BRPI0809473B1 - Métodos para controlar ervas daninhas na vizinhança de uma planta de girassol e para tratar uma semente de girassol - Google Patents

Abstract

PLANTA DE GIRASSOL, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA PLANTA DE GIRASSOL HÍBRIDA, PARA CONTROLAR ERVAS DANINHAS NA VIZINHANÇA DE UMA PLANTA DE GIRASSOL, PARA COMBATER VEGETAÇÃO INDESEJADA, PARA CONTROLAR OROBANCA QUE CRESCE SOBRE UMA PLANTA DE GIRASSOL, E PARA GENOTIPAR ACETOIDROXIÁCIDO SINTASE GRANDE DE GIRASSOL, SEMENTE DE GIRASSOL, E, KIT PARA GENOTIPAR ACETOIDROXIÁCIDO SINTASE GRANDE DE GIRASSOL. Plantas de girassol resistentes a herbicida que compreendem dois alelos resistentes a herbicida diferentes do gene da subunidade 1 grande da acetoidroxiácido sintase de girassol (AHASL 1) são descritas. Métodos para fabricar estas plantas de girassol e métodos para controlar ervas daninhas ou outra vegetação indesejada que cresce na vizinhança destas plantas de girassol são divulgados. Tais métodos envolvem o uso de herbicidas que inibem a acetoidroxiácido sintase. Métodos para controlar ervas parasíticas que crescem nas plantas de girassol também são descritos. São adicionalmente fornecidos métodos para determinar o genótipo de plantas de girassol para o gene AHASL 1.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[1] Esta invenção diz respeito ao campo da agricultura, particularmente às plantas de girassol resistentes a herbicida que compreendem dois alelos resistentes a herbicida diferentes do gene da subunidade 1 grande da acetohidroxiácido sintase de girassol (AHASL1).

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[2] A acetohidroxiácido sintase (AHAS; EC 4.1.3.18, também conhecida como acetolactato sintase ou ALS), é a primeira enzima que catalisa a síntese bioquímica dos aminoácidos de cadeia ramificada valina, leucina e isoleucina (Singh (1999) “Biosynthesis of valine, leucine e isoleucine,” em Plant Amino Acids, Singh, B. K., ed., Marcel Dekker Inc. Nova Iorque, Nova Iorque, pp. 227-247). AHAS é o sítio de ação de quatro famílias de herbicida estrutural e quimicamente diversas incluindo as sulfoniluréias (Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61: 246-57; Mallory-Smith e Retzinger (2003) Weed Technology 17: 620-626; LaRossa e Falco (1984) Trends Biotechnol. 2: 158-161), as imidazolinonas (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76: 545-546), as triazolopirimidinas (Subramanian e Gerwick (1989) “Inhibition of acetolactate synthase by triazolopirimidines,” em Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J. R. e Sonnet, P. E. eds., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D. C., pp. 277288) e os pirimidiniloxibenzoatos (Subramanian et al. (1990) Plant Physiol. 94: 239-244). Os herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréias são amplamente usados na agricultura moderna devido à sua eficácia em taxas de aplicação muito baixas ervas daninhas. Diversos exemplos de herbicidas de imidazolinonas comercialmente disponíveis são PURSUIT® (imazetapir), SCEPTER® (imazaquin) e ARSENAL® (imazapir). Os exemplos de herbicidas de sulfoniluréia são clorsulfuron, metsulfuron metila, sulfometuron metila, clorimuron etila, tifensulfuron metila, tribenuron metila, bensulfuron metila, nicosulfuron, etametsulfuron metila, rinsulfuron, triflusulfuron metila, triasulfuron, primisulfuron metila, cinosulfuron, amidosulfiuon, fluzasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etila e halosulfuron.

[3] Devido à sua alta eficácia e baixa toxicidade, os herbicidas de imidazolinona são favorecidos para a aplicação por pulverização sobre o topo de uma ampla área de vegetação. A capacidade para pulverizar um herbicida sobre o topo de uma ampla faixa de vegetação diminui os custos associados com o estabelecimento e manutenção da planta e diminui a necessidade quanto à preparação do local antes do uso de tais produtos químicos. A pulverização sobre o topo de uma espécie tolerante desejada também resulta na capacidade para se obter potencial de rendimento máximo da espécie desejada devido à ausência de espécies competitivas. Entretanto, a capacidade para usar tais técnicas de pulverizar sobre é dependente da presença de espécies resistentes à imidazolinona da vegetação desejada na área pulverizada sobre.

[4] Entre a maioria das safras agrícolas, algumas espécies leguminosas tais como a soja são naturalmente resistentes aos herbicidas de imidazolinona devido à sua capacidade para metabolizar rapidamente os compostos herbicidas (Shaner e Robinson (1985) Weed Sci. 33: 469-471). Outras safras tais como o milho (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100: 882-886) e o arroz (Barrett et al. (1989) Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, Nova Iorque, pp. 195-220) são um tanto suscetíveis aos herbicidas de imidazolinona. A sensibilidade diferencial aos herbicidas de imidazolinona é dependente da natureza química do herbicida particular e metabolismo diferencial do composto de uma forma tóxica a uma não tóxica em cada planta (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76: 545-546; Brown et al., (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27: 24-29). Outras diferenças fisiológicas de planta tais como absorção e translocação também desempenham um papel importante na sensibilidade (Shaner e Robinson (1985) Weed Sci. 33: 469471).

[5] As plantas resistentes às imidazolinonas, sulfoniluréias, triazolopirimidinas e pirimidiniloxibenzoatos foram produzidas com êxito usando semente, microesporo, pólen e mutagênese de calo em Zea mays, Arabidopsis thaliana, Brassica napus (isto é, canola) Glicina max, Nicotiana tabacum, beterraba açucareira (Beta vulgaris) e Oryza sativa (Sebastian et al. (1989) Crop Sci. 29: 1403-1408; Swanson et al., 1989 Theor. Appl. Genet. 78: 525-530; Newhouse et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 83: 65-70; Sathasivan et al. (1991) Plant Physiol. 97: 1044-1050; Mourand et al. (1993) J. Heredity 84: 91-96; Wright e Penner (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 612620; Patente U.S. No 5.545.822). Em todos os casos, um único, gene nuclear parcialmente dominante conferiu resistência. Quatro plantas de trigo resistentes à imidazolinona foram também anteriormente isoladas a seguir da mutagênese de semente de Triticum aestivum L. cv. Fidel (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100: 882-886). Estudos de hereditariedade confirmaram que um único, gene parcialmente dominante conferiu resistência. Com base em estudos alélicos, os autores concluíram que as mutações nas quatro linhagens identificadas foram localizadas no mesmo local. Um dos genes de resistência do cultivar Fidel foi designado FS-4 (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100: 882-886).

[6] As populações de planta que ocorrem naturalmente que foram descobertas serem resistentes aos herbicidas de imidazolinona e/ou sulfoniluréia também foram usados para desenvolver linhagens de cruzamento de girassol resistentes a herbicida. Recentemente, duas linhagens de girassol que são resistentes a um herbicida de sulfoniluréia foram desenvolvidos usando plasma germinativo que se origina de uma população selvagem de girassol comum (Helianthus annuus) como a fonte do traço de resistência a herbicida (Miller e Al-Khatib (2004) Crop Sci. 44: 1037-1038). Anteriormente, White et al. ((2002) Weed Sci. 50: 432-437) relataram que indivíduos de uma população selvagem de girassol comum de South Dakota, U.S.A. foram resistente cruzado a um herbicida de imidazolinona e um de sulfoniluréia. A análise de uma porção da região codificadora dos genes da subunidade grande da acetohidroxiácido sintase (AHASL) de indivíduos desta população revelou uma mutação pontual que resultou em uma substituição de aminoácido de Ala para Val na proteína AHASL de girassol que corresponde a Ala205 na proteína AHASL de Arabidopsis thaliana do tipo selvagem (White et al. (2003) Weed Sci. 51: 845-853). Antes, Al-Khatib e Miller ((2000) Crop Sci. 40: 869) relataram a produção de quatro linhagens de cruzamento de girassol resistentes à imidazolinona.

[7] A modelagem com base em computador das três conformações dimensionais do complexo AHAS-inibidor prognostica diversos aminoácidos na bolsa de ligação do inibidor proposto como sítios onde mutações induzidas provavelmente confeririam resistência seletiva às imidazolinonas (Oft et al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 359-368). As plantas de tabaco produzidas com algumas destas mutações racionalmente planejadas nos sítios de ligação propostos da enzima AHAS de fato exibiram resistência específica a uma única classe de herbicidas (Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 359-368).

[8] A resistência de planta aos herbicidas de imidazolinona também foi relatada em várias patentes. As Patentes U.S. Nos 4.761.373, 5.331.107, 5.304.732, 6.211.438, 6.211.439 e 6.222.100 no geral descrevem o uso de um gene de AHAS alterado para evocar resistência a herbicida em plantas e especificamente divulga certas linhagens de milho resistentes à imidazolinona. A Patente U.S. No 5.013.659 divulga plantas exibindo resistência a herbicida devido às mutações em pelo menos um aminoácido em uma ou mais regiões conservadas. As mutações descritas nesse ponto codificam a resistência cruzada para imidazolinonas e sulfoniluréias ou resistência específica à sulfoniluréia, mas a resistência específica à imidazolinona não está descrita. A Patente U.S. No 5.731.180 e a Patente U.S. No 5.767.361 debatem um gene isolado tendo uma única substituição de aminoácido em uma sequência de aminoácido de AHAS monocot do tipo selvagem que resulta em resistência específica à imidazolinona. Além disso, plantas de arroz que são resistentes aos herbicidas que interferem com AHAS foram desenvolvidas pela procriação mutacional e também pela seleção de plantas resistentes a herbicida de um grupo de plantas de arroz produzidas pela cultura de antera. Ver, as Patentes U.S. Nos 5.545.822, 5.736.629, 5.773.703, 5.773.704, 5.952.553 e 6.274.796.

[9] Em plantas, como em todos os outros organismos examinados, a enzima AHAS é compreendida de duas subunidades: uma subunidade grande (papel catalítico) e uma subunidade pequena (papel regulador) (Duggleby e Pang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33: 1-36). A subunidade de AHAS grande (também aludida aqui como AHASL) pode ser codificada por um único gene como no caso de Arabidopsis e da beterraba açucareira ou por membros da família de gene múltiplos como no milho, canola e algodão. As substituições específicas, de nucleotídeo único na subunidade grande confere na enzima um grau de insensibilidade a uma ou mais classes de herbicidas (Chang e Duggleby (1998) Biochem J 333: 765-777).

[10] Por exemplo, o trigo de pão, Triticum aestivum L., contém três genes da subunidade grande da acetohidroxiácido sintase homóloga. Cada um dos genes exibem expressão significante com base na resposta ao herbicida e dados bioquímicos de mutantes em cada um dos três genes (Ascenzi et al. (2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona, Espanha, Ref. No S10-17). As sequências codificadoras de todos os três genes compartilham homologia extensiva ao nível do nucleotídeo (WO 03/014357). Através do sequenciamento dos genes AHASL de diversas variedades de Triticum aestivum, a base molecular da tolerância a herbicida na maioria das linhagens tolerantes à IMI (tolerantes à imidazolinona) foi encontrada ser a mutação S653(At)N, indicando uma substituição de serina para asparagina em uma posição equivalente à serina no aminoácido 653 em Arabidopsis thaliana (WO 03/01436; WO 03/014357). Esta mutação é devido a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) na sequência de DNA que codifica a proteína AHASL.

[11] Os genes AHASL múltiplos também são conhecidos ocorrer em espécies de plantas dicotiledôneas. Recentemente, Kolkman et al. ((2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159) relatou a identificação, clonagem e sequenciamento para três genes AHASL (AHASL1, AHASL2 e AHASL3) de genótipos resistentes a herbicida e do tipo selvagem de girassol (Helianthus annuus L.). Kolkman et al. relataram que a resistência a herbicida foi devido à substituição Pro197Leu (usando a nomenclatura de posição de aminoácido AHASL de Arabidopsis) ou a substituição Ala205Val na proteína AHASL1 e que cada uma destas substituições forneceu resistência tanto aos herbicidas de imidazolinona quanto aos de sulfoniluréia.

[12] Dada a sua alta eficácia e baixa toxicidade, os herbicidas de imidazolinona são favorecidos para o uso agrícola. Entretanto, a capacidade de usar herbicidas de imidazolinona em um sistema de produção de safra particular depende da disponibilidade das variedades resistentes à imidazolinona da planta de safra de interesse. Para produzir tais variedades resistentes à imidazolinona, os reprodutores de planta necessitam desenvolver linhagens de procriação com o traço de resistência à imidazolinona. Assim, linhagens de procriação e variedades resistentes à imidazolinona adicionais de plantas de safra, assim como métodos e composições para a produção e uso de linhagens de procriação e variedades resistentes à imidazolinona, são resistentes a herbicida que compreendem dois alelos resistentes a herbicida diferentes do gene da subunidade 1 grande da acetohidroxiácido sintase (AHASL1) de girassol. Em particular, as plantas de girassol da invenção têm resistência aumentada aos herbicidas que inibem a acetohidroxiácido sintase (AHAS), quando comparado a uma planta de girassol do tipo selvagem. As plantas de girassol resistentes a herbicida da invenção compreendem um primeiro alelo de AHASL1 e um segundo alelo de AHASL1, em que o primeiro e o segundo alelos de AHASL1 codificam uma primeira e segunda proteínas de AHASL1 de girassol resistente a herbicida, respectivamente. O primeiro alelo AHASL1 codifica uma proteína AHASL1 de girassol que compreende a substituição de aminoácido A122T. o segundo alelo AHASL1 codifica uma proteína AHASL1 de girassol que compreende a substituição de aminoácido A205V ou a substituição de aminoácido P197L. Também são fornecidas partes, tecidos, células e sementes da planta de girassol que compreendem o primeiro e segundo alelos AHASL1.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[13] A presente invenção fornece novas plantas de girassol resistentes a herbicida que compreendem dois alelos resistentes a herbicida diferentes do gene da subunidade 1 grande da acetohidroxiácido sintase (AHASL1) de girassol. Em particular, as plantas de girassol da invenção têm resistência aumentada aos herbicidas que inibem a acetohidroxiácido sintase (AHAS), quando comparado a uma planta de girassol do tipo selvagem. As plantas de girassol resistentes a herbicida da invenção compreendem um primeiro alelo de AHASL1 e um segundo alelo de AHASL1, em que o primeiro e o segundo alelos de AHASL1 codificam uma primeira e segunda proteínas de AHASL1 de girassol resistente a herbicida, respectivamente. O primeiro alelo AHASL1 codifica uma proteína AHASL1 de girassol que compreende a substituição de aminoácido A122T. o segundo alelo AHASL1 codifica uma proteína AHASL1 de girassol que compreende a substituição de aminoácido A205V ou a substituição de aminoácido P197L. Também são fornecidas partes, tecidos, células e sementes da planta de girassol que compreendem o primeiro e segundo alelos AHASL1.

[14] A presente invenção fornece ainda um método para produzir uma planta de girassol híbrida que compreende a resistência a pelo menos um herbicida que inibe AHAS. O método envolve a polinização cruzada de uma primeira planta de girassol com uma segunda planta de girassol de modo a produzir sementes de girassol híbridas que podem ser semeadas e deixadas crescer em uma planta de girassol híbrida, particularmente uma planta de girassol híbrida F1. A primeira planta de girassol compreende no seu genoma pelo menos uma cópia de um primeiro alelo de um gene de AHASL1 e a segunda planta de girassol compreende no seu genoma pelo menos uma cópia de um segundo alelo de um gene de AHASL1. Preferivelmente, a primeira planta de girassol é homozigota para o primeiro alelo e a segunda planta de

[15] A presente invenção adicionalmente fornece métodos para controlar ervas daninhas ou vegetação indesejada na vizinhança de uma planta de girassol da invenção. Um método compreende aplicar uma quantidade eficaz de herbicida que inibe AHAS, particularmente um herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia, às ervas daninhas e à planta de girassol. Um outro método compreende contatar uma semente de girassol da presente invenção antes de semear e/ou depois da pré-germinação com uma quantidade eficaz de um herbicida que inibe AHAS, particularmente um herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia. A presente invenção fornece ainda as sementes de girassol da presente invenção tratada com uma quantidade eficaz de um herbicida que inibe AHAS. As plantas e sementes de girassol para o uso nestes métodos compreendem em seus genomas um primeiro alelo AHASL1 e um segundo alelo AHASL1. O primeiro alelo AHASL1 codifica uma proteína AHASL1 de girassol que compreende a substituição de aminoácido A122T. O segundo alelo AHASL1 codifica uma proteína AHASL1 de girassol que compreende a substituição de aminoácido A205V ou a substituição de aminoácido P197L.

[16] A presente invenção fornece ainda métodos para controlar as ervas parasíticas Orobanche cumana e Orobanche cernua, também conhecida como orobanca, nas plantas de girassol infectadas. O método compreende aplicar uma quantidade eficaz de um herbicida de imidazolinona às ervas daninhas e à planta de girassol resistente a herbicida da presente invenção, particularmente uma planta de girassol que compreende dois alelos A122T ou uma planta de girassol que compreende um alelo AHASL1 A122T e um alelo identificar os alelos do gene AHASL1 em girassol individual. Tais métodos de diagnóstico envolvem a amplificação pela reação da cadeia da polimerase (PCR) de regiões específicas do gene de AHASL1 do girassol usando iniciadores planejados para anelar aos sítios específicos dentro do gene do girassol de AHASL1 tal como, por exemplo, sítios nas ou na vizinhança de mutações no gene de AHASL1.

[17] A presente invenção fornece métodos de diagnóstico para identificar os alelos do gene AHASL1 em girassol individual. Tais métodos de diagnóstico envolvem a amplificação pela reação da cadeia da polimerase (PCR) de regiões específicas do gene de AHASL1 do girassol usando iniciadores planejados para anelar aos sítios específicos dentro do gene do girassol de AHASL1 tal como, por exemplo, sítios nas ou na vizinhança de mutações no gene de AHASL1. São adicionalmente fornecidos os iniciadores usados nestes métodos e kits para a realização dos métodos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[18] A Figura 1 é uma representação gráfica do efeito da aplicação foliar de imazapir sobre o topo da planta 14 dias depois do tratamento para materiais homozigoto para os eventos de mutação A122T e A205V e genótipos heterozigotos A205 + A122T. As alturas médias (% de plotagens não tratadas) são representadas pelos símbolos e as barras de erro representam o desvio padrão da média.

[19] A Figura 2 é uma representação gráfica do efeito da aplicação foliar de imazapir sobre o Índice de Fitotoxicidade (PI) 14 dias depois do tratamento com materiais homozigotos para os eventos de mutação A122T e A205V e genótipos heterozigotos A205 + A122T. Os PI médios são representados pelos símbolos e as barras de erro representam o desvio padrão da média.

[20] A Figura 3 é uma representação gráfica do efeito da aplicação foliar de imazapir sobre o acúmulo de biomassa 14 dias depois do tratamento com materiais homozigotos para os eventos de mutação A122T e A205V e genótipos heterozigotos A205 + A122T. a biomassa seca média (% de plotagens não tratadas) são representados pelos símbolos e as barras de erro representam o desvio padrão da média.

[21] A Figura 4 é uma ilustração fotográfica dos produtos de uma digestão com enzima de restrição de produtos da amplificação com PCR com o BmgB I a seguir da eletroforese em gel de agarose. Linha M, Marcador de peso molecular; Linha 1: BTK47 (do tipo selvagem); Linha 2: GM40 (A122T); Linha 3: planta F1 do cruzamento cmsBTK47 x GM40; e Linha 4: crosGM40 (A122T).

[22] A Figura 5 é uma ilustração fotográfica dos produtos de uma digestão com enzima de restrição de produtos da amplificação com PCR com o BmgB I a seguir da eletroforese em gel de agarose. Linha M, Marcador de peso molecular; Linha 1: BTK47 (do tipo selvagem); Linha 2: GM40 (A122T); Linha 3: planta F1 do cruzamento cmsBTK47 x GM40; e Linha 4: crosGM40 (A122T).

[23] A Figura 6 é uma ilustração fotográfica dos produtos de amplificação da PCR obtidos usando a combinação p-AHAS NIDF / AHAS 122 TMU. Linha 1, Marcador de peso molecular (Marcador de 25 pares de base), Linha 2, Marcador de peso molecular (Marcador de 100 pares de base), Linha 3, 122 Homozigoto Individual, Linha 4, 205 Homozigoto individual, Linha 5, 197 Homozigoto individual, Linha 6, WT (Haplotipo 1), Linha 7, 122/WT individual, Linha 8, 122/205 individual, Linha 9, 122/197 individual, Linha 10, Água (Controle Negativo), Linha 11, Marcador de peso molecular (Marcador de 25 pares de base), Linha 12, Marcador de peso molecular (Marcador de 100 pares de base).

[24] A Figura 7 é uma ilustração fotográfica de produtos de amplificação da PCR obtidos usando a combinação p-AHAS NIDF / AHAS 122 TWT. Linha 1, Marcador de peso molecular (Marcador de 25 pares de base), Linha 2, Marcador de peso molecular (Marcador de 100 pares de base), Linha 3, 122 Homozigoto Individual, Linha 4, 205 Homozigoto individual, Linha 5, 197 Homozigoto individual, Linha 6, WT (Haplotipo 1), Linha 7, 122/WT individual, Linha 8, 122/205 individual, Linha 9, 122/197 individual, Linha 10, Água (Controle Negativo), Linha 11, Marcador de peso molecular (Marcador 25 pares de base), Linha 12, Marcador de peso molecular diferenças nas sequências de nucleotídeo dos haplotipos AHASL1 de girassol quando o DNA genômico do girassol de cada haplotipo (Hap) é amplificado usando os pares de iniciador p-AHAS NIDF/ AHAS122TWT ou os pares de iniciador p-AHAS NIDF/AHAS 122 TMU. As posições dos iniciadores são mostradas com setas. A localização da sequência de nucleotídeo que codifica a repetição (ACC)n (codifica a região poli-Thr em peptídeo de trânsito putativo) e INDELs na sequência de nucleotídeo AHASL1 estão em tipo negrito e salientados, respectivamente. A repetição (ACC)n e acredita-se que os INDELS correspondam à porção da sequência de nucleotídeo AHASL1 que codifica o peptídeo de trânsito de AHASL1. A localização do polimorfismo de nucleotídeo único A122T (SNP) é indicada pelas setas (?). Os números no final das sequências indicam o tamanho de fragmento esperado de cada haplotipo quando amplificado com os pares de iniciador pAHAS NIDF/AHAS122TWT (Hapl-5) ou o p-AHAS NIDF/AHAS 122 TMU (Hap6).

[25] A Figura 8 é um alinhamento de sequência que mostra as diferenças nas sequências de nucleotídeo dos haplotipos AHASL1 de girassol quando o DNA genômico do girassol de cada haplotipo (Hap) é amplificado usando os pares de iniciador p-AHAS NIDF/ AHAS122TWT ou os pares de iniciador p-AHAS NIDF/AHAS 122 TMU. As posições dos iniciadores são mostradas com setas. A localização da sequência de nucleotídeo que codifica a repetição (ACC)n (codifica a região poli-Thr em peptídeo de trânsito putativo) e INDELs na sequência de nucleotídeo AHASL1 estão em tipo negrito e salientados, respectivamente. A repetição (ACC)n e acredita-se que os INDELS correspondam à porção da sequência de nucleotídeo AHASL1 que codifica o peptídeo de trânsito de AHASL1. A localização do polimorfismo de nucleotídeo único A122T (SNP) é indicada pelas setas (▼). Os números no final das sequências indicam o tamanho de fragmento esperado de cada haplotipo quando amplificado com os pares de iniciador pAHAS NIDF/AHAS122TWT (Hapl-5) ou o p-AHAS NIDF/AHAS 122 TMU (Hap6).

[26] A Figura 9 é uma ilustração fotográfica de produtos de amplificação da PCR obtida usando extratos de DNA de tecido de plantas de girassol que são heterozigotas para o alelo AHASL1 A122T (HET) , homozigotas (MUTANTE) para o alelo AHASL1 A122T ou tipo selvagem no local AHASL1 (WT). A amplificação pela PCR foi conduzida como descrita no Exemplo 7 e os produtos de PCR separados por intermédio da eletroforese em gel em um gel de agarose a 2 % (p/v).

[27] A Figura 10 é uma representação gráfica de lesão de safra (% média da Fitotoxicidade) em 200 g de ia/ha de Imazamox determinados de 9 a 12 dias depois do tratamento (painel esquerdo) e de 25 a 30 dias depois do tratamento (painel direito) em quatro locais no campo em 2007 para quatro tipos diferentes de híbridos. Os quatro sítios são: Velva, ND, USA; Angers, tipos diferentes de híbridos de girassol que carregam a mutação CLHA-Plus depois da aplicação de imazamox. Os quatro tipos diferentes de híbridos representados na Figura 11 são A122T homozigoto (CLHA-Plus homo), A122T/A205 (CLHA-Plus / IMISUN hetero), A122T heterozigotas (CLHA- Plus / WT hetero) e A205V homozigoto (IMISUN homo).

[28] A Figura 11 é uma representação gráfica de lesão de safra de tipos diferentes de híbridos de girassol que carregam a mutação CLHA-Plus depois da aplicação de imazamox. Os quatro tipos diferentes de híbridos representados na Figura 11 são A122T homozigoto (CLHA-Plus homo), A122T/A205 (CLHA-Plus / IMISUN hetero), A122T heterozigotas (CLHAPlus / WT hetero) e A205V homozigoto (IMISUN homo).

[29] A Figura 12 é uma representação gráfica da lesão de safra de tipos diferentes de híbridos de girassol que carregam a mutação CLHA-Plus depois da aplicação de imazapir (CLHA-Plus homozigoto: b = 0,20 ± 0,06, P < 0,048 CLHA-Plus /IMISUN heterozigotas: b: 0,26 ± 0,07, P < 0,0019; CLHA-Plus/WT: b: 0,55 + 0,18, P < 0,0109). Os quatro tipos diferentes de híbridos representados na Figura 11 são A122T homozigoto (CLHA-Plus homo), A122T/A205 (CLHA-Plus / IMISUN hetero), A122T heterozigotas (CLHA-Plus / WT hetero) e A205V homozigoto (IMISUN homo).

[30] A Figura 13 é uma representação gráfica da atividade da enzima AHAS (expressada como porcentagem de controles não tratados) de quatro linhagens de girassol na presença de 100 µM de imazamox (painel esquerdo) ou 100 µM de imazapir (painel direito).

[31] A Figura 14 é uma representação gráfica da atividade da enzima AHAS (expressada como porcentagem de controles não tratados) de cinco linhagens de girassol na presença de níveis aumentados de imazamox.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[32] As sequências de ácido nucléico e aminoácido listadas na listagem de seqüência anexa são mostradas usando as abreviações de letra padrão para as bases de nucleotídeo e o código de três letras para os aminoácidos. As sequências de ácido nucléico seguem a convenção padrão de começar na extremidade 5’ da sequência e prosseguir para adiante (isto é, da esquerda para a direita em cada linha) até a extremidade 3’. Apenas um filamento de cada sequência de ácido nucléico é mostrada, mas o filamento complementar é entendido estar incluído por qualquer referência ao filamento demonstrado. As sequências de aminoácido seguem a convenção padrão de começar no terminal amino da sequência e prosseguir para adiante (isto é, da esquerda para a direita em cada linha) até o terminal carbóxi.

[33] SEQ ID NO: 1 apresenta a sequência de nucleotídeo de p- AHAS18.

[34] SEQ ID NO: 2 apresenta a sequência de nucleotídeo de p- AHAS19.

[35] SEQ ID NO: 3 apresenta a sequência de nucleotídeo de p AHAS NIDF.

[36] SEQ ID NO: 4 apresenta a sequência de nucleotídeo de AHAS 122 TWT.

[37] SEQ ID NO: 5 apresenta a sequência de nucleotídeo de AHAS 122 TMU.

[38] SEQ ID NO: 6 apresenta a sequência de nucleotídeo da porção de AHASL1 do haplotipo 1 (Hap1) de girassol que é mostrada na Figura 8.

[39] SEQ ID NO: 7 apresenta a sequência de nucleotídeo da porção de AHASL1 do haplotipo 2 (Hap2) de girassol que é mostrada na Figura 8.

[40] SEQ ID NO: 8 apresenta a sequência de nucleotídeo da porção de AHASL1 do haplotipo 3 (Hap3) de girassol que é mostrada na Figura 8.

[41] SEQ ID NO: 9 apresenta a sequência de nucleotídeo da porção de AHASL1 do haplotipo 4 (Hap4) de girassol que é mostrada na Figura 8.

[42] SEQ ID NO: 10 apresenta a sequência de nucleotídeo da porção de AHASL1 do haplotipo 5 (Hap5) de girassol que é mostrada na Figura 8. corresponde à posição do iniciador p-AHAS NIDF dentro das sequências de nucleotídeo AHASL1 mostradas na Figura 8 (ver a seta superior na Figura 8). O iniciador p-AHAS NIDF anela à sequência de nucleotídeo que é o complemento da sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 12.

[43] SEQ ID NO: 11 apresenta a sequência de nucleotídeo da porção de AHASL1 do haplotipo 6 (Hap6) de girassol que é mostrada na Figura 8.

[44] SEQ ID NO: 12 apresenta a sequência de nucleotídeo que corresponde à posição do iniciador p-AHAS NIDF dentro das sequências de nucleotídeo AHASL1 mostradas na Figura 8 (ver a seta superior na Figura 8). O iniciador p-AHAS NIDF anela à sequência de nucleotídeo que é o complemento da sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 12.

[45] SEQ ID NO: 13 apresenta a sequência de nucleotídeo do sítio de anelamento do iniciador AHAS 122 TWT dentro das sequências de nucleotídeo de AHASL1 de Hap1-Hap5 (SEQ ID NOS: 6 a 10, respectivamente) mostrada na Figura 8 (ver a seta inferior na Figura 8).

[46] SEQ ID NO: 14 apresenta a sequência de nucleotídeo do sítio de anelamento do iniciador AHAS 122 TMU dentro da sequência de nucleotídeo AHASL1 de Hap6 (SEQ ID NO: 11) mostrada na Figura 8 (ver a seta inferior na Figura 8).

[47] SEQ ID NO: 15 apresenta a sequência de nucleotídeo de HA122CF. SEQ ID NO: 16 apresenta a sequência de nucleotídeo deHA122wt.

[48] SEQ ID NO: 17 apresenta a sequência de nucleotídeo de HA122mut. SEQ ID NO: 18 apresenta a sequência de nucleotídeo de HA122CR.

[49] SEQ ID NO: 19 apresenta uma sequência de nucleotídeo de tamanho parcial que codifica uma proteína de AHASL1 resistente a herbicida que compreende a substituição de aminoácido A122T das linhagens de girassol S4897 e GM40 como descrita na WO 2007005581.

[50] SEQ ID NO: 19 corresponde à SEQ ID NO: 1 da WO 2007005581.

[51] SEQ ID NO: 20 apresenta uma sequência de aminoácido 2007005581.

[52] SEQ ID NO: 20 corresponde à SEQ ID NO: 2 da WO 2007005581.

[53] SEQ ID NO: 21 apresenta a sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína AHASL1 resistente a herbicida, madura que compreende a substituição de aminoácido P197L da linhagem de girassol MUT28 como descrita na WO 2006024351. A SEQ ID NO: 21 corresponde à SEQ ID NO: 5 da WO 2006024351.

[54] SEQ ID NO: 22 apresenta a sequência de aminoácido da proteína AHASL1 resistente a herbicida, madura codificada pela sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 21. A SEQ ID NO: 21 corresponde à SEQ ID NO: 6 da WO 2006024351.

[55] SEQ ID NO: 23 apresenta a sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína AHASL1 resistente a herbicida, madura que compreende a substituição de aminoácido A205V da Helianthus annuus haplotipo 5 como descrita no Acesso do GenBank No AY541455 e Kolkman et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159. A SEQ ID NO: 23 corresponde aos nucleotídeos 244 a 1959 da sequência de nucleotídeo do Acesso do GenBank No AY541455.

[56] SEQ ID NO: 24 apresenta a sequência de aminoácido da proteína AHASL1 resistente a herbicida, madura codificada pela sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 23. A SEQ ID NO: 24 corresponde aos aminoácidos de 82 a 652 da sequência de aminoácido codificada pela sequência de nucleotídeo de Acesso do GenBank No AY541455.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[57] A presente invenção diz respeito às plantas de girassol resistentes a herbicida que compreendem em seus genomas dois alelos diferentes do gene de girassol de AHASL1. Cada um dos dois alelos diferentes codifica uma proteína AHASL1 de girassol que compreende uma sequência de aminoácido que difere da sequência de aminoácido de um AHASL1 de girassol do tipo selvagem por um ou mais aminoácidos. Cada um dos alelos de AHASL1 da presente invenção é conhecido conferir em uma planta de girassol resistência ou tolerância aumentadas a herbicida que inibe AHAS, particularmente herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia. A presente invenção diz respeito ainda a métodos de fabricar estas plantas de girassol e a métodos para controlar ervas daninhas ou vegetação indesejada que cresce na vizinhança das plantas de girassol da presente invenção.

[58] A presente invenção está fundamentada na descoberta de que as plantas de girassol híbridas F1 que compreendem uma única cópia de cada um de dois alelos resistentes a herbicida diferentes de AHASL1 de girassol compreendem níveis comercialmente aceitáveis de resistência a herbicidas que inibem AHAS. Assim, a presente invenção encontra uso na produção de plantas de girassol híbridas possibilitando que um criador de planta mantenha, por exemplo, uma primeira linhagem de girassol que seja homozigota para um primeiro alelo AHASL1 resistente a herbicida e uma segunda linhagem de girassol que é homozigota para um segundo alelo AHASL1 resistente a herbicida.

[59] Em certas formas de realização da invenção, os métodos envolvem o uso de plantas tolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida. Por uma planta “tolerante a herbicida” ou “resistente a herbicida”, é intencionado uma planta que seja tolerante ou resistente a pelo menos um herbicida em um nível que normalmente mataria ou inibiria o crescimento de uma planta normal ou tipo selvagem. Em uma forma de realização da invenção, as plantas tolerantes a herbicida da invenção compreendem uma proteína AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida. por “proteína AHASL tolerante a herbicida” ou “proteína AHASL resistente a herbicida”, é intencionado que uma tal proteína AHASL demonstre atividade de AHAS mais alta, em relação à atividade de AHAS de uma proteína AHASL do tipo selvagem, quando na presença de pelo menos um herbicida que é conhecido interferir com a atividade AHAS e em uma concentração ou nível do herbicida que é conhecido inibir a atividade de AHAS da proteína AHASL tipo selvagem. Além disso, a atividade de AHAS de uma tal proteína AHASL tolerante a herbicida ou resistente a herbicida pode ser aqui aludida como atividade de AHAS “tolerante a herbicida” ou “resistente a herbicida”.

[60] Para a presente invenção, os termos “tolerante a herbicida” e “resistente a herbicida” são usados intercambiavelmente e são intencionados a ter um significado equivalente e um escopo equivalente. Similarmente, os termos “tolerância a herbicida” e “resistência a herbicida” são usados intercambiavelmente e são intencionados a ter um significado equivalente e um escopo equivalente. Do mesmo modo, os termos “resistentes à imidazolinona” e “resistência à imidazolinona” são usados intercambiavelmente e são intencionados a serem de um significado equivalente e um escopo equivalente como os termos “tolerante à imidazolinona” e “tolerância à imidazolinona”, respectivamente.

[61] A presente invenção fornece plantas, tecidos vegetais, células vegetais e células hospedeiras com resistência ou tolerância aumentadas a pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia. A quantidade ou concentração preferidas do herbicida é uma “quantidade eficaz” ou “concentração eficaz.” Por “quantidade eficaz” e “concentração eficaz” é intencionado uma quantidade e concentração, respectivamente, que sejam suficientes para matar ou inibir o crescimento de uma planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira similares, do tipo selvagem, mas que a dita quantidade não mata ou inibe tão severamente o crescimento das plantas, tecidos vegetais, células vegetais e células hospedeiras resistentes a herbicida da presente invenção. Tipicamente, a quantidade eficaz ou concentração eficaz de um herbicida é uma quantidade girassol que compreendem níveis comercialmente aceitáveis de resistência ou tolerância a um herbicida que inibe AHAS. A menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo óbvio a partir do contexto, plantas de girassol que compreendem um tal nível de resistência ou tolerância a um herbicida que inibe AHAS são resistentes ou tolerantes a uma aplicação de uma quantidade eficaz ou concentração eficaz de pelo menos um herbicida que inibe AHAS. Como indicado acima, a quantidade eficaz ou concentração de um herbicida é uma quantidade ou concentração que é rotineiramente usada em sistemas de produção agrícola para matar uma erva daninha ou ervas daninhas de interesse e que uma tal quantidade é conhecida ou pode ser facilmente determinada por aqueles de habilidade comum na técnica.

[62] Em certas formas de realização, a invenção fornece plantas de girassol que compreendem níveis comercialmente aceitáveis de resistência ou tolerância a um herbicida que inibe AHAS. A menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo óbvio a partir do contexto, plantas de girassol que compreendem um tal nível de resistência ou tolerância a um herbicida que inibe AHAS são resistentes ou tolerantes a uma aplicação de uma quantidade eficaz ou concentração eficaz de pelo menos um herbicida que inibe AHAS. Como indicado acima, a quantidade eficaz ou concentração de um herbicida é uma quantidade ou concentração que é rotineiramente usada em sistemas de produção agrícola para matar uma erva daninha ou ervas daninhas de interesse e que uma tal quantidade é conhecida ou pode ser facilmente determinada por aqueles de habilidade comum na técnica.

[63] Por “planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira similares, tipo selvagem,” é intencionado uma planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira, respectivamente, que carece da resistência a herbicida características e/ou polinucleotídeo particular da invenção que são aqui divulgados. O uso do termo “tipo selvagem” não é, portanto, intencionado a implicar que uma planta, tecido vegetal, célula vegetal ou outra célula hospedeira carece do DNA recombinante no seu genoma e/ou carece de características resistentes a herbicida que são diferentes daqueles aqui divulgadas.

[64] Como aqui usado a menos que claramente de outro modo indicado, o termo “planta” é intencionado a significar uma planta em qualquer estágio desenvolvimental, assim como qualquer parte ou partes de uma planta que possa estar ligada a ou separada de uma planta intacta inteira. Tais partes de uma planta incluem, mas não são limitados a, órgãos, tecidos e células de uma planta. Os exemplos de partes de planta particular incluem uma haste, uma folha, uma raiz, uma inflorescência, uma flor, um flóscula, uma fruta, um pedículo, um pedúnculo, um estame, uma antera, um estigma, um estilo, um ovário, uma pétala, uma sépala, um carpelo, uma ponta de raiz, uma tampa de raiz, um pelo de raiz, um pelo de folha, um pelo de semente, um grão de pólen, um microesporo, um cotilédone, um hipocotilo, um epicotilo, xilema, floema, parênquima, endosperma, uma célula companheira, uma célula guardiã e quaisquer outros órgãos, tecidos e células de um planta conhecidos. Além disso, é reconhecido que uma semente é uma planta.

[65] Em um aspecto, a invenção fornece plantas de girassol que compreendem no seu genoma pelo menos uma cópia de um alelo mutante AHASL1 A122T e pelo menos uma cópia de um alelo mutante AHASL1 A205T. Uma tal planta de girassol compreende um nível comercialmente aceitável de tolerância a pelo menos uma herbicida que inibe AHAS, particularmente um herbicida de imidazolinona. Tais plantas encontram uso na agricultura, particularmente em métodos para controlar ervas daninhas que envolvem o uso de herbicidas de imidazolinona como aqui descrito.

[66] Em um outro aspecto, a invenção fornece plantas de girassol que compreendem no seu genoma pelo menos uma cópia de um alelo mutante AHASL1 A122T e pelo menos uma cópia de um alelo mutante AHASL1 P197L. Uma tal planta de girassol compreende um nível comercialmente aceitável de tolerância a pelo menos um herbicida que inibe AHAS, particularmente um herbicida de sulfoniluréia e/ou um de imidazolinona. Tais plantas encontram uso na agricultura, particularmente em métodos para controlar ervas daninhas que envolvem o uso de herbicidas de imidazolinona e/ou de sulfoniluréia como aqui descrito.

[67] A presente invenção envolve o uso de uma planta de girassol que compreende um gene de AHASL1 que compreende a mutação A122T. Um tal gene de AHASL1 codifica uma proteína de AHASL1 que compreende a substituição de aminoácido A122T. A presente invenção não depende do uso de uma variedade, linhagem ou planta de girassol particular que compreende um gene de AHASL1 com a mutação A122T. Qualquer planta de girassol que compreenda pelo menos um alelo de um gene de AHASL1 com a mutação A122T pode ser usada nos métodos aqui divulgados. Em uma forma de realização da invenção, o gene de AHASL1 com a mutação A122T compreende um polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 19 ou uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 20.

[68] Um exemplo de uma linhagem de girassol que compreende pelo menos uma cópia do alelo mutante AHASL1 A122T é GM40 (ver, a WO 2007005581 e Pedido de Patente Provisório U.S. Serial No 60/695.952; depositado em 1 de julho de 2005; ambos dos quais são aqui incorporados por referência). Um depósito de sementes do girassol GM40 foi feito com a Patent Depository of the American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110 USA em 17 de maio de 2005 e designado Depósito de Patente ATCC Número PTA-6716. O depósito de linhagem de girassol GM40 foi feito por um termo de pelo menos 30 anos e pelo menos 5 anos depois da requisição mais recente para o fornecimento de uma amostra do depósito ser recebida pela ATCC. Adicionalmente, os requerentes satisfizeram todas as exigências da 37 C.F.R. §§ 1.801-1.809, incluindo o fornecimento de uma indicação da viabilidade da amostra.

[69] Um outro exemplo de uma linhagem de girassol que compreende pelo menos uma cópia do alelo mutante AHASL1 A122T é GM1606 (ver, a WO 2007005581). Um depósito de sementes do girassol GM1606 foi feito com a Patente Depository of the American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110 USA em 19 de maio de 2006 e designado depósito de Patente ATCC Número PTA-7606. o depósito do girassol GM1606 foi feito por um termo de pelo menos 30 anos e pelo menos que compreende um gene de AHASL1 que compreende a mutação A205V. Um tal gene de AHASL1 codifica uma proteína de AHASL1 que compreende a substituição de aminoácido A205V. A presente invenção não depende do uso de uma variedade, linhagem ou planta de girassol particulares que compreendem um gene de AHASL1 com a mutação A205V. Qualquer planta de girassol que compreende pelo menos um alelo de um gene de AHASL1 com a mutação A205V pode ser usada nos métodos aqui divulgados. Em uma forma de realização da invenção, o gene de AHASL1 com a mutação A205V compreende um polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 23 ou uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 24.

[70] A presente invenção envolve o uso de uma planta de girassol que compreende um gene de AHASL1 que compreende a mutação A205V. Um tal gene de AHASL1 codifica uma proteína de AHASL1 que compreende a substituição de aminoácido A205V. A presente invenção não depende do uso de uma variedade, linhagem ou planta de girassol particulares que compreendem um gene de AHASL1 com a mutação A205V. Qualquer planta de girassol que compreende pelo menos um alelo de um gene de AHASL1 com a mutação A205V pode ser usada nos métodos aqui divulgados. Em uma forma de realização da invenção, o gene de AHASL1 com a mutação A205V compreende um polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 23 ou uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 24.

[71] As plantas de girassol que compreendem pelo menos um alelo de um gene de AHASL1 com a mutação A205V são amplamente usadas na produção de girassol comercial e são facilmente disponíveis. Qualquer uma de tais variedades de planta de girassol comercialmente disponíveis podem ser usadas nos métodos aqui divulgados. Tais variedades são disponíveis de várias fontes de companhias de semente comerciais (por exemplo, Nidera S. A., Buenos Aires, Argentina; Dekalb Genetics Corporation, Dekalb, ILA, USA; Mycogen Seeds, Indianápolis, IN, USA; Seeds 2000, Breckenridge, MN, USA; Triumph Seed Company, Ralls, TX, USA,) e incluem, mas não são limitadas a, Paraiso 101CL, Paraiso 102CL, DKF38,-80CL, 8H429CL, 8H419CL, 8H386CL, 8H358CL, 629CL, 630,CL, 4682NS/CL, 4880NS/CL, Barracuda, Cargar, Viper, 620CL, 650CL e 660CL. Além disso, as sementes de plantas de girassol que compreendem pelo menos um alelo de um gene de que compreende um gene de AHASL1 que compreende a mutação P197L. Um tal gene de AHASL1 codifica uma proteína de AHASL1 que compreende a substituição de aminoácido P197L. A presente invenção não depende do uso de uma variedade, linhagem ou planta de girassol particular que compreende um gene de AHASL1 com a mutação P197L. Qualquer planta de girassol que compreende pelo menos um alelo de um gene de AHASL1 com a mutação P197L pode ser usada nos métodos aqui divulgados. As plantas de girassol que compreendem pelo menos um alelo de um gene de AHASL1 com a mutação P197L foram divulgadas na WO 2006024351 e Pedido de Patente U.S. de Estágio Nacional Serial No 11/659.007, data de depósito internacional 29 de julho de 2005; ambos dos quais são aqui incorporados por referência. Em uma forma de realização da invenção, o gene de AHASL1 com a mutação P197L compreende um polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 21 ou uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 22.

[72] A presente invenção envolve o uso de uma planta de girassol que compreende um gene de AHASL1 que compreende a mutação P197L. Um tal gene de AHASL1 codifica uma proteína de AHASL1 que compreende a substituição de aminoácido P197L. A presente invenção não depende do uso de uma variedade, linhagem ou planta de girassol particular que compreende um gene de AHASL1 com a mutação P197L. Qualquer planta de girassol que compreende pelo menos um alelo de um gene de AHASL1 com a mutação P197L pode ser usada nos métodos aqui divulgados. As plantas de girassol que compreendem pelo menos um alelo de um gene de AHASL1 com a mutação P197L foram divulgadas na WO 2006024351 e Pedido de Patente U.S. de Estágio Nacional Serial No 11/659.007, data de depósito internacional 29 de julho de 2005; ambos dos quais são aqui incorporados por referência. Em uma forma de realização da invenção, o gene de AHASL1 com a mutação P197L compreende um polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 21 ou uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 22.

[73] Três linhagens de girassol que compreendem pelo menos um alelo de um gene de AHASL1 com a mutação P197L foram publicamente liberadas pelo United States Department of Agriculture Research Service. As três linhagens são HA 469, RHA 470 e RHA 471. As sementes de cada uma das três linhagens podem ser obtidas do Seedstocks Project, Department of Plant Sciences, Loftsgard Hall, North Dakota State University, Fargo, ND 58105, US.

[74] A presente invenção envolve plantas de girassol com mutações no gene AHASL1 de girassol. Estas mutações dão origem às proteínas AHASL1 de girassol que compreendem substituições de aminoácido específicas nas suas sequências de aminoácido quando comparadas com as sequências de aminoácido de uma proteína AHASL1 tipo selvagem de girassol. Tais substituições de aminoácido incluem, por exemplo, a A122T, A205V e P197L. Por “A122T” é intencionada a substituição de uma treonina no lugar da alanina na posição da proteína AHASL1 de girassol que corresponde à posição de aminoácido 122 na proteína AHASL1 da Arabidopsis thaliana. Por “A205V” é intencionada a substituição de uma valina no lugar da alanina na posição da proteína AHASL 1 de girassol que corresponde à posição de aminoácido 205 na proteína AHASL1 de Arabidopsis thaliana. Por “P197L” é intencionada a substituição de uma leucina no lugar da prolina na posição da proteína AHASL1 de girassol que corresponde à posição de aminoácido 197 na proteína AHASL1 da Arabidopsis thaliana.

[75] A menos que de outro modo indicado ou óbvio a partir do contexto, as posições de aminoácido na proteína AHASL1 de girassol que são aqui aludidas são as posições correspondentes na proteína AHASL1 de Arabidopsis thaliana bem estudadas. As posições de aminoácido na proteína AHASL1 de girassol que correspondem às posições de aminoácido de AHASL1 de Arabidopsis thaliana 122, 197 e 205 são 107, 182 e 197, respectivamente. Ver, a WO 2007005581 (Tabela 4 nesse ponto) para informação adicional sobre as posições de substituições de aminoácido conhecidas que conferem resistência a herbicida às proteínas AHASL e suas posições correspondentes nas proteínas AHASL1 de girassol e Arabidopsis thaliana.

[76] A presente invenção fornece proteínas AHASL com substituições de aminoácido nas posições de aminoácido particulares dentro das regiões conservadas das proteínas AHASL1 de girassol aqui divulgadas. Além disso, aqueles de habilidade comum reconhecerão que tais posições de aminoácido podem variar dependendo de se os aminoácidos são adicionados ou removidos, por exemplo, da extremidade do terminal N de uma sequência de aminoácido. Assim, a invenção abrange as substituições de aminoácido na posição declarada ou posição equivalente. Por “posição equivalente” é intencionado significar uma posição que esteja dentro da mesma região conservada como a posição de aminoácido exemplificada. Tais regiões conservadas são conhecidas na técnica (ver a Tabela 4 na WO 20070055581) ou podem ser determinadas pelos alinhamentos de sequência múltiplos ou por outros métodos conhecidos na técnica.

[77] A presente invenção fornece ainda um método para produzir uma planta de girassol híbrida que compreende a resistência a pelo menos um herbicida que inibe AHAS. O método envolve a polinização cruzada de uma primeira planta de girassol com uma segunda planta de girassol de modo a produzir sementes de girassol híbridas que podem ser semeadas e deixadas crescer em uma planta de girassol híbrida, particularmente uma planta de girassol híbrida F1. A primeira planta de girassol compreende no seu genoma pelo menos uma cópia de um primeiro alelo de um gene de AHASL1 e a segunda planta de girassol compreende no seu genoma pelo menos uma cópia de um segundo alelo de um gene de AHASL1. Preferivelmente, a primeira planta de girassol é homozigota para o primeiro alelo e a segunda planta de girassol é homozigota para o segundo alelo. O primeiro alelo codifica uma proteína AHASL1 de girassol que compreende a substituição de aminoácido A122T. O segundo alelo codifica uma proteína AHASL1 de girassol que compreende a substituição de aminoácido A205V ou a substituição de aminoácido P197L.

[78] O método para produzir uma planta de girassol híbrida pode envolver ainda colher uma semente resultante do dito cruzamento e selecionar pelo menos uma planta de girassol descendente do dito cruzamento que compreende no seu genoma o dito primeiro e o dito segundo alelos. Uma tal descendente pode ser selecionada por qualquer método conhecido na técnica incluindo a amplificação pela PCR de todo ou parte do gene de AHASL1 para determinar os alelos que estão presentes na planta. O DNA para o uso em uma tal amplificação pela PCR pode ser obtida de uma porção de semente de girassol resultante do cruzamento ou de uma porção de uma planta cultivada a partir de uma tal semente. No Exemplo 2 abaixo, um método preferido da invenção para selecionar a planta descendente desejada que envolve a amplificação pela PCR é fornecida. Alternativamente, a planta descendente pode ser selecionada pela avaliação do desempenho da planta descendente no teste de resistência a herbicida sob condições de estufa ou campo como descrito aqui abaixo.

[79] Em uma forma de realização preferida da invenção, uma planta de girassol híbrida da invenção é produzida pelo cruzamento de uma primeira planta de girassol que é homozigota quanto ao alelo A205V de AHASL1 a uma segunda planta de girassol que é homozigota do alelo A122T de AHASL1. Todas as sementes híbridas resultantes e plantas híbridas cultivada a partir de tais sementes são esperadas compreender nos seus genomas um alelo A205V de AHASL1 e um alelo A122T de AHASL1. Nesta forma de realização preferida, o primeiro ou segundo girassol pode ser o doador de pólen para o cruzamento.

[80] Em uma outra forma de realização preferida da invenção, uma planta de girassol híbrida da invenção é produzida pelo cruzamento de uma primeira planta de girassol que é homozigota para o alelo P197L de AHASL1 a uma segunda planta de girassol que é homozigota do alelo A122T de AHASL1. Todas as sementes híbridas e plantas híbridas resultantes cultivadas a partir de tal semente são esperadas compreender nos seus genomas um alelo P197L de AHASL1 e um alelo A122T de AHASL1. Nesta forma de realização preferida, o primeiro ou segundo girassol podem ser o doador de pólen para o cruzamento.

[81] Para os propósitos da presente invenção a menos que de outro modo expressamente indicado ou evidente a partir do contexto, uma “planta descendente” é qualquer planta que seja descendente de pelo menos uma planta da invenção e inclui, mas não é limitado à, descendentes da primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona e décima geração da planta da invenção. Preferivelmente, tal progênie ou descendentes compreendem resistência aumentada a pelo menos um herbicida de imidazolinona quando comparados a uma planta do tipo selvagem e tal progênie ou descendentes compreendem ainda pelo menos um alelo AHASL1 mutante selecionado do grupo que consiste dos alelos A122T, A205V e P197L. Ainda mais preferivelmente, tal progênie ou descendentes compreendem resistência aumentada a pelo menos um herbicida de imidazolinona quando comparados a uma planta do tipo selvagem e tal progênie ou descendentes compreendem ainda dois alelos AHASL1 mutantes diferentes selecionados do grupo que consiste dos alelos A122T, A205V e P197L.

[82] Em uma forma de realização da invenção, as plantas de girassol da invenção compreendem o alelo A122T e produzem sementes que compreendem um óleo de semente extraível que compreende pelo menos 85 % (p/p) de ácido oléico ou 850 g de ácido oléico/kg de óleo.

[83] Preferivelmente, a % do teor de ácido oléico do óleo das sementes de girassol da presente invenção é determinado pelos métodos padrão para a análise de óleos vegetais tais como, por exemplo, aqueles métodos descritos no Official Methods of Analysis of Association of the Official Analytical Chemists (1990) W. Horwitz, ed., 14a ed., Washington, D. C. e/ou AOCS - American Oil Chemists’ Society, Official and Tentative Methods of the American Oil Chemists’ Society (1998) 5a ed, Chicago, Illinois.

[84] A presente invenção fornece métodos para realçar a tolerância ou resistência de uma planta, tecido vegetal, célula vegetal ou outra célula hospedeira a pelo menos um herbicida que interfere com a atividade da enzima AHAS. Preferivelmente, um tal herbicida é um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia, um herbicida de triazolopirimidina, um herbicida de pirimidiniloxibenzoato, um herbicida de sulfonilamino-carboniltriazolinona ou mistura destes. Mais preferivelmente, um tal herbicida é um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia ou mistura destes. Para a presente invenção, os herbicidas de imidazolinona incluem, mas não são limitados a, PURSUIT® (imazetapir), CADRE® (imazapic), RAPTOR® (imazamox), SCEPTER® (imazaquin), ASSERT® (imazetabenz), ARSENAL® (imazapir), um derivado de qualquer um dos herbicidas anteriormente mencionados e uma mistura de dois ou mais dos herbicidas anteriormente mencionados, por exemplo, imazapir/ imazamox (ODISSEY®). Mais especificamente, o herbicida de imidazolinona pode ser selecionado de, mas não é limitado ao ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2- imidiazolin-2-il)-nicotínico, ácido [2-(4-isopropil)-4-] [metil-5-oxo-2- imidazolin-2-il)-3-quinolinocarboxílico], ácido [5-etil-2-(4-isopropil-] 4- metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo- 2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico, ácido [2-(4-isopropil-4-metil-5- oxo-2-] imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico e uma mistura de [6-(4-isopropil-4- ] metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato de metila e [2-(4-isopropil-4-metil- 5-] oxo-2-imidazolin-2-il)-p-toluato de metila. O uso do ácido 5-etil-2-(4- isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico e ácido [2-(4-isopropil- 4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-] il)-5-(metoximetil)-nicotínico é preferida. O uso do ácido [2-(4-isopropil-4-] metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5- (metoximetil)-nicotínico é particularmente preferido.

[85] Para a presente invenção, os herbicidas de sulfoniluréia incluem, mas não são limitados a, clorsulfuron, metsulfuron metila, sulfometuron metila, clorimuron etila, tifensulfuron metila, tribenuron metila, bensulfuron metila, nicosulfuron, etametsulfuron metila, rinsulfuron, triflusulfuron metila, triasulfuron, primisulfuron metila, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etila, halosulfuron, azimsulfuron, ciclosulfuron, etoxisulfuron, flazasulfuron, flupirsulfuron metila, foramsulfuron, iodosulfuron, oxasulfuron, mesosulfuron, prosulfuron, sulfosulfuron, trifloxisulfuron, tritosulfuron, um derivado de qualquer um dos herbicidas anteriormente mencionados e uma mistura de dois ou mais dos herbicidas anteriormente mencionados. Os herbicidas de triazolopirimidina da invenção incluem, mas não são limitados a, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam e penoxsulam. Os herbicidas de pirimidiniloxibenzoato da invenção incluem, mas não são limitados a, bispiribac, piritiobac, piriminobac, piribenzoxim e piriftalid. Os herbicidas de sulfonilamino-carbonil-triazolinona incluem, mas não são limitados a, flucarbazona e propoxicarbazona.

[86] É reconhecido que os herbicidas de pirimidiniloxibenzoato estão intimamente relacionados com os herbicidas de pirimidiniltio-benzoato e são generalizados sob o título do último nome pelo Weed Science Society of America. Consequentemente, os herbicidas da presente invenção incluem ainda os herbicidas de pirimidiniltiobenzoato, incluindo, mas não limitado aos herbicidas de pirimidiniloxibenzoato descritos acima.

[87] As plantas de girassol resistentes a herbicida da invenção encontram uso nos métodos para controlar ervas daninhas. Assim, a presente invenção fornece ainda um método para controlar ervas daninhas na vizinhança de uma planta de girassol resistente a herbicida da invenção. O método compreende aplicar uma quantidade eficaz de um herbicida às ervas daninhas e à planta de girassol resistente a herbicida, em que a planta tem resistência aumentada a pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona ou de sulfoniluréia, quando comparada a uma planta de girassol tipo selvagem.

[88] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece métodos para controlar as ervas parasíticas conhecida como orobanca (Orobanche spp.) em plantas de girassol infectadas. Tais Orobanche spp. incluem, por exemplo, Orobanche cumana e Orobanche cernua. O método compreende aplicar uma quantidade eficaz de um herbicida de imidazolinona às ervas daninhas e à planta de girassol resistente a herbicida da presente invenção, particularmente uma planta de girassol que compreende duas cópias do alelo A122T de AHASL1 ou uma planta de girassol que compreende uma cópia do alelo A122T de AHASL1 e uma cópia do alelo A205V de AHASL1. Em uma forma de realização preferido, o herbicida de imidazolinona é imazapir. Preferivelmente, o herbicida que inibe AHAS é aplicado em um estágio vegetativo posterior e/ou estágio reprodutivo inicial. Mais preferivelmente, o herbicida é aplicado em um estágio reprodutivo inicial. O mais preferivelmente, o herbicida é aplicado no estágio de crescimento R1.

[89] A menos que de outro modo indicado, os estados de crescimento de girassol aqui aludidos são os estágios de crescimento como definidos em Schneiter e Miller (1981) Crop Sci. 21: 901-903.

[90] Fornecendo-se plantas de girassol tendo resistência aumentada aos herbicidas, particularmente herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia, uma ampla variedade de formulações podem ser utilizadas para proteger as plantas de ervas daninhas, de modo a realçar o crescimento da planta e reduzir a competição quanto aos nutrientes. Um herbicida pode ser usado por si só para a pré-emergência, pós-emergência, pré-plantio e no controle no plantio de ervas daninhas em áreas que circundam as plantas aqui descritas ou uma formulação de herbicida de imidazolinona pode ser usada que contém outros aditivos. O herbicida também pode ser usado como um tratamento de sementes. Os aditivos encontrados em uma formulação do herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia incluem outros herbicidas, detergentes, adjuvantes, agentes de espalhamento, agentes de adesão, agentes estabilizantes ou semelhantes. A formulação do herbicida pode ser uma

[91] A presente invenção fornece sementes não-transgênicas e transgênicas com tolerância aumentada a pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida que inibe AHAS, mais particularmente herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia. Tais sementes incluem, por exemplo, sementes de girassol não transgênicas que compreendem as características de tolerância a herbicida da planta de girassol S4897, da planta de girassol GM40, da planta de girassol GM1606, da planta de girassol com depósito de Patente ATCC Número PTA-6716 ou a planta de girassol com depósito de Patente ATCC Número PTA-7606 e sementes transgênicas que compreendem uma molécula de polinucleotídeo da invenção que codifica uma proteína AHASL resistente a herbicida.

[92] A presente invenção fornece métodos que envolvem o uso de pelo menos um herbicida que inibe AHAS selecionado do grupo que consiste de herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfoniluréia, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de pirimidiniloxibenzoato, herbicidas sulfonilamino-carboniltriazolinona e misturas destes. Nestes métodos, o herbicida que inibe AHAS pode ser aplicado por qualquer método conhecido na técnica incluindo, mas não limitado a, tratamento de semente, tratamento de solo e tratamento foliar.

[93] Antes da aplicação, o herbicida que inibe AHAS pode ser convertido nas formulações habituais, por exemplo soluções, emulsões, suspensões, poeiras, pós, pastas e grânulos. A forma de uso depende do propósito intencionado particular; em cada caso, o mesmo deve garantir uma distribuição fina e uniforme do composto de acordo com a invenção.

[94] As formulações são preparadas em uma maneira conhecida (ver por exemplo para revisões a US 3.060.084, EP-A 707 445 (para concentrados líquidos), Browning, “Agglomeration”, Chemical Engineering, Dez. 4, 1967, 147-48, Perry’s Chemical Engineer’s Handbook, 4a Ed., McGraw-Hill, Nova Iorque, 1963, páginas 8 a 57 e et seq. WO 91/13546, US 4.172.714, US 4.144.050, US 3.920.442, US 5.180.587, US 5.232.701, US 5.208.030, GB 2.095.558, US 3.299.566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8a Ed., Blackweel Scientific Publications, Oxford, 1989 e Mollet, H., Grubemann, A., Formulation Technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Alemanha), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8), por exemplo pela diluição do composto ativo com auxiliares adequados para a formulação de agroquímicos, tais como solventes e/ou carreadores, se desejado emulsificadores, tensoativos e dispersantes, conservantes, agentes antiespumação, agentes anti- congelamento, para a formulação de tratamento de semente também opcionalmente corantes e/ou aglutinantes e/ou agentes de formação de gel.

[95] Os exemplos de solventes adequados são água, solventes aromáticos (por exemplo produtos Solvesso, xileno), parafinas (por exemplo frações de óleo mineral), álcoois (por exemplo metanol, butanol, pentanol, álcool benzílico), cetonas (por exemplo ciclo-hexanona, gama-butirolactona), pirrolidonas (NMP, NOP), acetatos (diacetato de glicol), glicóis, dimetilamidas de ácido graxo, ácidos graxos e ésteres de ácido graxo. Em princípio, misturas de solvente também podem ser usadas.

[96] Os exemplos de carreadores adequados são minerais naturais triturados (por exemplo caulins, argilas, talco, giz) e minerais sintéticos triturados (por exemplo sílica, sílicatos altamente dispersos).

[97] Os emulsificadores adequados são emulsificadores não iônicos metal alcalino terroso e amônio de ácido lignossulfônico, ácido naftalenossulfônico, ácido fenolsulfônico, ácido dibutilnaftaleno-sulfônico, arilsulfonatos de alquila, sulfatos de alquila, alquilsulfonatos, sulfatos de álcool graxo, ácidos graxos e éteres glicólicos de álcool graxo sulfatado, além disso condensados de naftaleno sulfonado e derivados de naftaleno com formaldeído, condensados de naftaleno ou do ácido naftalenossulfônico com fenol e formaldeído, éter de polioxietileno octilfenol, isooctilfenol etoxilado, octilfenol, nonilfenol, éteres de alquilfenol poli glicol, éter de tributilfenil poli glicol, éter de triestearilfenil poli glicol, álcoois de alquilaril poliéter, álcool e álcool graxo de condensados de óxido de etileno, óleo de mamona etoxilado, éteres de polioxietileno alquila, polioxipropileno etoxilado, acetal do éter de álcool laurílico de poli glicol, éteres de sorbitol, líquidos residuais de lignosulfito e metilcelulose.

[98] Os exemplos de dispersantes são líquidos residuais de ligninosulfito e metilcelulose.

[99] Os tensoativos adequados usados são sais de metal alcalino, metal alcalino terroso e amônio de ácido lignossulfônico, ácido naftalenossulfônico, ácido fenolsulfônico, ácido dibutilnaftaleno-sulfônico, arilsulfonatos de alquila, sulfatos de alquila, alquilsulfonatos, sulfatos de álcool graxo, ácidos graxos e éteres glicólicos de álcool graxo sulfatado, além disso condensados de naftaleno sulfonado e derivados de naftaleno com formaldeído, condensados de naftaleno ou do ácido naftalenossulfônico com fenol e formaldeído, éter de polioxietileno octilfenol, isooctilfenol etoxilado, octilfenol, nonilfenol, éteres de alquilfenol poli glicol, éter de tributilfenil poli glicol, éter de triestearilfenil poli glicol, álcoois de alquilaril poliéter, álcool e álcool graxo de condensados de óxido de etileno, óleo de mamona etoxilado, éteres de polioxietileno alquila, polioxipropileno etoxilado, acetal do éter de álcool laurílico de poli glicol, éteres de sorbitol, líquidos residuais de lignosulfito e metilcelulose.

[100] As substâncias que são adequadas para a preparação de soluções, emulsões, pastas ou dispersões oleosas diretamente pulverizáveis são frações de óleo mineral de ponto de ebulição de médio a alto, tal como querosene ou óleo diesel, além disso óleos de alcatrão e óleos de origem vegetal ou animal, hidrocarbonetos alifáticos, cíclicos e aromáticos, por exemplo tolueno, xileno, parafina, tetraidronaftaleno, naftalenos alquilados ou seus derivados, metanol, etanol, propanol, butanol, ciclo-hexanol, ciclo- hexanona, isoforona, solventes altamente polares, por exemplo sulfóxido de dimetila, N-metilpirrolidona ou água.

[101] Também agentes anti-congelamento tais como glicerina, etileno glicol, propileno glicol e bactericidas tais como podem ser adicionados

[102] Os agentes antiespumação adequados são por exemplo agentes antiespumação com base no silício ou estearato de magnésio.

[103] Os conservantes adequados são por exemplo Diclorofen e álcool benzílico hemiformal.

[104] As formulações para o tratamento de semente podem adicionalmente compreender aglutinantes e opcionalmente corantes.

[105] Os aglutinantes podem ser adicionados para melhorar a adesão dos materiais ativos nas sementes depois do tratamento. Os aglutinantes adequados são tensoativos de copolímeros de bloco EO/PO mas também álcoois polivinílicos, polivinilpirrolidonas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polibutenos, poliisobutilenos, poliestireno, polietileno-aminas, polietilenoamidas, polietilenoiminas (Lupasol®, Polimin®), poliéteres, poliuretanos, acetato de polivinila, tilose e copolímeros derivados destes polímeros.

[106] Opcionalmente, também corantes podem ser incluídos na formulação. Os corantes, pigmentos ou corantes adequados para as formulações de tratamento de sementes são Rhodamin B, C.I. Pigment red 112, C.I. Solvent red 1, solvent blue 15:4, solvent blue 15:3, solvent blue 15:2, solvent blue 15:1, solvent blue 80, pigment yellow 1, pigment yellow 13, pigment red 112, pigment red 48: 2, pigment red 48: 1, pigment red 57:1, pigment red 53:1, pigment orange 43, pigment orange 34, pigment orange 5, pigment green 36, pigment green 7, pigment white 6, pigment brown 25, basic violet 10, basic violet 49, acid red 51, acid red 52, acid red 14, acid blue 9, acid yellow 23, basic red 10, basic red 108.

[107] Um exemplo de um agente de formação de gel adequado é carragenano (Satiagel®).

[108] Pós, materiais para espalhamento e produtos empoáveis podem ser preparados misturando-se ou concomitantemente moendo-se as substâncias ativas com um carreador sólido.

[109] Grânulos, por exemplo grânulos revestidos, grânulos impregnados e grânulos homogêneos, podem ser preparados pela ligação dos compostos ativos aos carreadores sólidos. Os exemplos de carreadores sólidos são terras minerais tais como géis de sílica, silicatos, talco, caulim, attaclay, calcário, cal, giz, argila friável, loesse, argila, dolomita, terra diatomácea, sulfato de cálcio, sulfato de magnésio, óxido de magnésio, materiais sintéticos moídos, fertilizantes, tais como, por exemplo, sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, uréias e produtos de origem vegetal, tais como farinha de cereal, farinha de casca de árvore, farinha de madeira e farinha de casca de noz, pós de celulose e outros carreadores sólidos.

[110] No geral, as formulações compreendem de 0,01 a 95 % em peso, preferivelmente de 0,1 a 90 % em peso, do herbicida que inibe AHAS. Neste caso, os herbicidas que inibem AHAS são utilizados em uma pureza de 90 % e 100 % em peso, preferivelmente 95 % e 100 % em peso (de acordo com o espectro de RMN). Para os propósitos de tratamento de semente, as formulações respectivas podem ser diluídas 2 a 10 vezes levando às concentrações nas preparações prontas para o uso de 0,01 a 60 % em peso do composto ativo em peso, preferivelmente 0,1 a 40 % em peso.

[111] O herbicida que inibe AHAS pode ser usado como tal, na forma de suas formulações ou na forma de uso preparada a partir desta, por exemplo na forma de soluções, pós, suspensões ou dispersões diretamente pulverizáveis, emulsões, dispersões oleosas, pastas, produtos empoáveis, materiais para espalhamento ou grânulos, por meio de pulverização, atomização, empoamento, espalhamento ou versão. A forma de uso depende totalmente dos propósitos intencionados; elas são intencionadas para garantir em cada caso a distribuição mais fina possível do herbicida que inibe AHAS de acordo com a invenção.

[112] A forma de uso aquosa pode ser preparada a partir de concentrados de emulsão, pastas ou pós umectáveis (pós pulverizáveis, dispersões oleosas) pela adição de água. Para preparar emulsões, pastas ou dispersões oleosas, as substâncias, como tais ou dissolvidas em um óleo ou solvente, podem ser homogeneizadas em água por meio de um umidificador, agente de pegajosidade, dispersante ou emulsificador. Entretanto, também é possível preparar concentrados compostos de substância ativa, umectante, agente de pegajosidade, dispersante ou emulsificador e, se apropriado, solvente ou óleo e tais concentrados são adequados para diluição com água.

[113] As concentrações de composto ativo nas preparações prontas para o uso podem ser variadas dentro das faixas relativamente amplas. No geral, elas são de 0,0001 a 10 %, preferivelmente de 0,01 a 1 % em peso.

[114] O herbicida que inibe AHAS também pode ser usado com êxito no processo de volume ultra-baixo (ULV), sendo possível aplicar formulações que compreendem mais de 95 % em peso de composto ativo ou mesmo aplicar o composto ativo sem aditivos.

[115] Os seguintes são exemplos de formulações: 1. Produtos para diluição com água para aplicações foliares. Para propósitos de tratamento de semente, tais produtos podem ser aplicados à semente diluída ou não diluída.

A) Concentrados solúveis em água (SL, LS)

[116] Dez partes em peso do herbicida que inibe AHAS são dissolvidas em 90 partes em peso de água ou um solvente solúvel em água. Como uma alternativa, umectantes ou outros auxiliares são adicionados. O herbicida que inibe AHAS dissolve-se na diluição com água, depois do que uma formulação com 10 % (p/p) de herbicida que inibe AHAS é obtida.

B) Concentrados Dispersáveis (DC)

[117] Vinte partes em peso do herbicida que inibe AHAS são dissolvidas em 70 partes em peso de ciclo-hexanona com a adição de 10 partes em peso de um dispersante, por exemplo polivinilpirrolidona. A

[118] Quinze partes em peso do herbicida que inibe AHAS são dissolvidas em 7 partes em peso de xileno com a adição de dodecilbenzenossulfonato de cálcio e etoxilato de óleo de mamona (em cada caso 5 partes em peso). A diluição com água dá uma emulsão, por meio da qual uma formulação com 15 % (p/p) de herbicida que inibe AHAS é obtida.

D) Emulsões (EW, EO, ES)

[119] Vinte e cinco partes em peso do herbicida que inibe AHAS são dissolvidas em 35 partes em peso de xileno com a adição de dodecilbenzenossulfonato de cálcio e etoxilato de óleo de mamona (em cada caso 5 partes em peso). Esta mistura é introduzida em 30 partes em peso de água por meio de uma máquina emulsificadora (por exemplo Ultraturrax) e feita em uma emulsão homogênea. A diluição com água dá uma emulsão, por meio da qual uma formulação com 25 % (p/p) de herbicida que inibe AHAS é obtida.

E) Suspensões (SC, OD, FS)

[120] Em um moinho de bolas agitado, 20 partes em peso do herbicida que inibe AHAS são cominuídos com a adição de 10 partes em peso de dispersantes, umectantes e 70 partes em peso de água ou de um solvente orgânico para dar uma suspensão fina de herbicida que inibe AHAS. A diluição com água dá uma suspensão estável do herbicida que inibe AHAS, por meio da qual uma formulação com 20 % (p/p) de herbicida que inibe AHAS é obtida.

F) Grânulos dispersáveis em água e grânulos solúveis em água (WG, SG)

[121] Cinquenta partes em peso do herbicida que inibe AHAS são finamente triturados com a adição de 50 partes em peso de dispersantes e

G) Pós dispersáveis em água e pós solúveis em água (WP, SP, SS, WS)

[122] Setenta e cinco partes em peso do herbicida que inibe AHAS são trituradas em um moinho de rotor-estator com a adição de 25 partes em peso de dispersantes, umectantes e gel de sílica. A Diluição com água dá uma dispersão ou solução estáveis do herbicida que inibe AHAS, por meio da qual uma formulação com 75 % (p/p) do herbicida que inibe AHAS é obtida.

I) Formulação em Gel (GF)

[123] Em um moinho de bolas agitado, 20 partes em peso do herbicida que inibe AHAS são cominuídas com a adição de 10 partes em peso de dispersantes, 1 parte em peso de um agente formador de gel umectantes e 70 partes em peso de água ou de um solvente orgânico para dar uma suspensão fina de herbicida que inibe AHAS. A diluição com água dá uma suspensão estável do herbicida que inibe AHAS, por meio da qual uma formulação com 20 % (p/p) de herbicida que inibe AHAS é obtida. Esta formulação em gel é adequada para uso como um tratamento de semente. 2. Produtos a serem aplicados não diluídos para aplicações foliares. Para os propósitos de tratamento de semente, tais produtos podem ser aplicados às sementes diluídos.

A) pós empoáveis (DP, DS)

[124] Cinco partes em peso do herbicida que inibe AHAS são finamente triturados e misturados intimamente com 95 partes em peso de caulim finamente dividido. Isto dá um produto empoável tendo 5 % (p/p) de herbicida que inibe AHAS.

B) Grânulos (GR, FG, GG, MG)

[125] Meia parte em peso do herbicida que inibe AHAS é finamente triturada e associada com 95,5 partes em peso de carreadores, por meio da qual uma formulação com 0,5 % (p/p) de herbicida que inibe AHAS é obtida. Os métodos correntes são extrusão, secagem por pulverização ou o leito fluidizado. Isto dá grânulos a serem aplicados não diluídos para uso foliar.

[126] As formulações de tratamento de semente convencionais incluem por exemplo concentrados fluíveis FS, soluções LS, pós para tratamento seco DS, pós dispersáveis água para o tratamento em pasta fluída WS, pós solúveis em água SS e emulsão ES e EC e formulação em gel GF. Estas formulações podem ser aplicadas à semente diluída ou não diluída. A aplicação às sementes é realizada antes de semear, diretamente sobre as sementes.

[127] Em uma forma de realização preferida uma formulação FS é usada para o tratamento de semente. Tipicamente, uma formulação FS pode compreender 1 a 800 g/l de ingrediente ativo, 1 a 200 g/l de Tensoativo, de 0 a 200 g/l de agente anticongelamento, de 0 a 400 g/l de aglutinante, de 0 a 200 g/l de um pigmento e até 1 litro de um solvente, preferivelmente água.

[128] Para o tratamento de semente, as sementes das plantas resistentes a herbicida de acordo com a presente invenção são tratadas com herbicidas, preferivelmente herbicidas selecionados do grupo que consiste de herbicidas que inibem AHAS tais como amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron, clorimuron, clorsulfuron, cinosulfuron, ciclosulfamuron, etametsulfuron, etoxisulfuron, flazasulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron, halosulfuron, imazosulfuron, iodosulfuron, mesosulfuron, metsulfuron, nicosulfuron, oxasulfuron, primisulfuron, prosulfuron, pirazosulfuron, rimsulfuron, sulfometuron, sulfosulfuron, tifensulfuron, triasulfuron, tribenuron, trifloxisulfuron, triflusulfuron, tritosulfuron, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam,

[129] O termo tratamento de semente compreende todas as técnicas de tratamento de semente adequadas conhecidas na técnica, tais como cobertura de semente, revestimento de semente, empoamento de semente, embebimento de semente e pelotização de semente.

[130] De acordo com uma variante da presente invenção, um outro objetivo da invenção é um método de tratar o solo pela aplicação, em particular no sulco da semente: de uma formulação contendo o herbicida que inibe AHAS como uma composição/formulação (por exemplo uma formulação granular, com opcionalmente um ou mais sólidos ou líquidos, carreadores agricolamente aceitáveis e/ou opcionalmente com um ou mais tensoativos agricolamente aceitáveis. Este método é vantajosamente utilizado, por exemplo, em leitos de semente de cereais, milho, algodão e girassol.

[131] A presente invenção também compreende sementes revestidas com ou contendo uma formulação de tratamento de semente que compreende pelo menos um herbicida que inibe AHAS selecionado do grupo que consiste de amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron, clorimuron, clorsulfuron, cinosulfuron, ciclosulfamuron, etametsulfuron, etoxisulfuron, flazasulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron, halosulfuron, imazosulfuron, iodosulfuron, mesosulfuron, metsulfuron, nicosulfuron, oxasulfuron, primisulfuron, prosulfuron, pirazosulfuron, rimsulfuron, sulfometuron, sulfosulfuron, tifensulfuron, triasulfuron, tribenuron, trifloxisulfuron, triflusulfuron, tritosulfuron, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, bispiribac, piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, piriftalid e piritiobac.

[132] O termo semente abrange sementes e planta propágulos de todos os tipos incluindo mas não limitado a sementes verdadeiras, pedaços de semente, brotos secundários, cormos, bulbos, frutas, tubérculos, grãos, cortes, brotos cortados e outros e significa em uma forma de realização preferida sementes verdadeiras.

[133] O termo “revestido com e/ou contendo” no geral significa que o ingrediente de agente ativo é a maior parte na superfície do produto de propagação no momento da aplicação, embora uma parte maior ou menor do ingrediente pode penetrar no produto de propagação, dependendo do método de aplicação. Quando o dito produto de propagação é (re)plantado, o mesmo pode absorver o ingrediente ativo.

[134] A aplicação do tratamento de semente com o herbicida que inibe AHAS ou com uma formulação que compreende o herbicida que inibe AHAS é realizada pela pulverização ou empoamento das sementes antes da semeadura das plantas e antes da emergência das plantas.

[135] No tratamento de sementes, as formulações correspondentes são aplicadas tratando-se as sementes com uma quantidade eficaz do herbicida que inibe AHAS ou uma formulação que compreende o herbicida que inibe AHAS. Aqui, as taxas de aplicação são no geral de 0,1 g a 10 kg do ingrediente ativo (ou da mistura de ingrediente ativo ou da formulação) por 100 kg de semente, preferivelmente de 1 g a 5 kg por 100 kg de semente, em particular de 1 g a 2,5 kg por 100 kg de semente. Para as safras específicas tais como alface a taxa pode ser mais alta.

[136] A presente invenção fornece um método para combater vegetação indesejada ou controlar ervas daninhas que compreende contatar as sementes das plantas resistentes de acordo com a presente invenção antes da semeadura e/ou depois da pré-germinação com um herbicida que inibe AHAS. O método pode compreender ainda semear as sementes, por exemplo, em solo em um campo ou em um meio de vaso em estufa. O método encontra

[137] O controle da vegetação indesejada é entendido como significando a morte de ervas daninhas e/ou de outro modo retardando ou inibindo o crescimento normal das ervas daninhas. As ervas daninhas, no sentido mais amplo, são entendidos como significando todas aquelas plantas que crescem em locais onde eles são indesejados.

[138] As ervas daninhas da presente invenção incluem, por exemplo, ervas daninhas dicotiledôneas e monocotiledôneas. As ervas daninhas dicotiledôneas incluem, mas não são limitados a, ervas daninhas dos gêneros: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Poligonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Popover, Centauréia, Trifolium, Ranunculus e Taraxacum. As ervas daninhas monocotiledôneas incluem, mas não são limitados a, ervas daninhas dos gêneros: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poo, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropiron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sfenoclea, Dactiloctenium, Agrostis, Alopecurus e Apera. Outras ervas daninhas dicotiledôneas incluem, mas não são limitados a, plantas parasíticas que infectam girassóis, particularmente, Orobanche spp. (orobanca), tais como, por exemplo, Orobanche cumana e Orobanche cernua.

[139] Além disso, as ervas daninhas da presente invenção podem incluir, por exemplo, plantas de safra que estão crescendo em um local indesejado. Por exemplo, uma planta de milho voluntária que está em um campo que predominantemente compreende plantas de soja pode ser considerada uma erva daninha, se a planta de milho é indesejada no campo de plantas de soja.

[140] As plantas de girassol da presente invenção podem ser transformadas com um ou mais genes de interesse. Os genes de interesse da invenção variam dependendo do resultado desejado. Por exemplo, várias mudanças no fenótipo podem ser de interesse incluindo modificar a composição de ácido graxo em uma planta, alterando o teor de aminoácido de uma planta, alterando um dos mecanismos de defesa de inseto e/ou patógeno da planta e outros. Estes resultados podem ser obtidos fornecendo-se a expressão de produtos heterólogos ou expressão aumentada de produtos endógenos em plantas. Alternativamente, os resultados podem ser obtidos fornecendo-se uma redução da expressão de um ou mais produtos endógenos, particularmente enzimas ou cofatores na planta. Estas mudanças resultam em uma mudança no fenótipo da planta transformada.

[141] Em uma forma de realização da invenção, os genes de interesse incluem genes de resistência a inseto tal como, por exemplo, genes da proteína toxina de Bacillus thuringjensis (Patente U.S. Nos 5.366.892, 5.747.450, 5.736.514, 5.723.756, 5.593.881; e Geiser et al. (1986) Gene 48: 109).

[142] A presente invenção fornece métodos de diagnóstico para identificar os alelos do gene AHASL 1 em girassol individual. Tais métodos de diagnóstico, que são descritos abaixo, encontram uso em métodos para cruzar cultivares de girassol comerciais com resistência aumentada a herbicidas de imidazolinona. Os seguintes termos aqui usados na descrição destes métodos são definidos abaixo.

[143] Um “iniciador” é um oligonucleotídeo de filamento único, tendo uma extremidade 5’ e uma extremidade 3’, que é capaz de anelar a um sítio de anelamento em um filamento de DNA alvo e o iniciador serve como um ponto de iniciação para a síntese de DNA por uma DNA polimerase, particularmente em uma amplificação pela reação da cadeia da polimerase

[144] Um sítio de “anelamento” em um filamento de um DNA alvo é o sítio ao qual um iniciador é capaz de anelar nos métodos da presente invenção.

[145] No geral para a amplificação de um fragmento de um gene pela PCR, um par de iniciadores que anelam aos filamentos opostos de uma molécula de DNA de filamento duplo é utilizado. Pela convenção padrão e aqui usado a menos que de outro modo indicado ou evidente a partir do contexto, o “iniciador direto” anela ao filamento não codificador do gene e o “iniciador reverso” anela ao filamento codificador.

[146] Por todo o relatório descritivo, os termos “alelo mutante,” “alelo AHASL1 mutante,” ou “gene de AHASL1 mutante.” A menos que indicado de outro modo aqui ou evidente a partir do contexto, estes termos referem-se a um polinucleotídeo que codifica uma proteína de AHASL1 tolerante à imidazolinona que compreende uma única substituição de aminoácido quando comparada a uma proteína de AHASL1 tipo selvagem. Tais substituições de aminoácido únicas incluem, por exemplo, A122T, A205V e P197L. Tipicamente, uma tal substituição de aminoácido é o resultado da substituição de nucleotídeo único na sequência codificadora de AHASL1.

[147] Ao contrário, a menos que de outro modo indicado, os termos “alelo do tipo selvagem,” “alelo AHASL1 do tipo selvagem,” ou “gene de AHASL1 do tipo selvagem” referem-se a um polinucleotídeo que codifica uma proteína de AHASL1.

[148] A invenção envolve o uso de vários iniciadores para a amplificação pela PCR. Estes iniciadores são descritos em detalhes abaixo.

[149] Um “iniciador de AHASL1 direto” é um iniciador que pode ser usado nos métodos da invenção envolvendo a amplificação pela PCR de

[150] Um “iniciador de AHASL1 do tipo selvagem reverso” é um iniciador reverso que pode ser usado nos métodos que envolvem a amplificação pela PCR de um fragmento de um alelo AHASL1 que não compreende a mutação que dá origem à substituição de aminoácido A122T. O sítio de anelamento do iniciador reverso é mostrado na Figura 8. O nucleotídeo terminal 3’ (ou extremidade 3’) do iniciador de AHASL1 do tipo selvagem reverso anela ao G que está no sítio do SNP em Hap1-Hap5 na Figura 8. O nucleotídeo terminal 3’ do iniciador de AHASL1 do tipo selvagem reverso é um C.

[151] Um “iniciador de AHASL1 reverso mutante” é um iniciador reverso que pode ser usado nos métodos que envolvem a amplificação pela PCR de um fragmento de um alelo de AHASL1 mutante que compreende a mutação que dá origem à substituição de aminoácido A122T. O sítio de anelamento do iniciador reverso é mostrado na Figura 8. O nucleotídeo do terminal 3’ (ou extremidade 3’) do iniciador de AHASL1 reverso mutante anela a A em Hap6 que está no sítio do SNP na Figura 8. O nucleotídeo de terminal 3’ do iniciador de AHASL1 do tipo selvagem reverso é um T.

[152] A presente invenção fornece métodos para genotipar AHASLI de girassol. O método envolve obter DNA genômico de uma planta de girassol e usando o DNA genômico ou amostra ou porção deste como um padrão para uma primeira amplificação pela reação da cadeia da polimerase (PCR) que compreende o DNA genômico, polimerase, trifosfatos de desoxirribonucleotídeo, um iniciador de AHASL1 direto e um iniciador de AHASL1 do tipo selvagem reverso. O iniciador de AHASL1 do tipo selvagem reverso compreende uma molécula de ácido nucléico que anela a uma sequência de nucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 13, em que o nucleotídeo que está no nucleotídeo da extremidade 3’ do dito iniciador de AHASL1 do tipo selvagem reverso é o complemento do nucleotídeo que está na posição 1 da sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 13. O método compreende ainda o uso do DNA genômico ou amostra ou porção deste como um padrão para uma segunda amplificação pela PCR que compreende o dito DNA, polimerase, trifosfatos de desoxirribonucleotídeo, o dito iniciador de AHASL1 direto e um iniciador de AHASLI reverso mutante. O iniciador de AHASL1 reverso mutante compreende uma molécula de ácido nucléico que anela a uma sequência de nucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 14, em que o nucleotídeo que está no nucleotídeo da extremidade 3’ do dito iniciador de AHASL1 reverso mutante é o complemento do nucleotídeo que está na posição 1 da sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 14. O método compreende ainda detectar os produtos da dita primeira e da dita segunda amplificações pela PCR.

[153] Os iniciadores de AHASLI reverso tipo selvagem e de AHASL1 reverso mutante da invenção anela a uma sequência de nucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada nas SEQ ID NO: 13 e 14, respectivamente, sob condições adequadas para a amplificação pela PCR das porções dos genes AHASLI ou girassol mostrados na Figura 8. Os iniciadores de AHASLI reverso tipo selvagem e de AHASL1 reverso mutante adicionalmente têm um nucleotídeo da extremidade 3’ que consiste de um nucleotídeo que está no sítio da mutação que dá origem à substituição de aminoácido A122T. Cada um dos iniciadores reversos pode ser mas não é requerido ser totalmente complementar aos seus sítios de anelamento e não necessitam estender o tamanho natural do sítio de anelamento. Além disso, os iniciadores de AHASLI reversos do tipo selvagem e mutante podem compreender nucleotídeos adicionais na sua extremidade 5’ além dos sítios de anelamento. Tais nucleotídeos adicionais podem ser mas não são requeridos ser totalmente ou mesmo parcialmente complementares a uma porção do gene de AHASL1 de girassol. Os nucleotídeos 5’ adicionais podem incluir, por exemplo, sequências de reconhecimento de enzima de restrição. Em uma forma de realização da invenção, o AHASL1 do tipo selvagem reverso e os iniciadores de AHASL1 do tipo selvagem reversos compreendem as sequências de nucleotídeo apresentadas nas SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente.

[154] Os métodos para genotipar AHASL1 de girassol envolve o uso de um iniciador de AHASL1 direto. Diferente do AHASL1 reverso tipo selvagem e dos iniciadores de AHASL1 do tipo selvagem reversos que anelam no sítio da mutação que dá origem à substituição de aminoácido A122T, o sítio de anelamento do nucleotídeo iniciador de AHASL1 direto corresponde a uma região do gene de AHASL1 de girassol que é 5’ da região (ACC)n mostrada na Figura 8 de modo que os haplotipos 1 a 6 podem ser distinguidos pelas diferenças no comprimento (isto é, pares de base) dos produtos de PCR resultantes. As sequências destes haplotipos na vizinhança do sítio da mutação A122T são mostradas na Figura 8. Em uma forma de realização da invenção, o iniciador de AHASL1 direto anela a um sequência de nucleotídeo que compreende o complemento da sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 12. Em uma forma de realização preferida da invenção, o iniciador de AHASL1 direto compreende uma molécula de nucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 3 e em uma forma de realização ainda mais preferido, o iniciador de AHASL1 direto tem a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 3 com nucleotídeos opcionalmente adicional na extremidade 5’ do iniciador. Tais nucleotídeos adicionais pode ser mas não é requerido ser totalmente ou

[155] A presente invenção fornece ainda um método para identificar os alelos AHASL1 em uma planta de girassol. O método envolve obter DNA genômico de uma planta de girassol e usar o DNA genômico ou amostra ou porção deste em pelo menos uma amplificação pela PCR. A amplificação pela PCR envolve o uso do DNA genômico como um padrão para uma reação de amplificação da cadeia da polimerase que compreende o DNA genômico, polimerase, trifosfatos de desoxirribonucleotídeo, um primeiro iniciador direto que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 15, um primeiro iniciador reverso que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 16, um segundo iniciador direto que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 17 e um segundo iniciador reverso que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 18. O método envolve ainda detectar os produtos da amplificação pela PCR.

[156] Alternativamente, dois ou mesmo três amplificações pela PCR separadas podem ser usadas nos métodos da invenção. Quando duas amplificações pela PCR separadas são usadas, a primeira amplificação pela PCR envolve o uso do DNA genômico como um padrão para uma primeira amplificação pela reação da cadeia da polimerase que compreende o DNA genômico, polimerase, trifosfatos de desoxirribonucleotídeo, um primeiro iniciador direto que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 15 e um primeiro iniciador reverso que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 16. A segunda amplificação pela PCR envolve o uso do DNA genômico como um padrão para uma segunda amplificação pela reação da cadeia da polimerase que compreende o DNA genômico, polimerase, trifosfatos de desoxirribonucleotídeo, um segundo iniciador direto que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 17 e um segundo iniciador reverso que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 18. A primeira amplificação pela PCR pode opcionalmente compreender um terceiro iniciador que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 18 e a segunda amplificação pela PCR pode opcionalmente compreender um terceiro iniciador que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 15. A adição de um tal iniciador opcional a um ou tanto à primeira quanto à segunda amplificações pela PCR permite que a produção de uma faixa de controle que é amplificada pelos pares de iniciadores que compreende as sequências de nucleotídeo apresentadas nas SEQ ID NOS: 15 e 18. O método envolve ainda detectar os produtos da primeira e da segunda amplificações pela PCR.

[157] Quando três amplificações de PCR separadas são usadas, a primeira e segunda amplificações pela PCR são as mesmas como descritas acima. A terceira amplificação pela PCR envolve o uso do DNA genômico como um padrão para uma terceira amplificação pela reação da cadeia da polimerase que compreende o DNA genômico, polimerase, trifosfatos de desoxirribonucleotídeo, o primeiro iniciador direto compreendendo a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 15 e o segundo iniciador reverso compreendendo a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 18. O método envolve ainda detectar os produtos da primeira, da segunda e da terceira amplificações pela PCR.

[158] Em uma forma de realização da invenção, o primeiro iniciador direto tem uma sequência de nucleotídeo que consiste essencialmente da SEQ ID NO: 15, o primeiro iniciador reverso tem uma sequência de nucleotídeo que consiste essencialmente da SEQ ID NO: 16, o segundo iniciador direto tem uma sequência de nucleotídeo que consiste essencialmente da SEQ ID NO: 17 e/ou o segundo iniciador reverso tem uma sequência de nucleotídeo que consiste essencialmente da SEQ ID NO: 18. Para a presente invenção, um iniciador “que consiste essencialmente de” uma sequência exemplificada é intencionado a significar que o iniciador consiste da sequência exemplificada inteira mas pode adicionalmente incluir os nucleotídeos na extremidade 5’ do iniciador. Tais nucleotídeos adicionais podem mas não são requeridos ser total ou parcialmente complementar ao gene alvo para a amplificação. Porque a síntese de DNA é iniciada da extremidade 3’ de um iniciador, tais nucleotídeos adicionais não mudam o sítio de início para a síntese de DNA quando comparado a um iniciador que é idêntico exceto para os nucleotídeos adicionais.

[159] Em uma forma de realização preferida da invenção, o primeiro iniciador direto tem uma sequência de nucleotídeo que consiste da SEQ ID NO: 15, o primeiro iniciador reverso tem uma sequência de nucleotídeo que consiste da SEQ ID NO: 16, o segundo iniciador direto tem uma sequência de nucleotídeo que consiste da SEQ ID NO: 17 e/ou o segundo iniciador reverso tem uma sequência de nucleotídeo que consiste da SEQ ID NO: 18.

[160] A menos que de outro modo aqui indicado, “polimerase” refere-se a uma DNA polimerase, particularmente uma DNA polimerase que é adequada para o uso em uma ou mais das amplificações pela PCR da presente invenção.

[161] Nos métodos da invenção, os resultados de amplificações pela PCR podem ser detectados, por exemplo, pela eletroforese em gel de agarose dos produtos da PCR seguida pelo tingimento com brometo de etídio do DNA no gel e visualização na presença de luz UV.

[162] Os métodos da invenção envolvem o uso da PCR para amplificar DNA. Iniciadores de oligonucleotídeo podem ser planejados para o uso nas reações de PCR para amplificar que corresponde às sequências de DNA a partir do DNA genômico ou cDNA extraído de qualquer organismo de interesse. Métodos para planejar iniciadores de PCR são no geral conhecidos na técnica e são divulgados em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque); aqui incorporada por referência. Ver também, Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova Iorque); Dietmaier et al,. eds. (2002) Rapid Cicle Real Time PCR - Methods and Applications, (Springer Verlag, Nova Iorque); Theophilus and Raphley, eds. (2002) PCR Mutation Detection Protocols (Humana Press, Nova Iorque); e Bartlett and Stirling, eds. (2003) PCR Protocols (Humana Press, Nova Iorque); todas as quais são aqui incorporadas por referência. Outros métodos conhecidos de PCR que podem ser usados nos métodos da invenção incluem, mas não são limitados a, métodos usando iniciadores emparelhados, iniciadores abrigados, iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados, iniciadores específicos de gene, iniciadores de DNA/RNA misturados, iniciadores específicos de vetor, iniciadores parcialmente desemparelhados e outros.

[163] O uso aqui do termo “iniciador” “ou “iniciador de PCR” não é intencionado a limitar a presente invenção aos iniciadores que compreendem DNA. Aqueles de habilidade comum na técnica reconhecerão que tais iniciadores podem ser compreendidos, por exemplo, de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e combinações destes. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem tanto moléculas que ocorrem naturalmente quanto análogos sintéticos.

[164] Enquanto a invenção não depende dos iniciadores da PCR de qualquer número particular de nucleotídeos, é reconhecido que a porção de um iniciador de PCR que anela ao seu alvo complementar no DNA padrão no geral estará entre cerca de 10 e 50 nucleotídeos contíguos, preferivelmente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou

[165] Os métodos da invenção envolvem o uso de DNA polimerases para a amplificação de PCR de DNA. Qualquer DNA polimerase conhecida na técnica que seja capaz de amplificar um DNA alvo pela PCR pode ser usada nos métodos da invenção. Os métodos da invenção não dependem de uma DNA polimerase particular para a amplificação pela PCR de DNA, apenas que tais polimerases são capazes de amplificar um ou mais dos genes de AHASL vegetais ou fragmentos destes. Preferivelmente, as DNA polimerases da invenção são DNA polimerases termoestáveis, incluindo mas não limitadas a: Taq polimerases; Pfu polimerases; DNA polimerases termoestáveis de Thermococcus gorgonarious que também são conhecidos como Tgo DNA polimerases; DNA polimerases termoestáveis de Thermococcus litoralis tais como, por exemplo, aquelas que são conhecidas como Vent® DNA polimerases (Perler, F. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5577), DNA polimerases termoestáveis da espécie Pirococcus GB-D tais como, por exemplo, aquelas que são conhecidas como Deep Vent® DNA polimerases (Xu, M. et al. (1993) Cell 75, 1371-1377); e versões modificadas e misturas destas.

[166] Os métodos da invenção envolvem a amplificação de uma sequência de DNA alvo pela PCR. Em certas formas de realização da invenção, a sequência de DNA alvo será amplificada diretamente a partir de uma amostra que compreende DNA genômico isolado de pelo menos uma planta ou parte, órgão, tecido ou célula desta. Aqueles de habilidade comum na técnica reconhecerão que a quantidade ou concentração de DNA genômico dependerá de qualquer número de fatores incluindo, mas não limitado às condições da PCR (por exemplo temperatura de anelamento, temperatura de desnaturação, o número de ciclos, concentrações de iniciador, concentrações de dNTP e outros), a DNA polimerase termoestável, a sequência dos iniciadores e a sequência do alvo. Tipicamente, nas formas de realização da invenção aqui descritas, a concentração de DNA genômico é de pelo menos cerca de 5 ng/µl a cerca de 100 ng/µl.

[167] Além da amplificação pela PCR, os métodos da invenção podem envolver várias técnicas de biologia molecular incluindo, por exemplo, isolação de DNA, particularmente isolação de DNA genômico, digestão de DNA ou produtos da PCR pelas enzimas de restrição e nucleases, ligação de DNA, sequenciamento de DNA, eletroforese em gel de agarose, eletroforese em gel de poliacrilamida, eletroforese em gel em qualquer uma outra matriz adequada para a separação eletroforética de DNA, a detecção de DNA pelo tingimento com brometo de etídio e outros. Tais técnicas são no geral conhecidas no ramo e são divulgadas, por exemplo, em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque).

[168] Os métodos da invenção envolvem o uso de DNA genômico isolado de uma planta. Os métodos da invenção não dependem do DNA genômico isolado por qualquer método particular. Qualquer método conhecido na técnica para isolar ou purificar, a partir de uma planta, DNA genômico, que pode ser usado como uma fonte de DNA padrão para as amplificações pela PCR descritas acima, pode ser utilizado nos métodos da invenção. Ver, por exemplo, Stein et al. ((2001) Plant Breeding, 12: 354-356); Clark, ed. ((1997) Plant Molecular Biology - A Laboratory Manual, Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 3-15); Miller et al.,((1988) Nucleic Acids Research, 16: 1215); Todos os quais são aqui incorporados por referência. Preferivelmente, tais métodos para isolar DNA genômico vegetal são adequados ou podem ser adaptados por uma pessoa de habilidade comum na técnica, para a isolação de DNA genômico de números relativamente grandes de amostras de tecido de plantas. Em uma forma de realização da invenção, o DNA genômico é isolado de plantas de girassol usando um kit DNeasy® de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA). Em uma outra forma de realização, o DNA genômico é isolado de plantas de girassol usando um kit MagneSil® de acordo com as instruções do fabricante (Promega Corp., Madison, WI, USA).

[169] Para os métodos da presente invenção, o DNA genômico pode ser isolado de plantas inteiras ou qualquer parte, órgão, tecido ou célula deste. Por exemplo, o DNA genômico pode ser isolado de mudas, folhas, hastes, raízes, inflorescências, sementes, embriões, brotos, coleóptilos, anteras, estigmas, células cultivadas e outros. Além disso, a invenção não depende da isolação de DNA genômico das plantas ou partes, órgãos, tecidos ou células destas que são de qualquer estágio de desenvolvimento particular. Os métodos podem utilizar DNA genômico que é isolado, por exemplo, de mudas ou plantas maduras ou qualquer parte, órgão, tecido ou célula destas. Além disso, a invenção não depende das plantas que são cultivadas sob quaisquer condições particulares. As plantas podem ser cultivadas, por exemplo, sob condições de campo, em uma estufa ou uma câmara de cultivo, em cultura ou mesmo hidroponicamente em uma estufa ou câmara de cultivo. Tipicamente, as plantas serão cultivadas em condições de luz, temperatura, nutrientes e umidade que favoreçam o crescimento e desenvolvimento das plantas.

[170] Os métodos da invenção envolvem detectar os produtos das amplificações pela PCR. Tipicamente, os produtos de PCR são detectados primeiro separando-se os produtos em um substrato na base do peso molecular e depois detectando cada um dos produtos de PCR separados no substrato. Em uma forma de realização preferida da invenção, os produtos de PCR são detectados pela eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR seguidos pelo tingimento com brometo de etídio do DNA no gel e visualização no gel pela fluorescência na presença de luz UV. Entretanto, qualquer método de detecção adequado para separar polinucleotídeos pode ser usado para detectar os produtos de PCR da invenção incluindo, mas não limitado a, eletroforese em gel, cromatografia líquida de alto desempenho, eletroforese capilar e outros. Os substratos para tais métodos incluem, por exemplo, agarose, poliacrilamida, dietilaminoetil celulose, hidroxialquil celulose, sefarose, polioxietileno e outros. As amplificações de PCR da invenção podem envolver o uso de um ou mais iniciadores que são rotulados, por exemplo, radioativamente ou com um corante fluorescente, um rótulo luminescente, um rótulo paramagnético ou qualquer outro rótulo adequado para a detecção de ácidos nucléicos. Quando as amplificações pela PCR envolvem um ou mais de um tal iniciador rotulado, a etapa de detecção pode incluir a detecção do rótulo radioativo, fluorescente, luminescente, paramagnético ou outro rótulo por quaisquer métodos conhecidos na técnica para detectar um tal rótulo.

[171] A presente invenção também fornece kits para realizar os métodos para genotipar girassol AHASL1 como aqui descrito. Tais kits compreendem iniciadores da presente invenção, particularmente um iniciador de AHASL1 direto, um iniciador de AHASL1 do tipo selvagem reverso e um iniciador de AHASL1 reverso mutante como descrito acima. Preferivelmente, o iniciador de AHASL1 direto compreende uma sequência de nucleotídeo que corresponde a uma região do gene de girassol de AHASL1 que está a 5’ da região (ACC)n mostrada na Figura 8, o iniciador de AHASL1 do tipo selvagem reverso anela a uma sequência de nucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 13 e o iniciador de AHASL1 reverso mutante anela a uma sequência de nucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 14. Mais preferivelmente, o iniciador de AHASL1 direto compreende uma sequência de nucleotídeo que corresponde a uma região do gene de AHASL1 de girassol que está a 5’ da região (ACC)n mostrada na Figura 8, o iniciador de AHASL1 do tipo selvagem reverso anela a uma sequência de nucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 13 e o iniciador de AHASL1 reverso mutante anela a uma sequência de nucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 14. Mais preferivelmente, o iniciador de AHASL1 direto, o iniciador de AHASL1 do tipo selvagem reverso e o iniciador de AHASL1 reverso mutante compreendem moléculas de nucleotídeo tendo as sequências de nucleotídeo apresentadas na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente. Os kits da invenção podem opcionalmente compreender um ou mais dos seguintes: uma polimerase, trifosfatos de desoxirribonucleotídeo e instruções para realizar o método.

[172] A presente invenção fornece ainda kits que realizam os métodos para identificar os alelos AHASL1 em uma planta de girassol. Tais kits compreendem os iniciadores da presente invenção, particularmente um primeiro iniciador direto, um primeiro iniciador reverso e um segundo iniciador direto e um segundo iniciador reverso como descrito acima. O primeiro iniciador direto compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 15, o primeiro iniciador reverso compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 16, o segundo iniciador direto compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 17 e o segundo iniciador reverso que compreende a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 18. Os kits podem opcionalmente compreender um ou mais dos seguintes: uma polimerase, trifosfatos de desoxirribonucleotídeo e instruções para realizar o método.

[173] Além disso, a invenção fornece os iniciadores usados nos métodos que envolvem a amplificação pela PCR aqui descrita. Tais iniciadores compreendem uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste das sequências de nucleotídeo apresentadas nas SEQ ID NOS: 3,

[174] Os artigos “um” e “uma” são aqui usados para se referir a um ou mais do que um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Por via de exemplo, “um elemento” significa um ou mais elementos.

[175] Como aqui usado, a palavra “compreender,” ou variações tais como “compreende” ou “que compreende,” serão entendidas implicar a inclusão de um elemento estabelecido, número inteiro ou etapa ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.

[176] Os seguintes exemplos são oferecidos por via de ilustração e não por via de limitação.

EXEMPLO 1: Interações Fenotípicas das Mutações Resistentes à Imidazolinona em AHASL1 de Girassol

[177] GM40 e GM1606 são linhagens derivadas por mutação de girassol que mostram altos níveis de tolerância às imidazolinonas devido a uma mutação pontual no códon 122 (nomenclatura da Arabidopsis thaliana) de AHASL1 (WO 2007005581 e Pedido de Patente Provisório U.S. Serial No 60/695.952; depositado em 1 de julho de 2005). Foi demonstrado que a mutação A122T e as linhagens derivadas e os híbridos homozigotos para esta mutação apresentam uma melhor tolerância ao imazamox do que os girassóis Clearfield homozigotos para a mutação A205V em AHASL1 já conhecidos, comercialmente disponíveis, (WO 2007005581). Ambos os mutantes apresentam domínio incompleto em relação ao alelo do tipo selvagem, suscetível, como em muitos outros exemplos na literatura. Esta presente invenção está fundamentada na descoberta de que a mutação A122T apresenta domínio quase completo para a resistência às imidazolinonas em relação ao A205V em um faixa de aplicações de herbicida de 0,5x a 6x da dose comercial. A presente invenção fornece plantas de girassol heterozigotas em A122T/A205V que mostram o mesmo nível e padrão de tolerância de resposta às doses aumentadas de imidazolinonas como os das plantas de girassol homozigotas em A122T. Assim, um nível mais alto de tolerância às imidazolinonas pode ser obtido pela substituição alélica de A205V pelo A122T em apenas uma das linhagens parentais de um girassol Clearfield, que por sua vez permite um mais posicionamento estratégico rápido deste novo alelo na safra de girassol.

[178] Para determinar as interações fenotípicas do gene de resistência A122T e do gene Imr1 (A205V) já descritos nos girassóis IMI-R (HA425), as populações F1, F2 e BC1F1 do cruzamento GM40 (A122T)/HA425 (A205V) foram avaliados em duas taxas de aplicações de herbicida (80 e 320 g. ingrediente ativo Ha-1 de imazapir). Nenhuma planta suscetível foi observada nas populações F2 e BC1F1 resultantes deste cruzamento quando a progênie foi avaliada na taxa de herbicida mais baixa, indicando que os genes de resistência em GM40 e HA425 são alelos do mesmo local e que ambos deles apresentam o mesmo nível de resistência às imidazolinonas em 1x a taxa de aplicação do herbicida. Quando as populações F2 e BC1F1 foram contados na taxa de herbicida mais alta (320 g. a. i. Ha-1), que discrimina ambos os precursores, a segregação quanto a suscetibilidade foi observada. Apenas duas classes fenotípicas puderam ser detectadas, uma classe resistente com plantas sem qualquer lesão ou sintomas leves e um fenótipo suscetível que foi morto como a linhagem de controle HA425. As razões de segregação observadas em relação às 450 plantas F2 triadas não foram significantemente diferentes de uma razão de segregação de 3:1. Para confirmar estes resultados, plantas F1 foram retrocruzadas com HA425 e as plantas BC1F1 resultantes foram triadas em 320 g. ingrediente ativo ha-1 de imazapir. As razões de segregação observada deram um bom ajuste a uma razão R:S de 1:1, confirmando que o gene resistente em GM40 mostrou domínio completo em relação ao gene resistente em HA425 e que ambos deles são alelos do mesmo local, AHASL1.

[179] Para confirmar ainda mais estes resultados, um método de marcador molecular foi usado. O gene de AHASL1 no girassol apresenta um polimorfismo de repetição de sequência simples (SSR) que discrimina as linhagens que carregam o alelo Imr1 de qualquer outro genótipo de girassol (Kolkman et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159). A amplificação pela PCR do fragmento de gene de AHASL1 contendo este SSR usando os iniciadores p-AHAS18 e p-AHAS19 produziu um produto de 321 pares de base para GM40 e BTK47 (linhagem de mutagênese original) e um fragmento de 312 pares de base para HA425. Este polimorfismo de variante de comprimento detectado em GM40 e HA425 foi explorado para investigar a segregação na populações F2 e BC1F1 derivada de cruzar ambas as linhagens. Oitenta plantas da população F2 e 50 plantas da população BC1F1 foram escolhidas ao acaso, amostradas quanto a isolação de DNA, inoculadas com uma taxa de aplicação de imazapir de 320 g. a. i. ha-1 e genotipadas usando este marcador. Na população F2, 22 plantas foram mortas pelo herbicida (S) e 58 não mostraram nenhum sintoma ou uma lesão leve (R). A razão de segregação observada quanto a resistência não foi significantemente diferente (P < 0,61) da razão de segregação esperada quanto a um fator completamente dominante que segrega em F2 (3R:1S). A segregação observada para o marcador AHASL1 SSR (19 A/A: 39 A/B: 22 B/B) adapta uma razão de segregação esperada para um marcador co-dominante que segrega em F2 (1:2:1, P<0,87). Todas as plantas suscetíveis genotipadas quanto ao AHASL1 SSR foram homozigotas quanto ao haplotipo HA425 (B/B), ao passo que as plantas R foram heterozigotas (A/B) ou homozigotas quanto ao haplotipo GM40 (A/A) (Tabela 4, Fig. 1). A co-segregação de fenótipos da resistência a herbicida e haplotipos AHASL1 foi ainda avaliada em 50 descendentes BC1F1 que segregam quanto a resistência. As razões de segregação observadas para resistência adaptam uma razão 1:1 (P<0,78) como esperado

[180] Estes resultados confirmam que o gene de resistente em GM40 é diferente do gene de resistência em HA425, que ambos deles são variantes alélicas do AHASL1 local e, finalmente, que o gene presente em GM40 é completamente dominante em relação ao alelo Imr1.

Exemplo 2: Resposta de Eventos A122T/A122T e A205V/A205V Homozigotos e A122T/A205V Heterozigoto ao Imazapir ao Nível de Planta Inteira

[181] Este experimento foi conduzido para quantificar e contrastar a sensibilidade ao imazapir de híbridos de girassol que carregam as mutações A122T e A205V nos estados homozigotos (A122T/A122T ou A205V/ A205V) e heterozigotos (A122T/A205V) em fundos genéticos diferentes e ao nível da planta inteira.

Materiais

[182] Sementes das diferentes linhagens de girassol (Tabela 1) foram obtidas sob condições de campo. Tabela 1. Materiais de Girassol Utilizados, sua Genealogia e Tipo de Evento de Mutação

[183] As linhagens L1 e L2 são estéreis masculinas e restauram as linhagens de procriação, respectivamente, carregando o alelo A205V na condição de homozigoto. L5, BTK 47, é uma linhagem mantenedora que foi utilizada como material inicial para desenvolver a linhagem GM40. GM40 é a linhagem original que carrega a mutação A122T no estado homozigoto (Número de Depósito de Patente no ATCC PTA-6716; ver a WO 2007005581). L4 é uma linhagem restauradora BC2F4 derivada do cruzamento R701*3/GM40 usando o retrocruzamento assistido por marcador para selecionar a planta mais similar ao precursor recorrente em cada geração de retrocruzamento. R701 é uma linhagem restauradora suscetível com boa capacidade de combinação. Depois de duas gerações de retrocruzamento a planta mais similar ao R701 foi autopolinizada e a sua progênie foi selecionada quanto a resistência ao imazapir. As plantas A122T homozigotas foram selecionadas entre a progênie resistente usando-se um diagnóstico de marcador molecular da mutação A122T que é descrita abaixo. CMS GM40 é a versão estéril masculina de GM40 que foi desenvolvida a partir da geração BC1F1 do cruzamento cmsBTK47/*2 GM40 usando o mesmo marcador de diagnóstico para distinguir plantas homo e heterozigotas para o alelo A122T.

Métodos Marcador de diagnóstico para a mutação A122T

[184] Um ensaio de PCR específico de alelo é descrito para a genotipagem de alto rendimento de plantas de girassol que carregam a mutação A122T em AHASL1. O ensaio permite que se: (1) detecte os

[185] Os iniciadores de PCR foram tirados daqueles fornecidos por Kolkman et al. ((2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159) para amplificar um fragmento da sequência de AHASL1 de girassol que inclui a mutação A122T e um polimorfismo de inserção-deleção (“INDEL”) e que pode ser usado para distinguir a sequência da mutação A122T da sequência da mutação A205V já conhecida.

[186] Os nomes e sequências destes iniciadores são: p-AHAS18 5’-ttcctcccccgtttcgcattac-3(SEQ ID NO: 1) p-AHAS19 5’-cgccgccctgttcgtgac-3(SEQ ID NO: 2)

[187] A mistura de reação foi como segue: 1 U de Taq DNA Polimerase, 70 ng de DNA de girassol genômico, 25 µg de BSA e tem uma concentração final de 100 µM de cada dNTP, 0,25 µM de cada iniciador, 90 mM de Tris-HCl pH 8, 20 mM de (NH4)2SO4 e 2,5 mM de mgCl2. O programa de PCR consiste em uma etapa de desnaturação inicial de 94° C por 2 min, seguido por 40 ciclos de 30 segundos a 94° C, 30 segundos em 56° C e 30 segundos a 72° C, seguido por uma etapa de alongamento inicial a 72° C por 10 min.

[188] O tamanho do fragmento prognosticado para BTK47 (ou GM40) usando os iniciadores supracitados é de 321 pares de base e o tamanho do fragmento prognosticado com base no Acesso do GenBank No AY541455 para o haplotipo de girassol que carrega a mutação A205V é de 312 pares de base. A Fig. 4 mostra que a reação da PCR descrita permite discriminar ambos os mutantes A122T e A205V com base na presença de um polimorfismo INDEL entre as suas sequências.

[189] Os produtos amplificados foram restringidos e os fragmentos resultantes foram resolvidos em um gel de agarose. A reação de restrição

[190] A de tipo selvagem demonstrará fragmentos de 183 + 138 pares de base. GM40 (A122T): demonstra fragmentos de 183 + 76 + 62 pares de base. Indivíduos heterozigotas demonstrarão fragmentos de 183 + 138 + 76 + 62 pares de base. A Fig. 5 mostra que usando este método fragmentos do tamanho esperado são obtidos e que é possível detectar carreadores de A122T a partir de plantas do tipo selvagem e também, que é possível discriminar entre indivíduos homo e heterozigotas para a mutação A122T.

Tratamentos com herbicida

[191] As sementes foram semeadas em placas de Petri e, depois da germinação, as plantinhas foram transplantadas para vasos de 10 cm de diâmetro em um meio de vaso que consiste de partes iguais de vermiculita, solo e areia. As plantas foram cultivadas em uma estufa sob condições de luz natural suplementadas com lâmpadas de haleto de sódio de 400 W para fornecer uma duração de dia de 16 horas. As temperaturas dia/noite foram de 25 e 20° C, respectivamente. No estágio V2-V4 (Schneiter & Miller (1981) Safra Sci. 21: 901-903) 10 plantas de cada genótipo foram aleatoriamente designadas para cada tratamento que consiste de oito doses de imazapir (0, 40, 80, 160, 240, 320, 400 e 480 g de ia/ha, que corresponde a não tratada, 0,5x, 1x, 2x, 3x, 4x, 5x e 6x, respectivamente) e uma determinação de biomassa em tempo zero. O experimento foi disposto como um planejamento de bloco randomizado com um arranjo fatorial completo (linhagem de girassol x tratamento) de tratamentos e 10 replicações.

[192] No dia da aplicação de herbicida dez plantas de cada genótipo foram cortadas no nodo cotiledonal e secada a 60° C por 48 horas para a determinação de peso seco em tempo zero.

[193] As plantas remanescentes foram mantidas por 14 dias depois do tratamento com imazapir (DAT) e a sua altura, Índice de Fitotoxicidade (PI) e biomassa seca acima do solo foram determinados. A altura foi determinada como a distância entre o nodo cotiledonal e o ápice de cada planta. Os dados de biomassa acima do solo de cada linhagem foram convertidos para acúmulo de biomassa depois da aplicação subtraindo-se a biomassa em tempo zero média apropriada de cada amostra. Os dados da biomassa seca foram convertidos para porcentagens das plantas de controle não tratadas dentro de cada linhagem para permitir as comparações diretas entre os grupos. PI é uma escala fenotípica de 0 a 9 que foi avaliada quanto a cada planta pela inspeção visual. As plantas sem qualquer sintoma foram registradas como “0”, níveis aumentados de atrofia e clorose com respeito às plantas de controle não tratadas foram registrados como “1” a “4”, níveis aumentados de anormalidades de folha e necrose de folha foram registrados de “5” a “8” e as plantas mortas com necrose total do ápice foram registradas como “9”.

Resultados Altura

[194] A redução em altura da linhagem suscetível foi de 85 % na taxa mais baixa de aplicação de imazapir (0,5x). De 1x a 6x redução de altura nesta linhagem foi de aproximadamente 85 % das plantas de controle não tratadas. A altura da linhagem de girassóis e híbrido que carrega a mutação A205V na condição de homozigoto não diferiu dos controles não tratados quando uma taxa de 0,5x ou 1x de imazapir foi aplicada. De 2x a 6x, estas linhagens mostraram uma redução significante na altura que atingiu 69,6 % ± 3,9 dos controles não tratados (Tabela 2 e Fig,1). Ao contrário, as linhagens de girassol que carregam a mutação A122T na condição de homozigoto exibiram uma redução de altura reduzida (de 0,1 % e 18,8 % dos controles não tratados para 0,5x e 6x a taxa de of imazapir, respectivamente). Ambos os grupos de linhagens mostraram uma diferença significativa entre elas quanto a sua resposta a um aumento na taxa de herbicida de 2x a 6x (Tabela 2 e Fig. 1).

[195] Os materiais com ambos os alelos mutantes em AHASL 1 (heterozigotas A122T/A205V) mostraram uma redução de altura de 0,6 % e 38,2 % +/- 2,7 dos controles não tratados para 0,5x a 6x a taxa de aplicação de herbicida. Esta redução na altura para materiais heterozigotas não diferiu da redução observada para Homozigotos A122T/A122T mas foi menor do que aquela registrada para os Homozigotos A205V/A205V (Fig. 1). De fato, a redução de altura média em materiais heterozigotas não foi diferente do que aquela observada nas plantas A122T/A122T homozigotas em qualquer doses de aplicação de herbicida, mas foi estatisticamente diferente daquela observada em plantas A205V/A205V homozigotas de 2x a 6x as taxas de aplicação de herbicida (Tabela 2).

Índice de Fitotoxicidade

[196] Ambos os mutantes na condição de homozigoto mostraram enorme diferenças na sua resposta ao aumento na taxa de herbicida de 0,5x a 6x (Fig. 2). As linhagens de girassol que carrega a mutação A122T na condição de homozigoto apresentaram uma leve redução no tamanho da folha e cor verde mais clara do que as plantas de controle conforme a taxa de herbicida aumentada (Tabela 3). Ao contrário, as plantas que carrega a mutação A205V não apresentam nenhuma lesão em 0,5x ou 1x da taxa de herbicida, mas o nível de lesão (clorose, deformação da folha e necrose da folha) aumentou rapidamente de 2x a 6x (Tabela 3). Os dois mutantes na condição de homozigoto diferiram significantemente um do outro quanto ao Índice de Fitotoxicidade de 2x a 6x (Tabela 3). Materiais A122T/A205V heterozigotas mostraram o mesmo padrão de resposta como os materiais homozigotos A122T/A122T. De fato, eles mostraram apenas uma cor verde mais clara do que as plantas de controle em qualquer taxa de aplicação de

[197] As curvas de resposta de dose para o peso seco de mutantes A122T e A205V são mostradas na Fig. 3. O peso da biomassa do evento A122T na condição de homozigoto foi reduzido com respeito às plantas de controle nas taxas de 4x, 5x e 6x e esta redução atingiu 25 % para a dose mais alta. Entretanto, o peso seco do evento A205V foi reduzido com respeito às plantas de controle de 0,5x (40 g de ia/ha) a 6x. Ambos os mutantes apresentaram diferenças significantes entre eles com respeito a esta variável de 0,5x a 6x (Tabela 4). Materiais A122T/A205V heterozigotas apresentaram exatamente a mesma tendência como os materiais A122T homozigotos (Fig. 3, Tabela 4). Eles apresentaram uma redução no peso da biomassa de 0,3 % e 33 % para 0,5x a 6x as taxas de aplicação de herbicida que não diferiu daquela registrada para os indivíduos A122T homozigotos em qualquer taxa. Entretanto, materiais heterozigotas apresentaram diferenças significantes com respeito aos indivíduos A205V homozigotos quanto ao acúmulo de matéria seca a partir de 3x a 6x as taxas de aplicação de herbicida (Tabela 4). Conclusões

[198] Materiais heterozigotas que carregam ambos os alelos mutantes no local AHASL1 apresentaram o mesmo nível de tolerância e padrão de resposta para a altura da planta, índice de fitotoxicidade e acúmulo de matéria seca, para aumentar as taxas de aplicação de imazapir do que os materiais A122T homozigotos e este nível de tolerância é melhor do que aquele expressado pelos materiais A205V homozigotos. Tabela 2. Efeito de doses diferentes de imazapir na altura da planta 14 dias depois do tratamento para três genótipos de girassol que carregam o evento de mutação A205V, três genótipos que carregam o evento de mutação A122T, dois genótipos que carregam o evento de mutação A205V/A122T e uma linhagem suscetível. **: As médias são estatisticamente diferentes dos controles não tratados nos níveis de significância de 0,05 e 0,01, 5 respectivamente. Petição 870220054300, de 21/06/2022, pág. 77/114 Tabela 3. Efeito de doses diferentes de imazapir sobre o Índice de Fitotoxicidade 14 dias depois para três genótipos de girassol que carregam o evento de mutação A205V, três genótipos que carregam o evento de mutação A122T, dois genótipos que carregam o evento de mutação A205V/A122T e uma linhagem suscetível. **: As médias são estatisticamente diferentes dos controles não tratados ao nível de significância de 0,05 e 0,01, 5 respectivamente. Petição 870220054300, de 21/06/2022, pág. 78/114 Tabela 4. Efeito de doses diferentes de imazapir sobre o acúmulo de biomassa 14 dias depois do tratamento para três genótipos de girassol que carregam o evento de mutação A250V, três genótipos que carregam o evento de mutação A122T, dois genótipos que carregam o evento de mutação A205V/A122T e uma linhagem suscetível **: As médias são estatisticamente diferentes dos controles não tratados ao nível de significância de 0,05 e 0,01, 5 respectivamente. Petição 870220054300, de 21/06/2022, pág. 79/114

EXEMPLO 3: Tolerância a Herbicida de Linhagens Homozigotas e Heterozigotas para A122T e A205V Versus Linhagens Heterozigotas para Ambas as Mutações (A122T/A205V) sob as Condições de Campo

[199] Este experimento foi conduzido para comparar a tolerância ao herbicida de híbridos de girassol e linhagens em genótipos diferentes que carregam as mutações A122T e A205V nos estados de homozigoto (A122T/A122T ou A205V/ A205V), heterozigoto (A122T / - ou A205V / -) e heterozigotos empilhados duplos (A122T/A205V) sob as condições de campo.

Materiais

[200] Os materiais de girassol que foram usados são listados na Tabela 5. Tabela 5: Lista de Entrada

Métodos

[201] A semente de cada entrada na Tabela 5 foi produzida sob condições de produção de semente ótimas na América do Sul durante a estação de cultivo de 2005 a 2006. O teste de campo foi conduzido em um local em North Dakota, USA em 2006. As entradas foram organizadas em um Tabela 6: Fator A - Lista de Tratamento com Herbicida NIS = tensoativo não iônico Volume de Pulverização: 10 galões por acre (GPA) (ou 100 litros/ha) pulverizador tipo mochila ou 20 GPA (ou 200 litros/ha) para lança montada em trator Estágio de Crescimento na Aplicação de Herbicida: 2 a 4 folhas

[202] A Entrada 15 (linhagem mantenedora do tipo selvagem) foi deixada sem pulverizar em todos os blocos de tratamento.

[203] As classificações de fitotoxicidade foram avaliadas nos dias 7 e 21 a seguir da aplicação de herbicida. A fitotoxicidade foi registrada como a quantidade de dano á planta (em porcentagem), onde uma classificação de ‘0’ indicou nenhum dano às plantas nos lotes em relação ao lote não tratado. Uma classificação de ‘100’ indicou necrose completa (morte) das plantas no lote em relação ao lote não tratado.

[204] Os dados foram submetidos a uma análise ANOVA e a média das 3 repetições é apresentada na Tabela 7 (fitotoxicidade em 7 dias após o tratamento) e na Tabela 8 (fitotoxicidade em 21 dias após o tratamento). Resultados

[205] Em 160 g de ia/ha de imazapir não houve diferenças significantes na fitotoxicidade entre as entradas heterozigotas duplas A205V/A122T e as entradas homozigotas A205V e A122T ambas em 7 dias e 21 dias depois do tratamento (DAT). A fitotoxicidade nas entradas A205V heterozigotas foi significantemente mais alta do que nos A205V/A122T heterozigotas duplos e as entradas homozigotas para as classificações DAT tanto em 7 quanto 21 DAT (na faixa de 20 a 43 % para as entradas A205V heterozigotas por 21 DAT). A fitotoxicidade nas entradas heterozigotas também aumentou do momento em que a avaliação 7 DAT foi tirada para o momento em que a 21 DAT foi tirada. Não houve nenhum aumento significante na fitotoxicidade de 7 DAT para 21 DAT para as entradas heterozigotas duplas A205V/A122T e as entradas homozigotas A122T/A122T e A205V/A205V.

[206] Três níveis de imazamox, 50 g ai, 100 g ai e 200 g de ia/ha, foram testados em todas as entradas (exceto a entrada 15). Em 200 g de ia/ha de imazamox, as linhagens A205V/A122T heterozigotas (2 a 3 % de fitotoxicidade em 21 DAT) demonstrou significantemente menos fitotoxicidade do que as linhagens de A205V/A205V homozigotas (15 a 22 % de fitotoxicidade em 21 DAT) e fitotoxicidade equivalente para as linhagens A122T/A122T homozigotas (3 a 5 % de fitotoxicidade em 21 DAT). Debate

[207] As entradas A205V/A122T heterozigotas duplas demonstraram tolerância a herbicida equivalente às entradas A122T/A122T homozigotas e tolerância a herbicida superior às entradas A205V/A205V homozigotas, como demonstrado pelo nível de tratamento com imazamox mais alto (200 g de ia/ha).

[208] O nível de tratamento único de imazapir, 160 g de ia/ha, não foi alto o bastante para mostrar diferenças significantes na fitotoxicidade entre as entradas de A205V/A122T heterozigotas duplas e as entradas homozigotas, já esta foi suficiente para ilustrar a tolerância mais alta obtida pelo empilhamento das duas mutações A205V/A122T heterozigotas juntas versus

[209] Com base nos dados de tratamento com imazamox, a mutação A122T quando empilhada com a mutação A205V no estado heterozigoto, fornece tolerância herbicida mais forte do que a mutação A205V no estado homozigoto.

[210] O experimento descrito acima divulga as interações entre dois alelos mutantes de AHASL1 no girassol. A mutação no códon 122 tem tolerância a herbicida significantemente maior do que quaisquer mutações AHAS anteriormente relatadas em girassol, ao passo que a mutação no códon 205 confere níveis intermediários de resistência. Visto que o alelo 122 apresenta domínio sobre o seu alelo 205, genótipos heterozigotos que carregam ambos mutantes têm o mesmo nível de tolerância como o 122 homozigoto.

[211] Devido à tolerância a herbicida aumentada, a presente invenção fornece métodos que permitem o desenvolvimento de produtos herbicidas novos e altamente eficazes para a produção de girassol. Visto que a presente invenção fornece plantas de girassol com níveis comerciais de tolerância a herbicida produzidos fazendo-se uma única substituição de gene nos híbridos de girassol Clearfield do momento, que são A205V/A205V, a presente invenção descobre uso aumentando a eficiência de procriação para a produção de híbridos de girassol tolerantes a herbicida e também fornece um posicionamento estratégico mais rápido da mutação A122T em híbridos de girassol comerciais. Tabela 7. Classificações de Fitotoxicidade (% de Lesão de Safra) Tabela 8. Classificações de Fitotoxicidade (% de Lesão de Safra) registrada 21 Dias depois do Tratamento (DAT)

EXEMPLO 4: Tolerância a Herbicida dos Eventos A122T/A122T ou A205V/A205V Homozigotos e A122T/A205V Heterozigotos para Aplicações Foliares de Imazapir nos Estágios Vegetativo Tardio ou Reprodutivo Inicial de Desenvolvimento da Planta para o Controle de Orobanca

[212] Orobanche cumana e Orobanche cernua (orobanca) são duas plantas parasíticas que infectam os girassóis em muitas áreas de produção do mundo. Ambas as espécies infectam as plantas de girassol sequencialmente a partir do estágio V6 até o florescimento (R5). Foi proposto usar um herbicida de imidazolinona, tal como imazetapir, para controlar orobanca pela aplicação do herbicida às plantas de girassol contendo A205 nos estágios V10 a R1 de desenvolvimento (WO 1999065312). Usando este método, o controle de Orobanche foi bem sucedido e a fitotoxicidade foi negligenciável.

[213] Aqui nós demonstramos que a tolerância dos híbridos A122T/A122T ou A122T/A205V é melhor do que a tolerância de plantas homozigotas A205V quando um herbicida de imidazolinona, tal como imazapir, é aplicado em uma taxa de aplicação 2x durante os estágios reprodutivos iniciais de desenvolvimento (R1). Neste relato, nós demonstramos a utilidade de A122T/A122T e A122T/A205V para o controle de Orobanche em girassóis.

Materiais

[214] As linhagens H1, H2 e H3 são como descritas na Tabela 9. O híbrido H5 é um F1 que origina de um cruzamento entre L3 x R701 e o híbrido H6 é um F1 que se origina de um cruzamento entre L1 x R701. Métodos

[215] As sementes de cada entrada foram produzidas sob condições de produção de semente ótima em Laguna Blanca (Formosa, Argentina) em 2005. O teste de campo foi conduzido em um local em Venado Tuerto (Santa Fé, Argentina) em 2006. As entradas foram organizadas em um planejamento de bloco completo randomizado que consiste de 3 réplicas para cada combinação de tratamento. O fator A foi o estágio ontogenético de desenvolvimento do girassol (V8 e R1) e o fator B foi a entrada do girassol. O tamanho do lote foi de 5 fileiras x 6 metros, com plantas distribuídas a cada 25 cm dentro de cada fileira. No estágio V8 ou R1, 160 g de ia/ha de imazapir + 0,25 % (v/v) NIS foram aplicados com um volume de pulverização de 100 litros/ha usando um pulverizador de mochila.

[216] As classificações de fitotoxicidade foram avaliadas em 14 dias e 21 dias depois da aplicação de herbicida. A fitotoxicidade foi registrada como a quantidade de dano à planta, onde uma classificação de “0” indicou nenhum dano às plantas no lote em relação aos lotes de controle não tratados. Uma classificação de 1 a 15 indicou um nível aumentado de clorose no lote, onde “15” indicou um amarelamento generalizado do lote. As classificações de “20” a “49” indicaram um nível aumentado de atrofia, deformações e necrose. Uma classificação de “50”, indicou morte (necrose completa) das plantas.

[217] Os dados foram submetidos a uma análise ANOVA. As médias de cada entrada foram comparados usando o teste de LSD ao nível de probabilidade de 0,01.

Resultados

[218] O Índice de Fitotoxicidade (PI) médio registrado em 14 e 21 dias depois do tratamento (DAT) está apresentado nas Tabelas 9 e 10.

[219] Quase todos os híbridos apresentaram sintomas leves de clorose quando pulverizados no estágio V8 de desenvolvimento vegetal. A única exceção foi o híbrido 122/WT heterozigoto que demonstrou um amarelamento completo em 14 DAT (Tabela 9). Este amarelamento desapareceu em 21 DAT (Tabela 10). Também, em 21 DAT, não houve nenhuma diferença entre as linhagens com respeito ao PI (Tabela 10).

[220] Por outro lado, quando os híbridos foram pulverizados no estágio R1 de desenvolvimento vegetal e avaliados em 14 DAT, dois grupos bem definidos de materiais foram reconhecidos. Um grupo apenas apresentou sintomas de clorose (PI menor do que 11,7) enquanto que o segundo grupo apresentou sintomas de clorose junto com atrofia e deformação (PI maior do que 35). O primeiro grupo foi composto de linhagens que carregam pelo menos um alelo A122T (isto é: híbridos A122T/A122T, A122T/A205V e A122/WT) e o segundo grupo consistiu de híbridos que carregam o evento de mutação A205V tanto no estado homozigoto quanto heterozigoto (A205V/A205V, A205V/WT). Diferenças no PI entre ambos os grupos foram altamente significantes (p < 0,01; Tabela 9). Em 21 DAT, entretanto, o híbrido A122/WT aumentou a sua contagem de PI (de 11,7 para 23,3), enquanto, os híbridos A122T/A122T e A122T/A205V diminuíram as suas contagens de PI de 2,3-4,3 para 1,7-0,7. As diferenças entre estes dois últimos híbridos e o híbrido A122T/WT foram altamente significantes em 21 DAT (Tabela 10). As linhagens contendo A205/A205V e A205V/WT também apresentaram contagens de PI muito altos com muitas plantas apresentando sintomas de queimadura do ápice e dano aos pontos de crescimento (Tabela 10).

Conclusão

[221] Os resultados indicam que os híbridos A205V/A205V ou A205V/WT não podem ser pulverizados com imazapir depois do V8 porque eles apresentaram fitotoxicidade aumentada e dano grave depois da aplicação. Os híbridos A122T/A122T e A122T/A205V apresentaram apenas sintomas leves de clorose depois da aplicação de imazapir. Isto confirmou que as plantas A122T/A122T e A122T/A205V de girassol demonstraram um nível melhor de tolerância aos herbicidas de imidazolinona quando aplicados no estágio R1, do que o material A205V/A205V ou A205V/WT. Em resumo, as linhagens contendo a pilha A122T/A122T e A122T/A205V pode ser usada para controlar Orobanche com imazapir pela aplicação do herbicida no estágio R1 (vegetativo tardio ou reprodutivo inicial) de desenvolvimento vegetal. Tabela 9. Índice de Fitotoxicidade Médio registrado em 14 dias depois do tratamento (DAT) com Imazapir (160 g de ia/ha) aplicado em dois estágios diferentes de desenvolvimento vegetal (V8 e R1) para os eventos de mutação A122T e A205V e genótipos heterozigotos A122/A205, A122/WT e A205/WT. Letras diferentes indicam diferenças significantes em p < 0,01. valor LSD (p < 0,01) = 10,04 Média quadrada Residual= 20,0 Média quadrada de Genótipo = 476,22 (p < 2,2 e-16) Tabela 10. Índice de Fitotoxicidade Médio registrado em 21 dias depois do tratamento (DAT) com Imazapir (160 g de ia/ha) aplicado em dois estágios diferentes de desenvolvimento vegetal (V8 e R1) para os eventos de mutação A122T e A205V e genótipos heterozigotos A122/A205, A122/WT e A205/WT. Letras diferentes indicam diferenças significantes em p < 0,01. valor LSD (p < 0,01) = 16,39 Média quadrada Residual= 53,3 Média quadrada de Genótipo = 806,33 (p < 2,2 e-16)

EXEMPLO 5: Resposta de Eventos A122T/A122T ou P197L/P197L Homozigotos e A122T/P197L Heterozigotas para um Herbicida de Sulfoniluréia ao Nível de Planta Inteira

[222] A resistência às sulfoniluréias em girassol foi descoberta em populações de Helianthus selvagens do Kansas (USA, (Al-Khatib et al. (1998) Erva daninha Sci. 46: 403-407). O gene para resistência (Ar-kan) foi introgredido a partir de uma população selvagem em linhagens congênitas de elite com o propósito de desenvolver e posicionar cultivares e híbridos resistente a herbicida (Al-Khatib e Miller (2000) Safra Sci. 40: 869; Miller e Al-Khatib (2002) 42: 988-989; Miller e Al-Khatib (2004) Safra Sci. 44: 10371038). Foi demonstrado que AHASL1 de genótipos resistentes à sulfoniluréia abriga uma mutação de C para T no códon 197 que leva a uma mudança de Pro para Leu nesta posição (Kolkman et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159).

[223] Metsulfuron metila (2 E [C [(4-Metoxi-6-metil-1,3,5-Triazifl-2- il) amino]carbonil] amino] sulfonil.]benzoato] de Metila) é um herbicida de sulfoniluréia registrado para o uso no trigo e cevada e nos sítios que não de sensibilidade ao metsulfuron de híbridos de girassol que carregam as mutações A122T e P197L em estados homozigotos (A122T/A122T ou P197L/ P197L) e heterozigotos (A122T/P197L) ao nível de planta inteira sob condições de estufa. Materiais

[224] O objetivo deste estudo foi quantificar e contrastar a sensibilidade ao metsulfuron de híbridos de girassol que carregam as mutações A122T e P197L em estados homozigotos (A122T/A122T ou P197L/ P197L) e heterozigotos (A122T/P197L) ao nível de planta inteira sob condições de estufa.

[225] Os seguintes materiais foram usados: B770, GM1606, GM40, L4, cms GM40 x L4, cms GM40 x BTSu-R1 e BTSu-R1. B770 é uma linhagem de girassol suscetível que foi usada como a fonte precursora para mutagênese da linhagem GM1606. GM1606 é homozigoto para a mutação A122T e GM1606 e B770 são isolinhagens que apenas diferem no local AHASL1. GM40, L4 e crosGM40 x L4 foram descritas acima. BTSu-R1 é uma linhagem restauradora desenvolvida em nosso laboratório e obtida pela seleção da genealogia da população compósita SURES-2, que foi liberada por Miller e Al-Khatib (2004) Safra Sci. 44: 1037-1038.

Métodos

[226] As sementes foram semeadas em placas de Petri e, depois da germinação, as plantinhas foram transplantadas em vasos de 10 cm contendo meio de vaso que consiste de partes iguais de vermiculita, solo e areia. As plantas foram cultivadas na estufa sob condições de luz natural suplementada com lâmpadas de haleto de sódio de 400 W para fornecer uma duração de dia de 16 horas. As temperaturas do dia/noite foram 25 e 20° C, respectivamente. No estágio V2-V4 (Schneiter & Miller, 1981) 20 plantas de cada genótipo foram aleatoriamente designadas a cada tratamento que consiste de três doses de metsulfuron metila (0 ou nenhuma tratamento, 5 g de ia/ha ou uma taxa de 1x e 10 g de ia/ha ou uma taxa de 2x). Uma determinação de biomassa em

[227] Para a determinação do peso seco em tempo zero, dez plantas de cada genótipo foram cortadas no nodo cotiledonal no dia da aplicação de herbicida e secado a 60° C por 48 horas. O repouso das plantas foi mantido por 14 dias depois do tratamento com o herbicida (DAT) e a sua altura, Índice de Fitotoxicidade (PI) e biomassa seca acima do solo foram registrados. A altura foi determinada como a distância entre o nodo cotiledonal e o ápice de cada planta. Os dados de biomassa acima do solo para cada linhagem foi convertida para acúmulo de biomassa depois da aplicação subtraindo-se a biomassa em tempo zero média apropriada de cada amostra. A altura e a biomassa seca foram convertidos a uma porcentagem do controle não tratado para cada linhagem para permitir as comparações diretas entre os grupos. PI é uma escala fenotípica de 0 a 9 que avalia a fitotoxicidade para cada planta pela inspeção visual. As plantas sem quaisquer sintomas foram registradas como “0”. Os níveis aumentados de atrofia e clorose, com respeito às plantas de controle não tratadas, foram registrados na faixa de “1 a 4”. Níveis aumentados de anormalidades de folha e necrose de folha foram registrados na faixa de “5 a 8”. As plantas mortas com necrose total do ápice foram registradas como um “9”.

[228] Os dados foram submetidos a um ANOVA e a média foi comparada por um teste de LSD.

Resultados

[229] A altura, acúmulo de matéria seca e PI das plantas do tipo selvagem e A122/A122T homozigotas refletiram a enorme sensibilidade do girassol convencional e do evento mutante A122T às sulfoniluréias em ambas as taxas de aplicação (Tabela 11). Ao contrário, o evento de mutação P197L apresentou um nível maior de tolerância, com quase 80 % da altura dos controles não tratados em ambas as taxas de herbicida. Do mesmo modo, o acúmulo de matéria seca para este evento foi de 88 % e 77 % em taxas 1x e 2x de metsulfuron, respectivamente. Finalmente, o PI da linhagem P197L/P197L homozigota foi 0 e 0,1 em ambas as taxas de herbicida, refletindo que as plantas não tiveram virtualmente nenhum sintomas fitotóxico (Tabela 11).

[230] O híbrido A122T/P197L empilhado apresentou o mesmo padrão de tolerância como a linhagem P197 homozigota e apresentou um melhor desempenho do que todos os materiais A122T homozigoto para todas as variáveis analisadas (Tabela 11). Para ilustrar isto, a linhagem A122T/P197L, quando tratada com 1x metsulfuron, apresentou o mesmo PI e redução de altura como a linhagem resistente P197L homozigota. Na taxa de 2x metsulfuron, A122T/P197L demonstrou o mesmo acúmulo de matéria seca como a linhagem P197L homozigota. O híbrido P197L/A122T heterozigoto diferiu significantemente da linhagem P197L resistente para os seguintes parâmetros: DMA a 1x (74,4 vs 88,1, respectivamente), PH (62 vs 80,9 %) e PI em 2x (1 vs 0,1). Entretanto, a magnitude destas diferenças foi muito baixa quando comparada com as diferenças observadas entre o material A122T/P197L heterozigoto e todas as linhagens A122T homozigotos e do tipo selvagem.

Conclusão

[231] Com base nestes resultados, o A122T/P197L duplo heterozigoto demonstrou resistência ao metsulfuron superior do que os materiais A122T/A122T homozigoto e do tipo selvagem e quase o mesmo nível de tolerância como a linhagem P197L/P197L homozigota. Tabela 11. Redução Média da Altura (PH), Acúmulo de Matéria Seca (DMA) e Índice de Fitotoxicidade (PI) de materiais A122T/A122T, 97L/P197L homozigotos, P197L/A122T heterozigotos e do tipo selvagem depois da aplicação foliar de duas taxas de metsulfuron. * Letras diferentes indicam diferenças significantes no nível de probabilidade p < 0,01.

EXEMPLO 6: Marcadores de PCR de Diagnóstico para os Alelos de Resistência a Herbicida do Local AHASL1 em Girassol

[232] Um ensaio de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) é fornecido para a genotipagem de alto rendimento de plantas de girassol que carregam a mutação de girassol AHASL1 descrita aqui acima e no Pedido de Patente Provisório US No 60/695.952, depositado em 1 de julho de 2005). O ensaio permite (1) a detecção de indivíduos que carregam a mutação A122T, (2) a determinação da zigosidade da mutação A122T nestes indivíduos e (3) no caso de heterozigose, a detecção de ambas as mutações A122T junto com outro(s) alelo(s) resistente(s) de AHAS empilhados (A205V ou P197L) que estão presentes na planta. 1) Iniciadores de PCR e condições de amplificação

[233] Os iniciadores de PCR foram desenvolvidos com base nas sequências de DNA aqui divulgadas e no pedido de patente supracitado. O nome e as sequências destes iniciadores são como segue:

[234] Iniciador conservado direto p-AHAS NIDF 5’-TGT TCT CTC CGA CTC TAA A-3’ (SEQ ID NO: 3)

[235] Iniciador “do tipo selvagem” reverso AHAS 122 TWT 5’-TGG TGG ATC TCC ATT GAG TC-3’ (SEQ ID NO: 4)

[236] Iniciador “mutante” reverso AHAS 122 TMU 5’-TGG TGG ATC TCC ATT GAG TT-3’ (SEQ ID NO: 5)

[237] A mistura de reação foi como segue: 1 U de Taq DNA Polimerase (Biotools, 10.047), 70 ng de DNA de girassol genômico, 25 microgramas de BSA e têm uma concentração final de 100 µM de cada dNTP, 0,25 µM de cada iniciador p-AHAS NIDF / AHAS122TWT ou pAHAS NIDF / AHAS 122 TMU, 90 mM de Tris-HCl pH 8, 20 mM de 2) Detectar plantas que carregam a mutação A122T e a sua zigosidade

[238] O programa de PCR consiste em uma etapa de desnaturação inicial de 94° C por 2 min, seguido por 45 ciclos de 30 segundos a 94° C, 30 segundos em 55° C e 30 segundos a 72° C, seguido por uma etapa de alongamento inicial a 72° C por 10 min.

[239] De modo a detectar os indivíduos que carregam a mutação descrita, a combinação de iniciador p-AHAS NIDF / AHAS 122 TMU foram usadas. Indivíduos tendo pelo menos uma cópia (isto é, indivíduos homo e heterozigotos) do alelo A122T produzem um fragmento de 194 pares de base. Os indivíduos do tipo selvagem ou indivíduos tendo qualquer outro haplotipo para AHASL1 não produzem nenhum fragmento com esta combinação de iniciador (ver a Figura 6 e Tabela 12). Em conclusão, esta combinação de iniciador é diagnóstico para a mutação A122T.

[240] A combinação de iniciador p-AHAS NIDF / AHAS 122 TWT foi usada (a) para confirmar a especificidade do resultado anterior, porque o alelo A122T não deve produzir um produto de amplificação com esta combinação de iniciador e (b) para determinar que é o outro alelo presente em cada planta (se diferente de A122T) (ver a Figura 7 e Tabela 12).

[241] Quando a combinação de iniciador p-AHAS NIDF/AHAS 122 TWT foi usada, indivíduos tipo selvagem, mutantes A205V e P197L produziram um fragmento específico (Tabela 12); ao passo que homozigotos A122T não produziram nenhum produto de amplificação.

[242] Os produtos amplificados em 1) são resolvidos em um gel de agarose a 4 % (Metaphor Agarose).

[243] O tamanho esperado de produtos de PCR de vários haplótipos de girassol (Hap) no gene AHAHL1 são fornecidos na Tabela 12. Um alinhamento das sequências de Hap1-Hap6 é fornecido na Figura 8 e inclui a localização de sítios de anelamento dos iniciadores p-AHAS NIDF, Tabela 12. Tamanhos esperados de produtos de amplificação obtidos com os pares dos iniciadores p-AHAS NIDF/AHAS122TWT e p-AHAS NIDF/AHAS 122 TMU. 1 Os haplótipos (Hap) 1 a 5 correspondem àqueles fornecidos em Kolkman et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159). 2Tipo de mutação AHASL1, se alguma, mencionada em parênteses.

EXEMPLO 7: Reação da Cadeia da Polimerase Específica de Alelo para a Detecção do Alelo AHASL1 A122T de Girassol

[244] De modo a facilitar a geração do girassol CLEARFIELD, o seguinte ensaio de SNP para a detecção do alelo AHASL1 A122T de girassol foi desenvolvido. As variedades tolerante a IMI usadas para ensaiar o desenvolvimento e validação incluem numerosas variedades convencionais e tolerantes a herbicida. Este ensaio usa a reação da cadeia da polimerase (PCR) específica de alelo para detectar e determinar a zigosidade do alelo AHASL1 A122T do girassol. Uma única rodada de amplificação com quatro iniciadores fornece os produtos necessários para detectar os três estados possíveis de zigosidade: tipo selvagem, heterozigota e mutante (A122T/A122T). Porque os locais AHASL1 e AHASL2 são idênticos na região contendo a mutação, um conjunto de iniciadores foram planejados para amplificar especificamente o local AHASL1 (ver abaixo HA122CF e HA122CR). Além disso, os iniciadores específicos de alelo foram planejados para especificamente anelar/estender a partir do nucleotídeo único “G” para “A” responsável pela respectiva mudança de códon de alanina para treonina. O iniciador específico de alelo do tipo selvagem é um iniciador reverso. Assim, a base de terminal é “C” como representado abaixo. Uma faixa de controle de 794 pares de base formado pelo HA122CF e HA122CR, é produzido independente da(s) base(s) no sítio de mutação e serve como um controle positivo (Figura 9).

[245] A faixa de diagnóstico para a condição de tipo selvagem, formada pela amplificação dos iniciadores HA122CF e HA122wt, produz um fragmento de 258 pares de base (Figura 9). Este iniciador contém um desemparelhamento deliberado de 4 bases a montante da mutação real que serve para gerar especificidade aumentada para as amostras do tipo selvagem. A faixa de diagnóstico para a condição mutante produz um fragmento de 576 pares de base (Figura 9). Um produto de 576 pares de base é formado da amplificação de HA122mut e HA122CR e indica a presença do alelo mutante. O iniciador específico de mutante contém um desemparelhamento deliberado de 3 bases a montante da mutação real que serve para gerar especificidade aumentada para as amostras mutantes. Portanto, uma amostra que é heterozigota para a mutação produzirá três faixas na visualização pela eletroforese em gel de agarose, a faixa de controle e ambas das faixas de diagnóstico. Uma amostra homozigota mostrará duas faixas. O padrão de gel é dependente do cancelamento da base de códon 122. Os iniciadores de PCR são fornecidos abaixo.

[246] Iniciador direto comum (HA122CF): 5’GTTTCGCATTACCCATCACT3’ (SEQ ID NO: 15)

[247] Iniciador específico do tipo selvagem (HA122wt): 5’GGTGGATCTCCATTAACGC3’ (SEQ ID NO: 16)

[248] Iniciadores específicos de mutante (HA122mut): 5’ GCCTACCCCGGCTGCA3’ (SEQ ID NO: 17)

[249] Iniciador reverso comum (HA122CR): 5’ CAAAACCGGCCTCTTCGC3’ (SEQ ID NO: 18) EXEMPLO 8: Linhagem de Girassóis Resistente a Imidazolinona de Oléico Alto Que Expressa o Traço A122T

[250] Plantas de girassol foram produzidas que expressam o alelo mutante AHASL1 A122T (também conhecido como o traço CLHA-plus), que confere altos níveis de resistência aos herbicidas de imidazolinonas em uma planta de girassol e que produz sementes que compreendem um óleo de semente extraível que compreende pelo menos 85 % de ácido oléico. Estas plantas de girassol foram obtidas pelas metodologias de procriação convencionais, através do cruzamento de uma linhagem resistente a IMI derivada de GM40 com uma linhagem (VB141) Alta em Oléico (HO) e selecionar tanto traços em F2 quanto gerações posteriores de procriação consangüínea usando marcadores moleculares. GM40 e uma outra linhagem de girassol que compreende pelo menos uma cópia do alelo mutante AHASL1 A122T, GM1606, são descritos acima e na WO 2007005581. As sementes de GM40 e GM1606 foram depositados com a ATCC e designado os Números de Depósito de Patente no ATCC PTA-6716 e PTA-7606, respectivamente. Materiais

[251] As linhagens BTI-OL-M1511, BTI-OL-M1709 e BTI-OL- 2201 são três linhagens experimentais de girassol selecionadas quanto ao seu teor de oléico alto e a sua tolerância às imidazolinonas. VB141, HA445 e OB712 são linhagens altas em oléico, B770 e BTK112 são duas linhagens convencionais e GM40 é uma linhagem convencional A122T.

Métodos

[252] Composição de ácido graxo das sementes: Todas as plantas foram cultivadas sob condições de campo em Laguna Blanca (Formosa, Argentina) seguindo um Planejamento de Bloco Randomizado Completo com 3 réplicas. Dez gramas de sementes de cada réplica foram usadas para a análise. A composição de ácido graxo de cada amostra foi determinada pela cromatografia gasosa seguindo procedimentos padrão. Os valores médios através das 3 réplicas para cada material são fornecidos na Tabela 16.

[253] Tolerância às imidazolinonas: As sementes das nove linhagens foram semeadas em vasos sob condições de estufa. Pelo menos 20 plantinhas de cada linhagem foram pulverizadas no estágio V4 (Schneiter & Miller, 1981) com Imazapir em uma dose de 160 g/ha. Quatorze dias depois do tratamento cada planta foi registrada fenotipicamente usando um Índice de Fitotoxicidade (PI). PI é uma escala fenotípica de 0 a 9 que foi avaliada quanto a cada planta pela inspeção visual.

[254] Plantas sem qualquer sintomas foram registradas como “0”, níveis aumentados de atrofia e amarelamento com respeito às plantas de controle não tratadas foram registrados como “1” a “4”, níveis aumentados de de ácido oléico nas sementes de 85,79 a 88,97 %, materiais convencionais, por outro lado, apresentaram um teor muito menor (faixa: 18,62 a 24,2 %). Linhagens BTI-OL-M1511, BTI-OL-M1709 e BTI-OL-2201 apresentaram uma concentração de ácido oléico nas sementes de 89,58 a 90,83, similar àquelas obtidas para as linhagens HO (Tabela 16).

Resultados

[255] As linhagens com oléico alto apresentaram uma faixa de teor de ácido oléico nas sementes de 85,79 a 88,97 %, materiais convencionais, por outro lado, apresentaram um teor muito menor (faixa: 18,62 a 24,2 %). Linhagens BTI-OL-M1511, BTI-OL-M1709 e BTI-OL-2201 apresentaram uma concentração de ácido oléico nas sementes de 89,58 a 90,83, similar àquelas obtidas para as linhagens HO (Tabela 16).

[256] As linhagens HA445, VB141, OB712, B770 e BTK112 foram mortas pelo tratamento com o herbicida, ao passo que as linhagens BTI-OL- M1511, BTI-OL-M1709 e BTI-OL-2201 apresentaram um nível de resistência similar àquele observado na linhagem resistente GM40 (Tabela 17).

[257] Em conclusão, as linhagens BTI-OL-M1511, BTI-OL-M1709 e BTI-OL-2201 combinam um alto nível de resistência às imidazolinonas e um alto nível de ácido oléico em suas sementes. Tabela 16. Composição de ácido graxo de sementes de 9 linhagens de girassol (cada valor é a média de 3 réplicas). Petição 870220054300, de 21/06/2022, pág. 102/114

EXEMPLO 9: Avaliações de campo e Avaliações de Atividade AHAS para os Eventos A122T/A122T, A205V/A205V e A122T/A205V

[258] As avaliações de campo foram conduzidas através de diversas localizações para determinar os níveis de tolerância à imidazolinona relativos de plantas de girassol que são A122T/A122T, A122T/A205V ou A205V/A205V para o gene AHASLI. As plantas de girassol de cada um dos genótipos diferentes foram inoculados com doses diferentes de imazamox e imazapir sob uma faixa de condições ambientais. Além disso, a atividade AHAS in vitro foi determinada na presença de níveis aumentados de herbicidas para plantas de girassol de cada um dos três genótipos de girassol.

Materiais e Métodos

[259] Um linhagem de girassol, BTK47, especificamente selecionada para carecer de um fator E (imr1 imr1 / imr2 imr2) foi submetida às mutagênese de semente EMS. Uma linhagem M2:4 que sobreviveu à seleção de campo com imazapir, foi selecionada para estudos de cruzamento e atividade de enzima subsequentes. Esta linhagem foi chamada de GM40.

Avaliação de Campo do Traço A122T

[260] O alelo mutante A122T foi introgredido em linhagens mantenedoras, restauradoras e congênitas estéreis diferentes. Congênitos A122T homozigotos foram cruzados com congênitos do tipo selvagem (WT) (não contendo nenhuma mutação de tolerância a herbicida), congênitos de A122T homozigotos ou congênitos A205V homozigotos para produzir combinações de zigosidade de alelo mutante F1 diferentes (Tabela 18). Estas entradas, junto com diversos controles da variedade comercial regionalmente adaptada CLEARFIELD® A205V, foram testados no campo quanto a tolerância à imidazolinona em numerosas localizações na América do Norte, América do Sul e Europa de 2005 a 2008 (Tabela 19). Tabela 18. Lista de Entrada para Avaliações de Campo da Tolerância a Herbicida (2007)

[261] As entradas em cada localização em 2007 e 2007/2008 foram dispostas em um planejamento de lote de divisão fatorial dupla randomizada que consiste de 3 réplicas para cada combinação de tratamento. O fator A foi o tratamento com o herbicida (Tabela 20) e fator B foi a entrada de girassol (Tabela 18). O tamanho de lote foi de 2 fileiras x 7 m e a taxa de semeadura foi compatível com as práticas agronômicas locais. O tratamento com o herbicida foi aplicado no estágio de 2 a 4 folhas com uma haste montada em trator (20 galões/acre ou 200 litros/ha). O tratamento 2 foi apenas aplicado em 2 localizações na França. Tabela 20. Lista de Tratamento de Imidazolinona para Avaliações de Campo da Tolerância a Herbicida (2007) *NIS = tensoativo não iônico = Induce 90SC (90 %)

[262] As classificações de lesão de safra (% de fitotoxicidade) foram avaliadas de 6 a 10 dias depois do tratamento e em 16 a 21 dias depois do tratamento. A fitotoxicidade percentual foi registrada como a quantidade média de dano à planta em um dado lote, onde uma classificação de ‘0 %’ indicou nenhum dano às plantas em relação ao loto não tratado. Uma classificação de 10 % e 40 % indicaram níveis aumentados de clorose (onde 40 seria amarelamento completo das folhas). Uma classificação de 50 % ou mais alta indicaram que as plantas demonstraram amarelamento completo assim como níveis aumentados de necrose de folha. Uma classificação de ‘100 %’ indicou necrose completa (morte) das plantas.

[263] A emergência, dias para florescer, dias para o final do florescimento e maturidade também foram avaliadas para cada lote em cada localização (dados não mostrados). Os dados foram submetidos a uma análise de ANOVA.

Ensaio de Enzima para a Atividade AHAS

[264] Doze plantas de girassol que crescem em estufa de cada uma das linhagens representadas na Tabela 21 foram empilhadas e submetidas a um ensaio de atividade de enzima AHAS por intermédio do método de Singh et al. (1988) Anal. Biochem. 171: 173-179. Cada ensaio de atividade foi repetida duas vezes. Devido ao grande número de amostras, o experimento foi dividido em dois conjuntos (Tabela 21). Tabela 21. Descrições de Linhagem e Zigosidades do Alelo da Mutação AHASL1 Correspondente

[265] Folhas jovens que crescem ativamente, de plantinhas de quatro semanas de idade, foram trituradas em um almofariz e pistilo com N2 líquido e extraídas com um tampão composto de 100 mM de piruvato, 200 mM de KH2PO4, 20 mM de mgCh, 2 mM de pirofosfato de tiamina e 20 µM de flavina adenina dinucleotídeo. Os extratos de planta foram depois girados através de uma coluna giratória dessalinizadora de 10 ml Zeba TM (Pierce #89893) como pelas recomendações do fabricante. O ensaio de inibição foi realizado como descrito por Singh et al. (1988) Anal. Biochem. 171: 173-179. Os ensaios foram conduzidos em um formato de 96 reservatórios. Cinquenta µl de inibidor foram adicionados a cada reservatório contendo 50 µl de extrato de proteína solúvel para dar concentrações finais de 0,78, 1,56, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 e 100 µM de imazamox ou 0,78, 1,56, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 e 100 µM de imazapir. Os controles de zero herbicida também foram incluídos para cada linhagem. As reações foram processadas como esboçadas por Singh et al. (1988) Anal. Biochem. 171: 173-179. A absorbância foi medida em 530 nm. A atividade de AHAS, expressada como a média dos valores de absorbância para cada tratamento, foi apresentada como uma porcentagem da média dos controles zero em herbicida.

Resultados e Debate

[266] Em safras tolerantes a herbicida, o fenótipo de lesão de safra pode ser atribuído à interação entre o genótipo e o ambiente (GxE). O componente ambiental para a tolerância a herbicida é uma soma de fatores abióticos (isto é condições atmosféricas, solo) e bióticos (isto é pressão de inseto, doença e erva daninha) ligados com o efeito da dose de herbicida. Um exemplo deste efeito ambiental é observado na Figura 10, onde a variação na fitotoxicidade do mesmo genótipo cultivado em quatro localizações diferentes (Velva, ND, USA; Angers, FR; Saintes FR; Formosa, AR) na mesma taxa de dose (200 g de ia/ha de imazamox) é demonstrada. Os fatores genotípicos em uma planta tolerante a herbicida (HT) é a soma do(s) gene(s) HT mais o fundo genético remanescente e a interação entre os dois.

[267] Para avaliar genes HT quanto ao seu nível de tolerância relativa, dois métodos foram usados. O primeiro método mediu a lesão de herbicida sob uma faixa de estringências ambientais (localizações e anos em combinação com doses de herbicida diferentes) e o segundo método testou a enzima alvo (in vitro) com níveis aumentados de herbicida. Usando o primeiro método, nós quantificamos o fator ambiental associado com este traço, calculando-se o índice de fitotoxicidade (PI) médio das checagens de A205V comerciais correntes, regionalmente adaptadas, em 6 a 10 dias depois do tratamento com o herbicida. Os valores de PI para híbridos diferentes que carregam a mutação A122T foram plotados contra os valores de PI médios das checagens de A205V para avaliar o nível de resistência relativa da nova mutação através de uma faixa de componentes ambientais (Figuras 11 e 12). Como pode ser observado no eixo x das Figuras 11 e 12, a combinação de localizações com doses de herbicida produziu uma série diversa de condições ambientais, que variou nos valores médios de PI de 5,9 a 78 para os tratamentos com imazamox; e 2 a 100 para os tratamentos de imazapir. A linhagem y=x representou o valor PI médio para as checagens de A205V através de todos os componentes ambientais.

[268] Os resultados obtidos depois dos tratamentos com imazamox são mostrados na Figura 11. Os híbridos de homozigoto A122T apresentaram um aumento em PI conforme o componente ambiental tornou-se mais severo. Entretanto, a inclinação da linhagem de regressão (b = 0,149 + 0,0667, P < 0,0375) indicou que o nível de lesão de safra como uma função da estringência ambiental aumentou em uma taxa mais baixa do que as checagens A205V. Os híbridos que combinaram a mutação A122T com o alelo A205V em um estado heterozigota, apresentaram uma resposta similar à estringência ambiental (b = 4l,39 ± 0,05, P < 0,0001) como os híbridos A122T em um estado homozigoto. Por outro lado, os híbridos contendo a mutação A122T em um estado heterozigota (A122T /WT) demonstraram classificação de lesão de safra mais alta do que as checagens de A205V e níveis mais baixos de estringência ambiental, como mostrado pelo valor de interseção de y mais alto da linhagem de regressão (a = 15,3 ± 2,67). Quando a estringência do componente ambiental foi aumentada, estes híbridos heterozigotas A122T apresentaram um melhor desempenho do que as checagens A205V, como foi mostrado pela inclinação da sua equação linear (b = 0,45 ± 0,062, P < 0,0001). O mesmo se aplica para a Figura 12 quando as mesmas entradas, nos mesmos ambientes, foram inoculados com imazapir.

[269] As estringências ambientais com tratamento com imazapir podem ser resumidas pelas regressões resumidas na legenda para cada genótipo na Figura 12.

[270] Para substanciar o efeito de tolerância a herbicida observado no campo, as mesmas combinações de gene de tolerância a herbicida foram submetidas aos estudos de inibição da enzima AHAS. Estes estudos foram conduzidos na maior parte de 12 indivíduos de cada entrada na Tabela 18. A média de duas réplicas são representadas na Figura 13 para o primeiro experimento (Conjunto 1, Tabela 21) e na Figura 14 para o segundo experimento (Conjunto 2, Tabela 21). Uma amostra de controle não tratada foi incluída para fornecer uma referência para 100 % de atividade de enzima AHAS. A atividade de AHAS no híbrido A122T homozigoto tratado com 100 µM de imazamox foi de 69 % do controle não tratado e para os 100 µM de imazapir a mesma foi de 64 % do controle não tratado (Figura 13). A atividade da enzima de AHAS no híbrido A122T/A205V heterozigoto foi de 59 % e 60 % para os extratos tratados com 100 µM de imazamox e 100 µM de imazapir respectivamente (Figura 13). A linhagem de híbrido A205V homozigoto, que é o produto A205V comercial corrente, demonstrou atividades de AHAS de 36 % do controle não tratado e 42 % do controle não tratado em 100 µM de imazamox e 100 µM de imazapir respectivamente (Figura 13), mais baixo do que as atividades tanto do híbrido A122T homozigoto quanto do híbrido A122T/A205V heterozigoto.

[271] No segundo conjunto dos dados, os híbridos A205V homozigotos desempenharam de modo quase idêntico aos híbridos A122T heterozigotos (Figura 14). Ambos os tipos de híbridos demonstraram atividades AHAS de 30 % em 50 µM de imazamox, enquanto que o híbrido A205V teve 26 % de atividade em 100 µM de imazamox e o híbrido A122T heterozigoto teve 30 % de atividade em 100 µM de imazamox. Ao contrário, o extrato de enzima AHAS do híbrido A122T homozigoto demonstrou a quantidade mínima de inibição com níveis crescentes de imazamox, demonstrando atividades de 63 % e 60 %, em relação ao controle não tratado, em 50 µM e 100 µM de imazamox respectivamente (Figura 14). A linhagem WT (B7) foi genotipicamente idêntica em ambos os conjuntos experimentais e demonstrou uma variação de 6 % de atividade no nível de 100 µM de imazamox entre os dois experimentos (17 % de atividade de AHAS em relação ao controle não tratado no Conjunto 1 (Figura 13) e 11 % de atividade de AHAS em relação ao controle não tratado no Conjunto 2 (Figura 14).

[272] Com base nos dados de campo e atividade da enzima AHAS, foi determinado que a nova mutação A122T fornece tolerância a herbicida superior às imidazolinonas versus a mutação A205V corrente. Os níveis comerciais de resistência a herbicida em girassóis A205V requer a combinação de dois fatores genéticos em um estado homozigoto devido ao nível moderado de resistência conferida por Imr1. Ao contrário, usando-se a mutação A122T sozinha, o realçador Imr2 (ou gene pela interação de genótipo) não é mais necessário para se obter níveis comerciais de tolerância. De maneira mais importante, os resultados demonstram que A122T pode ser usado como um traço de HT de gene único homozigoto ou como uma pilha heterozigota junto com o traço HT de A205V, fornecendo níveis realçados de tolerância, maior flexibilidade no controle de erva daninha e facilitando o posicionamento desta nova mutação no CLEARFIELD Production System.

[273] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível daqueles habilitados na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados por referência no mesmo grau como se cada publicação ou pedido de patente individuais fossem específica e individualmente indicados serem incorporados por referência.

[274] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes por via de ilustração e exemplo para os propósitos de clareza de entendimento, estará óbvio que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (7)

1. Método para controlar ervas daninhas na vizinhança de uma planta de girassol que compreende aplicar a uma planta de girassol uma quantidade de herbicida que é suficiente para matar uma planta de girassol sem matar a planta de girassol, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) prover uma quantidade de um herbicida que inibe AHAS que é suficiente para matar uma planta de girassol do tipo selvagem; (ii) prover uma planta de girassol tendo tolerância aumentada e um herbicida que inibe AHAS quando comparada a uma variedade do tipo selvagem da planta de girassol, em que a dita planta de girassol é selecionada do grupo que consiste de: (a) uma planta de girassol que compreende uma primeira proteína de AHASL1 que compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 20 e uma segunda proteína de AHASL1 que compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 24; e (b) uma planta de girassol que compreende uma primeira proteína de AHASL1 que compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 20 e uma segunda proteína de AHASL1 que compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22. (iii) aplicar a quantidade do herbicida que inibe AHAS à planta de girassol; e (iv) colher sementes da planta de girassol.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito herbicida que inibe AHAS compreende um ou mais de um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia, um herbicida de triazolopirimidina, e um herbicida sulfonilamino-carboniltriazolinona.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito herbicida de imidazolinona é selecionado dentre ácido [2- (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidiazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4- isopropil)-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3-quinolinocarboxílico, ácido [5- etil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4- isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico e misturas de 6-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato de metila, [2-(4- isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-p-toluato de metila e mistura dos mesmos.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito herbicida de sulfoniluréia é selecionado dentre clorsulfuron, metsulfuron metila, sulfometuron metila, clorimuron etila, tifensulfuron metila, tribenuron metila, bensulfuron metila, nicosulfuron, etametsulfuron metila, rimsulfuron, triflusulfuron metila, triasulfuron, primisulfuron metila, cinosulfuron, amidosulfuron, flazasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etila, halosulfuron e misturas dos mesmos.

5. Método para tratar uma semente de girassol com uma quantidade de herbicida que é suficiente para matar uma planta de girassol sem matar a planta de girassol, caracterizado pelo fato de compreender: (a) prover uma composição de tratamento de semente compreendendo uma quantidade de um herbicida que inibe AHAS que é suficiente para matar uma planta de girassol do tipo selvagem (b) prover uma semente de uma planta de girassol, em que dita semente compreende uma primeira AHASL1 compreendendo uma sequência da SEQ ID NO:20 e uma segunda AHASL1 compreendendo uma sequência da SEQ ID NO:22 ou SEQ ID NO:24, em que uma planta a partir da dita semente terá tolerância aumentada a uma herbicida quando comparada a uma variedade do tipo selvagem da planta; e (c) aplicar a dita composição de tratamento de semente à dita semente.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o dito herbicida que inibe AHAS é uma herbicida de imidazolina.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o dito herbicida de imidazolinona é selecionado dentre ácido [2- (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidiazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4- isopropil)-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3-quinolinocarboxílico, ácido [5- etil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4- isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico e misturas de 6-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato de metila, [2-(4- isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-p-toluato de metila e mistura dos mesmos.