CN103421778A - 一种链霉菌组成型启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种链霉菌组成型启动子及其应用。本发明提供的一种DNA片段，为如下1）-3）中任一所述的DNA分子：1）序列表的序列1所示的DNA分子；2）在严格条件下与1）所述DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；3）与1）中所述DNA分子具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。本发明的实验证明，本发明筛选的到一个较强的组成型启动子kasO*p，并将这一启动子和红霉素启动子ermE*p在天蓝链霉菌、阿维链霉菌和委内瑞拉链霉菌中进行了转录水平和表达水平的比较表征，均表明改造过的启动子kasO*p优于红霉素启动子ermE*p。

Description

一种链霉菌组成型启动子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种链霉菌组成型启动子及其应用。

背景技术

链霉菌可以产生多种次级代谢产物，这些代谢产物除了可用在人体的医药以及作为家畜饲料的添加物外，在农作物生产方面，也可做为植物保护之用。链霉菌是抗生素产生菌的主要类群，它产生的抗生素种类占已知抗生素的60%外以上，其中包括许多临床上重要的抗生素。改变菌种的代谢途径，使其特定目标产物到改善，或者赋予其新的表型特征，这个主题古老而充满活力。在过去将近一个世纪的历程中，抗生素产生菌的菌种改造经历了以诱变育种为手段的传统菌种改造阶段，和以代谢工程为基础的理性改造时期，至今这两大手段仍在广泛应用。目前，在细菌调控、代谢理论大量积累和系统生物学迅速发展的今天，人们又开始了自下而上的de novo合成生物学改造工程菌的实践。合成生物学的基点是：基于工程化策略，采用标准化生物元件，构建通用型生物学模块，在有目的设计思想指导下，组装具有特定新功能的细胞工厂或者人工生命系统。细菌的基因表达调控主要发生在转录水平上，而启动子在转录水平调控中居于关键的地位，利用启动子可以改造或者重建细菌的代谢通路和调控级联，或者方便地表达目的蛋白，这使其作为必须的生物元件在细胞工厂生物制造中占有重要地位。而生物制造与物理法或化学法相比，还具有生产流程简单、底物的利用效率高、副产物少等特点，降低了产物后处理的成本，在可持续发展中具有重要的意义。所以无论代谢工程还是合成生物学，其基本元件启动子的开发方法和工程性鉴定表征显得尤为重要。尤其随着合成生物学的兴起，细菌启动子获得了越来越多的应用。

在链霉菌中，无论工程应用还是理论研究，组成型启动子目前只用红霉素启动子ermE*p被公认的广泛应用，这远远达不到系统的代谢工程改造和合成生物学的需求，且有研究表明在一些链霉菌中ermE*p活性并不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA片段。

本发明提供的DNA片段，为如下1）-3）中任一所述的DNA分子：

1）序列表的序列1所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）所述DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；

3）与1）中所述DNA分子具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

含有上述DNA片段的重组载体A、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围，具体保护上述DNA片段在放线菌中表达单一基因或基因簇的重组菌。

上述重组载体A为将上述的DNA片段插入表达载体中得到的重组载体，所述表达载体具体为pDR4。

上述重组载体A具体为将上述的DNA片段插入pDR4载体的BamHI和SpeI酶切位点间得到的载体。

上述pDR4载体为在载体pDR2的NotI位点插入BamHI和SpeI位点得到的载体。

扩增上述DNA片段全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4，另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列5。

上述DNA片段在使目的基因在链霉菌中的表达中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述链霉菌为天蓝色链霉菌M145（S.coelicolor M145;ATCCNumber:BAA-471）；

所述目的基因为actII-orf4，所述actII-orf4的核苷酸序列为序列表中的序列3。

上述应用为将actII-orf4通过重组载体B导入链霉菌中进行表达；

上述重组载体B(pkasO+actII)按照如下方法制备：

1）将上述的DNA片段插入pDR4载体的BamHI和SpeI酶切位点间得到的载体C；

2）用SpeI和KpnI酶切所述载体C，回收6162bp片段；

3）将所述6162bp片段与actII-orf4片段连接，得到重组载体pkasO+actII。上述DNA片段在制备抗生素ACT中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用为发酵重组菌，收集发酵液，即得到抗生素ACT；

所述重组菌为将重组载体B导入目的菌中，得到重组菌。

上述重组载体B(pkasO+actII)按照如下方法制备：

1）将上述的DNA片段插入pDR4载体的BamHI和SpeI酶切位点间得到的载体C；

2）用SpeI和KpnI酶切所述载体C，回收6162bp片段；

3）将所述6162bp片段与actII-orf4片段连接，得到重组载体pkasO+actII。上述应用中，所述目的菌为链霉菌，所述链霉菌为天蓝色链霉菌M145。

本发明的实验证明，本发明以天蓝色链霉菌kasO基因启动子为骨架，通过截短结合报告基因指示去除内源蛋白ScbR2的调控，并大幅度提高了转录水平；报告基因结合随机突变库进一步去除了内源蛋白ScbR的调控；筛选的到一个较强的组成型启动子kasO*p，并将这一启动子和红霉素启动子ermE*p在天蓝链霉菌、阿维链霉菌和委内瑞拉链霉菌中进行了转录水平和表达水平的比较表征，均表明改造过的启动子kasO*p优于红霉素启动子ermE*p。进一步分别用kasO*p和ermE*p过表达天蓝色链霉菌放线紫红素ACT的特异激活子actII-orf4基因，结果表明kasO*p过表达激活子actII-orf4，能够使抗生素ACT产量提高近2倍，而ermE*p过表达激活子actII-orf4仅提高了约20%。

附图说明

图1为kasO启动子去除ScbR2调控的策略；

A图为kasO启动子图示，ScbR能够结合site OA和site OB位点，ScbR2只结合site OB位点；虚线框出了-10和-35区；TSS表示转录起始位点；orf和翻译的KasO蛋白用灰色表示；B图为四次截短的具体长度；C图，lux报告基因分析截短的各启动子的相对活性。

图2为kasOp3进一步去除ScbR调控；

A图为突变体库筛选模型：只有突变的site OA不能结合ScbR蛋白，报告基因lux才有较高的发光；B图为筛选到的较为成功的突变。

图3为在天蓝色链霉菌M145中通过报告基因XylE筛选到的启动子的活性；

图4为pDR4+kasO*的载体结构示意图；

图5为kasO*p的转录水平表达量和驱动报告基因表达活性的结果图；

图6为kasO*p驱动天蓝色链霉菌M145的ACT途径特异激活子对提高抗生素产量效果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、启动子kasO*p的获得

1、改造成组成型启动子

将kasO启动子(kasOp)截短，kasOp的核苷酸序列如图1A，先前的研究表明，kasO基因受到严格的时序调控，其中蛋白ScbR能够结合在OA位置和OB位置起抑制作用，蛋白ScbR2能够结合在OB位置其抑制作用。这两个蛋白控制kasO基因只在对数期高水平转录；

将这一启动子kasOp改造成组成型启动子，首先通过PCR扩增了四个截短去除ScbR2结合位点的kasOp1、kasOp2、kasOp3和kasOp4（图1B），然后连接lux报告基因转录DH5a，分析表明，只有97bp的kasOp3的转录活性较原始的kasOp提高了近2个数量级（图1C）。进一步分析发现，尽管由于kasOp3的转录活性有较大提高，且不受ScbR2的调控，但仍受ScbR的抑制，这是因为kasOp3仍带有ScbR的一个结合位点OA。

上述PCR扩增所用引物：

kasOp-F:TGCGCGACGTGTGCGCGATCATC

kasOp-R:AACTCCCCCAGTCCTGCACGCTG

kasOp1-F：AGTCTCGAAAACCGCTACACTGAG

kasOp1-R：同kasOp-R

kasOp2-F：TCCCCCGTCCCAGGCCCTC

kasOp2-R：同kasOp-R

kasOp3-F：TGTTCACATTCGAACGGTCTCTG

kasOp3-R：同kasOp-R

kasOp4-F：TCTGCTTTGACAAACCGGTGTG

kasOp4-R：同kasOp-R

用以上引物扩增kasOp1、kasOp2、kasOp3和kasOp4，两端分别用XhoI和BamHI酶切，连入XhoI和BamHI酶切的线性化pSC26质粒，分别得到pSC26-kasOp1、pSC26-kasOp2、pSC26-kasOp3和pSC26-kasOp4。

2、突变kasOp3的OA位点

所用的兼并引物为：

Forward：

ACGTCTCGAGTGTTCACATTCGAACGGTCTCTGCTTTGACANNNNNNNNNNNNNNNNTGTAAAGTCGTGGCCAGGAG

Reverse：ACGTGGATCCAACTCCCCCAGTCCTGCACGCTGTCGTATTCTCCTGGCCACGACTTTA

扩增突变启动子库，并用XhoI和BamHI酶切，连接pCS26，然后转入含有pScbR的DH5a，得到重组菌。结合lux报告基因筛选（图2A），得到4个基本不受ScbR调控的启动子，kasOp34、kasOp361、kasOp382和kasOp3154（图2B），进一步将这四个启动子平滑，插入含有xylE-neo双报告基因的pDR4质粒BamHI和SpeI双酶切在平滑后的片段，然后通过结合转移转入天蓝色链霉菌进行分析，发现和大肠杆菌一致，kasOp361活性较好（图3），将其命名为kasO*p，kasO*p的核苷酸序列为序列表中的序列1（可人工合成）。

实施例2、启动子kasO*p的应用

一、启动子kasO*p的功能鉴定

1、重组质粒和重组菌的构建

分别kasO*p和ermE*p连接显色报告基因xylE和卡纳抗性基因neo（同图4），具体如下：

以序列1（可人工合成，为kasO*p）为模板，用kasO*p引物（序列kasO*p-F:ACGTCTCGAGTGTTCACATTCGA（序列4）；kasO*p-R:ACGTACTAGTAACTCCCCCAGTCCTG（序列5））扩增，得到PCR产物，将该PCR产物经过BamHI和SpeI酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的载体pDR4（载体pDR4为载体pDR2衍生，载体pDR4为在载体pDR2的NotI位点插入BamHI和SpeI位点，载体pDR2记载在Xiang SH,Li J,Yin H,ZhengJT,Yang X,Wang HB,Luo JL,Bai H,Yang KQ:Application of adouble-reporter-guided mutant selection method to improve clavulanic acidproduction in Streptomyces clavuligerus.Metab Eng 2009,11(4-5):310-318.公众可从中国科学院微生物研究所获得。）连接，得到连接产物pDR4+kasO*(图4)，将连接产物转入DH5a，测序验证，pDR4+kasO*为将序列表中的序列1插入载体pDR4的BamHI和SpeI酶切位点间得到的载体。

通过结合转移（结合转移步骤同：Kieser,T.,Bibb,M.J.,Buttner,M.J.,Chater,K.F.,and Hopwood,D.A.(2000)Practical Streptomyces Genetics,TheJohn Innes Foundation,Norwich,UK）将pDR4+kasO*为别转入天蓝色链霉菌M145（S.coelicolor M145;ATCC Number:BAA-471）、委内瑞拉链霉菌ISP5230（S.venezuelae ISP5230,ATCC Number:10712）和阿维链霉菌MA-4680（S.avermitilis，ATCC Number：31267）中，得到含有pDR4+kasO*的天蓝色链霉菌M145、含有pDR4+kasO*的委内瑞拉链霉菌ISP5230和含有pDR4+kasO*的阿维链霉菌MA-4680；将上述三种菌均提取质粒测序验证，均为pDR4+kasO*，因此，上述三种菌均为阳性。

以ermE*p为对照，其核苷酸序列为序列表中的序列2（可人工合成），ermE*p扩增引物如下：

ermE*p-F：ACGTCTCGAGGCGGTCGATCTTGACGGCTGGCG

ermE*p-R：ACGTACTAGTAGCTTGGATCCTACCAACCGGCA

将ermE*p扩增产物插入pDR4载体的BamHI和SpeI酶切位点间得到pDR4+ermE*p。

将pDR4+ermE*p分别转入天蓝色链霉菌M145、委内瑞拉链霉菌ISP5230和阿维链霉菌MA-4680中，得到含有pDR4+ermE*p的天蓝色链霉菌M145、含有pDR4+ermE*p的委内瑞拉链霉菌ISP5230和含有pDR4+ermE*p的阿维链霉菌MA-4680；将上述三种菌均提取质粒测序验证均为pDR4+ermE*p，因此，上述三种菌均为阳性。

2、kasO*p的相对表达量

提取含有pDR4+kasO*(kasO*p）或含有pDR4+ermE*p（ermE*p）的天蓝色链霉菌M145、委内瑞拉链霉菌ISP5230和阿维链霉菌MA-4680的mRNA，反转录成cDNA后，通过荧光定量PCR（qPCR）比较这两个启动子在不同链霉菌的相对转录水平，以xylE-neo为靶基因的荧光定量PCR引物为：qF：CTGCCGAGAAAGTATCCATC qR：CCCCTGATGCTCTTCGTCC，以hrdB为内参，天蓝色链霉菌和阿维链霉菌共用内参的引物为hrdBFc：GAGGACGGCGACAGCGAGTT，hrdBRc：GACGCCGTACACCTTGCCGA；委内瑞拉链霉菌内参引物为hrdBFv：GCCGAGTCCGAGTCTGTGA，hrdBRv：CTGGGTTGGCGGAATCTGGT；进行qPCR。

转录水平表达量测试时期为对数期，结果如图5A，可以看出，在三株菌中，kasO*p驱动的xylE-neo的相对表达量均大于ermE*p驱动的xylE-neo。

2、kasO*p驱动报告基因xylE的表达

将kasOp按照前面的方法插入pDR4载体的BamHI和SpeI酶切位点间得到pDR4+kasOp，并转入天蓝色链霉菌M145和委内瑞拉链霉菌ISP5230，得到含有pDR4+kasOp的天蓝色链霉菌M145和含有pDR4+kasOp的委内瑞拉链霉菌ISP5230；

将含有pDR4+kasOp（kasOp）的天蓝色链霉菌M145、含有pDR4+kasOp（kasOp）的委内瑞拉链霉菌ISP5230、含有pDR4+kasO*(kasO*p）的天蓝色链霉菌M145、含有pDR4+kasO*(kasO*p）的委内瑞拉链霉菌ISP5230、含有pDR4+ermE*p（ermE*p）的天蓝色链霉菌M145、含有pDR4+ermE*p（ermE*p）的委内瑞拉链霉菌ISP5230进行XylE报告基因测定，方法同Kieser,T.,Bibb,M.J.,Buttner,M.J.,Chater,K.F.,and Hopwood,D.A.(2000)Practical Streptomyces Genetics,The John InnesFoundation,Norwich,UK中描述，结果如图5B所示，可以看出，kasO*p驱动报告基因xylE的表达，且xylE活性高于ermE*p和kasOp驱动。

3、kasO*p驱动卡纳抗性基因neo的表达

含有pDR4+kasO*或含有pDR4+ermE*p的天蓝色链霉菌M145、委内瑞拉链霉菌ISP5230和阿维链霉菌MA-4680进行neo抗性基因测定，方法同引用文献Xiang SH,LiJ,Yin H,Zheng JT,Yang X,Wang HB,Luo JL,Bai H,Yang KQ:Application ofa double-reporter-guided mutant selection method to improve clavulanic acidproduction in Streptomyces clavuligerus.Metab Eng 2009,结果如表1所示，可以看出，kasO*p驱动卡纳抗性基因neo的表达，且活性高于ermE*p驱动表达。

表1为启动子在不同链霉菌中启动neo抗性基因的相对强度

从上述实验证明，kasO*p为启动子。

二、启动子kasO*p驱动天蓝色链霉菌途径特异激活子actII-orf4的表达

以质粒pDR4+ermE*p和pDR4+kasO*为出发质粒，分别通过SpeI和KpnI切除双报告基因xylE-neo（1814bp），分别得到6207bp的pDR4+ermE*p骨架载体和6162bp的pDR4+kasO*骨架载体，然后分别连入用相同位点酶切的actII-orf4片段（其核苷酸具有序列3，可添加相应的酶切位点并人工合成，），得到质粒permE*p+actII和pkasO+actII。

经过测序，质粒permE*p+actII为将actII-orf4片段（序列3）插入pDR4+ermE*p的SpeI和KpnI酶切位点间，替换掉双报告基因xylE-neo；

质粒pkasO+actII为将actII-orf4片段（序列3）插入pDR4+kasO*的SpeI和KpnI酶切位点间，替换掉双报告基因xylE-neo；

分别将质粒permE*p+actII和质粒pkasO+actII通过结合转移转入天蓝色链霉菌M145，得到含有permE*p+actII天蓝色链霉菌M145和含有pkasO+actII的天蓝色链霉菌M145。

将含有permE*p+actII天蓝色链霉菌M145（ermE*p）和含有pkasO+actII（kasO*p）的天蓝色链霉菌M145进行ACT（抗生素actinorhodin）产量检测，ACT检测方法同ieser,T.,Bibb,M.J.,Buttner,M.J.,Chater,K.F.,and Hopwood,D.A.(2000)Practical Streptomyces Genetics,The John Innes Foundation,Norwich,UK中描述。以天蓝色链霉菌M145为对照（control）。

结果如图6所示，Control的抗生素ACT产量为89.14±11.0648mg/L；

含有pkasO+actII（kasO*p）的天蓝色链霉菌M145的抗生素ACT产量为191.30±18.417mg/L；

含有permE*p+actI I天蓝色链霉菌M145（ermE*p）的抗生素ACT产量为120.19±10.357mg/L；

上述结果表明，kasO*p相对ermE*p可更好的过表达激活子actII-orf4，使抗生素ACT产量提高，kasO*p过表达激活子actII-orf4与control相比产量提高近2倍，而ermE*p过表达激活子actII-orf4相对control仅提高约20%。同理，该组成型启动子也可用于其他链霉菌提高相应抗生素的产量（actII-orf4是ACT的途径特异激活蛋白，和ACT产量正相关）。

以上实验说明得到的kasO*p启动子，在链霉菌生物制造领域提高目标产物的产量和合成生物学构建细胞工厂具有重大应用价值。

Claims (10)

1.一种DNA片段，为如下1）-3）中任一所述的DNA分子：

1）序列表的序列1所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）所述DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；

3）与1）中所述DNA分子具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。

2.含有权利要求1中所述DNA片段的重组载体A、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体A为将权利要求1所述的DNA片段插入表达载体中得到的重组载体。

4.扩增权利要求1中所述DNA片段全长或其任意片段的引物对。

5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于：所述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4，另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列5。

6.权利要求1所述DNA片段在使目的基因在链霉菌中的表达中的应用。

7.根据权利要求6中所述的应用，其特征在于：所述链霉菌为天蓝色链霉菌M145；

所述目的基因为actII-orf4，所述actII-orf4的核苷酸序列为序列表中的序列3。

8.权利要求1中所述DNA片段在制备抗生素ACT中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述应用为发酵重组菌，收集发酵液，即得到抗生素ACT；

所述重组菌为将重组载体B导入目的菌中，得到重组菌。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：

所述重组载体B按照如下方法制备：

1）将权利要求1中所述DNA片段插入pDR4载体的BamHI和SpeI酶切位点间得到的载体C；

2）用SpeI和KpnI酶切所述载体C，回收6162 bp片段；

3）将所述6162 bp片段与所述actII-orf4片段连接，得到重组载体B；

所述目的菌为链霉菌，所述链霉菌为天蓝色链霉菌M145。

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