培养2个月(一个月换一次相同的培养基)。

5.愈伤组织的增殖继代

将步骤4诱导出的抗性愈伤组织接入增殖培养基(MS培养基+MgCl₂0.91g/L+Gelrite 2.0g/L+葡萄糖30g/L,pH 5.8)中，在常规条件下(25℃)培养，每隔一个月继代一次，直到愈伤组织分化。在第一次和第二次转入增殖培养基后有部分愈伤组织褐化死亡，正常愈伤组织增殖也不快，第二次继代后，愈伤组织增殖速度才加快。

6.愈伤组织的分化及转基因苗移栽

愈伤组织经步骤5继代几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基中(无NH₄+、且KNO₃加倍的MS+谷氨酰胺1.0g/L+天门冬酰胺0.5g/L+MgCl₂0.91-1.35g/L+Gelrite 2.0-3.0g/L+葡萄糖20-30g/L,pH5.8)，进一步分化成胚状体，胚状体长成为小植株后再转入大的三角瓶中，待根长好后练苗移栽。洗去再生棉株根部的培养基，栽到灭菌蛭石中，浇足营养液。栽好的再生棉苗放入控温22℃、控湿80-85％的人工培养箱中5-7d，再在温室中培养10-20d，获得可嫁接抗性小苗。抗性植株经过PCR鉴定后嫁接并移栽，获得转基因棉花共279株。

实施例3T0代转基因棉花抗性鉴定

待实施例2中的转基因苗嫁接移栽成活后，于6-8叶期喷施3000ppm草甘膦溶液(草甘膦商品制剂农达：孟山都)，每平方米喷洒45ml(即30L/亩)，每次喷洒后7-14天观察症状，以非转基因受体材料冀棉14作为阴性对照。转双价mc2基因的转基因棉花有69个转化体表现抗草甘膦特性。抗性植株严格自交授粉，因组培操作、温室栽培条件等影响，部分抗性植株育性较差，收到52个株系的T1代自交种。

实施例4T1代转基因棉花抗性鉴定

于第二年正季在深圳龙岗生物园温室内播种实施例3得到的T1代自交种，分别在棉花的2-4叶期、8-10叶期于作物上方及周边喷施3000ppm草甘膦，用量及时期如表1所示，每次喷药时以20株受体材料冀棉14作为阴性对照，每次喷施后7-14天观察症状，并在花期对抗性植株进行育性观察。

表1 T1代转基因棉花草甘膦喷施时期及用量

每次喷施草甘膦异丙胺盐溶液后，阴性对照均表现叶片枯萎、嫩尖死亡，药害随着时间加重，后期均死亡。但转基因植株在喷施两次草甘膦异丙胺盐后，部分植株出现叶片萎蔫失绿等症状，在受试的1610株T1代阳性转基因材料中，有973株植株基本生长正常、无明显药害，对草甘膦表现较好的耐受性，抗性植株百分比平均值为60.48％。具体结果见表2。

表2.T1代转基因棉花抗草甘膦功能鉴定结果

转基因株系	试验植株数	抗性植株数	抗性植株百分比(％)
				1	35	26	74.29
2	41	25	60.98
				3	46	22	47.83
4	39	23	58.97
				5	38	19	50.00
6	37	17	45.95
				7	29	21	72.41
8	36	18	50.00
				9	35	16	45.71

10	35	24	68.57
				11	39	29	74.36
12	41	15	36.59
				13	49	25	51.02
14	31	17	54.84
				15	25	20	80.00
16	24	15	62.50
				17	37	9	24.32
18	40	28	70.00
				19	39	26	66.67
20	35	21	60.00
				21	34	17	50.00
22	29	18	62.07
				23	23	20	86.96
24	22	16	72.73
				25	34	21	61.76
26	39	20	51.28
				27	37	18	48.65
28	29	21	72.41
				29	12	6	50.00
30	19	10	52.63
				31	26	21	80.77
32	37	23	62.16
				33	29	15	51.72
34	36	27	75.00
				35	16	4	25.00
36	32	19	59.38
				37	25	17	68.00
38	12	3	25.00

39	19	15	78.95
				40	31	20	64.52
41	33	23	69.70
				42	37	26	70.27
43	39	28	71.79
				44	28	19	67.86
45	24	16	66.67
				46	29	23	79.31
47	11	5	45.45
				48	29	20	68.97
49	31	21	67.74
				50	38	17	44.74
51	23	19	82.61
				52	16	9	56.25
平均值	31	19	60.48
				冀棉14-1	30	0	0
冀棉14-2	30	0	0

序列：

SEQ ID NO：1：

Met Ala Cys Leu Pro Asp Asp Ser Gly Pro His Val Gly His Ser Thr Pro Pro Arg Leu Asp Gln Glu Pro Cys Thr His Met Ala Ser Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Asn Glu Ile Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Glu Asn Leu Leu Asn Ser Asp Asp Val His His Met Leu Val Ala Leu Gly Lys Leu Gly Leu Tyr Val Lys His Asp Ser Glu Lys Lys Gln Ala Ile Val Glu Gly Cys Gly Gly Gln Phe Pro Val Gly Lys Gly Glu Gly Gln Glu Ile Glu Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala Ile Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ser Ser Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Thr Gly Leu Lys Gln Leu Gly Ala Asp Val Asp Cys Ile Leu Gly Thr Asn Cys Pro Pro Val Arg Ile Glu Gly Lys Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Thr Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro Tyr Val Glu Met Thr Met Lys Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Thr Val Glu His Thr Asp Ser Trp Asp Arg Phe Phe Ile Arg Gly Gly Gln Lys Tyr Met Ser Pro Gly Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Val Thr Gly Gly Thr Val Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Ser Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Asn Ser Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Asn Ser Ser Gly Arg Lys His Leu Arg Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Tyr Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Ile Ala Ile Cys Thr Glu Leu Arg Lys Leu Gly Ala Thr Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys Val Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu Val Pro Val Thr Ile Lys Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro Asp Tyr Phe Glu Val Leu Asp Arg Val Thr Lys His

SEQ ID NO：2：

1 ATGGCTTGTC TTCCCGATGA CTCTGGACCT CATGTGGGTC ACTCCACTCC TCCACGCCTC

61 GATCAAGAAC CCTGCACCCA TATGGCTTCA GAGATTGTGC TTCAACCAAT TAATGAAATT

121 TCGGGTACTG TTAAGTTACC TGGGTCTAAA TCATTGTCTA ATCGGATCCT GCTCTTAGCT

181 GCTTTATCTG AGGGAACTAC TGTGGTTGAA AATTTGTTGA ACAGTGATGA TGTTCATCAC

241 ATGCTTGTTG CTTTGGGTAA ACTTGGTCTG TATGTGAAAC ATGATAGTGA AAAGAAACAA

301 GCCATTGTTG AAGGTTGTGG TGGTCAGTTT CCAGTCGGAA AAGGTGAAGG TCAAGAAATA

361 GAGCTTTTCC TCGGGAATGC TGGAATCGCA ATGCGATCTC TTACTGCCGC TATTACAGCT

421 GCCGGTGGCA ATTCGAGCTA CGTACTTGAT GGCGTACCCC GAATGAGAGA GAGG CCGATC

481 GGGGACTTAG TTACTGGTCT TAAGCAGCTC GGTGCTGATG TTGATTGCAT TCTTGGCACG

541 AATTGTCCCC CTGTTCGTAT AGAAGGAAAG GGTGGTCTTC CCGGGGGAAA GGTGAAACTC

601 TCTGGGTCTA TTAGTAGTCA ATACTTGACA GCTTTACTCA TGGCGGCTCC GTTGGCTCTT

661 GGGGATGTGG AAATTGAGAT AATTGATAAA CTTATTTCCA TCCCTTATGT GGAAATGACT

721 ATGAAGTTGA TGGAAAGGTT TGGGGTCACC GTGGAGCACA CTGATAGCTG GGATCGATTC

781 TTTATCCGAG GAGGTCAAAA GTATATGTCT CCTGGAAATG CTTATGTTGA AGGTGATGCT

841 TCGAGTGCCA GTTACTTCCT TGCGGGTGCA GCAGTCACGG GTGGGACTGT CACAGTAGAA

901 GGATGTGGAA CAAGTAGTTT ACAGGGTGAT GTAAAATTTG CCGAGGTTCT TGAGATGATG

961 GGTGCCAAAG TCACCTGGAC CGAGAATAGC GTAACTGTCA CCGGACCCCC AAGAAATTCC

1021 TCGGGGAGGA AACACTTGCG TGCTATTGAT GTCAACATGA ACAAAATGCC GGACGTTGCT

1081 ATGACTCTTG CTGTTGTTGC TCTTTACGCT GATGGTCCAA CTGCCATAAG AGATGTGGCA

1141 AGTTGGAGAG TGAAGGAGAC CGAAAGGATG ATTGCTATAT GCACAGAACT CCGGAAGCTC

1201 GGAGCAACAG TCGAAGAAGG GCCGGATTAT TGCGTGATCA CACCACCAGA GAAATTAAAC

1261 GTGACAGCAA TCGATACTTA TGATGATCAC CGAATGGCTA TGGCATTCTC TCTAGCCGCA

1321 TGCGCTGAGG TTCCAGTTAC CATCAAGGAT CCTGGTTGTA CCCGGAAAAC CTTCCCTGAT

1381 TACTTTGAAG TTCTCGATAG AGTTACGAAG CATTGACTCG AGGCTGAGTA

SEQ ID NO：3：

1 GTCGACAAAA TTTAGAACGA ACTTAATTAT GATCTCAAAT ACATTGATAC ATATCTCATC

61 TAGATCTAGG TTATCATTAT GTAAGAAAGT TTTGACGAAT ATGGCACGAC AAAATGGCTA

121 GACTCGATGT AATTGGTATC TCAACTCAAC ATTATACTTA TACCAAACAT TAGTTAGACA

181 AAATTTAAAC AACTATTTTT TATGTATGCA AGAGTCAGCA TATGTATAAT TGATTCAGAA

241 TCGTTTTGAC GAGTTCGGAT GTAGTAGTAG CCATTATTTA ATGTACATAC TAATCGTGAA

301 TAGTGAATAT GATGAAACAT TGTATCTTAT TGTATAAATA TCCATAAACA CATCATGAAA

361 GACACTTTCT TTCACGGTCT GAATTAATTA TGATACAATT CTAATAGAAA ACGAATTAAA

421 TTACGTTGAA TTGTATGAAA TCTAATTGAA CAAGCCAACC ACGACGACGA CTAACGTTGC

481 CTGGATTGAC TCGGTTTAAG TTAACCACTA AAAAAACGGA GCTGTCATGT AACACGCGGA

541 TCGAGCAGGT CACAGTCATG AAGCCATCAA AGCAAAAGAA CTAATCCAAG GGCTGAGATG

601 ATTAATTAGT TTAAAAATTA GTTAACACGA GGGAAAAGGC TGTCTGACAG CCAGGTCACG

661 TTATCTTTAC CTGTGGTCGA AATGATTCGT GTCTGTCGAT TTTAATTATT TTTTTGAAAG

721 GCCGAAAATA AAGTTGTAAG AGATAAACCC GCCTATATAA ATTCATATAT TTTCCTCTCC

781 GCTTTGAATT GTCTCGTTGT CCTCCTCACT TTCATCAGCC GTTTTGAATC TCCGGCGACT

841 TGACAGAGAA GAACAAGGAA GAAGACTAAG AGAGAAAGTA AGAGATAATC CAGGAGATTC

901 ATTCTCCGTT TTGAATCTTC CTCAATCTCA TCTTCTTCCG CTCTTTCTTT CCAAGGTAAT

961 AGGAACTTTC TGGATCTACT TTATTTGCTG GATCTCGATC TTGTTTTCTC AATTTCCTTG

1021 AGATCTGGAA TTCGTTTAAT TTGGATCTGT GAACCTCCAC TAAATCTTTT GGTTTTACTA

1081 GAATCGATCT AAGTTGACCG ATCAGTTAGC TCGATTATAG CTACCAGAAT TTGGCTTGAC

1141 CTTGATGGAG AGATCCATGT TCATGTTACC TGGGAAATGA TTTGTATATG TGAATTGAAA

1201 TCTGAACTGT TGAAGTTAGA TTGAATCTGA ACACTGTCAA TGTTAGATTG AATCTGAACA

1261 CTGTTTAAGG TTAGATGAAG TTTGTGTATA GATTCTTCGA AACTTTAGGA TTTGTAGTGT

1321 CGTACGTTGA ACAGAAAGCT ATTTCTGATT CAATCAGGGT TTATTTGACT GTATTGAACT

1381 CTTTTTGTGT GTTTGCAGCT CATAAAAA

SEQ ID NO：4：

1 cggtgataga aaaaggcaag gtttgttcat tgatcattgc agaagcacta ctcccacgat

61 cattttgttg ttgtatcctg ggagacagac gaccaacgtt tctccaagta ccctaggaac

121 tgccgaatcc atcttatgga aactgtgaaa acaggcctca acatctagta aaactcgatt

181 ccttattcga tttctgattt ttcaagatct tgtttattta attatttttc agatatgatg

241 ttttaaataa atataaatat ttatttaatt tgttttgttt agatctggtg tttttacatg

301 aatataaata tttgtttata ttatttgttc aagatcttgt atttaatata aatagttata

361 tttatattta ttcactaaag tattttatct aacatataac ttttcagtaa ttatcaaata

421 ttcattttct ttcaataatt catatcttca agattaaaag atttagttta gtattgttat

481 atttattgag tgtgtattaa tgttttgtac aggaatccgt tggattttgg tcttgtgtaa

541 attagctgtg gttgtgggta aataaatgtg tgcctttctt ctttctccaa acatactgaa

601 tataattatt ggcatttcaa gtgtggcata atataaaaaa atggttggct tcatcataat

661 ctgttttcca ggagactaac aggccacact ttgacctcca aatttagaaa atatttccag

721 agttggaaat tgtatttgta ataccctaat atttgtacac tgcagtgaac atggacaatc

781 atgtcatgat gcagaactat aaaattgtgc caactctcct tcttctcccc ctttttcttc

841 caaaactata tcctcgaaaa tggtgacatc aaacttcctt tcgtttatca aaggttcacc

901 cctcacatta ctgggtcctg ttcgcatctc aaggcaatca aacatggaat ccatatatat

961 gaatcttccc caatccttgt tgtagattct ttggggatac aagccttttt gtttgtattt

1021 aaatacaaaa aagggaaaaa gaaaagcgcc atctataact gcatgctaat gattgccaaa

1081 atcactgttt gttttgttgg aaggctttca atgttgcggg gtcttgaagt aagagcctgt

1141 ttcagtaact tgccattaat tctctcatac attccaatcc taaaaaatgc ttccatcttt

1201 tagctgcaac agtttataat catcagaaag gtctagtcag aataatatta ccttctcctt

1261 tttaacagtt tttttttttt taaatcatgc cactacaact gtagctgcgc tcatgttaac

1321 aattaattcc tataatcgac atcaaaatta tatgaaagaa ttaacacttg gttaccgagt

1381 taccatattt gaagataagg cgaaaggtaa aaacacaaaa ggcaagcatg accaagcaaa

1441 caaggtatgg acatagattt tttttgaatc gggaatggcc aaatgggacc gtgaagaggg

1501 gacaaaggag aaatcaggca ttcacggttt ccattggatg aaatgagata agatcactgt

1561 gcttcttcca cgtggcaggt tgccaaagat aaggctttac cattcaagaa aagtttccac

1621 cctctttgtg gtcataatgg ttgtaatgtc atctgattta ggatccaacg gtcacccttt

1681 ctcccaaacc aatctctaaa tgttgtgagc ttaggccaaa ttttatgact atatataggg

1741 gattgcacca aggcagtgac actattaagg gatcagtgag actcttttgt ataactgtag

1801 catatagtac tagtaagcag taatagca

SEQ ID NO：5：

ATGGCACAAATTAACAACATGGCTCAAGGGATACAAACCCTTAATCCCAATTCCAATTTCCATAAACCCCAAGTTCCTAAATCTTCAAGTTTCCTTGTTTTCGGATCTAAGAAGCTGAAAAATTCAGCAAATTCTATGTTGGTTTTGAAGAAAGATTCAATTTTCATGCAAAAGTTTTGTTCCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGGCTACAGCATGT

SEQ ID NO：6：

1 GCTGAGTGGTTAACTT TGAGTATTAT GGCATTGGAA AAGCCATTGT TCTGCTTGTA

61 ATTTACTGTG TTCTTTCAGT TTTTGTTTTC GGAAATAAAG TTAACAAAAA AAAAAAAAAA

121 AAAAAAAAAA TTTAACAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA ATTTAACAAA AAAAAAAAAA

181 AAAAAAAAAA ATTTAACAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AATTTAAAGA GCTCGAATTT

241 CCCCGATCGT TCAAACATTT GGCAATAAAG TTTCTTAAAA TTGAATCCTG TTGCCGGTCT

301 TGCGATGATT ATCATATAAT TTCTGTTGAA TTACGTTAAG CATGTAATAA TTAACATGTA

361 ATGCATGACG TTATTTATGA GATGGGTTTT TATGATTAGA GTCCCGCAAT TATACATTTA

421 ATACGCGATA GAAAACAAAA TATAGCGCGC AAACTAGGAT AAATTATCGC GCGCGGTGTC

481 ATCTATGTTA CTAGATCGGG AATTCGAT

SEQ ID NO：7：

CTTAgaatccCCGTACTAGagtactTTACGCGACAGGCTGCCGCC

SEQ ID NO：8：CTTAgaatccCCGTACTAGcgatcgATACTATGTTATACGCC

SEQ ID NO：9：ATAACTTCGTATAG CATACATTATACGAAGTTAT

SEQ ID NO：10：

1 TGATCACAGG CAGCAACGCT CTGTCATCGT TACAATCAAC ATGCTACCCT CCGCGAGATC

61 ATCCGTGTTT CAAACCCGGC AGCTTAGTTG CCGTTCTTCC GAATAGCATC GGTAACATGA

121 GCAAAGTCTG CCGCCTTACA ACGGCTCTCC CGCTGACGCC GTCCCGGACT GATGGGCTGC

181 CTGTATCGAG TGGTGATTTT GTGCCGAGCT GCCGGTCGGG GAGCTGTTGG CTGGCTGGTG

241 GCAGGATATA TTGTGGTGTA AACGGAGCTG TTGGCTGGCT GGTGGCAGGA TATATTGTGG

301 TGTAAACGGA GCTGTTGGCT GGCTGGTGGC AGGATATATT GTGGTGTAAA CAAATTGACG

361 CTTAGACAAC TTAATAACAC ATTGCGGACG TTTTTAATGT ACTGAATTGT TAACATAACT

421 TCGTATAGCA TACATTATAC GAAGTTATGT CGACGGTACC TTACAGATCT ATAACTTCGT

481 ATAGCATACA TTATACGAAG TTATGTTAAC AAGCTTGATA TCGAATTCCC CGGGGGATCC

541 TCTAGAGCGG CCGGTACCCT CGAGACTAGT GATCAGATTG TCGTTTCCCG CCTTCAGTTT

601 AAACTATCAG TGTTTGACAG GATATATTGG CGGGTAAACC TAAGAGAATA AGTCGCTGTA

661 TGTGTTTGTT TGTAAGTCGC TGTATGTGTT TGTTTGTAAG TCGCTGTATG TGTTTGTTTG

721 TAAGTCGCTG TATGTGTTTG TTTGAAGAGC GTTTATTAGA ATAACGGATA TTTAAAAGGG

781 CGTGAAAA

SEQ ID NO：11：CCTACTCGAGCACCAGAACC ACCACCAGAG

SEQ ID NO：12：TAGTGGATCCTCATGAGCGG AGAATTAAGG

SEQ ID NO：13：GGACTAGTCG GTGATAGAAA AAGGC

SEQ ID NO：14：CAAGTAAGCA GTAATAGCAA CAATGG

SEQ ID NO：15：GACTGCAGGG CACAAATTAA CAACA

SEQ ID NO：16：AGCCATGGAA CATGCTGTAG CCACTG

SEQ ID NO：17：TTCCATGGCT TGTCTTCCCG ATGAC

SEQ ID NO：18：GCCTCGAGTC AATGCTTCGT AACTC

SEQ ID NO：19：TAGAGCTCGA ATTTCCCCGA TCGTTC

SEQ ID NO：20：TCGAATTCCC GATCTAGTAA CAT

SEQ ID NO：21：CAGGTACCGG TGATAGAAAA AGGCA

SEQ ID NO：22：ACCTGCAGTG CTATTACTGC TTACTAG 。

Claims (10)

1.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体为含两个拷贝的抗草甘膦基因的环形载体，所述抗草甘膦基因编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示序列的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述抗草甘膦基因编码序列为序列表中SEQ ID NO.2所示的序列。

3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：

所述两个拷贝的抗草甘膦基因分别在两个表达盒中，

所述第一表达盒中启动抗草甘膦基因转录的启动子为来自拟南芥激动蛋白基因的启动子，所述启动子序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，所述第二表达盒中启动抗草甘膦基因转录的启动子为来自棉花1,5-二磷酸核酮糖羧化酶基因启动子，所述启动子序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；

所述启动子和抗草甘膦基因之间包括来自矮牵牛5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的叶绿体导肽，所述叶绿体导肽序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：

对于所述两个抗草甘膦基因，终止抗草甘膦基因转录的终止序列均为NosT，其序列如序列表中SEQ ID NO.6中所示的第235-504位；

所述抗草甘膦基因和终止子之间还包括来促进剪切的PS序列，其序列如序列表中SEQ ID NO.6中的第1-228位。

5.含有权利要求1-4任一项所述的表达载体的重组细胞系或转基因微生物。

6.权利要求5的重组细胞系或转基因微生物，所述重组细胞系或转基因微生物为农杆菌，例如菌株LBA4404。

7.权利要求1-4中任一项所述的表达载体或权利要求5或6所述的重组细胞系或转基因微生物在培育耐草甘膦转基因植物中的应用。

8.权利要求7的应用，其中所述耐草甘膦转基因植物为棉花。

9.一种培育耐草甘膦转基因植物的方法，所述方法包括如下步骤：

1)向目的植物中导入权利要求1-4任一项所述的表达载体或权利要求5或6所述的重组细胞系或转基因微生物，得到同时表达权利要求1-4任一项所述两个拷贝抗草甘膦基因的转基因植物；

2)从步骤1)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，草甘膦抗性增强的转基植物。

10.权利要求9的方法，其中所述植物为棉花。