CN1065573A - 抗抑制乙酰羟酸合酶的除草剂的小麦及其选择方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及选择使小麦具有抗抑制乙酰羟酸合 酶(AHAS)的除草剂性能的突变品种的筛选方法。 在小麦种子的突变形成后，种子被浸在含抑制 AHAS的除草剂的溶液中，该溶液含有特定的某类 抑制AHAS的除草剂。播种后，在籽苗从土壤中长 出前，用含与用于浸种步骤相同类别的抑制AHAS 的除草剂喷洒含有种子的土壤。那些长出的、外表正 常的麦苗表现出对与用于浸种和喷洒阶段相同的那 类抑制AHAS的除草剂的抗性。本发明也涉及小麦 的选择品种和用筛选法鉴定的种子的筛选法。

Description

本发明涉及用筛选法选择使小麦抗抑制乙酰羟酸合酶的除草剂的突变品种。本发明也涉及用这种方法培养的有抗性的小麦。
第一个酶催化步骤与支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）在植物体内的生物合成相同，是由酶乙酰羟酸合酶（AHAS;亦称作乙酰乳酸酯合酶;E.C.4.1.3.18）。AHAS催化两个平行反应：两摩尔丙酮酸酯缩合得到乙酰乳酸酯，和一摩尔丙酮酸酯与一摩尔α丁酮酸酯缩合得到乙酰羟丁酸酯。这个酶受到该途径的终产物（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）的抑制，并且这是已知的在高等植物中这种途径的调节机理之一。
AHAS是几类结构上不相关的除草剂的靶位点。这些除草剂包括咪唑啉酮类、氨磺酰脲类、磺酰羧酰胺类、磺胺类和磺酰脲类。
大规模的商业化农业主要依赖于中耕作物的生产实践。获得能有选择地杀灭害草而不损害作物的除草剂是这些实践中的主要可行性因素。对大多数作物来说，防治主要害草的除草剂是可获得的。前面提到的抑制AHAS的除草剂是杂草控制中的关键因素。但是，这些除草剂在某些小生境作物产区可能会错过重要的害草。而且，目前普遍使用的除草剂可能带来许多生态问题或成本上的限制。
开发具有抗抑制AHAS的除草剂的小麦品种是需要的。这些抗性品种的开发将使小麦种植者能使用抑制AHAS的除草剂，使用的结果是与其它类型除草剂相比，减少施用量，降低对地下水的污染和降低对动物的毒性。
因此，本发明的一个目的是开发一种选择能使小麦对抑制AHAS的除草剂具有抗性的突变品种的筛选方法。
本发明的一个特别的目的是开发一种选择能使小麦对抑制AHAS的咪唑啉酮除草剂具有抗性的突变品种的筛选方法。
本发明的另一个目的是鉴定用新的筛选方法鉴别的小麦的选择品种。
这些目的是通过用化学诱变剂对小麦种子进行诱变处理来实现的。在第一步筛选步骤中，种子被浸在含抑制AHAS的除草剂的溶液中。在播种后的第二步筛选步骤中，在籽苗从土中长出前向含有种子的土壤喷洒抑制AHAS的除草剂。那些长出的麦苗表明具有对抑制AHAS的除草剂的抗性。
对附图的简要说明
注：在这对附图的简要说明中的注册商标的除草剂和序号化合物的化学名称将在本申请的发明的详细描述部分阐明。
图1描绘的是增大咪唑啉酮除草剂SCEPTERTM的浓度对外表正常的植株数对在含咪唑啉酮除草剂的溶液中浸过的种子数的比值的影响。
图2描绘的是增大咪唑啉酮除草剂PURSUITTM的浓度对外表正常的植株数对在含咪唑啉酮除草剂的溶液中浸过的种子数的比值的影响。
图3描绘的是增大咪唑啉酮除草剂ARSENALTM的浓度对外表正常的植株数对在含咪唑啉酮除草剂的溶液中浸过的种子数的比值的影响。
图4和图5描绘的是与未处理的非抗性小麦比较的用浸种加上出芽前喷洒PURSUITTM处理的抗咪唑啉酮除草剂的小麦的外观。在图4中，抗性小麦在最左边的盘中;在图5中，抗性小麦在中间的盘中。
图6描绘的是由M3籽苗长成的小麦的外观，它们是FS4的子代。
图7描绘的是在出芽后用ARSENALTM处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对从FS1大量繁殖的M3-M4种子的植株的高度（cm）的比较。
图8描绘的是在出芽后用OUSTTM处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对从FS1大量繁殖的M3-M4种子的植株的高度（cm）的比较。
图9描绘的是在出芽后用PURSUITTM处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对从FS1大量繁殖的M3-M4种子的植株的高度（cm）的比较。
图10描绘的是在出芽后用SCEPTERTM处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对从FS1大量繁殖的M3-M4种子的植株的高度（cm）的比较。
图10a描绘的是在出芽后用化合物2处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对从FS1大量繁殖的M3-M4种子的植株高度（cm）的比较。
图11描绘的是在出芽前用SCEPTERTM处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对来自FS2和FS4的M4小麦突变品种的生长的比较（占对照组的百分比）。
图12描绘的是在出芽前用ARSENALTM处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对来自FS2和FS4的M4小麦突变品种的生长的比较（占对照组的百分比）。
图13描绘的是在出芽前用PURSUITTM处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对来自FS2和FS4的M4小麦突变品种的生长的比较（占对照组的百分比）。
图14描绘的是在出芽前用一种咪唑啉酮除草剂化合物2处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对来自FS2和FS4的M4小麦突变品种的生长的比较（占对照组的百分比）。
图15描绘的是在出芽后用PURSUITTM处理后过两星期野生型小麦（Fidel）对来自FS2和FS4的M4小麦突变品种的生长的比较（占对照组的百分比）。
图16描绘的是在出芽后用PURSUITTM处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对来自FS2和FS4的M4小麦突变品种的生长的比较（占对照组的百分比）。
图17描绘的是在出芽后用化合物2处理后过两星期野生型小麦（Fidel）对来自FS2和FS4的M4小麦突变品种的生长的比较（占对照组的百分比）。
图18描绘的是在出芽后用化合物2处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对来自FS2和FS4的M4小麦突变品种的生长的比较（占对照组的百分比）。
图19描绘的是在出芽后用PURSUITTM处理后过七星期野生型小麦（Fidel）对来自FS2和FS4的M4小麦突变品种的苗鲜重的比较（占对照组的百分比）。
图20描绘的是在出芽后用化合物2处理后过七星期野生型小麦（Fidel）对来自FS1和FS4的M4小麦突变品种的苗鲜重的比较（占对照组的百分比）。
图21描绘的是在出芽后用CLASSICTM处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对来自大量繁殖的M3-M4种子的FS2突变品种的植株生长的比较（cm）。
图22描绘的是在出芽后用磺酰脲除草剂OUSTTM处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对来自大量繁殖的M3-M4种子的FS2突变品种的植株生长的比较（cm）。
图23描绘的是在出芽后用氨磺酰脲除草剂化合物3处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对来自大量繁殖的M3-M4种子的F2突变品种的植株生长的比较（cm）。
图24描绘的是在出芽后用磺酰脲除草剂BEACONTM处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对来自大量繁殖的M3-M4种子的F2突变品种的植株生长的比较（cm）。
图25描绘的是在出芽后用磺酰羧酰胺除草剂化合物1处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对来自大量繁殖的M3-M4种子的F2突变品种的植株生长的比较（cm）。
图26描绘的是在出芽后用咪唑啉酮除草剂化合物7处理后过四星期野生型小麦（Fidel）对来自大量繁殖的M3-M4种子的F2突变品种的植株生长的比较（cm）。
图27描绘的是在出芽后用PURSUITTM、化合物2或咪唑啉酮除草剂化合物8处理后过三星期野生型小麦（Fidel）对来自FS1、FS2和FS4的M4小麦突变品种的植株高度（cm）的比较。
图28描绘的是在出芽后用PURSUITTM、化合物2或化合物8处理后过六星期野生型小麦（Fidel）对来自FS1、FS2和FS4的M4小麦突变品种的植株高度（cm）的比较。
图29描绘的是在出芽后用PURSUITTM、化合物2或化合物8处理后过10星期野生型小麦（Fidel）对来自FS1、FS2和FS4的M4小麦突变品种的产量的比较（占对照组的百分比）。
图30描绘的是在出芽后用PURSUITTM、化合物2、化合物8、咪唑啉酮除草剂CADRETM、或磺酰脲除草剂ACCENTTM处理后过6星期野生型小麦（Fidel）对来自FS4的M5小麦突变品种的生长的比较（占对照组的百分比）。
图31描绘的是在出芽后用PURSUITTM、化合物2、化合物8、CADRETM或ACCENTTM处理后过10星期野生型小麦（Fidel）对FS4突变品种（M5种子）的平均样地产量的比较（每块样地的谷物克数）。
图32描绘的是体外酶分析，它是通过用缬氨酸和亮氨酸（记作V+L）作为对照的测定出芽后未喷洒除草剂SCEPTERTM、PUR-SUITTM、化合物9和OUSTTM的FS1突变品种小麦（记作WS1）中的AHAS活性的抑制情况。
图33描绘的是体外酶分析，它是通过用缬氨酸和亮氨酸（记作V+L）作为对照的测定植株生长三星期后喷洒除草剂SCEPTERTM、PURSUITTM、化合物9和OUSTTM的FS1突变品种小麦（记作WS1）中的AHAS活性的抑制情况。
图34描绘的是体外酶分析，它是通过用缬氨酸和亮氨酸（记作V+L）作为对照的测定出芽后未喷洒除草剂SCEPTERTM、PUR-SUITTM、化合物9和OUSTTM的野生型小麦（Fidel）中的AHAS活性的抑制情况。
图35描绘的是体外酶分析，它是通过用缬氨酸和亮氨酸（记作V+L）作为对照的测定植株生长三星期后喷洒除草剂SCEPTERTM、PURSUITTM、化合物9和OUSTTM的型生型小麦（Fidel）中的AHAS活性的抑制情况。
图36描绘的是体外酶分析，它是通过用缬氨酸和亮氨酸（记作V+L）作为对照的测定出芽后未喷洒除草剂SCEPTERTM、PUR-SUITTM、化合物9和OUSTTM的FS4突变品种小麦中的AHAS活性的抑制情况。
图37描绘的是体外酶分析，它是通过用缬氨酸和亮氨酸（记作V+L）作为对照的测定植株生长三星期后喷洒除草剂SCEPTERTM、PURSUITTM、化合物9和OUSTTM的FS4突变品种小麦中的AHAS活性的抑制情况。
图38描绘的是体外酶分析，它是通过用缬氨酸和亮氨酸（记作V+L）作为对照的测定出芽后喷洒除草剂SCEPTERTM、PUR-SUITTM、化合物9和OUSTTM的野生型小麦（Fidel）中的AHAS活性的抑制情况。
图39描绘的是体外酶分析，它是通过用缬氨酸和亮氨酸（记作V+L）作为对照的测定植株生长三星期后喷洒除草剂SCEPTERTM、PURSUITTM、化合物9和OUSTTM的型生型小麦（Fidel）中的AHAS活性的抑制情况。
本发明涉及一种新颖的筛选方法以选择使小麦具有对抑制AHAS的除草剂的抗性的突变。通过常规方法用化学诱变剂对小麦种子进行诱变处理。在第一步筛选步骤中，将公知的大豆处理方法用于小麦，将致突变的种子浸在含抑制AHAS的除草剂的溶液中，该溶液含特定类别的抑制AHAS的除草剂。
在新颖的第二步筛选步骤中，种子随后被种于土中，并且在籽苗从土中长出之前用与浸种步骤中相同类别的抑制AHAS的除草剂喷洒。那些长出的且外观正常的小麦植株被认为有对用于两个筛选步骤中的那类抑制AHAS的除草剂的抗性。因而这些植株具有这样的优点，可种植于用一类抑制AHAS的除草剂处理过的地方，害草可被除去而小麦植株保持无损。从起始的对施加一类抑制AHAS的除草剂有抗性的突变体测试几代种子证明了抗抑制AHAS的除草剂的性质的遗传性。所得植株可能，但不是必然，具有对不同于两步骤筛选中所用的多种类别的抑制AHAS的除草剂的交叉耐受性。
种子的突变形成可通过常规方法用化学诱变剂来实现。一种方法是Kueh和Bright的方法（Kueh，J.S.H.和Bright，S.W.J，Plan-ta，153，166-171，1981），其中，将种子浸于水中，向种子鼓气泡，然后用化学诱变剂如叠氮化钠处理。然后将种子用水冲洗并干燥。在该方法中用叠氮化钠是特别优选的。
其它化学诱变剂及其用法包括N-甲基-N-亚硝基脲和N-乙基-N-亚硝基脲（Fluhr，R.和Cseplo，A.，Methods  Enaymol.（Plant  Mol.Biol），118，611-623（1986），甲磺酸乙酯（Sebastian，S.A.，等人，Crop  Sci.，29，1403-1408（1989），以及羟胺和联胺（Khamankar，Y.G.，J.Maharashtra  Agric.Univ.，14，322-325（1989）。
致突变的种子然后进行抑制AHAS的除草剂的抗性筛选。开始时，通过评价分离的小麦种胚、半种和全种对除草剂的耐受性进行体外筛选。但是，这些筛选费时而且由于污染问题和小麦的不同响应而带来问题。因此，其它方式的筛选被采用。这一方法来自Sebas-tian和Chaleff改进的草案（Sebasfian，S.A.和Chaleff，R.S.，Crop  Science，27，948-952，1987）有关大豆的除草剂耐受性的选择。这一筛选方法包括将完整、成熟的小麦种子浸在含抑制AHAS的除草剂的溶液中一段时间，该溶液含一特定类别的抑制AHAS的除草剂，之后，种子被种于无菌的土壤混合培养基中。
各种类别的抑制AHAS的除草剂包括咪唑啉酮类、氨磺酰脲类、磺酰羧酰胺类、磺酰胺类和磺酰脲类。
用于浸种筛选步骤的咪唑啉酮类除草剂的样品包括2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-尼克酸，2-（4-异丙基）-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-3-喹啉羧酸，5-乙基-2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-尼克酸，2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-5-（甲氧基甲基）-尼克酸，5-甲酰-2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-尼克酸，5-（二甲基乙缩醛），3-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-2-甲基-尼克酸，2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-5-甲基尼克酸和6-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-间-甲苯甲酸甲酯与2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-对-甲苯甲酸甲酯的混合物。优选的是采用5-乙基-2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-尼克酸和2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-尼克酸。特别优选的是采用5-乙基-2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-尼克酸。
用于浸种筛选步骤的氨磺酰脲类除草剂的样品包括1-（4-甲氧基-6-甲基-均三嗪-2-基）-3-〔（邻丙酰苯基）氨磺酰基〕脲，1-（4，6-二甲氧基-2-嘧啶基）-3-〔（邻丙酰苯基）氨磺酰基〕脲，1-〔（邻丙酰苯基）氨磺酰基〕-3-（4-甲氧基-6-甲基-2-嘧啶基）-脲，和1-〔（邻乙酰苯基）氨磺酰基〕-3-（4-甲氧基-6-甲基-均三嗪-2-基）脲。磺酰羧酰胺类除草剂的样品包括2-乙酰氨基-2，3-二甲基-N-（对甲苯磺酰）丁酰胺和2-乙酰氨基-N-〔（对氯苯基）磺酰基〕-2，3-二甲基丁酰胺。磺酰酰胺的一个例子是N-〔2，6-二氟苯基〕-5-甲基-（1，2，4）-三唑并-〔1，5a〕-嘧啶-2-磺酰胺。磺酰脲类的样品包括2-〔4，6-双（二氟甲氧基）嘧啶-2-基氨基甲酰基氨磺酰基〕苯甲酸，1-（4，6-二甲氧基嘧啶-2-基）-3-（二甲氧基氨基甲酰基-2-吡啶基磺酰）脲，邻{〔3-（4，6-二甲基嘧啶-2-基）脲基〕磺酰基｝苯甲酸甲酯和邻｛〔（4-氯-6-甲氧基-2-嘧啶基）氨基甲酰基〕氨磺酰｝苯甲酸乙酯。
如果只采用的浸种筛选，则处理如下：干燥后，种下种子，经过一段预定的时间如种植后三到四星期后，记下萌芽的种子数。也注明籽苗的大小和外观。萌芽并长成正常大小和外观的籽苗的种子可能具有对抑制AHAS的咪唑啉酮类除草剂的抗性。
但是，浸种筛选可能有“遗漏”的可能性或对除草剂处理的假阳性存活。为了消除假阳性，用出芽前的除草剂处理作为第二步筛选。
在浸种步骤后，将小麦种子种于土中。如果需要的话，可给土浇水。然后，在籽芽从土中长出前，用溶于水或其它合适的含水或有机溶剂的抑制AHAS的除草剂溶液喷洒含种子的土壤。喷洒的除草剂的浓度是用小规模试验以对每种咪唑啉酮进行确定的。
用于对种子喷洒步骤的抑制AHAS的除草剂是选自与用于浸种步骤相同的类别。在筛选的两个步骤中所选的特定的除草剂可以是相同或不同的，但在每种情况下，除草剂必须是选自相同类别的抑制AHAS的除草剂。用于种子喷洒步骤的除草剂的类别及每种类别的样品已在前面有关浸种步骤中描述过。
然后，在籽苗从土中长出后，对经过两步筛选的种子进行评价。在大小、产量和外形上生长正常的表明小麦含有导致所需要的对抑制AHAS的除草剂的抗性的突变。
通过这两步筛选草案选择出对抑制AHAS的除草剂有高水平耐受性的小麦。这个筛选体系通过在筛选的两个部分，即浸种处理和出芽前施用，将种子暴露在可使野生小麦植株致死的剂量的除草剂中以优先选择抗性强的小麦植株。这种两次置于除草剂中可消除假阳性，并可用于除去抗性弱的突变品种。这种有抗性的小麦对用于两步筛选中的除草剂是具有抗性的，这类作物在有些情况下可能具有对一类或其它更多类的抑制AHAS的除草剂的交叉耐受性，但这种交叉耐受性不是必须具备的。
以下的例子用咪唑啉酮类抑制AHAS的除草剂阐明本发明。其它类别的抑制AHAS的除草剂也在本发明的范围之内，因为它们的作用机理是与咪唑啉酮类相同的。所有抑制AHAS的除草剂类靠相同的机理起作用;它们以AHAS酶为靶，从而阻断缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成。通过阻断这种AHAS的活性，除草剂可抑制植物的代谢，导致植物的死亡。
当本发明的两步筛选法用咪唑啉酮类除草剂时，可实现抗咪唑啉酮类除草剂的小麦的选择。与未致突变的、未选择的小麦相比，抗除草剂的小麦对咪唑酮类的耐受性提高50倍。已证明咪唑啉酮类会抑制AHAS酶-支链氨基酸生物合成的第一个酶。这种小麦选择经体外酶分析进行分析（在下面实施例中描述），并被证明具有对咪唑啉酮类抑制不敏感的AHAS活性。但是无论通过整株植物或酶研究，很少或没有证据表明对其它以相似的方式作用于AHAS的化学品的交叉耐受性。
从117，000个经筛选的小麦种子中，按其抗性选出四株植物。这四个选出的突变品种记作FS1、FS2、FS3和FS4。这些小麦植株的种子已于1991年3月28日存入美国典型培养物收集处（Ameri-can  Type  Culture  Collection，12301  Parklawn  Drive，Rockville，MD  20852），并已指定登记号如下：
小麦突变品种  登记号
FS1  ATCC  40994
FS2  ATCC  40995
FS3  ATCC  40996
FS4  ATCC  40997
根据遗传数据，所选的小麦突变型FS1、FS2、FS3和FS4是等位基因，并表现为单一突变的结果。耐受性按单一遗传位点遗传，并表现为显性或半显性。对除草剂耐受性的增强被证明在有或无试验的咪唑啉酮除草剂的存在下对谷物产品无有害影响。
在抗性小麦选择品种中的基因突变的遗传性是通过测试种子的几代后代及突变选择子的杂交来证实的。测试的种子经历出芽前和出芽后施用各种类别的抑制AHAS的除草剂。观察籽苗的大小、产量和外观并与未处理的对照组（Fidel）和经同样的两步筛选的对照组（Fidel）比较。
这些试验的结果，如实施例中描述的，表明使对咪唑啉酮类具有抗性的基因突变从选择的品种FS1、FS2、FS3和FS4代代相传。抗性的专一性由表明突变的选择子不耐受其它类别的抑制AHAS的除草剂，如磺酰脲类、氨磺酰脲类、磺酰胺类或磺酰羧酰胺类而证实。
在本发明的第二种实施例中，两种不同类别的抑制AHAS的除草剂被用于两步筛选法中。在浸种步骤中采用一类除草剂，在喷洒步骤中采用第二类除草剂。所得存活的且生长正常的被选植株具有对两类除草剂的抗性。尽管由于采用了不同类别的除草剂，供选择的具有抗性的突变的频率大幅度降低，但是只要筛选种子的数量足够大就能获得双重抗性的选择物。
为了可以更好理解本发明，列出下列实施例。实施例只是为了说明的目的，不能视作对本发明范围的限制。
实施例1
两步种子筛选的开发
1.种子的诱变
五千粒“Fidel”种子（一种法国冬小麦）被按Kueh和Bright法（Kueh，J.S.H.和Bright，S.W.J.，Planta，，153，166-171（1981）进行诱变处理。在5℃，小麦种被浸在水中18小时，然后在20℃鼓入气泡通过种子6小时。这之后立即在pH3用1mM叠氮化钠（一种化学诱变剂）处理2小时。种子被用水冲洗30分钟，然后在纸巾上播成浅层，干燥。一干就将种子种于田中。
小麦植株长至成熟并收获到M2种子。大约收获117，000颗小麦种子并用于筛选抗咪唑啉酮小麦。这种材料萌芽率100%。
2.步骤1：浸种
按Sebastian和Chaleff开发的方案，将小麦种子在70%乙醇中30秒表面除虫，然后在真空并伴有摇动盘提供的轻微搅拌下，在每100ml溶液含1-2滴Tween 20TM（一种非离子聚乙烯酒石酸铋钠单月桂酸酯（polyethylene sorbitan monolaurate）表面活性剂，可由Atlas Chemical Industries注册商标的产品获得）的含2.625%次氯酸钠的50%的溶液中30分钟以除去虫害。种子经无菌蒸馏水冲洗，然后，如下所述，在一定浓度的除草剂中浸规定的一段时间。每批25粒种子于一无菌的100×15mm的塑料平皿中的25ml下述的除草剂中并浸泡预定的时间。用水冲洗种子，用纸巾干燥，种于装有湿润、无菌人造土Metro Mix 350TM（Grace Company，Cam-bridge，MA）的6×8英寸泥炭盘中约1/2″深（每盘种25粒）。处理后四星期评价该处理。除草剂、其用量和估计的时间如下：
实验1：
ARSENALTM：0，1，10，50，100，500μM，
SCEPTERTM：0，1，10，50，100，500μM
时间为48小时。每种处理重复4次。（ARSENALTM和SCEPTERTM是American Cyanamid Company的注册商标。ARSENALTM是2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-尼克酸，并在美国专利4，798，619号中有记述;SCEPTERTM是2-（4-异丙基）-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-3-喹啉羧酸，并在美国专利4，798，619号中有记述）。
随着浓度的增大，ARSENAL抑制种子的萌发和籽苗的生长。当浓度高达50μM或由视觉观察到一些潜在的假阳性，而更高的浓度则完全抑制籽苗生长。在100和500μM这些浓度，一些敏感的种子虽然萌发，但芽小且扭曲，通常形态不正常。
由视觉观察，SCEPTERTM也随浓度增加抑制籽苗生长，过三到四星期，籽苗恢复正常。实际上，用1-100μM处理的籽苗与对照组区分不出，用500μM处理的比对照组略微矮小些。
实验2：
ARSENALTM：0，10，50，100，500μM
SCEPTERTM：0，100，250，500，750，1000μM
处理48小时。每种处理重复两次。
ARSENALTM的浓度保持与前面的实验相同，得到结果与前面所述相同。而在这次试验中，SCEPTERTM增加到最大为1000μM。这次试验结果，由视觉观察表明这一浓度仍不足以防止“遗漏”。暴露于除草剂的持续时间也表现为对假阳性数有影响。在实验1中，浸种几小时长，出现一些根伸长;但当除草剂处理终止后，这一实验中的种子并非都表现出胚根生长。在下面的实验中考察用必要的浓度的除草剂以防止“遗漏”的浸种的持续时间的作用。
实验3：
ARSENALTM：0，50，75，100μM
SCEPTERTM：0，250，500，750，1000，1500μM
PURSUITTM：0，250，500，750，1000，1500μM
化合物1：0，500，1000，1500，2000μM
持续48、72或96小时。每种处理重复两遍。
（PURSUITTM是American Cyanamid Company的注册商标。PURSUITTM是5-乙基-2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-尼克酸，且记述于美国专利号4，789，619中。化合物1是2-乙酰氨基-N-〔（对氯苯基）磺酰基〕2，3-二甲基-丁酰胺，且记述于美国专利4，992，094中。）
在该试验中，咪唑啉酮类除草剂ARSENALTM、SCEPTERTM、PURSUITTM，和磺酰羧酰胺类的化合物1被作为浸种筛选的选择试剂而评定。浸种持续时间与除草剂浓度的相互作用也被评定。图1到图3表明咪唑啉酮除草剂处理的结果。当种子被浸48小时，“正常”植株的数量随着除草剂浓度的增加而减少。但是，即使在所试验的最高浓度，也有正常植株存在。随着在除草剂中暴露时间的延长，除草剂的致死必要浓度降低。如果暴露72小时以上，50μM的AR-SENALTM量已足够，但如果暴露时间少些，则75μM是必要的。SCEPTERTM对任何除草剂/暴露时间长度的组合均无效。然而，种子处理用1000μM PURSUITTM72小时或750μM PURSUITTM96小时可防止潜在的假阳性存活。化合物1对种子萌芽或籽苗生长均无抑制作用。
实验4：
SCEPTERTM：0，500，1000，1500，2000μM
持续3、4、7和10天。每种处理重复2次。
按前述方案，只是每个平皿浸35粒种子;而每盘仍种25粒种子。这实验重复两次。（注：7天和10天的作物在第一次实验中被真菌污染，并废弃。在第二个实验中，杀菌剂Captan被加入浸泡溶液以防污染。）
对用于小麦种子，浸泡7天和10天是太长了。到该时间，在浓度达1000μM的SCEPTERTM中，开始出现芽生长;在这期间，真菌污染也开始成为问题。
观察结果与实验3中对PURSUITTM获得的相似。用1000或1500μM SCEPTERTM浸3天对选择耐咪唑啉酮突变品种且假阳性问题减到最少是合适的。
3.步骤2：出芽前除草剂的施用
进行一系列实验以确定对这出芽前喷洒处理的合适的除草剂用量。将敏感的栽培品种Fidel小麦的种子种于6×8英寸的泥炭盘中的Metro Mix 350TM中，量为每盘100粒种子。在除草剂处理前先给盘浇水。每次处理喷洒三盘。除草剂用实验室用带式喷雾器施用，用量为每公顷950升（L/ha），带速为12.8秒/转，用的喷雾器喷嘴为＃40015E（TeejetTM喷洒系列）。三到四星期后，由视觉观察以对小麦种子/籽苗的毒性评定这一处理。PURSUITTM和SCEPTERTM在300-350g/ha最有效，而ARSENALTM当出芽前喷洒40-50g/ha最有效。
4.抗除草剂突变品种的筛选和选择
PURSUITTM被用作为筛选除草剂抗性的示范的咪唑啉酮。M2小麦种子被在70%乙醇中30秒进行表面除虫，随后在如前所述的含2.625%的次氯酸钠的50%的溶液中除虫。然后用无菌蒸馏水冲洗种子三遍，并被置于100×15mm的无菌塑料平皿中，每个平皿中250粒种子。向每只平皿中加入25ml 1000mM的PURSUITTM溶液，并且种子被浸于这溶液中在暗处保持3天。然后将种子排去溶液，用纸巾吸干，并种于含Metro Mix的6×8英寸的无菌泥炭盘中，每盘种1000粒种子。盘被浇水并立即喷洒每公顷300克（g/ha）的PURSUITTM。除草剂用实验室用带式喷雾器施用，量为950L/ha，带速12.8秒/转，所用喷雾器喷嘴为＃40015E，四星期后，评定籽苗的除草剂耐受性。M2小麦种子的筛选是一次每份25，000粒。从约117，000粒经两步法抗除草剂筛选的M2小麦种子中，选出4株抗PURSUITTM的小麦。
这些植株的外观与非抗性小麦相比非常明显。这些突变品种选择子中的两株描绘于图4和图5中。在图4中，抗性小麦在最左边的盘中;在图5中，抗性小麦在中间的盘中。这四个突变品种选择子被标记作FS1、FS2、FS3和FS4。有抗性的植株被种植至7.5英寸深的在泥炭盆中的Metro Mix 350TM中。
实施例2-5
抗除草剂突变品种的特性
实施例2
除草剂抗性的遗传性
1.M3植株筛选：在体内
对来自4个起始选择植株（记作FS1、FS2、FS3和FS4）的M3植株进行抗PURSUITTM筛选。来自这些M2突变品种的每种成熟的花序的5粒M3种子被在70%的乙醇中30秒除虫，然后在真空在如前所述的含2.625%次氯酸钠的50%的溶液中20分钟除虫，并伴随摇摆盘提供的轻微搅拌。用无菌蒸馏水冲洗种子两遍。
然后，每份5粒种子被置于在无菌的60×15mm塑料平皿中的10ml 1500μM的PURSUITTM溶液中浸3天。用水冲洗种子，用纸巾吸干，并种于含湿润、无菌Metro Mix 350TM的6″×8英寸泥炭盘中约1/2″深。出芽前用300g/haPURSUITTM喷洒这些盘。对比包括将来自有抗性的选择物的M3种子，按前述方法除虫，在无菌蒸馏水中浸3天，然后播种。另外，将未选择的敏感的Fidel小麦按上述方法除虫，并将一半种子用PURSUITTM处理（浸种和喷洒步骤），而另一半只浸于水中。用实验室带式喷雾器施用除草剂，量为950L/ha，带速为12.5秒/转，喷雾器喷嘴为＃40015E。
在接受最初的浸种后4星期，对M3小麦植株按植株是否抗除草剂、被除草剂损伤还是死亡进行评定。抗除草剂的植株被移种到装有Metro Mix 350TM的7.5英寸的杜鹃花盆中。植株移种一星期后，施加肥料-OsmocoteTM（Sierra Company，Milpita，CA）作为施顶肥。另外，有规律地用Peter's20-20-20TM（Grace Company，Cambridge，MA）给植株施肥。与未处理的Fidel对照例对比评定个别的植株。
当用PURSUITTM1500μM（浸种）和300g/ha（出芽前施用）处理时，未诱变、未选择的Fidel种子不能存活。这一同样的材料当用无菌蒸馏水浸泡且不喷洒时，在一到两个星期内萌发，平均发芽率为63.3%（两组对照组的平均值）。M3材料当用无菌蒸馏水浸泡且不喷洒时，发芽率为53.3%。抗性小麦选择品种的种子用PURSUITTM处理，发芽率如下：FS1-60%，FS2-47.5%，FS3-41.2%，FS4-55%。许多经受除草剂处理的M3籽苗生长速度与未处理的对照组相同;但是，一些FS4的子代的籽苗受到除草剂的影响，表现出阻碍生长，扭曲和/或黄萎病斑痕的症状（图6）。这些中的多数能存活并继续生长。除草剂处理后三星期的植株高度列于表1中。
表1：M3植株筛选：在浸种/出芽前施用筛选法中四个起始小麦选择品种的M3子代筛选结果。
Figure 921025572_IMG1
1长出植株数/播种种子数。
2在对照组1和2中，测试的是种子而不是头状花序。
对照组1＝在无菌蒸馏水中浸泡的敏感小麦的种子（Fidel）。
对照组2＝在除草剂溶液中浸泡的敏感小麦的种子（Fidel）。
对照组M3＝在无菌水中浸泡的起始选择品种的M3种子。
突变体的选择品种的植株高度范围在1到28cm。这证明耐除草剂程度的不同。对照组植株高度范围在8到31cm。所有植株移种入71/2英寸泥炭盆中的Metro Mix 350TM中，并用于该实施例2的第4部分（遗传状况研究）所述的杂交中。
2.M3植株筛选：在体外
来自4个起始植株选择品种（记作FS1，FS2，FS3和FS4）的M3植株在体外对抗PURSUITTM进行筛选。来自这些起始M2突变品种的每个成熟的花序的M3种子在70%乙醇中30秒除虫，然后在真空下并伴随由摇摆盘提供的轻微搅拌在如前所述的含2.625%次氯酸钠的50%的溶液中20分钟除虫。种子浸在100×15mm无菌塑料平皿中的无菌蒸馏水中20-24小时，这之后胚被切下并转入含10-4、10-5或10-6M的PURSUITTM的培养基中培养。对照组包括将未诱变的胚（Fidel）在含和不含除草剂的培养基上培养，而M3材料则在不含除草剂的培养基。在培养开始两星期和一星期半或三星期后评定胚胎。
在含10-4M PURSUITTM的培养基中培养的胚（Fidel对照组或M3）无一萌发，尽管一些M3胚表现出少量的初生根伸长（1-5mm）。M3胚在浓度为10-5M的培养基中对PURSUITTM有些耐受性;但是，还是存在着相当严重的生长抑制。表2表示对胚的评定，“T”（耐受的），“D”（受损的），“S”（敏感的）表示在含10-5和10-6M PURSUITTM的培养基上培养的胚。
表2：M3植株筛选：对四个初始小麦选择品种的M3子代的种子体外筛选的筛选结果。胚评定-“T”＝耐受性的，“D”＝受损的，“S”＝敏感的。
PURSUITTM浓度＝10-5
胚评定  平均苗高  苗高范围
选择品种  T  D  S  （cm）  （cm）
FS1  21  16  42  -  0-1.5
FS2  21  14  45  -  0-3.5
FS3  12  9  58  -  0-4.5
FS4  16  15  31  -  0-3.0
对照组1  60  0  0  15.6  1-28
对照组2  0  0  30  -  -
对照组M327 1 1 14.7 1-28
PURSUITTM浓度＝10-6
胚评定  平均苗高  苗高范围
选择品种  T  D  S  （cm）  （cm）
FS1  70  0  0  9.1  1-22
FS2  64  1  0  11.4  1-23
FS3  34  12  22  5.2  1-23
FS4  59  8  13  13.4  1-33
对照组1  20  0  0  23.1  14-32
对照组2  0  0  15  -  -
对照组M315 0 0 14.6 2-28
对照组1＝敏感小麦种子（Fidel），在不含除草剂的培养基中。对照组2＝敏感的小麦种子（Fidel）在含除草剂的培养基中。对照组M3＝来自初始的选择品种的M3种子在含除草剂的培养基中。
根据这些体外实验数据，突变体选择品种的PURSUITTM耐受性增加10到100倍。
3.分离研究：
本研究是进行测定初始的突变小麦选择品种的M4子代对咪唑啉酮的抗性和均一性。用于这个研究的是来自经过前述两步筛选存活下来的M3植株（来自初始的选择品种，FS1-FS4）的M4种子。另外，来自M3植株的未经筛选的每种选择品种（记作“母株”）的M4种子和Fidel对照组被评定。来自母株和经筛选的代表每个原始小麦选择品种（FS1-FS4）的每个花序的M3植株的种子被种于盘中，每盘8行，每行25粒。种植后一星期，当籽苗在Z12（两片叶子）阶段，用62.5g/ha PURSUITTM喷洒植株。用实验室用带式喷雾器施用除草剂，量为950L/ha，带速12.5秒/转，喷雾器喷嘴为＃40015E，喷洒在植株上方18英寸进行。Tween 20TM用作表面活性剂，浓度为0.25%体积/体积（V/V）。喷洒后三星期评定植株。
Fidel对62.5g/ha的PURSUITTM完全过敏（这些植株全部死亡）。在这温室测定中，抗咪唑啉酮冬小麦选择品种表现出对出芽后施用62.5g/ha PURSUITTM的极好的耐受性。来自FS1、FS2和FS4的选择品种的子代表现出对PURSUITTM均匀的抗性，即使得到一些敏感的植株和萌芽率低的子代。这三种选择品种的抗性似乎是纯合的。FS3的子代可以是全部敏感的、分离的或全部抗性的。在萌发率高的分离子代中，差不多1/4的个体是敏感的。这一选择品种表现为杂合的，需要另外自交繁殖以获得一致的纯合子材料。对全部的子代，将种子增加的样地里的种子种于田中。在这项温室试验后，来自每种单个的选择品种的非分离性的子代大量种植以提供田间耐受性测试的足够的种子（实施例4的第一部分的田间试验Ⅰ）。
4.遗传状态研究：
为了测定突变小麦选择品种是否是等位的（并且可能来自相同的突变）或不同的，需要进行突变品种互交。抗性品系也需要与敏感品种（Fidel）杂交以确定抗性性状的遗传方式。考虑到这一点，所有可能的杂交及它们的互交在五个亲代系Fidel、FS1、FS2、FS3和FS4间进行。检测这些杂交产生的F1杂种的抗性，再与敏感亲代自交或测交以产生必要的子代以测定选择品种的遗传和等位性信息。
实验1：六个含Metro Mix 350TM的盘中种上来自下列每种杂交的F1杂种：FS1×Fidel;FS2×Fidel;FS3×Fidel;FS4×Fidel和Fidel（敏感的亲代栽培品种）。一星期后，对盘喷洒，一盘用一种浓度的除草剂，所用PURSUITTM为50、100、150、200和250g/ha，对选择品种FS1-FS4测定抗除草剂性状的遗传状态。用实验室用带式喷雾器施用除草剂，浓度为950L/ha，带速12.5秒/转，喷雾器喷嘴＃40015E。Tween20TM用作表面活性剂，在除草剂溶液中占0.25%体积/体积。除草剂处理后10天，对植株进行评定。
杂种矮小但并未被250g/ha的PURSUITTM杀死，这表明甚至在杂合状态下，这些植株表现出相对高水平的对咪唑啉酮类的抗性。Fidel在PURSUITTM浓度为150g/ha时被杀死，用量为50和100g/ha时受到严重伤害。FS1×Fidel;FS2×Fidel;FS3×Fidel和FS4×Fidel的F1代杂种都表现出除草剂抗性。抗性品种与敏感品种的分离比率为1∶1将表明处于某种杂合子状态。但这未在四个选择品种中观察到。根据这些数据，在抗性小麦突变品种中，控制对除草剂抗性的基因是显性并且是纯合子的。
实验2：这个实验通过检验互交和自交的品种的除草剂抗性而继续对突变小麦选择品种进行评定。互交在代表每种四个原始突变选择品种的植株间和在这些选择品种与Fidel间进行。这些杂交的子代和用于杂交的植株自交的子代被种于6英寸的杜鹃花盆中的Metro Mix 350TM中。用每盆种2粒种子的形式种10盆每种杂交的品种。十天后，用200g/ha PURSUITTM对所有自交和互交的子代进行出芽后喷洒。除草剂处理的方式如实验1所述。除草剂处理后一周，将植株缩减为每盆一株（移去每盆中两株中弱小的一株）。突变品种互交的种子100%萌发，突变品种自交的种子90%以上萌发。没有突变品种的杂交的品种受到施用PURSUITTM的损害。
实验3：F1杂种（如实验1中所述）测交回Fidel的品种施用200g/ha的PURSUITTM。以下测交品种种于6英寸的杜鹃花盆中的Metro Mix 350TM中。杂交品种后的数字表示每次杂交种植的盆数。
Fidel×（Fidel/FS1）  12
Fidel×（Fidel/FS2）  21
Fidel×（Fidel/FS3）  9
Fidel×（Fidel/FS4）  8
Fidel＊ 20
（＊二十盆Fidel每盆种两株）。大约一个月后，对植株进行喷洒（除Fidel外）。PURSUITTM（200g/ha）如前述方法施用。三个星期和一个半星期后对植株进行评定。
经喷洒的49个测交子代中，29个存活，20个被杀死。如果单一的显性（或半显性）基因控制遗传的话，29∶20分离很接近预计的1∶1分离。但是，在这一研究推断的杂合子比在前面的研究中用相同量的除草剂喷洒的植株有更多受损。不清楚是否是在植株生长的后期用除草剂处理引起杂合子受损害的增加，或者是否还包括其它因素。
实验4：将抗性小麦选择品种，FS1-FS4与Fidel杂交，由此杂交得到的F1种子进行自交。这些自交如下：
（Fidel×FS1）自交
（Fidel×FS2）自交
（Fidel×FS3）自交
（Fidel×FS4）自交
将由这些自交得到的F2子代和它们的敏感的祖先品种Fidel种于盘中。这四种自交的每一个取五个F2子代。每种自交的每个子代种于一个盘中。这些盘中包括每盘六行，每行25粒种子。十一天后对这些盘进行出芽后喷洒200g/ha PURSUITTM。PURSUITTM施用方法如前所述。
这一用量的PURSUITTM被测定为对敏感的小麦是致死的，但对抗性杂合子或纯合子植株没有致死性。这一子代的除草剂抗性的分离证明四个选择品种（FS1-FS4）的每一个的抗性性状是以单一的显性或半显性性状遗传的。当出芽后用200g/ha PURSUITTM喷洒时，四种交配的每一种的F2后子代给出清楚的比率：3（抗性品种）∶1（敏感品种）。
实验5：在四个突变小麦选择品种间进行杂交和测交。种植这些杂交的F1种子并允许植株自交。收获F2种子用于这个实验以测定四个选择品种的等位性。整盘加入Metro Mix 350TM并且每种杂交种100粒种子（四行，每行25粒）。另外，每盘中种一行敏感品种Fidel。采用每种杂交的三种来源。当籽苗达到Z12阶段，每个盘用200g/ha PURSUITTM喷洒。PURSUITTM用如前所述方法施用。处理后四星期，测定抗性品种数对敏感性植株数的比。
在四个抗性小麦选择品种间的等位性研究证明所有的选择品种是等位的或很紧密地连锁的。在选择品种间的F2代杂交种中观察到很少或无敏感分离品种。在基因是非等位的和不连锁的情况中，预计F2子代会以15（抗性品种）：1（敏感品种）的比例分离。表3表示这些遗传状态研究的结果。
表3：遗传状态研究：抗性品种/对200g/ha PURSUITTM敏感的品种的植株数。数据取自处理后三星期。
来源  抗性品种  敏感  来源  抗性品种  敏感
品种  品种
（FS1/FS2）X-1  71  1  （FS2/FS1）X-1  95  0
（FS1/FS2）X-2  85  2  （FS2/FS1）X-2  91  0
（FS1/FS2）X-3  74  1  （FS2/FS1）X-3  97  0
Total  230  4  Total  283  0
（FS1/FS3）X-1  82  0  （FS3/FS1）X-2  95  0
（FS1/FS3）X-2  92  0  （FS3/FS1）X-3  97  0
（FS1/FS3）X-3  93  0  （FS3/FS1）X-5  94  1
Total  267  0  Total  286  1
（FS1/FS4）X-1  96  0  （FS4/FS1）X-1  93  1
（FS1/FS4）X-2  90  0  （FS4/FS1）X-2  91  0
（FS1/FS4）X-3  93  2  （FS4/FS1）X-3  94  1
Total  279  2  Total  278  2
（FS2/FS3）X-1  99  0  （FS3/FS2）X-1  96  0
（FS2/FS3）X-2  87  1  （FS3/FS2）X-2  94  0
（FS2/FS3）X-3  92  0  （FS3/FS2）X-3  96  0
Total  278  1  Total  286  0
（FS2/FS4）X-1  102  0  （FS4/FS2）X-1  94  0
（FS2/FS4）X-2  97  1  （FS4/FS2）X-2  95  1
（FS2/FS4）X-3  97  1  （FS4/FS2）X-3  95  0
Total  296  1  Total  284  1
（FS3/FS4）X-1  98  0  （FS4/FS3）X-1  96  0
（FS3/FS4）X-2  96  0  （FS4/FS3）X-2  100  0
（FS3/FS4）X-3  96  0  （FS4/FS3）X-3  94  0
Total  290  4  Total  290  0
没有一种情况下敏感分离品种达总量的1/16（表3）。也观察不到遗传的母体效应。这些数据支持了这样一种可能性，即所有的四个选择品种来自相同的致突变情况或是很紧密地连锁的。
实验6：来自抗性的突变品种与Fidel（敏感的祖先培养品种）的第二次回交的自交的子代的种子被种在装在Metro Mix 350TM的标准盘中。每个来源种30粒种子。种植后7到10天，用前述方法向这些盘喷洒200g/ha的PURSUITTM。处理后过三星期，评定植株的抗性性状的分离。同预料的一样，一些子代是完全抗性品种，一些子代发生抗性分离，如，一些子代是抗性的和一些子代是敏感的，而其他子代是对除草剂完全敏感的。选择出纯合抗性植株并用于扩大种子数量（在苗圃中）以得到抗性提高的培养品种。
实施例3
对除草剂抗性的研究
1.对除草剂的抗性水平和抗性谱
这一温室试验检验在整个植株水平的抗性选择品种的除草剂抗性水平和抗性谱。四种咪唑啉酮（PURSUITTM、SCEPTERTM、ARSENALTM和化合物2）和一个磺酰脲（OUSTTM，E.I.du Pont de Nemours and Company的注册商标，它是邻-｛〔3-（4，6-二甲基嘧啶-2-基）脲基〕磺酰基｝苯甲酸甲酯）被用于试验。化合物2是潜在的短期残留的咪唑啉酮，它是2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-5-（甲氧基甲基）-尼克酸。通过测定植株的高度评定被处理过的植株的生长状况，并与未处理的对照组比较。来自经除草剂抗性筛选的M3植株的M4种子被用于两步筛选（浸种和喷洒）而未筛选的M3母株在显示出非分离性（见分离性研究）后被大量繁殖。这些品系按照它们的亲代品系：FS1、FS2、FS3和FS4被大量繁殖。为了比较的目的，Fidel（野生型）被作为对照。每只6英寸的杜鹃花盆中种入这些品系（包括Fidel）中的每一个的5粒种子，以后再缩减为每盆三株。对每个种类的每个处理（化学处理和评定处理）重复3次，未处理的对照组的每个小麦品系重复6次。种植后过10天，植株经受出芽后喷洒，除草剂及用量如下：
咪唑啉酮类：
PURSUITTM20，40，80，160，320， g/ha
SCEPTERTM40，80，160，320，640， g/ha
ARSENALTM＊3，6，12，24，48 g/ha
化合物2  20，40，80，160，320  g/ha
磺酰脲：
OUSTTM5，10，20，40，80 g/ha
（＊注：喷洒ARSENALTM的植株比其它处理的植株早种三天;但与其它处理一起测定。另外，尽管每个ARSENALTM用量评定重复三次，但每盆只有两株作物而不是三株）。喷洒前向除草剂溶液加入0.25%V/V的Tween 20TM。除草剂用实验室用带式喷雾器施用，量为400L/ha，距离在小麦植株上方18英寸，带速8.2秒/转，喷雾器喷嘴为＃65015E。植株高度的测量在喷洒前立即进行和每间一星期测量持续四星期。
四个选择品种的抗性水平和抗性谱都相似。FS3比其它三个选择品种的抗性略差。因为FS3是作为杂合子选择的，所以在大量繁殖种子以进行这些实验的过程中可能无意中包括了杂合的或敏感的个体。根据处理后过四星期的植株生长状况，突变品种小麦能抵抗高于320g/ha的PURSUITTM，高于640g/ha SCEPTERTM，高于48g/ha ARSENALTM，高于80g/ha的化合物2和高于5g/ha的OUSTTM。这些数字大约转换为对PURSUITTM耐受性提高8倍，对SCEPTERTM和ARSENALTM耐受性提高大于16倍，对化合物2的耐受性提高到16倍和对OUSTTM耐受性提高到2倍。图7-10a分别表明突变小麦选择品种之一（FS1）对ARSENALTM、OUSTTM、PURSUITTM、SCEPTERTM和化合物2的耐受性。
2.出芽前对除草剂的耐受性
在这个研究中，咪唑啉酮类-SCEPTERTM、PURSUITTM、ARSENALTM和化合物2，及磺酰脲-OUSTTM在出芽前（而不是本实施例3的第1部分中所述的出芽后）对小麦品种Fidel和抗性选择品种FS2和FS4施用以评定对除草剂的耐受性。
两个突变选择品种，FS2和FS4，的M4种子和敏感的小麦品种Fidel的种子被用于这个实验。每个小麦品种的种子被以每盆5粒种于六英寸的杜鹃花盆中的Sassafras土（含砂肥土）中。对每个处理的（化学品及用量）每个品系重复四次，而对用作对照的未处理的小麦品种重复六次。种下种子的第二天，用以下的除草剂及用量喷洒种植盆：
PURSUITTM40，80，160，320，640 g/ha
SCEPTERTM40，80，160，320，640， g/ha
ARSENALTM2.5，5，10，20，40 g/ha
化合物2  5，10，20，40，80  g/ha
OUSTTM5，10，20，40，80 g/ha
除草剂如前述施用（对除草剂的抗性水平和抗性谱）。喷洒后向盆中浇水。处理后过四星期测量植株高度。
根据四星期后的植株生长状况，FS2和FS4选择品种对ARSENALTM和PURSUITTM的耐受性大约提高8倍（分别由图12和13表示），对化合物2（图14）和SCEPTERTM（图11）的耐受性提高8倍到16倍。对OUSTTM的耐受性表现为提高到2到4倍。处理后过7星期，对根和苗鲜重的测量数据得到相似的结果。
3.出芽后对除草剂的耐受性
在这第二个温室试验中，测定了突变选择品种对出芽后施用PURSUITTM和化合物2的抗性的上限。两个突变选择品种，FS2和FS4的种子和Fidel的种子被用于这个实验。每个品种的种子被以每盆5粒种于6英寸杜鹃花盆中的Metro Mix 350TM中。就在除草剂处理前，这些植株被缩减为每盆3株。每个品种的每次处理（化学品及用量）重复三次，用作未处理的对照组的每种小麦重复6次。种植后10天，用以下的除草剂及用量对植株进行出芽后喷洒：
PURSUITTM：10，25，50，100，250，500，1000，2500
化合物2：2.5，5，10，25，50，100，250，500
除草剂如前述方法施用。就在喷洒前测量植株高度。植株高度也在处理后过两星期和四星期测定，在处理后过七星期测定苗鲜重。
与未处理的对照组相比，选择品种对所有的处理情况表现出在处理后两星期中最初的矮小症状（图15和17）。但是在处理后过四星期，在用量达500-1000g/ha PURSUITTM（图16）和25-50g/ha化合物2（图18）时，FS2和FS4植株高度与未处理的对照组相等。在这个试验中与Fidel（未选择的）相比，选择品种显示出对PURSUITTM和化合物2的耐受性提高40到100倍。处理后过七星期取得的苗鲜重数据表明在这些相同的除草剂用量下，FS2和FS4的鲜重为未处理的对照组鲜重的90-100%（图19和20）。
4.出芽出前对氨磺酰脲的耐受性
进行两个实验测定是否有咪唑啉酮抗性的小麦选择品种表现出对氨磺酰脲除草剂的抗性。在出芽后和出芽前试验中对对四种氨磺酰脲除草剂（如下所述）和一种磺酰脲除草剂（OUSTTM）的抗性进行测定。
在第一个实验中，来自大量的M3-M4繁殖的突变小麦选择品种FS2的种子和Fidel种子被种在6英寸杜鹃花盆中的Sassafras土（含砂肥土）中。最初每盆种3粒种子;这些后来被缩减为2株。每个处理重复三次。另外，未处理的对照组由每种Fidel和FS2重复15次组成。用以下除草剂及用量对植株进行出芽前喷洒：
氨磺酰脲类：
化合物3  12.5，25，50，100，200  g/ha
化合物4  62.5，125，250，500，1000  g/ha
化合物5  12.5，25，50，100，200  g/ha
化合物6  12.5，25，50，100，200  g/ha
化合物3是1-（4-甲氧基-6-甲基-均-三嗪-2-基）-3-〔（邻-丙酰基苯基）氨磺酰基〕脲，化合物4为1-（4，6-二甲氧基-2-嘧啶基）-3-〔（邻-丙酰基苯基）氨磺酰基〕脲，化合物5为1-〔（邻-乙酰基苯基）氨磺酰基〕-3-（4-甲氧基-6-甲基-2-嘧啶基脲，及化合物6为1-〔（邻-乙酰基苯基）氨磺酰基〕-3-（4-甲氧基-6-甲基-均-三嗪-2-基）脲。全部四个化合物被揭示于美国专利4，622，065中。
磺酰脲：
OUSTTM1.56，3.125，6.25，12.5，25 g/ha
除草剂如前述方法施用。
出芽前研究中只有很低的发芽率，并且，再一次，Fidel与抗性选择品种从视觉观察不到区别。
5.出芽后对氨磺酰脲的耐受性
在第二个实验中，来自大量的M3-M4繁殖的突变小麦选择品种FS2的种子和Fidel种子被种在6″杜鹃花盆中的Metro Mix 350TM中。最初每盆种3粒种子;这些后来被缩减为2株。每个处理重复三次。另外，未处理的对照组由每种Fidel和FS2重复15次组成。种植后过12天，用以下除草剂及用量对植株进行出芽前喷洒：
氨磺酰脲类：
化合物3  12.5，25，50，100，200  g/ha
化合物4  62.5，125，250，500，1000  g/ha
化合物5  12.5，25，50，100，200  g/ha
化合物6  12.5，25，50，100，200  g/ha
磺酰脲：
OUSTTM:6.25，12.5，25，50，100 g/ha
除草剂如前述方法施用。
用预期会引起对敏感的小麦严重损害或致死的量的除草剂处理抗性的和敏感小麦。但是，甚至用在出芽后试验中试验用的氨磺酰脲除草剂的最大用量，敏感的小麦培养品种（Fidel）也未受损害（视觉观察）。可能是Fidel小麦对氨磺酰脲除草剂有相当的耐受性，或用量还不够高到足以引起损害，或由于其它原因除草剂不能损害小麦（配方、环境影响，等等）。在这个研究中，耐受性小麦表现出对OUSTTM耐受性提高2-4倍;这些结果与前面实验得到的结果相似。
6.M3-M4小麦对除草剂的抗性谱
在这个实验中，为寻找对不同于咪唑啉酮类的抑制AHAS的除草剂的交叉耐受性而对抗咪唑啉酮的小麦测试其对三种磺酰脲除草剂（BEACOMTM、CLASSICTM和OUSTTM（BEACONTM是Ciba-Geigy的注册商标，它是2-〔4，6-双（二氟甲氧基）-嘧啶-2-基氨基甲酰基氨磺酰基〕苯甲酸;CLASSICTM是E.I.du pont de Nemours and Company的注册商标，它是邻-｛〔（4-氯-6-甲氧基-2-嘧啶基）-氨基甲酰基〕-氨磺酰基｝-苯甲酸）、一种氨磺酰基脲除草剂（化合物3）、一种磺酰羧酰胺除草剂（化合物1）和一种咪唑啉酮除草剂（化合物7，它是3-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-2-甲基-尼克酸）的耐受性。来自大量的M3-M4繁殖的突变小麦选择品种FS2的种子和Fidel的种子被种在5″杜鹃花盆中的Metro Mix 350TM中。最初每盆种3粒种子;这些后来被缩减为2株。每个处理重复三次。另外，用作未处理的对照组的FS2和Fidel都重复六次。种植后7天，用以下除草剂及用量在出芽后喷洒植株：
磺酰脲：
BEACONTM：15.6，31.3，62.5，125，250 g/ha
CLASSICTM：31.3，62.5，125，250，500 g/ha
OUSTTM：6.25，12.5，25，50，100 g/ha
氨磺酰脲：
化合物3  125，250，500，1000，2000  g/ha
磺酰羧酰胺：
化合物1：250，500，1000，2000，4000  g/ha
咪唑啉酮：
化合物7  187.5，375，750  g/ha
除草剂如前述方法施用。用除草剂处理后过二、三和四个星期对植株进行评定。
对磺酰脲类（图21、22和24）、氨磺酰脲（图23）、或磺酰羧酰胺（图25）的交叉抗性为0-2倍，与前面对OUSTTM的研究所观察到的相似。对咪唑啉酮化合物7的抗性与先前对PURSUITTM或ARSENALTM（大于10倍）（图26）所观察到的相似。观察不到对非咪唑啉酮除草剂的抗性的明显增加。
实施例4
田间试验
1.田间试验Ⅰ
进行一个田间试验以评定抗咪唑啉酮的小麦选择品种FS1-FS4对出芽后施用咪唑啉酮除草剂的耐受性。包括用这些选择品种的来源Fidel（品种作为敏感性检测。由于Fidel是一种法国冬小麦品种而不适合于新泽西州，这个试验意在评定除草剂处理对谷物产量的相对影响，而不是测定实际的基因型产量潜力。因此，产量以克/样地表示，而不是蒲式耳/英亩或公吨/公顷。
来自亲本品系FS1、FS2、FS3和FS4的大量M4种子和野生型的Fidel种子被用于这个田间试验。试验是种植在设计的包括作为与除草剂量配合的主样地和分离的基因型样地的不完全分离的样地。每种处理（化学品及用量）重复三遍，但＃2和＃3重复不包括突变小麦选择品种FS3，因为缺少足够量的种子。样地为3米长1.5米宽（7行，行间距7英寸），每行约种25粒种子。不同小麦品种的样地间隔1米，重复试验的样地间隔10米。
处理包括以下：
未处理的对照组
PURSUITTM：100和200 g/ha
化合物2：50和100  g/ha
化合物8：100和200  g/ha
化合物8是5-甲酰-2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-尼克酸，5-（二甲基乙缩醛），在公开的欧洲专利申请322，616中有记述。
处理是用拖拉机上装配的喷雾器以400L/ha的量施用。Tween 20TM以0.25%V/V的量用作表面活性剂。小麦在Z22阶段或约6英寸高时被处理。处理后过3和6个星期测定小麦高度和受损情况。处理后过10星期估算产量。
处理后过3星期，由测定植株高度（图27），抗性小麦选择品种表现为不受这些除草剂处理的影响。视觉观察不到除草剂处理对抗性选择品种的明显的影响。这些选择样品未处理的情况下比未处理的Fidel略矮些。通过这些同样的处理，敏感栽培品种的生长发育受到严重阻碍。
处理后过六星期，抗性小麦选择品种的植株高度仍未受除草剂处理的影响（图28）。通过除草剂处理Fidel的生长受到严重阻碍或被杀死，而抗性选择品种明显不受处理影响。未处理的选择品种最终的植株高度与未处理的Fidel的高度接近相同，尽管在处理后三星期中未处理的选择品种比未处理的Fidel矮。抗性小麦的选择品种表现出比未喷洒的Fidel较慢些的生长速度，可能是有害的隐性突变引起的。用那些现有技术中可得到的技术通过回交除去隐性突变。
用任何除草剂处理的出芽后处理之后，FS1、FS2和FS4表现出无产量减少。相反，用100g/ha PURSUITTM处理使Fidel减产35%，用其它除草剂则减产75%。未处理的Fidel产量明显高于FS1或FS4（分别为133g/样地对40g/样地和76g/样地）。FS2的平均产量（98g/样地）也低于未喷洒的Fidel，但在处理后十星期少得并不显著（图29）。选择品种的低产是没有预料到的;突变品种表现为不及Fidel茁壮和较弱的植株丛体系，可能是因为诱变处理过程引起的有害基因的存在，但与抗咪唑啉酮的品质无关。有些奇怪FS1、FS2和FS4的产量有这么大的不同，因为全部这三个品种很可能是来自相同的突变品种。在植株高度和谷物产量方面，选择的品种具有对除草剂处理试验的完全的抗性。
2.田间试验Ⅱ
进行第二个田间试验以评定抗咪唑啉酮的小麦选择品种对FS4对出芽后施用咪唑啉酮除草剂PURSUITTM、CADRETM、化合物2和化合物8，及磺酰脲除草剂ACCENTTM的耐受性。CADRETM是American Cyanamid Company的注册商标。CADRETM是2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-5-甲基尼克酸，在美国专利4，798，619中有记述。ACCENTTM是E.I.du Pont de Nemours and Company的注册商标，是1-（4，6-二甲氧基嘧啶-2-基）-3-（3-二甲基氨基甲酰基-2-吡啶基磺酰基）脲。Fidel被包括作为敏感性检测。
在田间试验Ⅰ的苗圃中的最高产的FS4品种的M5种子被大量繁殖以与Fidel种子用于这次田间试验。试验是种植在带有代表除草剂处理的主样地的不完全分离的设计样地和分离的代表基因型的样地。有十一项处理，每个处理（化学品用用量）重复三次。样地长3米宽1.5米（种7行，行间距7英寸），播种密度约100粒种子/m2。小麦种间有0.5米间隔，重复试验间隔3米。
处理包括以下：
未处理的对照组
咪唑啉酮类：
PURSUITTM100和200 g/ha
化合物2：50和100  g/ha
化合物8：100和200  g/ha
CADRETM：50和100 g/ha
磺酰脲：
ACCENTTM20和40 g/ha
用除草剂处理采用背负式喷雾器，用量为200L/ha。非离子表面活性剂X-77TM（Balent Corporation）被用作湿润剂，用量0.25%V/V。小麦处理在当植株高约30-35cm在Z27-Z28阶段进行。在处理后1、2、3和6星期进行植株高度和受损评定。处理后10星期评定产量。
对所有的除草剂处理，三星期后，Fidel生长受到严重抑制。抗性选择品种FS4表现出对所有咪唑啉酮试验的耐受性;但是，观察不到对磺酰脲（ACCENTTM）的交叉抗性。图30所示的测定是在处理后过六星期进行的，它表明用PURSUITTM、CADRETM、化合物2、或化合物8出芽后处理对最终的植株高度无影响。抗性小麦对ACCENTTM很少或无耐受性。在这些相同的除草剂用量，对照的敏感品种的生长受到严重的阻碍或被杀死。图31表示三次重复的平均谷物产量。对任何咪唑啉酮处理，抗性小麦选择品种FS4的谷物产量不减少。用咪唑啉酮除草剂处理的Fidel严重减产或无产量。用ACCENTTM处理后，抗性品种和敏感的Fidel品种的谷物产量都很低或没有。用咪唑啉酮对Fidel处理而引起的对谷物产量的影响比前述的植株高度的减低甚至更严重。
用于这个田间试验的抗性品种小麦是通过大量收获田间试验Ⅰ的几个种子增产的品种而得到的。每个增产品种来自单一的植株。即使不进行这些材料与Fidel的回交，萌发率低和农艺性能差的种源也能被除去。结果，与那些田间试验Ⅰ中的测定相比，抗性选择品种的谷物产量有很大提高。得到的未处理的对照样地中的抗性小麦的产量与得到的那些未处理的样地的敏感的Fidel的产量相等。这表明含有抗咪唑啉酮的基因对谷物产量无内在影响。
实施例5
酶研究
1.初始分析（M3植株）
除草剂的施用：来自四个初始突变品种作物（FS1、FS2、FS3和FS4）的M3植株被用于测试AHAS（乙酰羟酸合酶）的代谢活性。在第一次浸种和喷洒筛选后显示出抗性的植株被从盘中移种到个别的盆中。当这些植株长到三个星期后，每个突变选择品种（FS1-FS4）的两株受到62.5g/ha的PURSUITTM的第二次喷洒，而每个选择品种的另两株不喷洒。在这个实验中也包括经喷洒和不喷洒的Fidel植株。施用除草剂后过两天，取下每个植株在土面上的大约一半叶子用缬氨酸和亮氨酸（作为对照）、SCEPTERTM、PURSUITTM、OUSTTM、和磺酰羧酰胺除草剂化合物9分析对AHAS的抑制作用。化合物9是2-乙酰氨基-2，3-二甲基-N-（对-甲苯磺酰基）丁酰胺，在美国专利4，883，914中有记述。
在未喷洒的植株中，可看出抗性小麦品种对PURSUITTM的弱的抗性。但是，喷洒过的FS1-FS4植株与喷洒过的野生型品种比较，可看出AHAS对PURSUITTM抗性的戏剧性的增长。图32-35表明对四个抗性选择品种之一（FS1）和对野生型（敏感的）Fidel植株的这种结果。因此，FS1-FS4对PURSUITTM的耐受性是由于改变了的抗PURSUITTM抑制作用的AHAS的存在。
酶的提取：为提取AHAS，在液氮中研碎10g组织，然后在含10mM丙酮酸盐、5mM MgCl3、5μM EDTA、100μM FAD、1mM缬氨酸、1mM亮氨酸、10%甘油、和10mM半胱氨酸的100mM磷酸钾缓冲液（pH7.5）中使之均匀化。用尼龙布（53μM网）过滤均浆并在25，000g离心20分钟。上清液部分加入到50%的（NH4）2SO4饱和溶液中，并在冰上静置20-30分钟。然后在25，000g离心20分钟，弃去上清液。将片状硫酸铵溶于含1mM EDTA和100mM NaCl的50mM磷酸钾缓冲液（pH7.5）中并用于分析步骤中。
AHAS分析：通过评定乙酰乳酸在酸存在下脱羧转变成乙偶姻产物来测定AHAS的活性。标准的反应混合物含有在含100mM丙酮酸钠、10mM MgCl2、1mM焦磷酸维生素B、和10μM FAD的50mM磷酸钾缓冲溶液（pH7.0）中的酶。在试管中，这一混合物在37℃保温一小时后用加入最终形成0.85%H2SO4浓度的H2SO4以停止反应。反应产物可在60℃脱羧15分钟。形成的乙偶姻可用Westerfild法用与肌酸（0.17%）和1-萘酚（1.7%，在4N NaOH中）一起保温来测定（Westerfield，W.W.，J.Biol.Chem.，161，495-502（1945）。通过在60℃保温15分钟，然后继续在室温恒温15分钟观察极限颜色。在520nm测定有色配合物的吸收。在酶分析中采用适当的指示乙偶姻形成的检测。每个分析至少重复两次，并且实验至少重复两次。
2.酶分析Ⅰ（M4植株）
除草剂的施用：在两盘无菌Metro Mix 350TM中种约100粒每种小麦选择品种（FS1、FS2和FS4）和Fidel的种子。十天后，向每盘进行出芽后喷洒62.5g/ha的PURSUITTM。喷洒量为400L/ha，带速8.2秒/转，喷嘴＃65015E。Tween 20TM用作表面活性剂，量为0.25%V/V。三天后收割植株，分析AHAS活性。
酶的提取和AHAS分析：如前所述。
3.酶分析Ⅱ（M4植株）
除草剂的施用：如前所述（酶分析Ⅰ中），只是喷洒量为950L/ha带速12.8秒/转，喷嘴＃40015E。
酶提取和AHAS分析：如前所述。
这两套实验的结果很相似。与来自野生型对照植株（Fidel）的酶相比，来自由未喷洒的植株得到的全部四个纯合子的抗性突变品种的AHAS的活性表现为适中水平。但是，与来自经喷洒的Fidel植株的酶相比，观察到来自经喷洒的选择品种的酶的明显较高的对PURSUITTM抗性（图36-39）。也能观察到一些对SCEPTERTM和OUSTTM的抗性，但抗性水平比对PURSUITTM的抗性低。所有突变品种对各种除草剂的抗性谱及抗性水平都很相似，这表明全部四个突变品种可能是单一突变情况的结果。这个结论得到前面所述遗传途径的证实。

Claims (6)

1、一种选择使小麦具有对抑制乙酰羟酸合酶的除草剂的抗性的突变的筛选方法，其特征在于它包括用选自一组包括叠氮化钠、N-甲基-N-亚硝基脲、N-乙基-N-甲磺酸乙酯、羟胺和联胺的化学诱变剂使小麦种子致突变，将致突变的种子浸在含抑制乙酰羟酸合酶的除草剂的溶液中，该溶液含有一特定类别的抑制乙酰羟酸合酶的除草剂，将浸过的种子种在土中并在籽苗从土中长出前向含有种子的土壤喷洒与用于浸种步骤中的相同或不同类别的抑制乙酰羟酸合酶的除草剂，这样，所长出的外表正常的小麦植株对用于浸种和/或喷洒步骤中的类别的抑制乙酰羟酸合酶的除草剂具有抗性。
2、如权利要求1的方法，其特征在于用于浸种步骤的抑制乙酰羟酸合酶的除草剂与用于种子喷洒步骤的是相同的。
3、如权利要求1的方法，其特征在于用于浸种步骤的抑制乙酰羟酸合酶的除草剂与用于种子喷洒步骤的是不同的。
4、如权利要求1的方法，其特征在于抑制乙酰羟酸合酶的除草剂的类别是选自包括咪唑啉酮类，氨磺脲类，磺酰羧酰胺类，磺酰胺类和磺酰脲类的一组。
5、如权利要求4的方法，其特征在于咪唑啉酮是选自包括2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）尼克酸，2-（4-异丙基）-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-3-喹啉羧酸，5-乙基-2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-尼克酸，2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-5-（甲氧基甲基）-尼克酸，5-甲酰-2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-尼克酸，5-（二甲基乙缩醛），3-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-2-甲基-尼克酸，2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-5-甲基尼克酸，和6-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-间-甲苯甲酸甲酯与2-（4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）-对-甲苯甲酸甲酯的混合物的一组。
6、一种对一类抑制乙酰羟酸合酶的除草剂有抗性的改变了的乙酰羟酸合酶酶，其特征在于该酶是在用权利要求1的方法处理的小麦的生长中产生的。
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