CN116023452A - 水稻基因OsROHAN在提高植物耐铵毒和氮素利用效率中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及水稻基因OsROHAN在提高植物耐铵毒和氮素利用效率中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述基因序列是通过PCR技术从水稻中克隆获得。实验证实利用本发明的基因OsROHAN构建植物过表达载体，进行植物转基因操作获得的转基因植物对铵毒的耐受得到显著提高，并且显著提高水稻氮素利用效率和产量，预示本发明的基因OsROHAN的实施将能创造新型耐铵毒和氮高效植物，可以为后续的作物品种改良提供候选基因，对我国农业生产具有重大意义。

Description

水稻基因OsROHAN在提高植物耐铵毒和氮素利用效率中的应用

技术领域

本发明涉及水稻基因OsROHAN在提高植物耐铵毒和氮素利用效率中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

随着世界人口的基数还在不断的增加，对粮食的需求会越来越大。水稻作为主要的粮食作物之一，如何提高它的产量，减少化学肥料的施用(肥料施用过多造成环境的污染，土壤环境发生改变)，一直以来是科学家们努力解决的技术难题。

氮素作为植物必需和最感缺乏的大量营养元素之一，是植物蛋白质合成所必须的氨基酸、DNA/RNA合成所必须的核酸、叶绿素以及植物生长所必须的其他天然化合物的重要组成部分。因此，作物对氮素的高效感应、吸收和利用对其发育、生长和产量具有决定作用(Xu et al.，2012)。在过去的几十年中，为了克服氮肥利用率低并提高作物产量，无机氮肥被大量施用于农田，造成土壤酸化，水体严重富营养化，温室气体排放超标等一系列生态环境问题；同时，氮肥的过量施加也会对作物的生长造成负作用，如贪青晚熟、植株倒伏、品质下降、高铵毒害和抑制根系生长等。因此，减少农田氮肥的施用具有社会、经济和生态意义。揭示作物对土壤氮素供应状况的响应机制，挖掘调控氮素吸收和利用的关键基因，提高作物的氮素吸收和利用效率，培育氮素高效的农作物新品种，是在有限的肥水等资源投入条件下保证作物的高产、稳定和优质的重要生物学途径之一，是实现现代农业的绿色可持续性发展的必然需求。

如今，植物的耐铵毒基因及其应用研究在重要的粮食作物水稻中的发现很少。研究水稻耐铵毒对提高高铵胁迫土壤稻谷产量和品质具有重要的作用。而水稻响应氮素基因的发掘也成为目前水稻遗传资源与品种改良研究的热点。因此，从水稻中克隆并鉴定具有耐铵毒功能植物基因，明确这些基因发挥耐性的作用机制，从科学层面上有助于加深理解植物对氮响应的分子机理，丰富植物响应氮基因资源；从应用层面上，这些挖掘的新的耐铵毒基因将被用到水稻等作物新品种培育中，有助于通过遗传手段改良水稻，提高水稻的抗逆能力。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种水稻耐铵毒相关的基因OsROHAN及其在提高植物耐铵毒中的应用，利用基因工程手段挖掘植物自身的抗铵毒能力，为解决酸性土壤中铵毒害和使农业生产可持续发展提供了有效策略。

本发明一方面提供了一种耐铵毒的基因，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示:

ATGGCCGCCGCCACCTCCCAATCCTTCCTCTCGCCGGCGCCCAACCCCCTTCTCCGCCCGAGGATCCTCCCCTTCCCCGCCGGCGGGTCCGTGTCCCTCCGCGGCCGCCGCCCCGCCTTCCCGTCCGTCGCCGCGGCGTCCACATCGATGGCGTCCTCGGAGAGCGAGGAGAGGAAGGAGACCAAGCTGTGGGGCGGGCGATTCGAGGAGGGCGTCACCGACGCCGTGGAAGGGTTCACCGAGTCCATCTCCTACGACTGGCAGCTCTACAAGTACGACATCATGGGCAGCAAGGCCCACGCATCCATGCTCGCCGCGCAGGTACTGTGTGCGCGCGCCTCCACCGTGCCCATCTGCTTCGTTGTCTCTGTTGGTGGTGGTGGTAGTGCGATCCACCTAGGTGTTCGGCTAATCATGCCTGCGCTGGAGAGCTGCGGCTAAGCCGTTTTGGGGAGTTTTAGTCTGGGGTTAATCCGCTGCTAATGCGCTCGCCATGTGTTCGATGAAATTGCTAGCTCCACTGTAATGCTTGAGATGTGTCTGCAAGTTTCTAAATCTAACTTTCTTAGTTCTTAGTGTTTCATCAAAGGGTTTAGAGTTTGTCAGTATGTTAATCAGATGCTTGATGAAACACCTGCCTCTAATTCTTTTTTTGCACTTTGTAGATGCTAATTGTACCAATGTGCTGTCGACCTTGATTCACATTGGGGAATCATTTGCAATGCAGGGTTTGATAACGGCTGGCGATAAGGACATCATCTTAGAGGGGCTTGATCAAATAGAGAAGCTGATTCAGGATGGAAAATTTGAGTGGCGGACAGACCGGGAGGATGTCCATATGAATATTGAGGCAGCTCTGATCGAAAAGGTTGGTGAACCAGCCAAGAAACTGCATACTGCTAGGAGCCGCAATGACCAAATCGTGACGGATCTCCGCCTGTGGTGCCGTGATGCTATTGACAAGATTTTGTTCCGCATCAAACAGTTTCAGGTTTGTTTCTGAATTTACTTTGTAGTGACCATAGTTCACTGTTTGTAATTTTTTGCATGTTTGTTGTGCATGGGTTATTTCTTGCTGGTGCAATACTATTCTTTCTGCTTGATCAACACTTGATGAAAATTATCAACACATAGTGAAAATTATGGATTCTTACTGCATGAACCATTTATAAAACTTTTTGGTCATGGTATACCTAAGCAATCATTCAGGTAAACTAGCTAAGTTGAAAGCTTTAAGTGTTGATTCTACTGTAGTGCTGAGTCTGGGGCAATGGTTTCTGAAGAGAACCAGAGCATATGCTTCCTTTCTTTCACTATCTAAAGGCTGGAGCAAGAGACTAGATTGACATATCCTAAGTTTTGCCTCAAGCCTTCAAGGAAATATGGTTGACTTACTATACTAGAAAATTATCTAATAGCCATGCTGCTGGCATCCATACTGAACGACTTCTTAAGCACTTCCAGATGCAAACTTTTTTTTGATTAAGCAGTTCTTGATGTGCAGAAATGCCTCACTATTATGTATAACATGAAATATGGTTGATTATTGCAACTCCATTTTGTAAATATTAACACTGGTTTCTCTCTCTCTCTTTTTTTCTGATAAAAGTCTAAATTGGATGTTTTTCACTTTTCTAACACCACTTTACATTATTTCAGGTGTCTCTTGTTCTGTTAGCTTCAAAATATGTTGACTTAATAGTTCCTGGTTACACTCACCTGCAAAGGGCACAGCCTGTTTTGCTTCCACATCTCCTCTTATCATATGTTGAACAGGTGAATTTTCTTATGCACCCTTCCCTGATACCGTTCATGCCCATTGGGTTTTTTAATGTTAGTTTTCTTGGTGTAATCCAGGGATTGTCAATGCGTGTCAAATGTCAATCCCATGCAGTTTTTTTAGACTTATTTCCTATGATTACATATGTTGGTTATTGTGTTAACAAACCTGAATGGTTGAATCCTCTCTCCACTATGTATGTTAATCAAATAATCTACTTTATCCCAAGTTCTGATCAAAAGATGATTTGGACAATTTATGTGGTGAATCTCTCTCTTTTTTTTTGTGAAATAGAAAAATGATGCCTCTTATGTAGATAAAATGAACATTTTGTGCCAAAACATTCAACTCCTTAATTTATGTGGTGAATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTGTTCGTTCCACCAATGCCAGTACAATGCCAAAATTTACATGATTTTCAGGCTTGCCTCTACTCGCCAATGCTGATATATCAACGGTCTATATACTGTTCACAAAAAAGTTATTAAATCTGGAATATAAAGAAACTGCAGTACATGTTTGTGTTACTTAAGCTACAATCTCCTTTGTTTAATAAACTTCAGCAACTCCAGCTTTATTTGTTGAATTAGCTGGCATATCATGCCAGTATGACACAATGAGTAGCCTATAGACAAGTACTTCCTGTATTCCCTGTGCGGGGATATAATAGTGCTTCAAACACTACATGATCTGATAAAGCTTACTTCTTTGAGAACAAGCCATCAATGAACTTGACCGCTTATTTATGTACTTTGCACAGTTGGAGCGTGATGCTGGACGGCTGGTCAACTGCAGGGAACGGTTGAATTTCTGTCCTCTTGGTGCTTGTGCTTTGGCTGGTACTGGACTTCCTATCGATAGGTTCAAAACTGCTAAAGATTTGAAGTTTACAGCTCCAATGAAGAACAGGTAAATTCCCCAGTTTGTTTTAGTACTGTGAACTTTAAAAAGTTTCAGTCACATTGCATGATTTCTATGGTATTTTAGTAGTTTGACCTATATCACCTATGTCAAAGTTAACACACAGCAAATACTTGCTCTTCATTTCTGCTCAAATAAGTAATCTCTGCTCAAATAAGTATGTCTTCTCACATAGCACATGTGTAGATGAATTACCTATTTTCTCCGCTGGAATCTCCACTGTGATTTGTCATGTATGCTATGCCTTTGTAAAGCAAACTCTGAAACATAATTTTTGGCTTTCCTCTTTGTTGGTTACCTCACTTTTGACATATGATAAGCCCTTCCTCACTTAATCTGGAAACTTTTCCTTGTACAGTATTGATGCAGTATCAGACCGCGACTTTGTATTGGAATTTCTTGCTGCCAATTCAATTGCTGCTGTTCATCTTTCACGAATTGGTGAAGAGTGGGTCTTATGGGCATCAGAGGAGTTTGGATTCCTCACACCAAGTGACTCTGTTTCAACTGGAAGCAGCATTATGCCACAGAAGAAAAATCCAGATCCAATGGAGCTTGTTCGTGGCAAATCTGCTCGTGTTTTTGGAGATCTCATGACTGTCCTCACCCTTTGTAAAGGACTTCCGCAGGCCTACAACCGTGATTTACAGGTGATTATCCTTCGTACAAGTTATTCATGCTGATGTTATGTCATTGCATGCTCTCAATATTTCGTTTTGAGCAGGAAGACAAGGAACCCTTGTTTGACAGCGTGAAGGCTGTATTAGGAATGCTTGAAGTATGTACCGAGTTTGCTCAAAATATCTCCTTCAACTCAAAAAGAATACAAAGTTCGCTGCCTGCTGGCTATTTGGATGCAACAACACTAGCAGATTATCTTGTGAAGAAGGTAAGCTTCTCCCATAGCTTGTAAAGTTCATTTACAACCCAAACTATCTGAAAGTCTATAAATCAACTCTGAACTACATCAAAACCTATTTTTGTAACCTCAGTAAAAAAAAATTATTGTTCGTTCAAAACACACACACACACACACATTCACACACACACTAGGGCTCACCGCTCACGTTCTCCTTAATCTTATAATAGGTGCTATGCTGTTGTACTACAATCAGATTATTTATTCTAGTTTATTTATTTGCTTTTCAGGGCGTGCCGTTCAGAACCTCGCACGAGATAGTTGGAAGGTCTGTAGCTCTATGCGTCTCGAAGAACTGTCAGCTCGCCGAACTTGGACTAGACGACCTGAAATCTGTTCACCCCGTTTTTGAGGGCGATGTGTACGAGTATCTGGGAGTGGAGAACGCCGTAAACAAGTTCATATCTTACGGCTCTACAGGCTCGGAGCAAGTAAAAAAACAGCTCGAGGATTGGCGCACTCAGCTTGGCATTAGTTCATAA

本发明还提供了由上述基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示:

MAAATSQSFLSPAPNPLLRPRILPFPAGGSVSLRGRRPAFPSVAAASTSMASSESEERKETKLWGGRFEEGVTDAVEGFTESISYDWQLYKYDIMGSKAHASMLAAQGLITAGDKDIILEGLDQIEKLIQDGKFEWRTDREDVHMNIEAALIEKVGEPAKKLHTARSRNDQIVTDLRLWCRDAIDKILFRIKQFQVSLVLLASKYVDLIVPGYTHLQRAQPVLLPHLLLSYVEQLERDAGRLVNCRERLNFCPLGACALAGTGLPIDRFKTAKDLKFTAPMKNSIDAVSDRDFVLEFLAANSIAAVHLSRIGEEWVLWASEEFGFLTPSDSVSTGSSIMPQKKNPDPMELVRGKSARVFGDLMTVLTLCKGLPQAYNRDLQEDKEPLFDSVKAVLGMLEVCTEFAQNISFNSKRIQSSLPAGYLDATTLADYLVKKGVPFRTSHEIVGRSVALCVSKNCQLAELGLDDLKSVHPVFEGDVYEYLGVENAVNKFISYGSTGSEQVKKQLEDWRTQLGISS。

本发明提供水稻基因OsROHAN在提高植物耐铵毒和氮素利用效率中的应用，所述水稻基因OsROHAN的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述水稻基因OsROHAN编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，所述植物为禾本科植物。

本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明在另一方面提供了一种对铵态氮敏感的突变体，该突变体具有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因。

本发明还提供了上述突变体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、制备突变体库；

步骤2、将所述突变体库中的每个单株取数颗发芽；

步骤3、在铵态氮溶液中处理，观察根生长抑制情况，挑选出候选的植株繁种；

步骤4、候选突变体种子收获后，通过测量比较铵态氮溶液处理前后的相对根伸长情况，挑选出对铵态氮敏感突变体。

优选地，上述步骤1中，制备突变体库地具体方法为：武运粳7号野生型种子，清水浸泡8h后用1％甲基磺酸乙酯浸泡16h，期间搅拌，洗净后将所述种子播种，收获M2代种子。

优选地，上述步骤3中，在2.5mM硫酸铵溶液中处理6天。

本发明在又一方面提供了一种培育耐铵毒植物的方法，该方法包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列OsROHAN过量表达导入目的植物。

优选地，过量表达OsROHAN的方法包括以下步骤：

步骤1、在OsROHAN基因上设计引物序列；

步骤2、采用Gateway连接方法，导入到表达载体里面；

步骤3、将测序正确的质粒转化农杆菌；

步骤4、将培养后的所述农杆菌用感菌液制成菌浮液；

步骤5、用所述菌浮液侵染所述目的植物的愈伤组织，并置于共培养基上进行暗培养；

步骤6、在选择培养基上对所述愈伤组织进行筛选，并在分化培养基上培养至分化成苗。

优选地，扩增引物序列如SEQ ID NO:3～6所示。

更为优选地，步骤4中，用含200μM乙酰丁香酮的AAM感菌液制备所述菌浮液。

更为优选地，步骤5中，侵染时间5-10min。

更为优选地，步骤5中，暗培养在25℃下进行2.5天。

更为优选地，步骤6中，选择培养基含头孢拉定和潮霉素，并进行3轮筛选。

优选地，上述方法中目的植物为禾本科植物。

更为优选地，上述目的植物为水稻。

更为优选地，上述目的植物为粳稻和/或籼稻。

本发明还提供了上述耐铵毒的基因在提高植物耐铵毒能力中的应用。

优选地，上述植物为禾本科植物。

更为优选地，上述禾本科植物是水稻、玉米、小麦、高粱或燕麦。此外还包括的植物是大豆和藜麦。

有益效果

本发明从水稻中克隆鉴定了一段与耐铵毒相关的基因序列，命名为水稻耐铵毒基因OsROHAN，同时证明了该基因序列能够增强植物对铵毒的耐受力，并提高植株的氮素利用效率和产量。经过检索，有关水稻耐铵毒基因OsROHAN在提高植物耐铵毒和氮素利用效率的应用未见报道。本发明培育出来的耐铵毒水稻在10mM硫酸铵处理下相对根长相对于江苏省主栽品种武运粳7号提升了23％，且产量在350kg/ha氮肥施用的田块中提升了16％。本发明利用基因工程手段挖掘植物自身的抗铵毒能力，为解决酸性土壤中铵毒害和使农业生产可持续发展提供了有效策略。

附图说明

图1a示出了本发明较优实施例中在缺铵盐和加铵盐的情况下野生型和突变体(rohan)的根系长度的变化表型；图1b示出了在图1a中的表型的种子根长度的统计结果；图1c示出了不同铵态氮浓度下野生型和突变体(rohan)的根系对铵毒的反应情况；

图2a示出了本发明较优实施例中过表达载体相关信息；图2b示出了本发明较优实施例中回补载体相关信息。

图3a示出了本发明较优实施例中野生型、突变体(rohan)和两个独立回补株系(C1、C2)的供铵条件下的根的表型图，图3b示出了图3a中根生长的相对长度统计结果。

图4a示出了本发明较优实例中OsROHAN基因的相对表达量受到铵盐处理下的诱导。图4b示出了OsROHAN亚细胞定位在植物的质体中。

图5a示出了本发明较优实施例中缺氮和高铵下的野生型和两个独立过表达株系(OE-1、OE-2)根的表型图，图5b示出了不同铵浓度下野生型和两个独立过表达株系(OE-1、OE-2)根生长的相对长度统计结果，图5c示出了野生型和两个独立过表达株系(OE-1、OE-2)OsROHAN的相对表达量结果。

图6a示出了本发明较优实施例中在三个不同施肥浓度下的田间农艺性状，不同施肥浓度分别是75kg/公顷的尿素、150kg/公顷的尿素和350kg/公顷的尿素下的野生型和过表达株系(OE-1)的田间表型，和单株收获种子的表型。图6b示出了在不同施肥浓度下的野生型和过表达株系(OE-1)单株分蘖数目的统计结果，图6c示出了在不同施肥浓度下的野生型和过表达株系(OE-1)单株产量，图6d示出了在不同施肥浓度下的野生型和过表达株系(OE-1)氮素利用效率。图6e示出了在不同施肥浓度下的野生型和过表达株系(OE-1)收获种子中蛋白的含量。

具体实施方式

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因此这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制的，本发明的范围将由所附的权利要求书限制。

实施例1

铵态氮敏感突变体的制备

在本实施例中，以模式作物水稻为研究对象，根据以下方法制备对铵态氮敏感的突变体。

取约2.5kg武运粳7号野生型种子，清水浸泡8h，然后用1％甲基磺酸乙酯溶液浸泡16h，期间多次搅拌，洗净后将种子播种，收获M1代种子，即获得突变体库

突变体库中每一个小库取100粒种子发芽，在2.5mM硫酸铵溶液中处理6天，观察根生长抑制情况，挑选出获选的植株繁种；候选突变体种子收获后，通过测量比较硫酸铵溶液处理前后的相对伸长情况，挑选出对铵态氮敏感突变体rohan。并再次繁种一代，测量比较铵盐处理前后的相对根伸长确认其对铵的敏感能力。

表1水稻营养液组成(木村氏培养液)

水稻营养液配方

将各组分溶于水配制水稻营养液母液，使用时用水稀释为终浓度。

铵态氮敏感突变体的鉴定

为了定位rohan突变体的突变基因，构建了与野生型武运粳7号的回交群体。利用回交群体F2代BSA建库高通量测序结果，精确定位到了突变基因ROHAN，并利用转基因回补确认了基因定位的结果。我们构建了候选基因的自身启动子驱动的包含全部编码区的回复载体，其中其扩增的引物分别如下。

基因启动子上游引物：

GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGCGCCAGCCTACGACGCCACGAA(SEQ ID NO:3)

基因启动子下游引物：

GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGCAGTATCGTCGCCGAGGGTG(SEQ ID NO:4)

基因上游引物：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATATGGCCGCCGCCACCTCCCA(SEQ ID NO:5)

基因下游引物：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTATGAACTAATGCCAAGCT(SEQ ID NO:6)

将回复载体转化突变株rohan诱导的愈伤。转化方法与转化株鉴定同实施例2。图3a和图3b显示出野生型(WT)、突变体(rohan)和两个独立回补株系(C1，C2)的相对根伸长，结果表明两个独立回补株系(C1，C2)的相对根伸长都恢复到了野生型水平，没有表现出更强的对铵态氮敏感的能力，确认了基因定位的结果。

实施例2

OsROHAN过表达载体构建和rohan突变体回补载体构建及导入水稻

在OsROHAN基因组DNA序列上设计基因的扩增引物为：

上游引物：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATATGGCCGCCGCCACCTCCCA(SEQ ID NO:3)

下游引物：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTATGAACTAATGCCAAGCT(SEQ ID NO:4)

在OsROHAN基因组DNA的启动序列约2000bp上设计启动子的扩增引物为：

上游引物：GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGCGCCAGCCTACGACGCCACGAA(SEQ ID NO:5)

下游引物：GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGCAGTATCGTCGCCGAGGGTG(SEQ ID NO:6)

采用如图所示的Gateway连接方法，导入到过表达载体中和回补的表达载体中(图2a和图2b)。

将OsROHAN过表达载体和回补载体导入水稻植株及阳性转化株鉴定

使用农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化法转化，具体过程如下：

1.水稻转基因过程用到的培养基及溶液的配方见下表。

表2水稻组培培养基母液配方

表3粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基

粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基(1L用量)

表4粳稻成熟胚愈伤组织继代培养基

粳稻成熟胚愈伤组织继代培养基(1L用量)

表5粳稻共培养培养基

粳稻共培养培养基(1L用量)

表6愈伤选择培养基

愈伤选择培养基(1L用量)

表7粳稻分化培养基

粳稻分化培养基(1L用量)

表8粳稻生根培养基

粳稻生根培养基(1L用量)

表9悬浮农杆菌侵染愈伤组织的培养基

悬浮农杆菌侵染愈伤组织的培养基(1L用量)

2.水稻成熟愈伤组织的准备：

野生型武运粳7号水稻成熟种子脱壳后，挑选饱满光洁无菌斑的种子放入到烧杯中，用70％酒精消毒2min；倒去酒精，加入30％(v/v)次氯酸钠水溶液消毒30min；倒去次氯酸钠水溶液，用无菌水清洗5遍，最后一遍在无菌水中浸泡30min；倒去无菌水，将种子放在无菌滤纸上吸干，获得预处理后水稻种子。将预处理后水稻种子平放于粳稻成熟胚诱导培养基中，28℃暗培养10天左右；超净工作台上打开培养皿，用无菌镊子将芽和胚乳去掉，留下胚性愈伤组织(淡黄色，致密不规则)，移入粳稻继代培养基中，28℃暗培养5-10天，获得水稻成熟胚愈伤组织。

3.农杆菌的培养：

将OsROHAN基因的回复载体或者过表达的载体使用冻融法转化农杆菌(Agrobacterium)EHA105感受态细胞，具体方法是：取构建好的上述质粒2μL加入100μL农杆菌感受态细胞中。混匀后冰上放置1 5min，放入液氮90s，37℃放置5min，冰上5min后加入800μL无抗生素的YEP液体培养基在28℃摇2h。取200μL菌液涂在具有50mg/L壮观霉素(Spec)和50mg/L链霉素(Str)的YEP固体培养液上。生长2d后，挑取EHA105单克隆菌斑于5ml含50mg/L壮观霉素(Spec)和50mg/L链霉素(Str)抗性的YEP液体培养基中，28℃，250rpm摇床振荡培养过夜，至菌液OD600在2.0左右；从上述菌液中吸取500μL于30ml含50mg/L壮观霉素(Spec)和50mg/L链霉素(Str)抗性的YEP液体培养基中，28℃，250rpm在摇床上振荡培养14h至菌液OD600＝1.0，获得农杆菌菌液。所述YEP液体培养基组成：酵母提取物(YeastExtract)10g/L、蛋白胨(Tryptone powder)10g/L、NaCl 5g/L、溶剂为水，pH 7.0。所述YEP固体培养基是在YEP液体培养基中添加15g/L琼脂。

4.共培养及抗性愈伤的筛选：

取步骤3培养好的农杆菌菌液15ml置于50ml离心管中，4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体；用含200μmol/L的乙酰丁香酮(As)的AAM感菌液30ml制成农杆菌悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.6。

将步骤2水稻成熟胚愈伤组织挑出，切割成粒状，放入农杆菌悬浮液中，28℃振荡培养30min；将愈伤组织小心取出，置于无菌的滤纸上沥干30min；然后将愈伤组织置于放有一层灭菌滤纸的含200μmol/L的乙酰丁香酮(As)的粳(籼)稻共培养基上；25℃暗培养2.5天后，将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，期间需不停的振荡；再用含250mg/L羧苄青霉素钠的无菌水清洗1-2遍；最后置于无菌滤纸上沥干2h；将晾干的愈伤转入含250mg/L羧苄青霉素钠和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮抗性筛选，28℃暗培养14天，获得初愈伤转到含含250mg/L羧苄青霉素钠和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第二轮选择，28℃暗培养14天，此时长出的愈伤为带有潮霉素抗性基因的抗性愈伤。

5.抗性愈伤的分化及成苗：

将分化培养基加入500ml分化罐中(1/3体积)，从步骤4挑取同一愈伤的抗性愈伤2-3颗置于分化培养基上，盖上盖子，25℃光照培养(16h/8h光周期，光强2000LUX)30天左右至愈伤组织分化出小苗，当小苗长至3-5cm左右，转入生根培养基试管中，用封口膜封口，25℃光照培养(16h/8h光周期，光强2000LUX)。

6.转基因苗的锻炼和移栽：

步骤5生根14天后，将苗根部和茎叶分化得较完好得苗的试管挑出，打开封口膜，加入30ml无菌水30℃在培养室炼苗2-3天；洗去琼脂，转入水稻营养液(同实施例1)中培养，收种。

7.T0代阳性转基因植株的筛选、鉴定

T0代转基因苗在正常(温度：白天30℃，晚上22℃；湿度60％；光照强度30000LUX，白天晚上时间分别为12h)水稻营养液培养一周后，取1cm长的叶片使用CTAB法buffer提取基因组DNA，利用抗性筛选标记基因对转基因苗经行鉴定，筛选阳性的转化株系，获得两个株系的过表达材料OE-1，OE-2。

基因组DNA的提取CTAB法：

取1cm叶片置于2ml离心管中，加入一枚直径3mm的钢珠，盖紧离心管盖，含有叶片的离心管用液氮预处理，然后在打样仪(北京鼎昊源)振荡2min，频率为25次/秒，获得捣碎的植物样品加入400μl CTAB solution buffer(500ml母液，10g CTAB，100mM Tris-HCl pH7.5，0.7mol NaCl，20mM EDTA)。置于60℃水浴30min，加入250μl氯仿8000g离心10min，取上清到另外一个新的2ml离心管，加入300μl异丙醇，混匀放入-20℃冰箱至少一个小时或者过夜。10000g离心20min弃掉液体，加入500μl 70％乙醇，然后10000g离心5min，然后弃掉乙醇在超净台吹干离心管，加入100μl去离子无菌水至最后的吹干离心管。取1μl作为PCR模板。

潮霉素抗性基因检测：

潮霉素抗性基因引物序列为：

上游引物：CGAGTACTTCTACACAGCCATC(SEQ ID NO:7)

下游引物：TAGCGAGAGCCTGACCTATT(SEQ ID NO:8)

PCR条件是95℃变性5min，然后进入循环反应：95℃，30s，59℃，30s，72℃，1min，循环数为38，最后延伸5min结束。取10μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测，然后用GelDocTMXR+(BIO-RAD，USA)成像系统记录实验结果。有扩增条带的为转基因阳性植株。

实施例3

OsROHAN是一个受氮素诱导且定位在植物质体内的蛋白

通过基因的克隆以及回补材料的构建，OsROHAN的回补材料可以回补突变体rohan对铵态氮的敏感性(图3a和3b)所示；通过时间点和2.5mM硫酸铵(铵态氮)和2.5mM硝酸钾(硝态氮)处理下RT-PCR，基因OsROHAN明显受到氮素诱导表达(图4a)所示；进一步通过回补材料的根系在激光共聚焦显微镜下，514nm的激发光波长下，发现OsROHAN蛋白定位于植物细胞的质体中(图4b)所示。

实施例4

OsROHAN过表达耐铵毒能力评价

以相对根伸长为指标评价根据上述获得的OsROHAN的过表达植株的耐铵毒能力。图5a和5b示出了不同硫酸铵浓度下(0mM,2.5mM,5mM,10mM硫酸铵)野生型和两个独立过表达材料植株(OE-1、OE-2)对铵毒的反应。结果在高浓度的硫酸铵处理下过表达株系的种子根要比野生型长，表明过表达植株在高浓度的硫酸铵处理下表现出更强的耐铵毒的能力。

实施例5

OsROHAN过表达田间产量及氮素利用效率评价

以三个不同浓度施肥量的田块(75kg/公顷的尿素、150kg/公顷的尿素和350kg/公顷的尿素)对水稻成熟期的分蘖，单株产量，氮素利用效率和种子中的蛋白含量为指标评价根据上述获得的OsROHAN的过表达植株的农艺利用价值。图6a示出了在三个不同浓度施肥量的田块，野生型(WT)和一个独立的过表达株系(OE-1)在田间的植株表型以及单株收获的种子表型。结果表明在三个不同浓度(75kg/公顷,150kg/公顷,350kg/公顷尿素)施肥量的田块独立过表达株系(OE-1)表现出相对于野生型(WT)表现出分蘖数目增加，单株产量增加，氮素利用效率提高和种子中的蛋白含量提高(图6b，6c，6d，6e所示)。证明了OsROHAN的过表达可以提高水稻的氮素利用效率和产量，对水稻种质创新具有极高的应用价值。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.水稻基因OsROHAN在提高植物耐铵毒和氮素利用效率中的应用，其特征在于，所述水稻基因OsROHAN的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述水稻基因OsROHAN编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为禾本科植物。

3.一种对铵态氮敏感的突变体，其特征在于，所述突变体具有核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示的基因。

4.根据权利要求3所述的突变体的鉴定方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1、制备突变体库；

步骤2、将所述突变体库中的每个单株取数颗发芽；

步骤3、在铵态氮溶液中处理，观察根生长抑制情况，挑选出候选的植株繁种；

步骤4、候选突变体种子收获后，通过测量比较铵态氮溶液处理前后的相对根伸长情况，挑选出对铵态氮敏感突变体。

5.一种培育耐铵毒植物的方法，其特征在于，将如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列OsROHAN过量表达导入目的植物。

6.根据权利要求5所述的培育耐铵毒植物的方法，其特征在于，过量表达OsROHAN的方法包括以下步骤：

步骤1、在OsROHAN基因上设计引物序列；

步骤2、采用Gateway连接方法，导入到表达载体里面；

步骤3、将测序正确的质粒转化农杆菌；

步骤4、将培养后的所述农杆菌用感菌液制成菌浮液；

步骤5、用所述菌浮液侵染所述目的植物的愈伤组织，并置于共培养基上进行暗培养；

步骤6、在选择培养基上对所述愈伤组织进行筛选，并在分化培养基上培养至分化成苗。

7.根据权利要求6所述的培育耐铵毒植物的方法，其特征在于，扩增引物序列如SEQ IDNO:3～6所示。

8.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤4中，用含200μM乙酰丁香酮的AAM感菌液制备所述菌浮液。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述选择培养基含头孢拉定和潮霉素，筛选次数为3次。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述目的植物为水稻。

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