CN109295056A - 一种天蓝色链霉菌双向启动子scp1 - Google Patents

一种天蓝色链霉菌双向启动子scp1 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种天蓝色链霉菌双向启动子SCP1，所述双向启动子SCP1的核苷酸序列是用SEQ ID NO.1所示；或与所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在构建基因表达载体时，质粒设计时要加入启动子序列，以保证目的基因的表达。而双向启动子被放置于两个ORF之间可同时表达两个ORF。由于两个ORF分别有自己的起始密码子和终止密码子，所以会翻译两个独立的、没有经过修饰的蛋白，不会带来多启动子载体中启动子相互干扰或抑制的问题，从而达到高效表达目的基因的作用。在天蓝色链霉菌中还未有双向启动子的相关报道，本发明提供一种天蓝色链霉菌双向启动子SCP1，可大大提高基因的表达效率。

Description

一种天蓝色链霉菌双向启动子SCP1
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种天蓝色链霉菌双向启动子SCP1及含有所述启动子的一种天蓝色链霉菌双向启动子SCP1的重组载体。
背景技术
启动子(Promoter)是指位于基因转录起始位点上游、能够与RNA聚合酶和其它转录因子结合并进而调节其下游目的基因转录起始和转录效率的一段DNA序列。启动子在用于设计和制备基因工程产品等方面，具有重要的应用价值。当相反方向转录的两个基因相邻的转录起始位点(transcription start site，TSS)之间的距离低于1kb左右时，这段基因间DNA序列可称之为“双向启动子(bidirectional promoter)”。双向启动子属于一种特殊类别的启动子，该类启动子能够同时驱动其两侧邻近的转录方向相反的两个基因的转录。与传统的单向启动子相比，双向启动子在具体应用时，不仅可以实现单个外源基因的表达，还可以实现两个外源基因的同时表达，因此在用于设计和制备基因工程产品等方面具有更为重要的价值。
在转基因过程中由于重复序列的出现会引起基因沉默现象，尤其是进行多个基因导入时，这种现象会更严重。而在进行两个或两个以上基因导入时，通常需要这些基因的表达量、表达时间的同一性，进而确保转入基因行使正常的功能，使用单向启动子很难达到这样的要求。这些都是基因工程中亟待解决的问题。随着基因组学的发展，多种生物基因组测序已完成，经过生物信息学分析人们发现了双向启动子的存在，这为我们利用天蓝色链霉菌自身的双向启动子进行操作，从而避免多基因插入引起的基因沉默现象提供了可能。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种天蓝色链霉菌双向启动子SCP1。
本发明的第二个目的是提供一种含有一种天蓝色链霉菌双向启动子SCP1的重组载体。
本发明的技术方案概述如下：
一种天蓝色链霉菌双向启动子SCP1，所述双向启动子SCP1的核苷酸序列是用SEQID NO.1所示；或与所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
含有一种天蓝色链霉菌双向启动子SCP1的重组载体，用下述方法构建：
(1)用细菌基因组DNA提取试剂盒提取天蓝色链霉菌M145基因组；
(2)以基因组DNA为模板，以SCP1-F，SCP1-R为引物进行PCR扩增，所述SCP1-F的核苷酸序列用SEQ ID NO.2所示，所述SCP1-R的核苷酸序列用SEQ ID NO.3所示；
(3)PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶检测，用凝胶回收试剂盒回收目的片段双向启动子SCP1,所述目的片段双向启动子SCP1的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示；
(4)在所述双向启动子SCP1的两侧用融合PCR的方法连接上目的基因，得到融合片段，将所述融合片段连接在质粒上，得到含有一种天蓝色链霉菌双向启动子SCP1的重组载体。
优选的是，目的基因为绿色荧光蛋白基因eGFP，所述绿色荧光蛋白基因eGFP的核苷酸序列用SEQ ID NO.4所示，还可以选用其它基因。
所述质粒优选为pACYCDuet-1，还可以选用其它质粒。
本发明的优点：
在构建基因表达载体时，质粒设计时都需要加入启动子序列，以保证目的基因的表达。而双向启动子被放置于两个ORF之间的时候，可以同时表达这两个ORF。由于两个ORF分别有自己的起始密码子和终止密码子，所以会翻译两个独立的、没有经过修饰的蛋白，不会带来多启动子载体中启动子相互干扰或抑制的问题，从而达到高效表达目的基因的作用。在天蓝色链霉菌中还未有双向启动子的相关报道，本发明提供一种双向启动子序列及含有双向启动子的重组载体，可大大提高基因的表达效率。
附图说明
图1为双向启动子单侧连接报告基因重组体的构建,其中A为在双向启动子右侧连接绿色荧光蛋白基因重组体的构建,将其命名为正向启动子载体构建；B为在双向启动子左侧连接绿色荧光蛋白基因重组体的构建，将其命名为反向启动子载体构建。
图2为双向启动子两侧连接绿色荧光蛋白基因重组体的构建。
图3为在启动子两侧及单侧连接绿色荧光蛋白基因测定启动子活性，1表示在双向启动子两侧各连接eGFP，相对荧光强度为10.8；2表示在双向启动子右侧连接eGFP，相对荧光强度为8.34；3表示在双向启动子左侧连接eGFP，相对荧光强度为1.19。
具体实施方式
天蓝色链霉菌M145购于北纳生物公司。
pACYCDue-1质粒购于优宝生物公司。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：一种天蓝色链霉菌双向启动子SCP1(以下简称SCP1)单侧连接绿色荧光蛋白基因(eGFP,简称报告基因)重组体的构建
(1)用细菌基因组DNA提取试剂盒提取天蓝色链霉菌M145基因组；
(2)以基因组DNA为模板，以SCP1-F，SCP1-R为引物进行PCR扩增，反应体系为50ul，包括ddH2O 18ul,dNTP mixture 1ul,SCP1-F引物1ul，SCP1-R引物1ul，DNA模板1ul，2×Phanta Max 25ul,Fidelity DNA polymerase 1ul。
扩增过程为：95℃预变性3min；95℃变性15s，66℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min
所用引物：
SCP1-F 5'GCGCCACCCCTCGACACAG 3'(SEQ ID NO.2)；
SCP1-R 5'GCGCCACCCCTCGACACAG 3'(SEQ ID NO.3)
(3)PCR产物经质量体积比1.5％的琼脂糖凝胶检测，用凝胶回收试剂盒回收目的片段，为双向启动子SCP1的核苷酸序列是用SEQ ID NO.1所示；
与所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列，也可以用于本发明。
(4)在启动子右侧用融合PCR的方法连接上绿色荧光蛋白基因eGFP，将此序列连接在pACYCDuet-1上。
(5)将DNA测序正确的质粒电转转入BL21大肠杆菌感受态细胞中，于加有氯霉素抗性(氯霉素终浓度为0.1mg/ml)的LB平板培养基(LB固体培养基)中过夜培养，挑取单菌落做菌落PCR，选取正确的菌于加有氯霉素抗性LB液体培养基中过夜培养。次日将菌液转接进入LB液体培养基中培养至OD600达到0.3-0.4之间，加入100mM IPTG至终浓度为0.2mmol/L诱导eGFP融合蛋白表达。37℃培养4h后，以未加诱导剂的菌液为空白对照，使用荧光分光光度计对菌液的荧光强度进行测量，激发波长480nm，发射波长520nm，将荧光测量值与相应OD600值作比值进行归一化。以诱导后绿色荧光蛋白强度和未诱导绿色荧光蛋白强度的比值来表示启动子片段的相对活性。
LB固体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和8g琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000mL；然后分装于500mL三角瓶中，121℃、6.859×104Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用。
LB液体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠溶解于蒸馏水中，定容于1000mL，然后分装于500mL三角瓶中，121℃、6.859×104Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用。
其中融合PCR过程如下：
(1)引物设计：首先需要将SCP1片段的3’端引物含有eGFP片段的一部分，eGFP片段的5’端引物含有SCP1片段的一部分，这样分别扩增获得SCP1和eGFP就含有了互补片段。所用引物如下：
F1:5'GCGCCACCCCTCGACACAG 3'(SEQ ID NO.4)；
R1:5'ATGACCATGATTACGCATCATCATC 3'(SEQ ID NO.5)；
F2:5'CGACGGGAGCGATTCCATGGGCGGT 3'(SEQ ID NO.6)；
R2:5'TTACTTGTACAGCTCGTCCATG 3'(SEQ ID NO.7)
(2)分别用引物F1、R1，F2、R2PCR扩增SCP1-右和eGFP-左片段，25μL体系一次扩增8管含有一管阴性对照，切胶回收这两个片段。
(3)以SCP1-右和eGFP-左两个片段为模板，进行融合PCR实验。融合PCR分为两步，操作步骤如下：
第一步：(不加引物)dNTPs 1μl,10×Buffer2.5μl,TemplateDNA(SCP1-右和eGFP-左)各1μl，Taq酶0.5μl,ddH2O 19μl总体系25ul。
循环参数：95℃预变性5min，94℃变性20s、57℃退火20s、72℃延伸40s进行10个循环，72℃延伸5min。
第二步：10个循环后，取出反应管加入引物F1、R2。循环参数：95℃预变性5min，94℃变性20s、60℃退火20s、72℃延伸40s进行10个循环，72℃延伸5min。待反应完毕后，1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，这样就将eGFP连接在了SCP1右侧。
左侧连接绿色荧光蛋白重组载体步骤除融合PCR过程不同外均同上。
左侧连接绿色荧光蛋白融合PCR所用引物为
F3:5'AATGAACATGTCGAGCAGGTACG 3'(SEQ ID NO.8)
R3:5'GCGCCACCCCTCGACACAGACGGC3'(SEQ ID NO.9)
F4:5'CTACTACTACTACGCATTAGTACCAGTA3'(SEQ ID NO.10)
R4:5'GCGCCACCCCTCGACACAG 3'(SEQ ID NO.11)
分别用引物F3、R3，F4、R4PCR扩增eGFP-右和SCP1-左片段，25μL体系一次扩增8管含有一管阴性对照，切胶回收这两个片段。
以eGFP-右和SCP1-左两个片段为模板，进行融合PCR实验。融合PCR分为两步，操作步骤如下：
第一步：(不加引物)dNTPs 1μl,10×Buffer2.5μl,TemplateDNA(SCP1-左和eGFP-右)各1μl，Taq酶0.5μl,ddH2O 19μl总体系25ul。
循环参数：95℃预变性5min，94℃变性20s、57℃退火20s、72℃延伸40s进行10个循环，72℃延伸5min。
第二步：10个循环后，取出反应管加入引物F3、R4。循环参数：95℃预变性5min，94℃变性20s、60℃退火20s、72℃延伸40s进行10个循环，72℃延伸5min。待反应完毕后，1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，这样就将eGFP连接在了SCP1左侧。
实施例2.SCP1启动子双侧连接报告基因重组体的构建
(1)用细菌基因组DNA提取试剂盒提取天蓝色链霉菌M145基因组
(2)以基因组DNA为模板，以SCP1-F，SCP1-R为引物进行PCR扩增，反应体系为50ul，包括ddH2O 18ul,dNTP mixture 1ul,SCP1-F引物1ul，SCP1-R引物1ul，DNA模板1ul，2×Phanta Max 25ul,Fidelity DNA polymerase 1ul。
扩增过程为：95℃预变性3min；95℃变性15s，66℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min
所用引物为：SCP1-F 5'GCGCCACCCCTCGACACAG 3'；SCP1-R 5'GCGCCACCCCTCGACACAG 3'
(3)PCR产物经质量体积比1.5％的琼脂糖凝胶检测，用凝胶回收试剂盒回收目的片段。
(4)在启动子右侧用融合PCR的方法连接上绿色荧光蛋白基因eGFP，将此序列连接在pACYCDuet-1质粒上。
实施例1中已经将SCP1右侧连接eGFP，融合后的片段视为一条片段称为B片段，融合PCR只需将eGFP片段连接在B片段左侧，过程如下:
分别用引物F3、R3，F4、R2PCR扩增eGFP和B片段，25μL体系一次扩增8管含有一管阴性对照，切胶回收这两个片段。
(3)以eGFP和B片段两个片段为模板，进行融合PCR实验。融合PCR分为两步，操作步骤如下：
第一步：(不加引物)dNTPs 1μl,10×Buffer2.5μl,TemplateDNA(eGFP和B片段)各1μl，Taq酶0.5μl,ddH2O 19μl总体系25ul。
循环参数：95℃预变性5min，94℃变性20s、57℃退火20s、72℃延伸40s进行10个循环，72℃延伸5min。
第二步：10个循环后，取出反应管加入引物F3和R2。循环参数：95℃预变性5min，94℃变性20s、60℃退火20s、72℃延伸40s进行10个循环，72℃延伸5min。待反应完毕后，1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，这样就将eGFP连接在了B片段左侧，从而得到SCP1两端连接绿色荧光蛋白的片段。
将DNA测序正确的质粒电转转入BL21大肠杆菌感受态细胞中，于加有氯霉素抗性(氯霉素终浓度为0.1mg/ml)的LB平板培养基中过夜培养，挑取单菌落做菌落PCR，选取正确的菌于抗性LB液体培养基中过夜培养。次日将菌液转接进入LB培养基中培养至OD600达到0.3-0.4之间，加入100mM IPTG至终浓度为0.2mmol/L诱导eGFP融合蛋白表达。37℃培养4h，以未加诱导剂的菌液为空白对照，使用荧光分光光度计对菌液的荧光强度进行测量，激发波长480nm，发射波长520nm，将荧光测量值与相应OD600值作比值进行归一化。
以诱导后绿色荧光蛋白强度和未诱导绿色荧光蛋白强度的比值来表示不同启动子片段的相对活性。见图3。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种天蓝色链霉菌双向启动子SCP1
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 234
<212> DNA
<213> 天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)
<400> 1
gcgccacccc tcgacacaga cggctgccgc gctggcataa ccacgcggca ttcgtaaacc 60
cagcgtagtt cgccgcatcc caggcgttaa gaggcattgt tccggatggc gggattgtgg 120
tccgtactca agtgcggtgc atgtacggtc tgttgccgcg tgctcccgat gtgtggccgt 180
gcgcccgtgc gtgcgctctt ctccggccac gacgggagcg attccatggg cggt 234
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgccacccc tcgacacag 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgccacccc tcgacacag 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgccacccc tcgacacag 19
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaccatga ttacgcatca tcatc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgacgggagc gattccatgg gcggt 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttacttgtac agctcgtcca tg 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatgaacatg tcgagcaggt acg 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcgccacccc tcgacacaga cggc 24
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctactactac tacgcattag taccagta 28
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcgccacccc tcgacacag 19

Claims (4)

1.一种天蓝色链霉菌双向启动子SCP1，所述双向启动子SCP1的核苷酸序列是用SEQ IDNO.1所示；或与所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述的一种天蓝色链霉菌双向启动子SCP1的重组载体，其特征是用下述方法构建：
(1)用细菌基因组DNA提取试剂盒提取天蓝色链霉菌M145基因组；
(2)以基因组DNA为模板，以SCP1-F，SCP1-R为引物进行PCR扩增，所述SCP1-F的核苷酸序列用SEQ ID NO.2所示，所述SCP1-R的核苷酸序列用SEQ ID NO.3所示；
(3)PCR产物经质量体积比为1.5％的琼脂糖凝胶检测，用凝胶回收试剂盒回收目的片段双向启动子SCP1,所述目的片段双向启动子SCP1的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示；
(4)在所述双向启动子SCP1的两侧用融合PCR的方法连接上目的基因，得到融合片段，将所述融合片段连接在质粒上，得到含有一种天蓝色链霉菌双向启动子SCP1的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征是所述目的基因为绿色荧光蛋白基因eGFP，所述绿色荧光蛋白基因eGFP的核苷酸序列用SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求2所述的重组载体，其特征是所述质粒为pACYCDuet-1。
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