CS395891A3 - Ahas deletion mutants, resistant to herbicides - Google Patents

Description

Deleční mutanty AHAS, odolné proti herbicidům

Oblast techniky

Vynález se týká nových sekvencí DNA, kódujících novépozměněné formy enzymu syntázy acetohydroxykyseliny /dáleJen AHAS/. Enzym AHAS Je kritickým enzymem, rutinně produko-vaným v různých rostlinách a širokém rozsahu mikroorganismů.Normální funkce AHAS Je inhibována četnými různými typy her-bicidů, avšak nové enzymy AHAS, kódované mutovanými sekven-cemi DNA, normálně katalyticky fungují i v přítomnosti tako-vých herbicidů, a tudíž dodávají rostlině nebo mikroorganis-mu, který Je obsahuje, odolnost proti herbicidům.

Nové sekvence DNA Jsou založeny na neočekávaném zjiště-ní, že delece Jedné nebo více specifických aminokyselinv určitých oblastech normální sekvence genu AHAS vede k plněfunkčnímu enzymu, avšak dodává enzymu odolnost vůči lnhiblclrůznými typy herbicidů včetně imidazolinů, triazolopyrimidí-nů a sulfonylmočovin. Tyto obměněné sekvence poskytují mož-nost transformace nejrůznějších plodin na plodiny, odolnéproti herbicidům, stejně Jako získání nových buněčných znakůpro selekci a použití v dalších typech genetických transfor-mačních experimentů.

Dosavadní stav techniky V současné době Je používání herbicidů v zemědělstvívelmi rozšířené. Přestože Je k dispozici množství sloučenin,které účinně ničí plevely, nejsou všechny herbicidy schopnyselektivně působit na nežádoucí rostliny mezi pěstovanýmiplodinami ani být netoxické vůči živočichům. Často Je nutnose spokojit se sloučeninami, které Jsou prostě méně toxickévůči plodinám než vůči plevelům. Vzhledem k těmto problémůmse vývoj plodin, odolných vůči herbicidům, stal hlavním ob-

Jektem agrochemického výzkumu» Důležitým aspektem vývode odolnosti vůči herbicidům Jepochopení, Jak herbicid působí při inhibici růstu rostlin, apak manipulace zasažené biochemické dráhy v plodině, vedoucík odstranění inhibičního efektu při zachování normální biolo-gické funkce rostliny. Jedny z prvních objevů biochemickéhomechanismu herbicidů se vztahovaly na řadu strukturně nepříbuzných herbicldních sloučenin, imidazollnů, sulfonylmočovin atrlazolopyrimldinů. Nyní Je známo ZShaner et al., Plant Phy-síol. 76, 545-546, 1984, US 4761373/, že všechny tyto herbi-cidy inhibují růst rostlin prostřednictvím Interference s in-tegrálním buněčným enzymem syntézou acetohydroxykyseliny/AHAS, též acetolacetát syntáza, ALS/> AHAS Je nutný prosyntézu aminokyselin isoleucinu, leucinu a valinu»

Je známo, že enzym AHAS Je přítomen ve vyšších rostli-nách a nachází se rovněž v různých mikroorganismech, Jako Jekvasinka Saccharomyces cerevisiae a střevní bakterie Escheri-chia coli a Salmonella typhimurium. Genetický základ proprodukci normálního AHAS v různých těchto druzích byl rovněždostatečně charakterizován. Například v E. coli i v S. ty-phimuríum existují tři ísozymy AHAS; dva z nich Jsou citlivévůči herbicidům, avšak třetí nikoliv. Každý tento isozym máJednu velkou a Jednu malou proteinovou podjednotku a odpoví-dají operonům IlvIH, IlvGlíl a IlvBN. V kvasinkách odpvídámístu ILV2 Jediný isozym AHAS. V každém případě byly identi-fikovány senzitivní a rezistentní formy a určeny sekvencerůzných allel /Friden et al., Nucl. Acld Res. 13, 3979-3993,1985, Lawther et al., PNAS USA 78, 922-928, 1982, Squires etal., Nucl. Acids Res. 811 . 5299-5313, 1983, Wek et al., Nucl.Acids Res. 13. 4011-4027, 1985, Falco a Dumas, Genetics 109.21-35, 985, Falco et al., Nucl. Acids Res. 13. 4011-4027,1985/. V tabáku Je funkce AHAS kódována dvěma nespojenými genySuRA a SuRB. {Tezi oběma geny existuje podstatná Identita zra- lého proteinu Jak na úrovni nukleotidů, tak aminokyselin, a-však N-terminální oblast předpokládaného přechodu se víceliší /Lee et al., EÍYIBQ J. 7, 1241-1248, 1988/. Naproti tomuArabidopsis má Jediný gen AHAS, Jehož sekvence byla rovněžkompletně určena. Porovnání mezi sekvencemi genů AHAS vevyšších rostlinách ukazuje na vysoký stupen zachování urči-tých oblastí sekvence; konkrétně se zachovává alespoň 10oblastí. Již dříve byl vysloven předpoklad, že tyto zachova-né oblasti Jsou pro funkci enzymu kritické a že zachovánítéto funkce závisí na zachování podstatné sekvence.

Nedávno bylo zaznamenána /EP 0257993/, že mutanty, vy-kazující odolnost vůči herbicidům, obsahují v Jedné nebo vícetěchto zachovaných oblastA^rautace v alespoň Jedné aminokyse-lině. Zejména se ukázalo, že Je tolerována náhrada divokéhotypu aminokyseliny v těchto konkrétních místech sekvenceAHAS určitými aminokyselinami a skutečně vede k odolnostirostliny, obsahující tuto mutaci, vůči herbicidům při zacho-vání katalytické funkce. Bylo zjištěno, že tyto mutace sev tabáku vyskytují na místech SuRA i SuRB, a podobné mutacebyly izolovány v Arabidopsis a kvasinkách.

Nyní bylo neočekávaně objeveno, že delece Jedné nebovíce aminokyselin v Jedné nebo více těchto oblastech se ^za-chovanou" sekvencí vede nejen k funkčnímu enzymu AHAS, aletaké k odolnosti proti herbicidům. Zachování sekvence nor-málně znamená, že nebude tolerována žádná změna v těchto ob-lastech a povede vždy k nefunkčnímu proteinu. V tomto přípa-dě Je však zvlášt překvapující, že Je zachována funkce enzy-mu, a to s ohledem na skutečnost, že delecí se nejen vyne-chává zbytek aminokyseliny, který Je stavební Jednotkou en-zymu, ale že nutně vede 1 k posunu zbytků, a tak ničí zdán-livé zachování sekvence, obsahující mutaci. Byly tedy nale-zeny nové sekvence nukleových kyselin, vhodné k transformacirostlin, citlivých vůči herbicidům, na rostliny, vůči herbi-cidům odolné. Dosud transformované rostliny poskytují základvývoje nových odrůd rostlin, odolných vůči herbicidům.

Podstata vynálezu Předmětem vynálezu Jaou nové sekvence nukleových kyse-lin, kódujících funkční enzymy AHAS, necitlivé vůči různýmherbicidům. Tyto sekvence obsahují deleci Jednoho nebo vícekodonů, kódujících určitou aminokyselinu, v Jedné nebo víceoznačených takzvaných zachovaných oblast ^molekuly AHAS di-vokého typu. Identita těchto míst a vypustitelné kodony budoupodrobněji diskutovány dále. Alterované sekvence DNA Jsou po-užitelné při postupech produkce rostlinných buněk, odolnýchproti herbicidům, při nichž se provádí transformace cílovérostlinné buňky Jednou nebo více alterovanými sekvencemi po-dle vynálezu. Jinou možností Je mutagenezí vytvořit delečnímutanty v rostlinných buňkách nebo semenech, obsahující*1 sek-venci nukleových kyselin, kódující AHAS, citlivý vůči herbi- Φ v cidůro. Tyto rostlinné buňky se pak nechají projít tkáňovoukulturou k regeneraci rostlin, které mají odolnost nebo ne-citlivost proti herbicidům. Vynález tedy také zahrnuje rošt- v v linné buňky, rostlinné tkáňové kultury, dospělé rostliny asemena rostlin, které obsahují delečně mutované sekvencenukleových kyselin a které exprimují funkční enzymy AHAS, o-dolné vůči herbicidům.

Tyto nové rostliny, odolné proti herbicidům, umožňujínové metody pěstování plodin v přítomnosti herbicidů. Iflístoneodolných rostlin Je možno na polích pěstovat odolné rost-liny podle vynálezu a pole rutinně ošetřovat herbicidy bezpoškození plodin. Výhodnými herbicidy pro tento účel Jsouimidazoliny, sulfonylmočoviny a triazolopyrimidiny. (Tlutované nukleové kyseliny podle vynálezu poskytujírovněž nové blřiogické znaky k selekci a použití v transfor-mačních experimentech. Sekvence nukleových kyselin, kódujícíAHAS, odolný vůči herbicidům, Je před přenesením do hosti-telské buňky navázána na druhý gen a celá sestava Je trans-formována do hostitele. Předpokládané transformované buňky se pak pěstují v kultuře v přítomnosti inhibičních množstvíherbicidu; přežívající buňky úspěšně získaly druhý použitý gen. V popisu a nárocích se používají tyto definice: "Funkční" nebo "normální" enzym AHAS Je schopen katalý-zy prvního stupně dráhy pro syntézu esenciálních aminokyse-lin isoleucinu, leucinu a valinu. "Zachovaná" sekvence nebooblast AHAS Je řada nukleových kyselin nebo aminokyselinv sekvenci nukleových kyselin nebo aminokyselin AHAS, kteráJe stejná v alespoň dvou z druhů, majících enzym AHAS. Sek-vence AHAS "divokého typu" Je sekvence, přítomná v Jedincidaného druhu, citlivém vůči herbicidům. "Odolná" rostlinaprodukuje normální enzym AHAS a Je schopna dosáhnout dospě-losti, Jeii pěstována v přítomnosti normálně inhibiěníchmnožství herbicidů. Používaný termín "odolný" zde rovněž za-hrnuje "tolerantní" rostliny, tj. takové, které fenotypickyvykazují nepříznivou, avšak nikoli letální reakci na herbi-cid. Úplná nukleotidová sekvence genu AHAS Již byla popsánav četných organismech, zahrnujících kvasinky, E. coli, Bras-sica, Arabidopsis, cukrovku a tabák /ffiazur et al., viz výše,Lee et al., EITiBO J. 7, 1241, 1988/. Kromě toho bylo zazname-náno, že odolnost proti herbicidům Je spojena s Jednou nebovíce mutacemi v sekvenci AHAS; konkrétně bylo zjištěno, žeodolnost Je spojena s náhradou určitých konkrétních aminoky-selin v sekvenci /EP 259793, Yadav et al., PNAS USA 83, 441B-22, 1986, Sathasivan et al., Nucl. Acids Res. Jji, 2188,1990/. Bylo však odvozeno /Hartnett et al., v ffianagingResistance To Agrochemicals, Ch. 31. 459-473, American Che-mical Society, 1990, EP 259793/, že tyto zachované oblasti,ve kterých dochází k mutacím, přinášejícím odolnost, musíbýt obecně ponechány k zachování enzymatické funkce.

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že zachování těchtosekvencí zjevně není nezbytné pro katalytickou funkci mole- kuly. V průběhu vývoje vynálezu se používá místně zaměřenámutageneze kódující oblastí AHAS Arabídopsís k vytvoření de-lečních mutací, při nichž Je zbytek, který se dříve pojevilJako nahraditelný, vypuštěn ze sekvence. Vypuštění zbytkůJasně ničí zachování charakteru oblastí, ve kterých se vy-skytují. Nicméně takto vytvořené deleční mutace si všechnyzachovávají funkci AHAS a současně vykazují odolnost protiherbicidům.. Konkrétně se Jednoduchými delecemi zbytků Trp574,Pro197 a SerS53 a dvojitými delecemi Pro197 a Ser653 získajíplně funkční rostliny, odolné proti herbicidům. Veškeré po-užité číslování aminokyselin Je založeno na sekvenci AHASArabídopsís. Rozumí se však, že všechny odkazy na . specifické místo dalece v sekvenci Arabidopsis zahrnují od-povídající místa v sekvenci AHAS kteréhokoli Jiného druhu,majícího gen AHAS. Z pohledu uvedených dat Je zřejmé, že zachování těchtooblastí molekuly AHAS, spojených s odolností proti herbici-dům, není kritické pro katalytickou aktivitu a že deleceJedné nebo více aminokyselin v Jedné nebo více "zachova-ných” sekvencích aminokyselin může být enzymem snadno tole-rována a navíc dodává rostlině odolnost proti herbicidům.Vynález zahrnuje sekvence DNA AHAS, ve kterých byla protisekvenci divokého typu provedena Jedna nebo více dalecí,které nemění katalytickou funkci výsledného enzymu AHAS,avšak způsobují odolnost proti herbicidům. Taková delečnímutace zahrnuje, avšak není na ni omezena, deleci Jednohonebo více kodonů, kódujících tzv. "zachované subsekvence",definované v EP 257793. Jedná se o sekvence DNA, kódujícíaminokyseliny 119-122, 194-197, 201-208, 255-257, 348-353,373-377 a 569-578 v AHAS Arabidopsis. Další "zachovaná sek-vence", v níž byla popsána náhrada a v níž Je delece vhodnák získání odolnosti proti herbicidům, Je 650-653. Vynálezzahrnuje deleci Jednoho kodonu, více než Jednoho kodonu ažvšech kodonů ve výše uvedených "subsekvencích". Výhodné Jsoudelece kodonů, kódujících mutanty, mající dsleci alespoň Jed- noho zbytku v poloze, zvolené ze skupiny zahrnující aminoky-seliny 120, 121, 197, 205, 256, 351, 375, 571, 574, 576 a653. Zvlášt výhodné Jsou sekvence, kódující delece na 197, 574 nebo 653. I když výše uvedené delece představují oblasti, v nichžJe podle dosavadních znalostí tolerována obměna, Je s ohle-dem na značnou "flexibilitu" molekuly pravděpodobné, že bu-dou uskutečnitelné i další delece. Například kromě Již uve-dených zjevně existují další "zachované" oblasti enzymu AHAS.Z pohledu, nevázaného žádnou určitou teorií, se nyní zdápravděpodobné, že většina těchto zachovaných oblastí nenímísty spojenými s katalytickou aktivitou molekuly, a tudížvyžadujícími zachování ve struktuře, ale spíše představujevazebná místa pro herbicid. Delece Jedné nebo více aminoky-selin v těchto místech by tedy logicky bránila navázání her-bicidu a v důsledku toho zamezila Interferenci herbicidus aktivitou AHAS. S použitím této úvahy, dostupných znalostiohledně "zachovaných" sekvencí AHAS /viz například fTlazur etal., Plant Physiol. 85, 1110-1117, 1987/ a známých metod,

Jako Je mutageneze specifická pro vazebné místo, by bylo vě-cí rutiny navrhnout další deleční mutanty, u nichž by sepravděpodobně vyskytovala odolnost proljtllerbicidům. Předpo-kládané mutanty Je pak možno podrobit screeningu pěstovánímv inhibičním množství příslušného herbicidu, a tak stanovit,zda byla či nebyla získána odolnost proti herbicidu.

Jako všechny proteiny má funkční enzym AHAS trojrozměr-nou strukturu, která Je konečným výsledkem lineárního uspo-řádání Jednotlivých aminokyselin. Interakce postranních sku-pin aminokyselin vytváří sekundární strukturu proteinu adalším naskládáním vzniká terciární struktura proteinu. Danáspecifická "architektura" proteinu, která Je důsledkem sek-vence aminokyselin, může být kritická pro funkci proteinu.Substitucí, aminokyseliny dochází k zachování celkové struk-turní integrity proteinu, zatímco vypuštění aminokyseliny tu-to strukturní integritu účinně ničí a lze předpokládat, že významně mění trojrozměrnou strukturu proteinu a přitom měnífunkci molekuly· S ohledem na potenciální poškození, kterémůže být delecí způsobeno, Je tedy zvlášt překvapivé, že sivýsledná molekula uchovává dostatečný podíl své trojrozměrnéstruktury a zůstává nejen katalyticky funkční, ale získává iodolnost proti herbicidům·

Odborníkovi Je zřejmé, že deleční mutanty podle vynálezunejsou omezeny Jen na zdroj DNA nebo enzym. Přestože uvedenáexperimentální část primárně používá sekvenci genu AHAS Ara-bidopsis, Je možno podobné mutace rutinně provádět v sekven-cích AHAS Jakéhokoli organismu, majícího takový gen, napří-klad Jiných vyšších rostlin, kvasinek, E. coli a dalšíchmikroorganismů. Podobnost genu AHAS divokého typu mezi všemiznámými sekvencemi Je tak velká, že vytvořit identické mu-tanty v sekvencích AHAS Jiných než v Arabidopsls Je věcí ru-tinního experimentu. Rovněž Je možno konstruovat chimérickégeny, které obsahují deleční mutantovou část genu AHAS Ara-bldopsis rekomblnovanou s nezměněnými částmi genu AHAS z Ji-ných zdrojů.

Nové typy genů podle vynálezu mohou dodávat odolnostproti Jednomu nebo více typům herbicidů. Jak Již bylo doká-záno, Je AHAS místem působení několika různých skupin herbi-cidů, konkrétně imidazolinů, sulfonylmočovin, trlazolopyri-midinů, sulfamoylmočovin a sulfonylkarboxamidů. Stejně Jakoodolnost proti herbididům, získaná náhradou aminokyselin,může být odolnost, získaná takovouto mutaci, selektivní vůčikonkrétnímu herbicidu nebo může Jít o kombinovanou odolnostproti více než Jednomu herbicidu. Například delecí Trp574 aSerS53 se získá kombinovaná odolnost proti imidazolinům asulfonylmočovinám. Odborník však může snadno určit specifi-citu konkrétního mutantu odděleným screeningem v přítomnostinapříklad pouze imidazolinů nebo pouze sulfonylmočovin aizolací přeživších rostlin. Kombinovaná odolnost může býtstanovena pěstováním v přítomnosti více než Jedné skupiny herbicidů. Typy herbicidů, pro. něž Je vynález použitelný,Jsou popsány například v US patentech č. 4 188 487, 4 201 565, 4 221 586, 4 297 128, 4 554 013, 4 608 079, 4 638 068, 4 547 301 , 4 650 514, 4 698 092, 4 701 208, 4 709 036, 4 752 323, 4 772 311, 4 798 619, 4 127 405, 4 435 206, 4 424 703, 4 417 917, 4 398 939, 4 394 506, 4 391 527, 4 383 113, 4 378 991, 4 372 778, 4 371 391 , 4 370 480, 4 370 479, 4 369 320 /sulfonylmočovíny/ V současnosti Je prokázáno, že AHAS Je nejen přítomenv rozmanitých rostlinách, ale rovněž se zjistilo, že před-stavuje kritické místo, určující citlivost vůči herbicidům,v širokém rozsahu v podstatě nepříbuzných rostlin, napří-klad v kukuřici, Brassica, tabáku, lnu, Arabidopsis a cuk-rovce /Stougaard et al., Atol. Gen. Genet. 219. 413-420, 1989, Jordán a ITIcHughen, J. Plant Physiol. 131 . 333-338,1987, ITIcHughen, Plant Cell Reports 8, 445-449, 1989/. Jakvýše uvedeno, Je pak možno vytvořit relevantní mutaci přímov dané rostlině známými mutagenními metodami. /Viz napříkladITlaniatis et al., Rlolecular Cloning, laboratorní příručka,Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, a příklad II/. Častovšak bude pohodlnější vytvořit transformované rostliny seznámou a izolovanou sekvencí DNA, obsahující potřebné dele-ce, Jako Jsou zde popisované delečni mutanty Arabidopsis»Plasmidy, obsahující delečni mutanty v polohách 574 a 553,byly uloženy 6.12.1990 v American Type Culture Collection,Rockville, ITID, pod přírůstkovými čísly ATCC 68488 a 68489.

Izolované sekvence DNA AHAS podle vynálezu Jsou vhodnék transformaci cílových plodin, kterou se dosahuje odolnostproti herbicidům bez nutnosti mutageneze. K provádění příménebo nepřímé transformace vyšších rostlin s exogenní DNA e-xistuje v současnosti množství metod a vynález zahrnuje veš-keré metody, kterými Je možno novou sekvenci včlenit do hos-titelského genomu tak, aby byla stabilně děděna potomstvem. 10 -

Podrobný popis Jedné z těchto metod Je uveden v příkladech.

Nepřímou transformaci rostlinných buněk Je možno prová-dět s použitím vektorů. Běžnou metodou transformace Je pou-žití Agrobacterium tumefaciens k zavedení cizího genu do cí-lové rostlinné buňky. Například v daném případě se mutantnísekvence AHAS zavádí do plasmidového vektoru, obsahujícíhoboční sekvence v Ti-plasmidové T-DNA. Plasmid Je pak trans-formován do E. coli. Dochází k trojrodičovské kopulaci mezitímto kmenem, kmenem Agrobacterium, obsahujícím Ti-plasmidbez odnoží, obsahující virulentní funkce, nutné k uskutečně-ní přenosu AHAS, obsahujícího sekvence T-DNA, do chromosomůcílové rostliny, a druhým kmenem E. coli, obsahujícím plas-mid, mající sekvence, nutné k mobilizaci přenosu stavebníJednotky AHAS z E. coli do Agrobacterium. K infekci listovýchdisků se používá rekombinační kmen Agrobacterium, obsahujícípotřebné skevence k transformaci rostliny- Disky se pěstujína selekčním médiu a pak se identifikují transformované re-generáty. Získané rostliny Jsou při pěstování v přítomnostiherbicidu odolné proti Jeho účinkům. Vhodný prostředek pře-nosu exogenní DNA poskytují i Jiné rostlinné vektory, JakoJsou rostlinné viry.

Ittísto vektorů Je možno rovněž použít přímé transformacerostlinných buněk. Nejčastěji se protoplasty cílové rostlinyumístí do kultury v přítomnosti přenášené DRA a na jejich po-vrchu Je absorbováno činidlo, podporující příjem DNA proto-plastem. Vhodnými činidly v tomto ohledu Jsou polyethylen-glykol nebo fosforečnan vápenatý. Příjem DNA Je možno také stimulovat elektroporací. Přitéto metodě se používá éLektrického pulsu k otevření dočasnýchpórů v buněčné membráně protoplastu a skrze póry se pak dobuňky natáhne DNA z okolního roztoku. K dopravení DNA přímodo buňky, a výhodně přímo do buněčného Jádra, lze podobněpoužít mikroinjekce. Při každé z uvedených technik dochází k transformaci 11 v rostlinné buňce v kutuře. Po proběhnutí transformace muse-jí být buňky regenerovány na celé rostliny. Metody regenera-ce dospělých rostlin z kalusu nebo protoplastové kulturyJsou nyní známy pro velký počet různých druhů /viz napříkladHandbook of Plant Cell Culture, díly 1-5,. 1983-1989 McMillan,N.Y./. Po dosažení transformace Je tedy regenerace dospělýchrostlin z transformovaných rostlinných buněk pro odborníkaznámou věcí. V současné době Jsou kromě toho dostupné alternativnímetody, které nezbytně nevyžadují použití izolovaných buněk,a tedy regerwativních technik, k provedení transformace. Obecně se nazývají "balistické” metody nebo metody "urychlováníčástic" a kovové částice, povlečené DNA, Jsou při nich hnánydovnitř rostlinných buněk buň náloží černého prachu /Kleinet al., Nátuře 327. 70-73, 1987/ nebo elektrickým výbojem/EP 270 356/. Tímto způsobem Je možno požadovanou sekvencíDNA stabilně transformovat rostlinné buňky v kultuře neboreprodukční orgány nebo buňky rostlin, například qI.

Vynález Je možno použít k transformaci prakticky každé-ho typu rostlin, Jak Jednoděložných, tak dvouděložných. Meziplodiny, u nichž Je možno transformací získat odolnost protiherbicidům, patří kukuřice, pšenice, rýže, proso, oves, Ječ-men, čirok, vojtěška, cukrovka, druhy brukví, rajčata, papri-ky, sója, tabák, melouny, tykve, brambory, podzemnice olejná,hrách, bavlník nebo kakaovník. Nové sekvence mobou být pou-žity také k transformaci ozdobných druhů, Jako Jsou růže, adřevin, Jako Je borovice.

Nové sekvence podle vynálezu Jsou vhodné rovněž Jakovolitelné buněčné znaky při genetických studiích rostlin.Například mohou být při transformaci rostlin sekvence, kódu-jící odolnost proti herbicidům, vázány k příslušnému genu,který má být použit k transformaci cílové rostliny,citlivé vůči herbicidům. Vytvořený úsek, obsahující Jak po- 12 žadovaný gen, tak sekvenci, rezistentní vůči herbicidům, sezavede do buňky a tyto rostlinné buňky se pak pěstují v pří-tomnosti inhibičního množství herbicidu. Rostlinné buňky,které toto ošetření přežijí, pravděpodobně získaly Jako genodolnosti, tak požadovaný gen, a proto Jsou předpokládanétransformanty snadno identifikovatelné. Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1a a 1b ukazují sekvenci aminokyselin, resp. nuk-leotidů divokého typu AHAS Arabidopsis. Zarámované oblastina obr. 1a představují příklady sekvencí, kde Je možno pro-vést deleci, vedoucí k odolnosti proti herbicidům. Zakrouž-kované zbytky identifikují konkrétní místa, kde Je tyto de-lece možno provést, šipka na obr. 1b označuje začátek kódu-jící oblasti.

Obr. 2a-c představuje tři fotografie potomstva /prvnígenerace/, získaného z transgenní tabákové rcstliny /10-1/,transformované úsekem, obsahujícím deleční mutaci Trp574AHAS Arabidopsis, aplikovaným postemergentním postřikem p s imidazolinovým herbicidem Pursuit v koncentraci 0, 10, 20, 40, 60, 30 a 160 g/ha. Všechny tři fotografie byly poří-zeny 25 dní po postřiku. Na všech fotografiích Jsou v prvnířadě kontrolní rostliny /kultivar tabáku divokého typu, cit-livý vůči herbicidům, Wisconsin 33 - W38/. a/ kontrolní W38 a samotný 10-1 - W38 představuje kont-rolu a 10-1 samooplodněné transgenní potomstvo tabáku. Při 0g/ha Pursuitu^ vypadá W38 1 10-1 podobně. Při 10 g/ha Jerostlina W38 ve srovnání s 10-1 lehce inhibována, avšak od20 g/ha Je růst W38 lnhibován téměř úplně. Při 80 g/ha sezdá růst rostliny 10-1 mírně inhibován a při 160 g/ha Je je-jí růst Jasně inhibován. b/ kontrolní W38 a 0 x 10-1 - W38 má výše uvedený vý-znam a 0 x 10-1 představuje W33 Jako mateřského rodiče /0/ a 13 10-1 Jako otcovského rodiče. Výsledky Jsou velmi podobné Ja-ko na fotografii samooplodnšného 10-1. c/ kontrolní W38 a 10-1 x 0 - W3B má výše uvedený vý-znam a 10-1 x 0 představuje 10-1 Jako mateřského rodiče aW38 Jako otcovského rodiče /0/. Výsledky Jsou velmi podobnéJako na fotografii samooplodnšného 10-1 kromě toho, že natéto fotografii Je v potomstvu 10-1 vidět segregace znakuodolnosti proti herbicidům. □

Obr. 3 ilustruje účinek postemeřgentní aplikace Pursuituna růst tabákových sazenic, měřeno výškou rostliny. C před-stavuje střed kontrolních rostlin /citlivý rodičovský kulti-var/ a každý další sloupec představuje Jednotlivé transgennípotomstvo.

Obr. 4 ilustruje účinek imidazolinového herbicidu Pur-

O suit na enzymy AHAS, odvozené od E. coli, transformovanédelecí Trp574 /DEL/, substitucí Trp574 /SUB/ a E. coli,transformované sekvencí AHAS divokého typu /WT/.

Obr. 5 ilustruje účinek sulfonylmočovinového herbicidu p

Glean na enzymy AHAS, extrahované z transformantů E. coli.zkratky mají stejný význam Jako na obr. 4.

Obr. 6 ilustruje účinek imidazolinového herbicidu Pur- p suit na enzymy AHAS, extrahované z transformantů E. coli.Enzymy Jsou odvozeny od E. coli, transformované delecíSerS53 /DEL/, E.coli, transformované substitucí Ser653 /SUB/a E. coli, transformované sekvencí AHAS divokého typu /WT/.

Obr. 7 ilustruje účinek sulfonylmočovinového herbiciduGlean^ na enzymy AHAS, extrahované z transformantů E. coli.Zkratky mají stejný význam Jako na obr. 6.

Obr. 3 ilustruje účinek imidazolinového herbicidu Pur-

R suit na enzym AHAS, odozený z tabákové rostliny pomocí kmene Agrobacterium, obsahujícího mutační allelu AHAS Arabi- dopsis s delecí Trp574. Příklady provedeni vynálezu

Příklad I

Izolace qenomového klonu, kždu~iiciho AHA5 Arabidopsis 2,1 Kb fragment EcoRI, zahrnující promotor, přechodnýpeptid a část dospělé kódující oblasti AHAS Arabidopsis, Jezušlechtující translací značen P^ /ITlaniatis et al., (Tlolecu-lar Cloning: A Laboratory ITlanual, Cold Spring Harbor Labora-tory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982/ a použit Jako hybridi-zační sonda ke screeníngu genomové banky, připravené z geno-mové DNA Arabidopsis thaliana /Clontech, Palo Alto, CA/.Filtry se hybridizují 24 h při 42 °C v 6xSSC, 5 x Denhardto-vě roztoku, 50míT! fosfátu sodném, pH 7,2, 0,1 % SDS a 100/Ug/ml DNA denaturovaného lososího spermatu. Filtry se pro-mývají několikrát při 60 °C v 1xSSC a 0,1 % SDS. Jako prav-děpodobně pozitivní Je klasifikováno šest rekomblnačníchbakteriofěgů /A22, A31, A42, A52, A72, A83/. Tyto bakterio-fágy se podrobí čištění plaků a infikují s nízkou raultipli-citou kmenem E. coli K802 v kapalném bujónu NZY /NZCYlfl Je 10g aminu NZ, 5 g NaCl, 5 g droždového extraktu, 1 g kasamino-kyselin, 2 g ff!gSC!4.7H20 a 10 ml 1ΙΪ1 tris-HCl, pH 7,2/ postu-pem podle ÍYlaniatise et al·, viz výše. Kapalné kultury se in-kubují přes noc při 37 °C za stálého míchání /300 otáček zaminutu/. K 50 ml roztoku se přidá pevný chlorid sodný a pev-ný polyethylenglykol do 1 ÍYl NaCl a 8 % PEC. K vysrážení bak-teriofágů se suspenze inkubuje přes noc pří 4 °C. Bakterio-fágy se peletizují centrifugováním pří 18000 x g po dobu 20min. Peleta se resuspenduje v 2 ml pufru ΤΓΠ /10 mm tris-HCl,pH 7,5, 10 míTl ITlgClg/, nalije na stupňový gradient CsCl /4,8(Ϊ1 CsCl, 4,0 ΙΪΙ CsCl a 3,2 ÍYl CsCl/ a centrifugu Je 1 h při50000 x g v zařízení SW60 s kyvnými lopatkami. Pruh -Tágu sepřenese z rozmezí 4,0/3,2 ÍYl CsCl do 1,5 ml Eppendorfovy zku-mavky a bakteriofágy se lyžují přídavkem 1 objemu formamidu 15 a inkubují 30 min při teplotě místnosti. DNA se získá dopl-něním roztoku na 10 mflf] tris-HCl, pH 8,0 a 1 mflfl Na2“EDTA avysrážením DNA přídavkem 2 objemů 100% ethanolu. Bakteriofá-gová DNA se izoluje centrifugací, promyje 70% ethanolem aresuspenduje v pufru TE /pufr TE Je 10 míT) tris-HCl, pH 7,5, 1 míYl Na2~EDTA/» Vyčištěná DNA se rutinně extrahuje Jednou ažněkolikrát směsí fenol - chloroform - isoamylalkohol 24:24:1,vysráží ethanolem a resuspenduje v 50 až 100 ^ul pufru TE,načež se digeruje s různými restrikčními enzymy. Přípravky DNA ze šesti rekombinačních fágů se dIgoruJís různými restrikčními enzymy a štěpí elektroforézou na 1%agarosovém gelu. DNA se přenese na nitrocelulózu /Southern/a hybridizuje /24 h při S0 °C v 2xSSC, 5 x Denhardtov# roz-toku, 50 míYl fosfátu sodném, pH 7,2, 0,1% SDS a 100 yug/mlDNA denaturovaného lososího spermatu/ proti radioaktivněznačenému 900 bp fragmentu Ncol/EcoRI, představujícímu ob-last 3* 2,1 Kb fragmentu EcoRI /přechodný peptid a podíl 5*dospělé kódovací oblasti/. Filtr se promyje dvakrát při 65C v 0,5xSSC a 0,1% SDS. 900 bp fragment Ncol/EcoRI se hybri-dizuje k fragmentu 5,5 Kb Xbal a 2,1 EcoRI Jak A42, tak A52.Tyto údaje souhlasí s publikovanými informacemi o klonovánía charakterizaci genomové sekvence, kódující AHAS Arabidop-sis /fflazur et al·, Plant Physiol. 85, 1110-1117, 1987/.

Pro další analýzu Je zvolen bakteriofág A52. 5,5 Kbfragment Xbal A52 se izoluje z 1% agarózového gelu a čistív elektroelučním zařízení IBI podle doporučení výrobce. 5,5Kb fragment Xbal se vysráží ethanolem a resuspendujev dd^O· Tyto fragmenty se naváží na plasmidovou DNA Xbal,digerovanou pSK/-/ /dodávanou fou Stratagene, La Jolla, CA/.Fragmenty se navazují po dobu 16 až 24 h při 14 °C v objemu20 /ul podle flflaniatise et al., viz výše. Po inkubaci se re-akční objem 20 ^ul zředí 100 mflfl tris-HCl, pH 7,2, na 100 yUl.25 /Ul tohoto vzorku se dále 100 mirtris-HCl, pH 7,2, zředína 100 /Ul a inkubuje se 100 ^ul vhodných buněk HB101, při- 16 pravených přesně podle (Ylorrisona /ÍYleth. Enzymol. 68, 326-3311979/· Transformační směs plasmid/E. coli se 20 min inkubujena ledu, na 2 min přivede na 42 °C, 10 min při teplotě míst-nosti, načež se okamžitě přidá 1 ml bujónu LB /bujón LB Je10 g baktotryptonu, 5 g droždového extraktu, 5 g NaCl a 10ml 1 (YI tils-HCl, pH 7,2, na 1 litr/ a dále se inkubuje 20 minpři 37 °C. Vehikula, klonující plasmid DNA, použitá v tétopráci, nesou Jeden z genů, dodávajících odolnost proti ampi-cilinu nebo kanamycinu. Proto se 200 /Ul každé transformačnísměsi umístí přímo buó na plotny LĎarop nebo t-Bj<an /100 /Ug///ul každého antibiotika/ a inkubuje se podle velikosti ko-lonie 12 až 20 h při 37 °C.

Kolonie se přenesou do 3 ml t-B nebo LBa inkubujíza stálého míchání přes noc: při 37 °C. V malém měřítku seplasmidové přípravky DNA připravují mírně modifikovanou me-todou alkalického rozkladu, popsaného (Ylaniatisem et al., vizvýše. Rutinně se 400 /ul z 3 ml kultury, vzniklé přes noc,peletizuje v 1,5 ml EppendorfovŠ zkumavce a resuspenduje ve150 /ul roztoku GTE /roztok GTE Je 50 mTFl glukóza, 25 mTO tris-HC1, pH 8,0 a 10 mffl Na2~GDTA/ a inkubuje 20 min na ledu,načež se přidá 300 /Ul alkalického roztoku SDS a 200 /ul 5 ÍTIK+/3 (H GAc v předepsaných časových intervalech. Konečná pe-leta DNA se resuspenduje ve 40 /til 50 ^g//ul RNAzy A v pufruTE. 15 /Ul plasmidové DNA se oddělí pro restrikční digeraci.Dva plasmidy, pAC301 /5*-·3*/ a pAC302 /3* —> 5*/, před-stavují úseky, obsahující 5,5 Kb fragment Xbal, vázaný k místu Xbal pSK/-/. Další restrikční analýza pAC301 a pAC3O2 po-tvrzuje přítomnost promoční oblasti, přechodného peptidu,dospělé kódující oblasti a oblastí bez 3'-translace genomovésekvence, kódující AHAS Arabidopsis /Mazur et al., viz výše/ 17

Příklad II fYlutaqeneze kodurllcí oblasti AHAS Arabidopsls, směrovaná do oliqonukleotldovvch míst a/ Příprava dednořetězcového templátu pAC3Q1 - plasmidpAC301 Je transformován do kmene E. coli XL-1 /Stratagene/.Jednořetězcový teraplát pAC301 Je generován z této konstrukcena bázi "fágmidu" podle návodu výrobce. Rutinně se 3 ml kul-tury SBg , získané přes noc, přidá do sterilní banky, obsa-hující 50 ml SBg /SB Je 35 g baktotryptonu, 20 g droždové-ho extraktu, 5 g NaCl a 10 ml 1 Π) tris-HCl, pH 7,5, na litr-/a inkubuje za stálého míchání /300 otáček za minutu/ pří 37°C do dosažení 0D6Q0 0,3. V tomto okamžiku se kultura inoku-luje pomocným fágem R408 /1 x 10 fágů/ a přes noc se pokra-čuje v intenzivním míchání při 300 otáčkách za minutu při 37°C. Bakterie se centrifugací při 10000 x g peletizují po do-bu 10 min. Peleta bakterií se odstraní a supernatant /při-bližně 45 ml/, obsahující Jednořetězcový templát pAC301, sedo použití skladuje při 4 °C. Supernatant se rutinně používámaximálně do Jednoho měsíce k přípravě Jednořetězcových fág-midů. ITlalorozměrné přípravky /1 ,2 ml/ Jednořetězcové fágmi-dové DNA pAC301 se připravují v podstatě podle pokynů výrob-ce /Stratagene/. Fágy se srážejí přídavkem 300 ^ul 3,5 ΓΠNH^Ac, pH 7,5, 2D % ťoiztoku PEG. Roztok se dokonale promícháv 1,5 ml Eppendorfově zkumavce a inkubuje 20 min při teplotěmístnosti. Jednořetězcové fágy se peletizují centrifugací podobu 20 min v Eppendorfově mikrocentrifuze. Supernatant sedekantuje, peleta se vysuší a nakonec resuspenduje v 300 /Ulpufru TE. Fágy se lyžují př^pjiavkem 200 ^ul aměsi fenol -- chloroform -isoamylalkohol 24x24:1 a 1 min mícháním. Tentokrok sa Jednou opakuje a pak se provedou Ještě dvě extrakcesměsí chloroform - Isoamylalkohol 24:1. Konečná vodná fáze sevysráží ethanolem /desetina objemu 5 (Γ. K+/3 IYl OAc a dva obje-my 100% ethanolu/, promyje 70% ethanolem, resuspenduje ve 20 18 /Ul pufru TE a přenese do čerstvé 1,5 ml Eppendorfovy zku-mavky» c/ Příprava oligonukleotldu - všechny oligonukleotidybyly zakoupeny v New England .Blolabs. Qligonukleotidy se po-užívají k zavedení 1/ substituce aminokyseliny ve zbytkuTrp574 kódující oblasti AHAS Arabidopsis /Trp Leu/ a 2/delece aminokyseliny v aminokyselinovém zbytku Trp574. substituce Trp574 --·> Leu

V PR Q W E D R divoký typ 5*-GTT ATG CAA TGG GAA GAT CGG-3*

V ÍYl Q L E D R mutant 5*-GTT ATG CAA TTG GAA GAT CGG-3* /21-mer/delece Trp574 V (Π Q W E 0 Rdivoký typ 5*-GTT ATG CAA TGG GAA GAT CGG-3*

V ffi q E D R mutant 5'-G GTT ATG CAA ---GAA GAT CGC /21-mer/ 200 ng každého nukleotidu se před hybridizací k Jedno-řetězcovému templátu pAC301 podrobí výměnné reakci s kinázou.Reakční objem 40 ^ul zahrnoval 50 míYl tris-HCl, pH 7,5, 10 roflflÍTgCl2> 50 mfli DTT, 0,1 milí spermidinu a 0,1 mRl Na2“EDTA. Reak-ce se iniciuje přídavkem 10 Jednotek T4-polynukleotidkinázy/Pharmacia/ a směs se inkubuje 30 min při 37 °C. Reakce seukončí přivedením reakční směsi na dobu 3 min na 90 °C· Po-lovina kinázové reakční směsi se přidá k celému množství20 /Ul Jednořetězcového přípravku pAC301 a hybridizace sepodporuje 10minutovou inkubací při 65 C» K těmto 40 ^ulsměsi kináza/oligonukleotid se přidá 6 ^ul 1mfíl dNTP, 6 yUl10 x ligázového pufru /500 mlY! tria-HCl, pH 7,5, 70 míli fflgC^a 10 mfn DTT/, 2 ^ul 10míTI rATP, 5 Jednotek Klenowovy DNA po-lymerázy /Pharmacia/, 8 Jednotek DNA ligázy /Stratagene/ a 4 19 - yul ddh^Q. Ligační reakce s polymerázou se inkubuje 3 h přiteplotě místnosti. Polovina směsi se použije k transformacivhodných buněk XL-1 E. coli. Transformační směs se rozpro-stře na plotny LB a inkuhuje přes noc při 37 °C. Trans-formanty se podle čtverečkované šablony přenesou na Čerstvéplotny LBarop. Screening kolonií hybridizací byl provedenpřesně podle Stratagene Technical Service /červen 1983,pBSII Exo/fflung Beán DNA Sequencing System/. Oba nukleotidy

Jsou značeny P výměnnou reakcí s kinázou /300 ng oligonuk-32 leotidu v přítomnosti 40 zuCi P-ATP s použitím podmínek32 pro kinázu, popsaných výše/. Neinkorporovaný P-ATP se od-straní elektroforézou kinázové reakční směsi přes gel 20 %akrylamid/7 ΓΓ! močovina. Radioaktivní pás, odpovídající 21--mernímu oligonukleotidu, se ad gelu adřízně žiletkou a e-luuje buď 1/ metodou "crush and soak" flflaxama a Gilberta/PNAS LÍSÁ 74, 560-566, 1977/ nebo 2/ elektraelucí v elektro-elučním přístroji IBI. Čištěné radioaktivně značené oligo-nikleotidy se hybridizují za mírných podmínek /37 °G po dobu24 h v 6xSSC, 5 x Denhardt, 50 irfTI Na-P, pH 7,2 a 500 /ug/^ulDNA telecího brzlíku/ k vyvýšeninám nítrocelulózové kolonie.Filtry se promývají Jednou při teplotě místnosti v 6xSSC a50 nJTl Na-P, pH 7,2. Nakonec se filtry promyjí dvakrát při 60°C v 15 min intervalech v 3íYl tetramethylamoniumchloridu, 50raflfl tris-HCl, pH 7,5, 2 mflfl Na2~EDTA a 1 mg/ml SDS. Z 21-mer-ního oligonukleotidu s dokonalou hybridizací báze k bázi/tj. oligomerní mutant k fágmidovému mutantu/ se při 60 °Cfágmidová DNA nevymyje, zatímco při mírné odchylce v hyfari-dizaci /tj. oligomerní mutant k fágmidu divokého typu/ sevymyje. Předpokládané pozitivní produkty se z původní plotny LB přenesou na čerstvou plotnu LB . Deset transfromantůamp r r amp z každého z nich se pak uspořádá čtverečkovitě a hybridizace kolonií se opakuje. Sekundární pozitivní produkty se pak po- tvrdí analýzou sekvence DNA v kódující oblasti Trp574 /Sanger et al., PNAS USA 74, 5463-5467, 1977/. Pro další analýzu by- 20 ly vybrány dva pozitivní mutanty pAC324 /substituce Trp574—> Leu/ a pAC325 /delece Trp574/.

Příklad III

Transformace tabáku prostřednictvím Aqrobacterlum a/ Konstrukce vektorů - vektory i kmen Agrobacteriumbyly zakoupeny u Clontech. Plasraid pBIN19 3® binární kyvad-lový vektor, mající levou i pravou hraniční sekvenci Ti-plasmidové T-DNA, polylinker, bakteriální původ replikace RK2,funkční v E. coli i v Agrobacterium, a gen dodávající odol-nost proti kanamycinu /Bevan, Nucl. Acids Res. 12. 8711--8721, 1984/. Plasmidy pAC324 a pAC325 se digerují s Xbal apodrobí elektroforéze přes 1% agarózový gel. 5,5 Kb fragmentXbal, obsahující příslušnou mutaci pAC324 a pAC325, se izo-luje výše uvedeným způsobem. Plasmid pBIN19 se digeruje Xbala inkubuje při oddálené ligační reakci s 5,5 Kb fragmentemXbal z pAC324 a pAC325. Celá ligační směs se transformuje doXL-1 buněk E. coli a pozitivní transformanty se vybírají se-lekcí modrá/bílá barva na plotnách LBg^x /plotny LB s 100/Ug/yUl arapicilinu, 80 ^ug/ml X-Gal a 20 mlíl IPTG/. Přípravaplasroidů v. malém měřítku, restríkční digesění analýza a e-lektroforéza na agarózovém gelu k potvrzení pozitivníchtransformantů se provádí výše popsaným způsobem. Ze Čtyřplasmidových konstrukcí na bázi pBIN19, pAC348-pAC349 /oběorientace 5,5 Kb fragmentu Xbal, obsahujícího v pBIN19 sub-stituci Trp574 —r> Leu/ a pAC35Q-pAC351 /obě orientace 5,5Kb fragment»Xbal, obsahující v pBIN19 deleci Trp574/, se protransformaci tabáku volí Jedna konstrukce z každé mutace. b/ Mobilizace pAC348-oAC351 do Agrobacterium

Plasmid pRK2Q13 Je konjugativní plasmid, obsahující trans-působící sekvence, nutné k mobilizaci úseků na bázi pBIH19 z E. coli do nerozvětveného kmene Agrobacterium - 21 L3A4404 /pAL44Q4/. Tento kmen Agrobacterium Je rezistentnívůči streptomycinu a obsahuje nerozvětvený plasmid TipAL4404 /Ooms et al., Plasmid 7, 15-29, 1982/. Tento Tiplasmid má účinné transakční funkce, nutné k usnadnění pře-nosu oblasti T-DNA na bázi pBIN19 do chromozómu tabáku.Trojrodičovské kopulace vektorů na bázi pBIN19, konjugativ-ního plasmidu /pRK2013/ a kmene Agrobacterium /LBA44D4/ seprovádějí v podstatě postupem podle Bevana /Nucl. Acids Res.12, 8711-8721, 1984/. Plasmidy pAC348-351 /Kan^ a pRK2O13/Kan / se transformují do vhodných buněk HB101 nebo XL-1 E.coli výše popsaným způsobem. Transformanty, obsahující Jed-notlivé plasmidy, se inokulují do 3 ml bujónových kulturL^kan a louhují za stálého míchání při 37 °C. Kmen Agrobac-terium LBA44Q4 se inokuluje do média ABgtrp /20 x AB Je 20 gNH4C1, 6 g RigSO^T^O, 3 g KC1, 80 g K2HPQ4,· 20 g NaM2Pa4, 3g CaCl2 a 50 mg FeS04.7H20. K 1 x zásobnímu roztoku Je při-dána glukóza do konečné koncentrace 0,5 x/ a inkubuje 36 až48 h při 28 °C za stálého míchání. Trojrodičovská kopulaceJe iniciována spojením 1 ml každé ze tří kultur /úsek na bá-zi pBIN19, pRK2013 a LBA4404/ ve sterilní zkumavce a dalšíinkubací po dobu 1 h při 28 °C. Kultura se vakuově zahustí na0,45 /uDřl filtr a inkubuje přes noc při 28 °C na plotně NB/NB Je 4 g práškového živného bujónu Difco a 10 ml 1 (TI tris--HC1, pH 7,2/. Filtr se umístí do 2 ml čerstvého média AB a1 h se nechá pomalu otáčet. Zředovací řada se nanese na plot-ny ABgtrp/kan a ir,kubuje 3 až 4 dny při 28 °C. Na médiuA^strp/kan ros^ou Pauze Agrobacteria /strpr/, nesoucí úsekna bázi pBIN19 /kan^/. Jednotlivé kolonie z ploten ^3trp/kanse inokulují do bujónu ^®strp/kan a in*<u^u3í za stálého mí-chání 36 až 48 h při 28 °C. Tyto kultury se znovu nanesou naplotny inkubují 3 až 4 dny při 28 °C a skladují do použití při 4 c/ Transformace tabáku orostřednictvim Agrobacterium pAC348 a pAC351 se inokulují do 50 ml ABkgn a inkubují - 22 36 až 4Θ h při 23 °C za stálého míchání. Bakterie se peleti-zují 10 min centrifugováním při 2500 otáčkách za minutu vestolní odstředivce Damon/IEC. Bakteriální peleta se resupen-duje v 5 ml média BAT /médium BAT Jsou 1x soli [TIS /flbrashigea Sk©og, Plant Physiol. 15. 473-497, 1962/, 1x vitaminy B^/100x Bg Je 10 mg myo-inositolu, 100 mg kyseliny nikotinové,100 mg pyridoxin-HCl a 1000 mg thiamin-HCl na 1 litr/, 3 %sacharózy, 5 ^ulTl 6-benzylaminopurinu o pH 5,77. ÍTlladé listytabáku Wisconsln 38, vypěstovaného ve skleníku, se rozříznouna dvě podélné části a ponoří do teplé vody, obsahující toa-letní mýdlo Ivory. Řezy listů se promyjí sterilní destilova-nou vodou, ponoří na 10 min za míchání do 10% roztoku Clorox ++ Tween 20 a 3x propláchnou dd^G. Z těchto řezů se korkovrtemnebo důlčíkem vyříznou kotoučky. Tyto kotoučky se umístí do50 ml zkumavky, obsahující resuspendovanou kulturu Agrobac-terium. Suspenze se 5 min pomalu míchá, nechá okapat ne ste-rilním papírovém ubrousku a pěstuje na plotnách s médiemBAT. /plotny 100 x 20 mm s přibližně 10 kotoučky na plotnu/.Plotny se inkubují 48 h při 25 °C pod fluorescenčním osvět-lením. Kotoučky se pak přenesou do selekčního média /BATCK;médium BAT plus karbenicilin a kanamycin/ a po vytvoření vý-honků se vrátí do původních inkubačních podmínek. Výhonky,rezistentní vůči kanamycinu, se přenesou do selekčního /za-kořeňovacího'' média OTCK /médium QTCK Je médium BATCK minus6-benzylaminopurin/ v boxech /GA7/ ITlagenta a pokračuje sev inkubaci za výše uvedených podmínek. Jakmile výhonky, re-zistentní vůči kanamycinu, vytvoří dostatečný kořenový sys-tém /alespoň 3 kořeny delší než 1 cm/, přenesou se rostlinydo půdy. Stručně řečeno, výhonek zakořeněný v agaru se vyjmez boxu GA7, agar se opatrně opláchne teplou vodovodní vodoua výhonky se přenesou do metromíxu v rašelinových květnícíchv nádobách GA7. Rostliny se umístí do skleníku a nechají seotužit. Do půdy se přenese celkem 5 výhonků, rezistentníchvůči kanamycinu, obsahujících pAC348, a 9 výhonků, rezistent- 23 nich vůči kanamyclnu, obsahujících pAC350. Přibližně po 10až 14 dnech se rašelinové květniky přemisti do většich květ-niků. pAC348 pAC351 transformant: transformant: 1/ 19-1 1/ 10-1 2/ 33-1 2/ 20-1 3/ 33-2 3/ 20-2 4/ 46-1 4/ 20-3 5/ 46-2 5/ 27-1 6/ 27-2 7/ 27-3 8/ 30-1 9/ 42-4

Přiklad IV

Stanoveni a charakterizace mutantů. dodávalicich odolnost proti herbicidům

Test enzymu AHAS /listová tkáň/ - krátce po přenesenido skleniku se připraví extrakty Jednotlivých transformantů,rezistentních vůči kanamyclnu, a testji se na necitlivost

D vůči lmidazolinovému herbicidu Pursuit . Syntáza acetohydro-xykyseliny se extrahuje a testuje výše popsaným postupem.

Dva transformanty, rezistentní vůči kanamyclnu /33-1 a 46-2/,která obsahuji mutační allelu allely AHAS Arabidopsls sesubstituci Trp574 Leu, vykazuji v přítomnosti herbiciduPursuit^ aktivitu AHAS. Kromě toho aktivita AHAS delečnihotransformantu, rezistentního vůči kanamyclnu /10-1/, výkazu-Je necitlivost vůči přídavku herbicidu Pursuit /obr. 7/.Tento delečni transformant Trp574 Je samooplodněn a zkřížens Wisconsinem 38. Potomstvo 10-1 vykazuje toleranci vůčipostemergentni aplikaci herbicidu Pursuit 4 až 8krát větší 24 než Je letální koncentrace pro tabákové rostliny.

Na obr. 2a až c Je fotografické porovnání fenotypů výšepopsaných kříženců a kontrolních Jedinců. Tato pozorování u-kazují na dědičnost odolnosti, pozorované v původním testuAHAS z transformované listové tkáně, a expresi tohoto znakuna úrovni celé rostliny.

Kvantitativnější test se provádí tak, že se semena sa-mooplodněného potomstva transgenní tabákové rostliny /10-1/,obsahující mutaci AHAS Arabidopsis s delecí Trp574, a semenavhodného rodičovského kultivaru "Wisconsin 38” vloží do lYlet-romixu 350 v květnících Azalea o vdlikosti 12,7 cm. Po 2dnech se rostlinky protrhají a ponechá se vždy Jediná nej-silnější. Po Jedenácti dnech se tyto rostliny postemergentněpotsříkají Pursuitem^ v koncentraci 0, 10, 20, 40, 80 a 160g/ha. Jednou koncentrací se ošetřuje pět rostlin každého typu/transgenního i kontrolního/. Před postřikem se k roztokuherbicidu přidá 0,25 % objemových Tweenu 20^. Herbicid seaplikuje pomocí laboratorního pásového potřikovače v dávce400 1/ha ze vzdálenosti 46 cm nad rostlinami při rychlostipásu 8,2 s na otáčku s potřikovací tryskou č. 65015E. Výškarostlin se měří po 1, 2, 3 a 4 týdnech po ošetření a údajeo živé hmotnosti rostlin se sbírají po čtyřech a půl týdnech. Výsledky tohoto postřiku Jsou znázorněny na obr. 4. li-de Je pro potomstvo Jsou v grafu uvedeny tak, že nejvíce to-lerantní Jedinec Je uveden první a nejnáchylnější Jedineeposlední, a to pro každou koncentraci herbicidu. Jak Jez grafu zřejmé a Jak se předpokládá podle samooplozeného po-tomstva původní transgenní rostliny, potomstva se dělí podletolerance vůči herbicidu. Je možno pozorovat Jak náchylnépotomstvo, tak Jedince s různým stupněm tolerance vůči her-bicidu. V tabulce 1 Jsou uvedeny průměrné hodnoty čerstvé hmot-nosti rotlin /g/ pro každou koncentraci herbicidu. 25

Tabulka 1 střední hmotnost tabáku /g/: kontrola transgenní potomstvo /z 5 hodnot/ koncentrace herbicidu /g/ha/ ' 0 52,1 53,7 10 8,1 36,4 20 2,0 28,8 40 0,8 20,9 80 0,5 25,5 150 0,2 21 ,4

Jak Je z této tabulky zřejmé, samooplodněné potomstvo transgenní tabákové rostliny /10-1/ vykazuje vysoký stupeňR ř tolerance vůči postemergentní aplikaci Pursuitu . Náchylnýrodičovský kultivar nevykazuje při žádné testované koncent-raci toleranci vůči herbicidu.

Semena, pocházející z transgenní rostliny 10-1, serovněž testují na éfiolnost proti imidazolinovému Pursuitu ·Semena Jsou umístěna na médium, obsahující Pursuit^ v kon-centraci 0, 1,25, 2,5, 3,75 a 5,0 /uffl. Pro každou koncentra-ci. se použijí dvě Petrího misky po dvaceti semenech. Tole-rance rostlinek vůči herbicidu se hodnotí po třech týdnech.Výsledky v hmotnostech /g/ čerstvých rostlin při koncentraci5,0 /UÍTl Jsou uvedeny v tabulce 2. Kontrolní rostliny vykazo-valy citlivost vůči herbicidu i při nejnižší koncentraci/1 ,25 /UÍTi/. Tyto výsledky ilustrují dědičnost znaku odolnos-

ti proti herbicidům z rodičovské tomstvo. rostliny 10-1 na její po Tabulka 2 Pursuit^ koncentrace 5 /uffi S D R potomstvo: W38 /divoký typ/ 20 0 0 2.0 0 C 26 10-1 7 6 6 samooplodněný 3 11 6 10-1 x 0 11 9 0 11 9 0 0 x 10-1 10 9 0 3 8 0 S - náchylný D - poškozený R - odolný

Příklad V

Test enzymu AHAS v E. coll

Test enzymu AHAS /exprese v E. coli/ - mutanty pAC224 apAC225, směrované do míst, se použijí Jako templáty pro vytvoření expresního systému na bázi E. coli. K testování necitli-vosti vůči herbicidům se použije exprese daného genu vyššírostliny v bakteriálním kmeni, zbaveném veškeré endogenníaktivity AHAS. Za tím účelem se fragment Ncol/Pst1 divokéhotypu AHAS Arabidopsis /pAC3Q1/, substituce Trp574-Leu /pAC224/ a delece Trp 574 /PAC225/ subklonují do místa Nco1/ /Pst1 expresního vektoru E. coli pKK233-2 /zakoupeného uPharmacia/. Tento expresní plasmid obsahuje promotor, indu-kovatelný IPTG, ajterminační sekvenci transkrlptoru. Obě tytooblasti obklopují sekvenci Nca1, HlndlII a linkeru Pst1, kte-rá umožňuje správnou orientaci příslušného genu ve vztahuk bakteriálnímu promotoru. Subklonování a ligace Jednotli-vých fragmentů Nco1/Pst1 do DNA pKK233-2, digerované Nco1//Pst1 /odolnost proti ampicilinu/ se provádí výše popsanýmzpůsobem. Llgační reakce Je transformována do kmene E. coliIYF2Q0Q /£lvB800:mu-1, Bg132, ilvI15, thi-1, argE3, RPSL31,/ara-leu, ilvHI/ 963, mtl-1, xyl-5 galK2, lacYI, recAl?.

Tento bakteriální kmen Je prost endogenní aktivity AHAS. Pro- 27 - to pěstování na minimálním médiu bez isoleucinu a valinu/koncové produkty aminokyselinové biosyntetlcké dráhy, na nížse podílí enzym AHAS/ ve kmeni ÍTF2000, transformovaném buópAC224 /Trp574-Leu/ nebo pAC225 /trp del/, vyžaduje expresia funkci genu Arabidopsis v E. coli. Každá z těchto tří kon-strukcí doplňuje na agarovém médiu i v bujónových kulturáchÍTF2000·

Jednotlivé kolonie (TF2000, obsahující Jeden z plasmido-vých úseků pAC210, pAC224 nebo pAC225, se inokulují do 3 mlbujónových kultur minimálního média ΓΠ63 /amp/, obsahujícíchaminokyseliny arginin, leucln, isoleucin a valin /ÍTÍ63 Je 30g KH2PO4, 70 g K2HPO4, 20 g /NH4/2S04, 5 mg FeS04, 100 /U1 1lil flflgSQ^, 200 /Ul thiaminu. Koncentrace gldózy Je zvýšena na 1,2 %/. Kultury se inkubují přes noc při 37 °C za stálého mí-chání· Bakteriální buňky se peletizují, resuspendují v něko-lika ml ΡΠ6Ί3 /amp/, doplněného argininem a leucinem, ale bez v isoleucinu a valinu /médium minus ilv/. Buňky se přenesou do10 až 50 ml média minus ilv a stále se přes noc míchají při37 °C. Pak se buňky peletizují a buá použijí přímo k testůmenzymu AHAS, nebo před použitím zmrazí na -20 °C.

Extrakce a test AHAS Arabidopsis v bakteriálních buň-kách se provádí v podstatě podle Singha et al. /J. Chromato-graphy 444. 251-261, 1988/. Bakteriální peleta se v kapalnémdusíku převede do formy prášku a homogenizuje v 100 mfO pufruna bázi fosfátu draselného /pH 7,5/, obsahujícím 10 míTl pyru-vétu, 5 mlYl chloridu hořečnatého, 5 míTl Na2~EDTA, 100 /Uffl fla-vln-adenin-dinukleotidu /FAD/, 1 mňl valinu, 1 min leucinu, 10 % objemových glycerolu a 10 mHl cysteinu· Homogenát sepřefiltruje přes nylonovou tkaninu /53 yUÍYl mesh/ a 20 mincentrifuguje při 25000 x g. Supematantová frakce se nasytína 50 % s ohledem na síran amonný a nechá 20 až 30 min státna ledu. Sraženina se peletizuje centrifugací po dobu 20 minpři 25000 x g. Supernatant se odstraní a peleta síranu amon- 28 - ného se použije přímo nebo se před použitím zmrazí kapalnýmdusíkem a skladuje při -20 aC.

Aktivita AHAS v přítomnosti nebo nepřítomnosti herbici-du se měří stanovením produktu acetolaktátu po konverzi de~karbaxylací kyseliny na acetoin. Standardní reakční směsiobsahují enzym /a herbicid/ v 50 mltt pufru na bázi fosfátudraselného /pH 7,0/, obsahujícího 100 mffl pyruvátu aodného, 10 mfTÍ chloridu hořečnatého, 1 mfTl pyrofosfátu thiaminu /TPP/a 10 /UÍTI FAD. Tato směs se inkubuje 1 h při 37 °C. Reakce sezastaví přídavkem kyseliny sírové do konečné koncentrace 0,85%♦ Reakční produkt se nechá dekarboxylovat 15 min při 60 °C.Vzniklý acetoin se stanovuje inkubací s kreatinera /0,17 %/a 1-naftolem /1,7 %/ postupem podle Westerfelda /J. Biol.Chem. 161. 495-502, 1945/. Během testů enzymu se provádějípříslušné zkoušky přímé tvorby acetoinu. AHAS Arabidopsis divokého typu /pAC201/ Je citlivá vůčiimidazolinovému herbicidu PursultH a sulfonylmočovinovémuherbicidu Glean , zatímco Jak substituce Trp574-Leu /pAC224/,tak delece Trp574 /pAC225/ Je necitlivá ke vzrůstající kon-centraci herbicidu Pursuit /obr. 4/ i herbicidu Glean /obr.5/. Delece překvapivě dodává ekvivalentní nebo vyšší hladinunecitlivosti vůči těmto herbicidům než odpovídající substi-tuce. Delece zbytku Trp574 kódující oblasti AHAS Arabidopsistedy vede k funkční formě enzymu, která Je necitlivá vůčipřídavku každého z obou nepříbuzných herbicidů, schopných in-hibovat formu enzymu divokého typuk Výše uvedený postup se používá rovněž k provedení sub-stituce šeřinu v poloze 653 asparaglnem a delece v- této po-loze. Plasmidy, obsahující substituci /pAC229/ nebo deleci/pAC23D/, se transformují do (TF2Q00 E. coli a pro oba se výšepopsaným postupem stanovuje aktivita delečních a substituč-nich mutantů v přítomnosti herbicidů Pursuit a Glean . AHAS, vzniklá substitucí šeřinu asparaginem, Je podle dřívěj-ších údajů /Sathasivan et al., viz výše/ necitlivá k inhibi- 29 -

n R ci Pursuitem /obr. 6/, ale citlivost vůči Gleanu je pouzemírně snížena /asi o 10 %/ v porovnání s enzymem divokéhotypu /obr. 7/. Naproti tomu AHAS, získaná cfelecí Ser653, Je p p vysoce odolná vůči inhiblcl Jak Pursuitem , tak Gleanem/obr. 6 a 7/.

Uloženi biologického materiálu U American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,Rockville, (Ttaryland, 20357, byly 6.12.1990 uloženy pod uvede-nými přírůstkovými čísly tyto mikroorganismy: mikroorganismus pAC351 /Agro/351/, získanýz kwevse Agrobacterlum LBA4404/delece Trp574/ plasmid pAC324, získanýz kmene Agrobacterlum LBA4404/delece Ser653/ přírůstkové číslo 68488 58489

Claims (16)

- 30 - PATENTOVÉ NÁROKY í]

1. Sekvence nukleové kyseliny, kódující funkční ertžyjp,^-*AHAS, Jehož se_kvence aminokyselin se liší od sekvence AHA5divokého typu alespoň Jednou delecí aminokyseliny, dodávají-cí enzymu odolnost proti herbicidům.

2. Sekvence podle nároku 1, vyznačující se tím, že de-lece Je přítomna v zachované oblasti sekvence AHAS.

3. Sekvence podle nároku 1 až 2, vyznačující se tím, žedelece se vyskytuje v oblasti sekvence AHAS Arabidopsis di-vokého typu, zvolené ze souboru zahrnujícího aminokyseliny119 až 122, 194 až 197, 201 až 208, 255 až 257, 348 až 353,373 až 377, 559 až 578 a 550 až 553 nebo homologní oblasti v odlišném druhu.

4. Sekvence podle nároku 1 až 3, vyznačující se tím, žedelece se vyskytuje v alespoň Jedné poloze, zvolené ze sou-boru zahrnujícího aminokyseliny 121, 122, 197, 205, 255, 351, 376, 571, 574, 578 a 553.

5. Sekvence podle nároku 1 až 4, vyznačující se tím, žeodolnost se projevuje vůči alespoň Jednomu herbicidu, zvole-nému ze souboru zahrnujícího imidazoliny, sulfonylmočoviny atriazolopyrimidiny.

6. Funkční enzym AHAS, Jehož sekvence aminokyselin seliší od sekvence AHAS divokého typu alespoň Jednou delecí a-mingkysellny, dodávající enzymu odolnost proti herbicidům.

7. Enzym podle nároku 5, vyznačující se tím, že delecese vyskytuje v zachované oblasti sekvence AHAS» -Μ - 31

8. Enzym padle nároku 5 až 7, vyznačující se tím, žedelece se vyskytuje v oblastí sekvence AHAS Arabidopsls di-vokého typu, zvolené ze souboru zahrnujícího aminokyseliny119 až 122, 194 až 197, 201 .až 208, 255 až 257, 348 až 353,373 až 377, 559 až 578 a 650 až 553 nebo homologní oblastiv odlišném druhu.

9. Enzym podle nároku 5 až 8, vyznačující se tím, žedelece se vyskytuje v alespoň Jedné poloze, zvolené ze sou-boru zahrnujícího aminokyseliny 120, 121, 197, 205, 255,358, 571, 574, 578 a 553.

10. Vektor, obsahující sekvenci nukleové kyseliny, kó-dující funkční enzym AHAS, Jehož sekvence aminokyselin seliší od AHAS divokého typu alespoň Jednou delecí aminokyse-liny, dodávající enzymu odolnost proti herbicidům.

11. Hostitelská buňka, obsahující sekvenci nukleové kyseliny podle některého z nároků 1 až 5.

12. Hostitelská buňka, obsahující vektor podle nároku 10.

13. Rostlinná buňka, obsahující sekvenci nukleové kyšeliny, kódující funkční enzym AHAS, Jehůž sekvence aminokyselin se liší od sekvence AHAS divokého typu alespoň Jednoudelecí aminokyseliny, dodávající enzymu odolnost proti her-bicidům.

14. Způsob pěstování rostlin, odolných proti herbici-dům, vyznačující se tím, že se kultivuje rostlina, kteráprodukuje funkční enzym AHAS, Jehož sekvence aminokyselinliší od sekvence AHAS divokého typu alespoň Jednou delecí aminokyseliny, dodávající enzymu odolnost proti herbicidům,v přítomnosti inhibičního množství herbicidu. - 32

15. Způsob selekce hostitelských buněk, úspěšně trans-formovaných požadovaným genem, vyznačující se tím, že seperspektivním hostitelským buňkám dodává daný gen, spojený sesekvencí nukleové kyseliny padle některého z nároků 1 až 5,buňky se pěstují v přítomnosti inhibičního množství herbici-du a přeživší buňky se identifikují jako obsahující daný gen.

•16. Úsek nukleové kyseliny, obsahující sekvenci podleněkterého z nároků 1 až 5, spojenou s genem, kódující agro-nomicky použitelný biologický znak.