CN1234722A - 生产杂交小麦的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供生产杂交小麦的方法,该方法基于稳定保持普通小麦或硬粒小麦基因性雄性不育母本系的能力。它亦提供对隐性雄性不育等位基因和对显性雄配子杀伤等位基因纯合的雄性不育母系,以及容易和稳定繁殖的保持系。该保持系与母系等基因但具有一条异源工程化染色体,该染色体携带恢复保持系育性的显性雄性能育性等位基因、对天然雄配子杀伤因子的杀伤效应敏感并因此防止该染色体传递至母系的隐性雄配子杀伤等位基因、以及一个或多个便于保持保持系自身的选择标记。本发明亦提供将任何所需栽培品种转化成为雄性不育母系和保持系的程序。
Description
发明领域
本发明涉及生产普通小麦和硬粒小麦的杂种种子,所述种子产生高度杂合性和表现型一致的杂种植株。更具体地说,本发明涉及基于染色体工程的保持用于产生杂交小麦植株的雄性不育母本系的新方法,该母本系对隐性突变雄性不育等位基因、对隐性标记等位基因和对显性雄配子杀伤等位基因是纯合的,本发明还涉及用于保持该母本系的新保持系,其与该母本系等基因但却具有一条附加的异源工程化染色体,该染色体携带一个显性雄性能育性等位基因、一个对所述显性天然雄配子杀伤等位基因的雄配子杀伤敏感的隐性雄配子杀伤等位基因和一个显性选择性标记等位基因。所述异源染色体臂上所有的等位基因由于所述异源染色体与所述小麦染色体之间缺乏配对和重组而永久地连锁。所述异源工程化染色体上的隐性雄配子杀伤等位基因的存在,保证了所有的保持系存活的雄性配子缺乏该染色体,并由此缺乏所述显性雄性能育性等位基因和所述选择性标记等位基因。一方面,约20-50%的雌性配子携带该异源工程化染色体。当所述选择性标记是影响植株高度的等位基因时(携带该工程化染色体的植株比未携带该工程化染色体的植株高8-10cm),可以独立于矮植株收获高植株。高植株上发育的种子中约20-50%携带所述异源工程化染色体,并因此而发育成雄性可育植株,而50-80%缺乏该染色体并因此发育成为雄性不育植株。每年独立收获高植株种子的能力保持了所述保持系中雄性可育植株的比例恒定。当该选择性标记是除草剂抗性基因时(例如,对绿麦隆抗性),可以将该除草剂施用于该自交保持系的子代,由此杀死缺乏该工程化染色体的所有植株(雄性不育植株),仅保持系(雄性可育)植株存活。这使得可以在每代中仅生长所述自交保持系子代的雄性可育植株。当所述选择性标记是蓝糊粉(胚乳着色性状)时,可以分离在该保持系上发育成蓝色种子的种子(从该种子发育雄性可育植株(保持系))以及天然着色(红色/白色)的种子(从该种子发育雄性不育植株(母系)。从所述自交保持系子代直接选出雄性不育母系的可能性简化了该系统,并大大降低了杂种种子的生产成本。本发明再提供产生所述保持系的新方法、将所需栽培品种转化成为雄性不育母系和该母系的保持系的新方法以及产生杂交小麦的新方法,其中产生的杂种植株对所述隐性突变雄性不育等位基因均为杂合的并因此是雄性可育的。
发明背景
已确认许多杂种植株系比纯化等位基因植物系的产量高,并表现出品质改良和对环境和生物压力的更高的耐受。与雄花和雌花物理分离的玉米不同,普通小麦(面包)(Triticum aestivum var.aesticum)和硬粒小麦(通心粉)(Triticum turgidum var.durum)是主要自花授粉的物种,每朵花具有雌器官和雄器官。为产生杂种种子,因此有必要使母本雄性不育。由于小麦人工去雄不切实际,因此可以通过施用化学杂交药剂(CHA)或通过遗传手段导致雄性不育。利用CHA对小麦植株杀雄很昂贵、效率低且具污染性。实际上,CHA的使用目前主要局限于科学实验。
通过遗传手段产生杂种种子需要以下条件:1)母本完全和稳定的雄性不育性;2)通过父本完全和稳定的育性恢复;3)通过保持系容易地繁殖母本(雄性不育)。尽管小麦遗传学家已知这些条件,但是自从描述了第一个雄性不育小麦(Kihara,1951)后的46年中在杂交小麦生产方面一直未有突破。
有二种主要类型的遗传雄性不育可以用于杂种种子生产:核置换或异质品系中的细胞质雄性不育(CMS),由异源细胞质与普通小麦细胞核的不亲和相互作用引起,和真细胞质(euplasmic)品系中的基因性雄性不育(GMS),由正常情况下赋予普通小麦细胞质中雄性能育性的核基因隐性突变或缺失引起。应注意涉及异源细胞质的CMS通常降低杂种的生产能力,而涉及天然细胞质的GMS应提供基因组正常表达和杂种的完全生产能力。
虽然在许多经济作物(例如玉米)中基因性雄性不育占优势,尚未在普通小麦或硬粒小麦中充分利用该类型。普通小麦中的绝大多数尝试均是针对在细胞质雄性不育的基础上产生杂种种子。在此方面普遍使用了另一小麦物种提莫菲维小麦(Triticum timopheevii)的细胞质(G细胞质)。含有该细胞质的异质系为雄性不育。研究过的另一细胞质类型是易变山羊草(Aegilops variablilis)(Sv细胞质)的细胞质。该细胞质在缺乏染色体臂1BS上Sv恢复基因的品系中引起雄性不育。但是,如上所述,将异源细胞质做为不育因子在普通小麦中使用有很大的缺点,因为普通小麦细胞核与异源细胞质之间的相互作用负面影响各种重要的性状。另外,难以为这种异质雄性不育系寻找在广泛基因型范围内高度有效的稳定的育性恢复基因。另外,该系统亦需要父本育种(例如导入可以恢复异源细胞质雄性能育性的基因),因此使得杂种种子生产更加昂贵,并且限制了可以用于测试结合能力(对显著的杂种优势起作用)的父本的数量。
另一方面,基因性雄性不育在正常普通小麦或硬粒小麦细胞质中表达。因此预期没有对植株特性的细胞质诱导的有害影响。另外,使用隐性雄性不育等位基因纯合的母本,天然对赋予雄性能育性的显性等位基因纯合的任何小麦栽培品种都可以做为将F1杂种完全恢复育性的父本使用。不需要育种父本系,不存在对可以与雄性不育母本杂交并评价其结合能力的父本的数量的限制。
已描述了普通小麦中携带影响雄性能育性的几条染色体臂,例如第四组的染色体臂:染色体4A的长臂(4AL)、染色体4B的短臂(4BS)和染色体4D的短臂(4DS),它们分别携带正常雄性能育性Ms-A1、Ms-B1和Ms-D1基因,和第五组染色体的长臂:分别携带Ms-A2、Ms-B2和Ms-D2基因的5A、5B和5D(分别为5AL、5BL和5DL)。但是,直到现在才仅在染色体臂4BS(原为4AS)的远端区上的Ms-B1基因座中发现或诱导引起雄性不育的三个隐性等位基因。据报道这些等位基因ms-B1-a、ms-B1-b和ms-B1-c(亦常分别称为ms1a、ms1b和ms1c)除雄性不育外对植物特性不造成任何影响(Wilson和Driscoll,1983综述)。
雄性不育母本系的保持是基于GMS的成功杂种生产系统的主要障碍。在二个方向上进行了努力以保持雄性不育母本。一个是使用“育性细胞质”,另一个是为保持系配备与所述隐性突变雄性不育等位基因近同源等位的异源育性等位基因,该等位基因不传递至所述母本系。
保持雄性不育母本的第一种方法即使用“育性细胞质”在很早以前由Hermsen(1965)提议,但直至现在未得到实验结果支持。他描述了“育性细胞质”的可能性,该细胞质即天然或异源细胞质,其中在雄性不育等位基因纯合的植物中不表达雄性不育,因此该系表现型为雄性可育。不幸的是至今未发现这种细胞质。Hermsen提议的系统不能实际实现,主要是因为在普通小麦中没有可以恢复雄性不育基因型育性的充足的细胞质种内变异,并且紧密相关的小麦种的细胞质亦不能促进恢复雄性不育基因型的雄性能育性。另一方面,较远缘物种的细胞质通常引起雄性不育,除了在该异质系携带合适的恢复基因(restorer)的情况下。虽然如此,未研究它们对雄性不育等位基因的影响。
Franckowiak等(1976)将雄性能育性恢复基因归因于普通小麦的D基因组,因为节节麦(Aegilops squarrosa)(D)细胞质中的异质普通小麦(基因组AABBDD)是雄性可育的,并且D细胞质中的异质硬粒小麦(基因组AABB)是雄性不育的。他们在具有D细胞质的普通小麦异质系中诱导突变,并且提议了一个杂种生产系统,其中通过同一栽培品种的euplasmic类型保持这种异质雄性不育亲本,即雄性不育母本,雄性不育亲本具有雄性能育性突变等位基因和D细胞质,保持系具有同样的突变等位基因和天然(B)细胞质,父本具有正常雄性能育性等位基因和B细胞质。通过杂交这种母本和父本恢复杂种的育性。但是这种杂种具有源自母本的D细胞质,从这种细胞质可能对杂种特性(产量、活力等)具有有害影响的事实来看,这是不利的。而且,在上述Franckowiak等的系统中,用于在该雄性不育母本的后续世代中obtention的保持系是携带雄性能育性突变和确保保持系育性的B细胞质的系。从所有得到的雄性不育突变体在B细胞质中亦是不育的(Sasakuma等,1978)事实来看,该系统证明是不切实际的。因此,如此提议的“保持”系亦是雄性不育的,没有实用价值。因此,由于不存在合适的保持系,已放弃了Franckowiak等的系统。
与上述相似,Feldman和Millet(未发表数据)发现携带B基因组染色体(例如4B和5B)上的雄性不育等位基因的基因型在含有D和Sv细胞质的异质系中亦是雄性不育的。因此看起来“育性细胞质”的概念(Hermsen,1965)在小麦中不可能实现。
保持雄性不育雌性的第二种方法的实例是Driscoll(1972)的XYZ系统。二十年前他提议向雄性不育母本Z系(隐性突变体等位基因ms-B1-c纯合)加入附加的单条(在Y系中)或一对(在X系中)异源染色体,所述染色体携带显性Ms近同源等位基因,该等位基因依次赋予X系和Y系育性。该异源染色体不与其小麦部分同源的染色体配对,其在Y系中以极低的频率通过花粉传递,因此受粉的雄性不育母系产生种子,绝大部分的种子发芽成为雄性不育植株。因为该保持系(Y)不是纯化等位基因系,通过用二体异源附加系(X)授粉雄性不育母系(Z)产生该保持系。该系统有二个主要缺点为特征:通过保持系的花粉发生的异源染色体的一些传递向雄性不育母系的新世代导入了雄性能育性;X系中发生的附加衰变降低了其纯度。这些可能是该系统从未实际(商业)应用的原因。
最近,Driscoll(1985)提议修饰上述产生杂交小麦的XYZ系统。在该系统中,自交Y系取代了Y系以保持和繁殖雄性不育Z系。该修饰取消了对起先用于产生大量Y系植株所需的X系的需要。而且,新提议的Y系携带异源等臂染色体,以使该补偿性雄性能育性近同源等位基因为二份。虽然该修饰的XYZ系统比原XYZ系统需要较少的各种亲本植株之间的杂交以保持和繁殖雄性不育雌株,但是在该修饰的XYZ系统中亦存在如上述表征原XYZ系统的缺点,限制了其在商业生产杂种种子的应用。
从上述来看,好象杂种生产的传统方法不够有效,需要新的方法。在国际PCT专利申请PCT/AU91/00319(WO 92/01366)和PCT/AU93/000017(WO93/13649)中已描述了一种基于上述Driscoll(1972)XYZ系统的改进的这种新方法,它涉及诸如普通小麦的杂交谷类作物的生产。在这些出版物中有用于产生杂种的植物系,其具有携带对雄性不育突变等位基因近同源等位的显性雄性能育性基因和赋予子代种子着色的颜色标记基因的异源染色体或染色体节。通过用颜色分选物理分离子代种子完成雄性不育(母本)亲本系的保持。这种遗传改变了的普通小麦植株含有具有二倍体小麦一粒小麦的显性正常雄性能育性等位基因的修饰染色体,做为附加或替换小麦4B染色体中的一条染色体。该修饰的染色体带有携带Ms-Am1等位基因的一粒小麦染色体4Am的短臂(4AmS)和具有带有着色等位基因(C)的或者一粒小麦染色体4Am的长臂(4AmL)或者长穗鹅冠草染色体4E的长臂(4EL)的近端节以及小麦染色体臂4BL的远端节的第二条臂。该修饰的染色体的一部分与携带所述隐性雄性不育等位基因的小麦染色体4B同源,其一部分与携带所述隐性雄性不育等位基因的小麦染色体4B部分同源。该同源部分即4BL的远端区可以与正常小麦4BL配对,由此保证减数分裂时的规则的分离。标记该携带正常显性雄性能育性等位基因Ms-Am1的染色体的另一种可能性是利用赋予子代植株植株高度增加的基因。
然而就有效保持亲本系而言,上述杂种生产系统有一些缺点。第一,由保持系对雌株授粉产生大量的具有重组异源/4BL染色体的种子,它们将发育成为雄性可育植株。第二,雄性不育母本的保持涉及复杂的基于标记基因的子代选择程序。第三,用于母(雄性不育)本系的保持系亦是遗传不稳定系,因为它携带20对正常普通小麦染色体、一条携带雄性不育性(ms-B1-b)突变等位基因(已知为‘Probus’)(Wilson和Driscoll,1983)的4B染色体和一条具有正常雄性能育性Ms-Am1等位基因和种子着色等位基因的重组异源组4/4BL染色体。因此,所述保持系是雄性可育的,并在自交时将产生对该修饰的染色体纯合或杂合性的育性植株。因此不可能基于着色基因区分这二种基因型,基于高度基因区分也非常困难。因此,该保持系的繁殖和其用于提供雄性不育母系工作量很大,不适于大规模商业应用。
为克服选择携带雄性能育性Ms等位基因的异源染色体的机械或其它间接方法的困难,日本Kyoto的Kyto大学T.R.Endo建议(由Tsujimoto和Tsunewaki 1983引用)使用杀配子基因Gc1,并将其连接至雄性不育等位基因ms。该源自Ae.Speltoides的杀配子等位基因使不携带它(但携带天然隐性gc1等位基因)的配子败育。按照Endo的建议,该雄性不育母系对紧密连锁的ms和Gc1均为纯合的,将对所述母系是等基因的、但具有Ms和gc1等位基因的雄性可育系(保持系)用于对所述母系授粉,以产生双杂合子msMsGc1gc1。由于携带gc1的配子败育,这种自交系的所有子代将是纯合子msmsGc1Gc1并与所述母系相同。然而,按照他们的建议,亦应培育该杂种生产系统中的雄系(R系)使其含有Gc1等位基因,否则F1杂种的育性将降低。另外,Gc1引起雌配子以及雄配子的败育,因此每年需要杂交(母系和保持系之间)和自交(双杂合子)以更新母本种子储备。这在时间和成本方面是缺点。Endo建议的另一个缺点源自这一事实,即所述雄性不育母本含有携带源自斯卑尔托山羊草(Ae.Speltoides)的Gc1等位基因的异源染色体节。该节亦可能携带对所述雌株特性有负面影响的等位基因,增加了杂种种子生产的成本,或者甚至影响杂种的产量。
鉴于普通小麦杂种生产的重要性,应注意对实验性杂种特性的不同报道表明最好的小麦杂种产量比主要的最好栽培品种提高多达30%(Wilson和Driscoll,1983)。另外,众所周知与常规栽培品种相比,许多杂种表现出品质改良和对环境和生物学压力的耐受性更大。一般假定,杂交小麦超出纯化等位基因栽培品种的相对较小的优势是连续选择纯合种质高性能的结果。因此预期选择杂合性种质的改进性能可能导致在短时间内显著增加产量。
由于杂种基于目前的栽培品种,这些栽培品种正通过常规育种方法持续地改进,因此能将每个新开发或新公布的栽培品种转化成为潜在的母系是有利的。不仅调查新公布的植物材料的结合能力是必要的,而且更重要的是当杂种与新公布的纯系之间保持显著差距时才保持其市场的商业化生产新杂种。
定义
在说明书和权利要求中使用了以下术语和缩写:
普通小麦=面包小麦Triticum aesticm var.aestivum,是具有三个基因组ABD的异源六倍体物种(2n=42)。
硬粒小麦=制通心粉小麦,Triticum turgidum var.durum,是具有二个基因组AB的异源四倍体物种(2n=28)。
一粒小麦=包含野生(var.boeoticum)和栽培(var.一粒)分类群的二倍体物种(2n=14),与硬粒小麦和普通小麦的A基因组二倍体供体紧密相关,具有染色体4Am与硬粒小麦和普通小麦的染色体4A以及其它第4组染色体部分同源(部分地同源)的基因组Am。
高大山羊草(Aegilops longissima)和Aegilops searsii=二倍体物种(2n=14),分别与具有基因组Sl和Ss的硬粒小麦和普通小麦的B基因组供体紧密相关,其染色体与小麦的染色体部分同源(部分地同源)。
长穗鹅冠草(Agropyron elongatum)=包括二倍体(2n=14)、四倍体(2n=28)和十倍体(2n=70)分类群的复合物种,与硬粒小麦和普通小麦相关,具有其染色体与硬粒小麦和普通小麦染色体部分同源的E基因组(多倍体是同源多倍体)。
4BS=普通小麦和硬粒小麦染色体4B(原4A)的短臂。
6BL=普通小麦和硬粒小麦染色体6B的长臂。
4AmS和4AmL=分别为一粒小麦染色体4Am的短臂和长臂。
4EL=长穗鹅冠草染色体4E的长臂。
4SsS=Aegilops searsii染色体4Ss的短臂。
4S1S=高大山羊草染色体4Sl的短臂。
6SsL=Aegilops searsii染色体4Ss的长臂。
6SlL=高大山羊草染色体6Sl的长臂。
Ms=负责小麦雄性能育性的显性等位基因。
Ms-B1=位于4BS上的硬粒小麦和普通小麦雄性能育性的显性等位基因。
ms=赋予雄性不育的Ms的隐性突变等位基因。
ms-B1=当以纯合状态存在时赋予硬粒小麦和普通小麦雄性不育的Ms-B1的隐性突变体等位基因。
ms-B1-a=ms1a,它是‘Pugsley’突变体的ms-B1等位基因。
ms-B1-b=ms1b,它是‘Probus’突变体的ms-B1等位基因。
ms-B1-c=ms1c,它是‘Cornerstone’突变体的ms-B1等位基因。
Ms-Ss1=位于4SsS上的雄性能育性的显性等位基因,与Ms-B1近同源等位。
Ms-Sl1=位于4SlS上的雄性能育性的显性等位基因,与Ms-B1近同源等位。
Ms-Am1=位于4AmS上的雄性能育性的显性等位基因,与Ms-B1近同源等位。
Ki-B1=普通小麦6BL上的显性雄配子杀伤等位基因,诱导杀伤携带ki-B1-a或ki-Sl1-a的花粉。
ki-B1-a=普通小麦6BL上的隐性雄配子杀伤等位基因;携带它的花粉在具有Ki-B1的植株中被杀死。
ki-B1-n=普通小麦6BL上的中性雄配子杀伤等位基因;携带它的花粉在具有Ki-B1的植株中不会被杀死,它亦不诱导杀伤携带ki-B1-a或ki-Sl1-a的花粉。
ki-Sl1-a=高大山羊草6SlL上的雄配子杀伤等位基因;携带它的花粉在具有Ki-B1的植株中被杀伤。
Rht1和Rht2=分别位于染色体臂4BS和4DS上的隐性或部分隐性等位基因,诱导植株高度降低。
rht=决定正常植株高度(高植株)的显性或半显性等位基因。
rht-Ss1=位于4Ss上决定正常植株高度(高植株)的显性或半显性等位基因。
rht-Sl1=位于4SsS上决定正常植株高度(高植株)的显性或半显性等位基因。
rht-Am1=位于4AmS上决定正常植株高度(高植株)的显性或半显性等位基因。
Su-B1=六倍体和四倍体小麦6BL上的等位基因,它赋予对除草剂绿麦隆[3-(3-氯-对-甲苯基)-1,1-二甲脲]和其它苯脲除草剂{例如,甲氧隆[3-(3-氯-4-甲氧基苯基(metoxyphenylyl))-1,1-二甲脲])的抗性。
su-B1=在六倍体和四倍体小麦6BL上发现的Su-B1的隐性等位基因;携带它的植株对绿麦隆敏感。
su-Sl1=在高大山羊草6SlL上发现的与Su-B1近同源等位的隐性等位基因;携带它的植株对绿麦隆敏感。
Su-Ss1=在Aegilops searsii 6SsL上发现的与Su-B1近同源等位的显性等位基因,赋予对绿麦隆抗性。
Ba=决定3n胚乳糊粉层蓝色的显性等位基因。
Ba-Am1=4AmL上蓝色糊粉颜色的显性等位基因。
Ba-E1=4EL上蓝色糊粉颜色的显性等位基因。
Ph1=普通小麦和硬粒小麦染色体5B长臂上抑制部分同源染色体配对的显性等位基因。
ph1b=允许部分同源配对的隐性突变等位基因。
cv.=栽培品种。
EC=由源自二条或多条不同的异源染色体的节组成的工程化染色体,其携带Ms等位基因、ki等位基因和选择标记,通过该标记可以选择具有该染色体的植株。
EC-H=携带做为选择标记的rht等位基因(植株高度)的工程化染色体。
EC-H1=由4SsS/6SlL组成、携带Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a的工程化染色体(图2a)。
EC-HR=携带做为选择标记的rht等位基因(植株高度)和Su等位基因(对除草剂绿麦隆抗性)的工程化染色体。
EC-HR1=由4SsS/6SlL组成、携带MS-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a的工程化染色体(图2b)。
REC=由源自二条或多条不同的异源染色体的节和天然染色体臂6BL的远端节组成的重组工程化染色体,其携带Ms等位基因、ki-Sl1-a等位基因和选择标记,通过该标记可以选择具有该染色体的植株。
REC-H=携带做为选择标记的rht等位基因的重组工程化染色体。
REC-H1=由4SsS/6SlL/6BL组成、携带Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a的重组工程化染色体(图2c)。
REC-HR=携带做为选择标记的rht等位基因和Su等位基因的重组工程化染色体。
REC-HR1=由4SsS/6SlL/6BL组成、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a的重组工程化染色体(图2d)。
IEC=由源自二条或多条不同的异源染色体的节组成的改进工程化染色体,除携带Ms等位基因、ki等位基因和选择标记等位基因之外,还携带种子标记,通过该标记可以从不具有该染色体的种子分离具有该染色体的种子。
IEC-HC=携带做为选择标记的rht(植株高度)和Ba(种子颜色)的改进工程化染色体。
IEC-HC1=由4SsS/4EL/6SlL组成、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a的改进工程化染色体(图3a)。
IEC-HC2=由4SsS/4AmL/6SlL组成、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的改进工程化染色体(图4a)。
IEC-HC3=由4AmS-4AmL/6SlL组成、携带Ms-4m1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的改进工程化染色体(图5a)。
IREC=由源自二条或多条不同的异源染色体的节和天然染色体臂6BL的远端节组成的改进重组工程化染色体,除携带Ms等位基因、ki等位基因和选择标记等位基因之外,还携带种子标记,通过该标记可以从不具有该染色体的种子分离具有该染色体的种子。
IREC-HC=携带做为选择标记的rht和Ba的改进重组工程化染色体。
IREC-HC1=由4SsS/4EL/6SlL/6BL组成、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a的改进重组工程化染色体(图3b)。
IREC-HC2=由4SsS/4AmL/6SlL/6BL组成、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的改进重组工程化染色体(图4b)。
IREC-HC3=由4AmS-4AmL/6SlL/6BL组成、携带Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的改进重组工程化染色体(图5b)。
保持系=与雄性不育母系等基因但含有一条附加的EC类型的工程化染色体的雄性可育系。
重组保持系=与雄性不育母系等基因、但染色体6B是单体并且含有做为单体置换的REC类型的一条工程化染色体的雄性可育系。
改进保持系=与雄性不育母系等基因但含有一条附加的IEC类型工程化染色体的雄性可育系。
改进重组保持系=与雄性不育母系等基因、但染色体6B是单体并且含有做为单体置换的IREC类型的一条工程化染色体的雄性可育系。
发明概述
为克服先有技术的上述缺点,本发明的目的是提供保持普通小麦或硬粒小麦栽培品种基因性雄性不育母本系的方法,该方法提供稳定保持所述雄性不育母本系的简单方法。
本发明的再一目的是提供用于上述方法的保持系,该保持系容易、快速和稳定地繁殖。
本发明的又一目的是提供产生所述保持系的方法。
本发明的另一目的是提供将任何所需普通小麦或硬粒小麦栽培品种转化成为雄性不育母系和成为保持系的新方法。
本发明使得普通小麦和硬粒小麦杂种的商业生产成为可能。在一个方面,本发明提供保持隐性雄性不育突变(ms)等位基因纯合和显性雄配子杀伤(Ki)等位基因纯合的雄性不育母本系(A系)的新方法。保持系(B系)(图1)与所述母系等基因,并且还有一条携带与隐性雄配子杀伤等位基因(ki)连锁的显性雄性能育性等位基因(Ms)和至少一个选择标记等位基因的异源工程化染色体。含有所述工程化染色体(Ms和ki等位基因)的保持系花粉粒被杀伤。几种类型的所述工程化染色体携带rht(影响植株高度)做为选择标记,其它的则都携带rht和Su1(绿麦隆抗性)等位基因做为二个选择标记,每个臂携带一个,而再有些类型携带rht和Ba(诱导蓝色种子颜色)做为二个选择标记,每个臂携带一个。
因此,按照本发明已开发了一个简单系统,通过该系统保持雄性不育母本系(A系),方法是或者通过用雄性可育保持系(B系)对该母本系授粉,产生的所有子代都是雄性不育雌植株(图1a),或者最好根据不同的着色,从保持系的自交子代分选出那些将发育成为雄性不育母系的种子与那些将发育成为雄性可育保持系的种子(图1b)。类似地,通过自花授粉可以容易地保持该保持系,产生混合种子,其中约20%携带该工程化染色体并因此是雄性可育的,而约80%缺乏该染色体并因此是雄性不育的。在那些仅携带rht等位基因做为选择标记的保持系中,可以首先收获含有该工程化染色体的较高的植株。该选择性收获便于在包括雄性不育的自交保持系的子代中每年保持恒定比例的约20%雄性可育保持系植株。在那些携带rht和Su1等位基因做为选择标记的保持系中,可以用除草剂绿麦隆杀死缺乏该工程化染色体的植株。这确保了每年在播种自交保持系的子代的小区中仅生长雄性可育保持系植株。另一方面,在携带Ba等位基因做为选择标记的改进保持系中,用种子清选机,可以从红/白色种子分离蓝色种子,蓝色种子生长时将发育成为雄性可育植株,红/白色种子生长时将发育成为雄性不育植株。这便于每年种植100%雄性可育植株的保持系。
按照本发明的一个方面,工程化染色体EC-H和EC-HR是源自二条异源染色体的易位染色体。它们的一条臂携带Ms和rht等位基因,另一条臂在EC-H中携带ki等位基因、在EC-HR中携带Su-1和ki等位基因。由于所述异源臂通常不与它们的小麦部分同源染色体配对,EC-H上的三个等位基因和EC-HR上的四个等位基因是连锁的,互相之间不分离。EC-H(图2a)或EC-HR(图2b)以单份加入保持系,即该保持系是单体附加系。该保持系的有功能的花粉粒不含该工程化染色体。因此,雄性不育母系与该保持系之间杂交产生的所有子代都是雄性不育的,而源自该保持系自花授粉的子代的基因型是混合的,其中约20%是雄性可育的,约80%是雄性不育的。
普通小麦中EC的构建是基于本发明人的新发现,即高大山羊草6号染色体长臂(6SlL)上的隐性雄配子杀伤ki-Sl1-a等位基因在以单份存在于携带普通小麦染色体6BL上的显性雄配子杀伤Ki-B1等位基因的植株中(如在单体异源附加系中)时,不通过花粉粒(即,通过雄配子)传递。因此,构建携带Ae.searsii的雄性能育性Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因以及高大山羊草的雄配子杀伤ki-Sl1-a等位基因的EC-H1是可行的,通过在附加4Ss和6Sl双单体的普通小麦中发生的染色体4Ss和6Sl的同时着丝粒错分裂、然后4SsS和6SlL着丝粒融合而产生它(图7a)。所述EC-H1具有Ae.searsii(4SsS)4号染色体短臂和高大山羊草(6SlL)6号染色体长臂,Ae.searsii(4SsS)4号染色体短臂携带已证实赋予ms-B1-c纯合的六倍体基因型雄性能育性的Ms-Ss1等位基因和使得植株较高的rht-Ss1等位基因,高大山羊草(6SlL)6号染色体长臂携带使得携带其的花粉粒在存在Ki-B1等位基因时易受杀伤的隐性ki-Sl1-a等位基因。因为在异源工程化染色体和其小麦部分同源臂之间通常不发生配对和重组,Ms-Sus1、rht-Ss1和ki-Sl1-a等位基因是连锁的,因此亦防止了通过花粉粒传递Ms-Ss1等位基因。这使得可以生产6BL上的Ki-B1等位基因纯合、位于染色体4B短臂上的已知隐性雄性不育突变等位基因之一(例如ms-B1-c)纯合的保持系,但其雄性不育不表达,即由于存在携带Ms-Ss1等位基因的工程化染色体,该保持系为雄性可育。用该保持系对雄性不育母系授粉仅产生雄性不育的植株,而该保持系自交产生约20%雄性可育和80%雄性不育植株。
本发明的另一方面是增加自交保持系子代中保持系雄性可育基因型的比例(从20%增至50%)。虽然20%的比例足以增加保持系自己的种子,它使得母系种子的生产成本高,因为给定面积的母本需要较大面积的保持系以确保由该保持系经济有效地授精。因此增加保持系自交子代中保持系的比例有极大的优越性。通过修饰EC-H即构建重组工程化染色体(本文命名为REC-H)可以提高至约50%。以下述方式(图7b)在普通小麦中产生命名为REC-H1的含有源自Ae.searsii的Ms等位基因的REC-H(图2b):将小麦染色体臂6BL的远端节易位至6SlL臂,其中易位断点位于ki-Sl1-a等位基因远端,使得它能与6BL染色体配对。易位产生于缺乏Ph1的双单体条件(即在基因型ph1bph1b中)的部分同源配对,EC-H1(4SsS/6SlL)和6B可以配对并重组,导致产生REC-H1,即4SsS/6SlL/6BL。在Ph1纯合、正常6B单体并具有单份REC-H1的系中,这二条染色体几乎在每个性母细胞中在同源区(6BL的远端区)配对并分离至相对的极,导致REC-H1包含于一半的配子中。
再则,本发明的另一方面是在含有EC-H1或REC-H1的自交保持系子代中分别保持以下比例恒定:1份雄性可育:4份雄性不育或1份雄性可育:1份雄性不育。在通过自花授粉繁殖所述保持系时,自交子代中雄性不育植株的比例随世代增加,因为雄性不育植株不仅在雄性可育子代中得到,而且由混合生长的雄性可育姊妹株授粉的雄性不育植株的所有子代都是雄性不育的。因此,混合中的雄性可育植株(保持系)的比例降低至花粉团不足以在所有的母系生产小区中对所有的雄性不育雌花授粉的程度。因此很重要的是保持每代中雄性不育与雄性可育植株的原始比例恒定。这可以通过在每代中从保持系自交子代中对雄性不育植株选株达到。该步骤工作量很大,增加了母本种子的生产成本。因此最好利用rht等位基因在EC-H1或REC-H1的4Ss短臂上的存在。该等位基因永久性地与Ms-Ss1等位基因连锁,它影响植株高度,其方式是携带它的植株(即保持系)比缺乏它的植株(雄性不育雌植株)高(6-8cm)。这个高度差异便于在此混合植株中选择性收获保持系。
保持自交保持系子代中雄性可育与雄性不育植株原始比例恒定的另一优选方法是通过进一步改进EC或REC来达到,其基于将再一选择标记例如除草剂抗性、抗病性或蓝色种子颜色加入所述保持系的这二条工程化染色体中的任一条。将绿麦隆抗性等位基因Su-Ss1加入EC中(使之为EC-HR)(图2b)或REC中(使之为REC-HR)(图2d)便于用该除草剂在每代中选择性地仅杀死雄性不育植株。通过以下步骤产生EC-HR(图8a):用携带Su-Ss1的Ae searsii品系授粉ms-B1、su-B1和Ki-B1纯合并且携带EC-H的栽培品种中国春(CS)保持系植株,将F1做为雌株与CS回交。在产生的回交子代中选择除草剂抗性植株,然后自交产生BC1F2子代。通过染色体计数(选择2n=43)和通过绿麦隆抗性从BC1F2选择保持系植株。类似地,将抗病性等位基因加入EC或REC,使得可以用病原体感染田地。仅雄性不育植株敏感并产生较少的种子,这些种子皱缩并被联合收割机吹走。将长穗鹅冠草或一粒小麦或任何其它禾本科物种的蓝糊粉(Ba)等位基因做为选择标记加入EC或REC,构成了本发明的优选实施方案,以产生改进工程化染色体(IEC)或改进重组工程化染色体(IREC),所述染色体可能含有一粒小麦染色体4Am的Ms-Am1等位基因、长穗鹅冠草染色体4E的Ba-E1等位基因和高大山羊草染色体6Sl的ki-B1-a等位基因,由此便于生长100%雄性可育植株的保持系。所述Ba等位基因决定3n胚乳糊粉层中的颜色(由于产生花色素苷)。Ba等位基因的表达为剂量依赖型:由雌配子贡献给3n胚乳的二份Ba等位基因决定蓝色种子颜色,该颜色与小麦种子的典型红色/白色有区别。所述种子颜色标记永久性地与Ms等位基因连锁,并且因此区分生长时发育成为雄性可育植株(保持系)的蓝色种子和生长时发育成为雄性不育植株的红色/白色种子。可以通过分选设备机械分离这二种类型的种子。
EC和REC中的上述修饰命名为IEC-HC(图3a、4a和5a)IREC-HC(图3b、4b和5b),并以以下方式产生:以二个步骤产生携带Ae.searsii的Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因、长穗鹅冠草的Ba-E1等位基因和高大山羊草的ki-Sl1-a等位基因的IEC-HC1(图9a-d):首先,由于在附加4Ss和4EL双单体的普通小麦发生染色体4Ss和4EL的同时着丝粒错分裂,然后4SsS和4EL着丝粒融合,产生易位染色体4SsS/4EL;第二步涉及用热中子辐射4SsS/4EL和4SsS/6SlL双单体附加的种子,并在子代中选择所需易位4SsS/4EL/6SlL。
通过以下步骤产生携带Ae.searsii的Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因、一粒小麦Ba-Am1等位基因和高大山羊草的Ki-Sl1-a等位基因的IEC-HC2(图10):首先,由于在附加4Ss和4Am双单体(或在4Ss单体附加和4BS/4AmL单体易位置换)的普通小麦中发生染色体4Ss和4Am的同时着丝粒错分裂,然后4SsS和4AmL着丝粒融合,产生易位染色体4SsS/4AmL;第二步涉及辐射4SsS/4AmL和4SsS/6SlL双单体附加,并在子代中选择所需易位4SsS/4AmL/6SlL。
通过辐射在附加4Am和6Sl双单体的普通小麦,产生携带一粒小麦Ms-Am1、rht-Am1和Ba-Am1等位基因和大山羊草的ki-Sl1-a的IEC-HC3,并在子代中选择所需易位(图11)。IEC-HC3具有一粒小麦4号染色体的短臂和长臂的近端区(携带已证实赋予ms-B1-c纯合的六倍体基因型雄性能育性的Ms-Am1等位基因、对高植株负责的rht-Am1等位基因和决定糊粉蓝色着色的Ba-Am1等位基因)和携带隐性ki-Sl1-a等位基因的高大山羊草(6SlL)的6号染色体长臂的远端部分。
产生各种REC和IREC(图2b、2d、3b、4b和5b)以增加自交保持系自交子代中保持系雄性可育基因型的比例(从20%增至50%),并且防止由于所述工程化染色体着丝粒错分裂产生的偶然性着丝粒断裂。通过诱导完成产生这些重组工程化染色体,即借助诱导的部分同源配对诱导EC-H1、EC-HR1、IEC-HC1、IEC-HC2或IEC-HC3中的任何一个与6B之间的重组,其中6BL的远端节易位至6SlL臂(断点距ki-Sl1-a等位基因远端)(图7b和12)。该易位使得REC和IREC可以在几乎每个性母细胞中与Ph1纯合的、6B和REC或IREC之一为单体的普通小麦品系中的6BL配对,并分离至相对的极,导致在一半配子中包含REC或IREC。
由于着丝粒错分裂造成的所述工程化染色体的不合需要的着丝粒断裂,在EC-H1中将Ms-Ss1和rht-Ss1与ki-Ss1-a分离,在EC-HR1中将Ms-Ss1和rht-Ss1与Su-Ss1和ki-Sl1-a分离,促进Ms-Ss1等位基因通过雄配子传递。这在用所述保持系对雄性不育母系授粉时产生一些雄性可育后代。这些携带rht等位基因的植株比雄性不育植株高,可以被选株。另外,因为着丝粒错分裂主要在未配对染色体(单价体)中发生,所以使用在几乎每个性母细胞中与天然6B配对的REC或IREC防止了这种不合需要的着丝粒断裂。
本发明再提供普通小麦或硬粒小麦的雄性可育保持系,以保持用于生产杂交小麦的雄性不育母本系,以及提供其生产方法。
本发明的再一方面涉及从携带或者IEC-HC(图15a)或者IREC-HC(图15b)的自交保持系子代中直接选择雄性不育母本的种子。具有IEC-HC的保持系产生的种子约80%不是蓝色,缺乏该IEC-HC并因此生长时发育成为雄性不育植株,约20%的种子是蓝色,携带该IEC-HC并在生长时发育成为雄性可育植株。通过颜色分选设备分选所述保持系的自交种子,将从保持系的那些种子(蓝色)分离母本种子(红色/白色)。通过该优选的方法,直接从所述保持系自交得到雄性不育母系的种子;不需要交替种植保持系和母系,显著降低了母系生产成本。
在另一方面,本发明提供将普通小麦或硬粒小麦的任何所需栽培品种转化成为雄性不育母本系和所述母系的雄性可育保持系的方法。
在再一方面,本发明涉及普通小麦或硬粒小麦杂种植物系的生产方法,其中将雄性不育母本系与同一物种的在本质上对Ms-B1等位基因纯合的雄性可育的任何栽培品种(R系)杂交,产生均为可育的和杂合性的F1杂种子代(Ms-B1ms-B1)。
附图简要说明
图1a-1c描绘保持雄性不育母本系(A系)的一般性图解,即通过或者(1a)用保持系(B系)授粉;(1b)在自交保持系分离子代中选择它;或者(1c)将1a和1b中描述的方法结合;并用雄性系(R系)对A系授粉产生杂种种子(F1)。
图2a-2d描绘工程化染色体EC-H1(2a)、EC-HR1(2b)和重组工程化染色体REC-H1(2c)和REC-HR1(2d)的图解图。
图3a-3b描绘改进工程化染色体IEC-HC1(3a)和改进重组工程化染色体IREC-HC1(3b)的图解图。
图4a-4b描绘改进工程化染色体IEC-HC2(4a)和改进重组工程化染色体IREC-HC2(4b)的图解图。
图5a-5b描绘改进工程化染色体IEC-HC3(5a)和改进重组工程化染色体IREC-HC3(5b)的图解图。
图6描绘将Cornerstone突变体隐性雄性不育性等位基因ms-B1-c转移入普通小麦栽培品种中国春(CS)4Ss单体附加系的图解程序。
图7a-7b描绘在普通小麦栽培品种中国春中产生具有携带Ae.searsii 4SsS的Ms-Ss1和rht-Ss1和高大山羊草6SlL的ki-Sl1-a的工程化染色体EC-H1(7a)和重组工程化染色体REC-H1(7b)的保持系以及雄性不育母系的图解程序。将EC-H1做为二体6B植株中单体附加而制备,EC-H1因此对Ki-Bl亦是纯合的;将REC-H1做为单体6B植株中单体置换而制备,因此REC-H1对Ki-B1是半合子的。
图8a-8b描绘产生具有携带Ae.searsii 4Ss的Ms-Ss1和rht-Ss1、Ae.searsii 6SsL的Su-Ss1和高大山羊草6SlL的ki-Sl1-a的工程化染色体EC-HR1(8a)和重组工程化染色体REC-HR1(8b)的保持系的图解程序。将EC-HR1做为二体6B植株中单体附加而制备,EC-H1因此对Ki-B1亦是纯合的;将REC-HR1做为二体6B植株中单体置换而制备,因此REC-HR1对Ki-B1是半合子的。
图9a-9d描绘在普通小麦栽培品种中国春中产生具有携带Ae.searsii 4SsS的Ms-Ss1和rht-Ss1、长穗鹅冠草4EL的Ba-E1和高大山羊草6SlL的ki-S11-a的改进工程化染色体IEC-HC1的保持系以及雄性不育母系的三个图解程序。在EC-H1和4E染色体双单体附加中诱导双断裂和重接(9a);在EC-H1与已经辐射易位的染色体4SsS/4EL之间诱导单断裂和重接(9b);在EC-H1与通过错分裂和着丝粒融合得到的易位染色体4SsS/4EL之间诱导单断裂和重接(9c),图9d显示了图9a、图9b和图9c的相互关系。
图10描绘在普通小麦栽培品种中国春中产生具有携带Ae.searsii 4SsS的Ms-Ss1和rht-Ss1、一粒小麦4AmL的Ba-Am1和高大山羊草6SlL的ki-Sl1-a的改进工程化染色体IEC-HC2的保持系以及雄性不育母系的图解程序。
图11描绘在普通小麦栽培品种中国春中产生具有携带一粒小麦4AmS的Ms-Am1和rht-Am1、一粒小麦4AmL的Ba-Am1和高大山羊草6SlL的ki-Sl1-a的改进工程化染色体IEC-HC3的保持系以及雄性不育母系的图解程序。
图12描绘在普通小麦栽培品种中国春中产生具有携带Ae.searsii 4SsS的Ms-Ss1和rht-Ss1和高大山羊草6SlL的ki-Sl1-a的改进重组工程化染色体IREC-HC1的保持系以及雄性不育母系的图解程序。
图13a-13b描绘基于基因性雄性不育的普通小麦和硬粒小麦的按照图1a的图解,其中本文将A系命名为cv.“1”,其对隐性雄性不育等位基因ms-B1-c和显性雄配子杀伤等位基因Ki-B1是纯合的;(13a):同一cv.“1”的B系与A系等基因,但是还具有携带4SsS上显性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和显性rht等位基因和6SlL上隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1的工程化染色体EC-H1(4SsS/6SlL),本文将R系命名为cv.“2”,其对野生型雄性能育性等位基因Ms-B1和隐性雄配子杀伤等位基因ki-B1-a或ki-B1-n之一纯合;(13b):与(13a)相同,但是B系具有重组工程化染色体REC-H1而不是EC-H1,并只有单份携带Ki-B1的染色体6B。
图14a-14b描绘基于基因性雄性不育的普通小麦和硬粒小麦的按照图1a的图解,其中本文将A系命名为cv.“1”,其对隐性雄性不育等位基因ms-B1-c、隐性除草剂敏感性等位基因su-B1和显性雄配子杀伤等位基因Ki-B1纯合;(14a):同一cv.“1”的B系与A系等基因,但是还具有携带4SsS上显性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和显性rht等位基因和6SlL上显性Su-Ss1等位基因和隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1的工程化染色体EC-HR1(4SsS/6SlL),本文将R系命名为cv.“2”,其对野生型雄性能育性等位基因Ms-B1和隐性雄配子杀伤等位基因ki-B1-a或ki-B1-n之一纯合;(14b):与(14a)相同,但是B系具有重组工程化染色体REC-HR1而不是EC-HR1,并只有单份携带Ki-B1的染色体6B。
图15a-15b描绘基于基因性雄性不育的普通小麦和硬粒小麦的按照图1b和1c的替代性图解,其中本文将A系命名为cv.“1”,其对隐性雄性不育等位基因ms-B1-c和显性雄配子杀伤等位基因Ki-B1纯合;(15a):同一cv.“1”的B系与A系等基因,但是还具有携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1、ki-Sl1-a等位基因的4SsS/4EL/6SlL的改进工程化染色体IEC-HC1,本文将R系命名为cv.“2”,其对野生型雄性能育性等位基因Ms-B1和对隐性雄配子杀伤等位基因ki-B1-a或ki-B1-n之一纯合;(15b):与(15a)相同,但是B系具有改进重组工程化染色体IREC-HC1而不是IEC-HC1,并只有单份携带Ki-B1的染色体6B。
图16a-16b描绘图解程序,即将目的栽培品种(cv.“新”)转化成为携带EC-H的雄性不育系和保持系(16a);和将目的栽培品种(cv.“新”)转化成为携带REC-H的雄性不育系和重组保持系(16b)。
图17a-17b描绘图解程序,即将目的栽培品种(cv.“新”)转化成为携带EC-HR的雄性不育系和保持系(17a);和将目的栽培品种(cv.“新”)转化成为携带REC-HR的雄性不育系和重组保持系(17b)。
图18a-18b描绘图解程序,即将目的栽培品种(cv.“新”)转化成为携带IEC-HC的雄性不育系和改进保持系(18a);和将目的栽培品种(cv.“新”)转化成为携带IREC-HC的雄性不育系和改进重组保持系(18b)。发明详述
按照本发明已经开发了图1a、13a和14a中描绘的普通小麦或硬粒小麦的简单系统,通过该系统,通过用保持系(B系)授粉保持雄性不育母本系(A系),所得到的所有子代均为雄性不育雌株。类似地,通过自花授粉容易地保持保持系自身,产生混合种子,其中约20%在生长时发育成为与保持系相同并携带工程化染色体的雄性可育植株,约80%在生长时由于缺乏Ms-Ss1等位基因发育成为雄性不育植株。利用鉴定保持系特征的选择标记,在自交保持系的每代的子代中保持80%雄性不育对20%雄性可育植株的比例。
当所述选择标记是诸如蓝糊粉的颜色选择标记或另一种子特性时,本发明提供同时保持雄性不育母本系(A系)和雄性可育保持系(B系)的替代改进和优选的系统(图1b、c和14a)。通过保持系自花授粉得到所述二系的种子:80%的种子是红/白色,当生长时发育成为雄性不育植株(A系),20%的种子为蓝色,当生长时,发育成为雄性可育植株(B系)。使用颜色分选装置分选出自交保持系的种子分离了这二种类型的种子。通过该优选的方法,直接从保持系自交得到雄性不育母系种子;不需要交替种植保持系和母系,母本种子的生产成本显著降低。而且,保持系小区中活花粉的数量没有降低,因为保持系小区中的所有植株都是雄性可育的。
对于杂交小麦生产,将雄性不育母本系与天然为Ms-B1等位基因纯合的雄性能育性的任何普通小麦或硬粒小麦栽培品种(R系)杂交,产生均为杂合Ms-B1ms-B1并因此为雄性可育的F1杂种后代。
因此,在一个方面,本发明提供保持普通小麦或硬粒小麦雄性不育母本系以用于杂交小麦生产的方法(图13a、14a和15a),所述方法包括:
(a)用父本杂交母本,所述母本是雄性不育植株,对染色体4B短臂(4BS)上隐性ms-B1雄性不育等位基因的任何一个纯合并对染色体6B长臂(6BL)上的显性雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合,所述父本是保持系并与母本等基因,且对母本的相同ms-B1和Ki-B1等位基因纯合,并且具有选自以下的一条附加的异源工程化染色体:(ⅰ)本文称为EC的工程化染色体,由源自二条或多条不同的异源染色体的节组成,携带显性雄性能育性等位基因Ms、对6BL上的天然雄配子杀伤等位基因的杀伤作用敏感的隐性等位基因ki以及一个或二个通过其可以选择具有该染色体的植株的选择标记;和(ⅱ)本文称为IEC的改进工程化染色体,由源自二条或多条不同的异源染色体的节组成,除携带Ms、ki和选择标记等位基因之外,还携带种子标记,通过该种子标记可以将具有该染色体的种子与不具有该染色体的种子分离;和
(b)从(a)的杂交收获子代种子,所有的种子对所述雄性不育和雄配子杀伤等位基因均为纯合,并且缺乏所述工程化染色体EC或IEC,所述种子当生长时发育成为所述雄性不育母系。
本发明再提供保持普通小麦或硬粒小麦雄性不育母本系以用于杂交小麦生产的替代方法(图13b、14b和15b),所述方法包括:
(a)用父本杂交母本,所述母本是对染色体4B短臂(4BS)上隐性ms-B1雄性不育等位基因的任何一个纯合并对染色体6B长臂(6BL)上的显性雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合的雄性不育植株,所述父本是保持系并与母本等基因,且对母本的同一ms-B1等位基因纯合,但对携带Ki-B1等位基因的染色体6B和选自以下的重组工程化染色体是单体的:(ⅰ)本文称为REC的重组工程化染色体,由源自二条或多条不同的异源染色体的节和天然染色体臂6BL的远端节组成,携带Ms等位基因、ki等位基因和一个或二个通过其可以选择具有该染色体的植株的选择标记;和(ⅱ)本文称为IREC的改进工程化染色体,由源自二条或多条不同的异源染色体的节和天然染色体臂6BL的远端节组成,除携带Ms、ki和选择标记等位基因之外,还携带种子标记,通过该种子标记可以将具有该染色体的种子从不具有该染色体的种子分离;和
(b)从(a)的杂交收获子代种子,所有的种子均对所述雄性不育和雄配子杀伤等位基因纯合,并且缺乏所述工程化染色体REC或IREC,所述种子当生长时发育成为雄性不育母系。
本发明亦提供保持普通小麦或硬粒小麦雄性不育母本系以用于小麦F1杂种生产的另一替代改进方法(图15a),所述方法包含:
(a)将改进保持系自交,所述保持系与母本等基因,即对任何一个隐性ms-B1雄性不育等位基因和显性雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合,并且具有本文命名为IEC-HC一条附加的改进工程化染色体(图3a-5a):除携带Ms、rht和ki-Sl1-a等位基因之外,还携带决定蓝种子颜色的种子选择标记Ba等位基因,因此所述改进工程化染色体包含或者携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a的IEC-HC1(4SsS/4EL/6SlL)、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的IEC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL)或者携带Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的IEC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL);和
(b)从所述(a)的自交植株收获子代种子,所有的种子均对所述雄性不育和雄配子杀伤等位基因纯合,80%的种子缺乏IEC-HC并因此为红/白色,可以通过分选装置从含有所述改进工程化染色体的蓝色种子分离,所述红/白色种子当生长时发育成为雄性不育母系。
本发明亦提供保持普通小麦或硬粒小麦雄性不育母本系以用于小麦F1杂种生产的另一替代改进方法(图15b),所述方法包含:
(a)将改进重组保持系自交,所述保持系与母本等基因,即对任何一个隐性ms-B1雄性不育等位基因纯合,但对携带Ki-B1等位基因的染色体6B和对IREC-HC类型的改进重组工程化染色体为单体(图3b、4b、5b),该IREC-HC再包含位于ki-Sl1-a远端的染色体6B长臂(6BL)远端区,该区规则地与天然6BL的其同源区配对,所述IREC-HC除携带Ms、rht和ki-Sl1-a之外,还携带决定蓝种子颜色的种子选择标记Ba等位基因,因此所述改进重组工程化染色体包含或者携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a的IREC-HC1(4SsS/4EL/6SlL/6BL)、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的IREC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL/6BL)或者携带Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的IREC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL/6BL);
(b)从所述(a)的自交植株收获子代种子,所有的种子对所述雄性不育等位基因纯合,50%的种子对染色体6B为二体,且缺乏IREC-HC并因此为红/白色,当生长时发育成为雄性不育植株,剩余50%对染色体6B为单体、对IREC-HC为单体并因此为蓝色,当生长时发育成为雄性可育植株,将(a)的所述子代种子再种植一个世代,其中雄性可育植株将自交并对雄性不育植株授粉;和
(c)从(b)的植株收获子代种子,所有的种子对所述雄性不育等位基因纯合,约75%的种子对染色体6B为二体并且缺乏IREC-HC,因此为红/白色,可以通过分选装置从具有IREC-HC的蓝色种子分离,所述红/白色种子当生长时发育成为雄性不育母系。
任何雄性不育ms-B1等位基因都可以按照本发明使用,例如ms-B1-a、ms-B1-b和ms-B1-c等位基因或诱导雄性不育的该基因座的或者普通小麦或硬粒小麦另一基因座的任何其它等位基因。禾本科一物种的任何Ba等位基因都可以按照本发明使用,例如一粒小麦的Ba-Am1、长穗鹅冠草的Ba-E1、黑麦的Ba-R1和大麦的Ba-H1。任何影响种子特征的等位基因都可以按照本发明使用。禾本科一物种的任何rht等位基因都可以按照本发明使用,例如Ae.searsii的rht-Ss1、高大山羊草的rht-Sl1和一粒小麦的rht-Am1。禾本科一物种的任何除草剂抗性等位基因都可以按照本发明使用,例如Ae.searsii的Su-Ss1或高大山羊草的Su-Sl1。禾本科一物种的任何对Ki-B1或任何其它雄配子杀伤基因的杀伤效应敏感的ki等位基因都可以按照本发明使用。
另一方面,本发明提供普通小麦或硬粒小麦雄性可育保持系,以保持用于杂交小麦生产的雄性不育母本系,所述保持系与所述母本等基因,并对任何一个ms-B1雄性不育等位基因纯合、对母本的雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合,且具有携带Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a等位基因的一条附加的异源工程化染色体EC-H1(4SsS/6SlL)。因为保持系的雄性能育性等位基因不通过花粉粒传递,所以雄性不育母系与雄性可育保持系之间杂交的所有后代都与母本等基因,且为雄性不育。
本发明亦提供普通小麦或硬粒小麦雄性可育保持系以保持用于杂交小麦生产的雄性不育母本系,所述保持系与所述母本等基因并对任何一个ms-B1雄性不育等位基因纯合、对母本的su-B1绿麦隆敏感性等位基因和雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合,且具有携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-sl1-a等位基因的一条附加的异源工程化染色体EC-HR1(4SsS/6SlL)。因为保持系的雄性能育性等位基因不通过花粉粒传递,所以雄性不育母系与雄性可育保持系之间杂交的所有后代都与母本等基因且为雄性不育。
本发明再提供普通小麦或硬粒小麦替代重组雄性可育保持系以保持用于杂交小麦生产的雄性不育母本系,所述保持系与所述母系等基因并对任何一个ms-B1等位基因纯合、但对染色体6B为单体并因此对Ki-B1等位基因为半合子,而且具有一条附加的重组工程化染色体REC-H1(4SsS/6SlL/6BL),该REC-HC1再包含位于ki-Sl1-a等位基因远端的6BL远端区,该区规则地与天然6BL的其同源区配对。因此,REC将包含于50%的配子中。因为重组保持系的雄性能育性等位基因不通过花粉粒传递,雄性不育母系与重组雄性可育保持系之间杂交的所有后代都与母本等基因且为雄性不育。另一方面,自交重组保持系的50%子代将具有REC并因此为雄性可育。
本发明还提供普通小麦或硬粒小麦替代重组雄性可育保持系以保持用于杂交小麦生产的雄性不育母本系,所述保持系与所述母系等基因并对任何一个ms-B1和su-B1等位基因纯合、但对染色体6B为单体并因此对Ki-B1等位基因为半合子,而且具有一条附加的重组工程化染色体REC-HR1(4SsS/6SlL/6BL),该REC-HR1再包含位于ki-Sl1-a等位基因远端的6BL远端区,该区规则地与天然6BL的其同源区配对。因此,REC-HR1将包含于50%的配子中。因为重组保持系的雄性能育性等位基因不通过花粉粒传递,雄性不育母系与重组雄性可育保持系之间杂交的所有后代都与母本等基因且为雄性不育。另一方面,自交重组保持系的50%子代将具有REC-HR1并因此为雄性可育。
本发明亦提供普通小麦或硬粒小麦替代改进保持系以保持用于杂交小麦生产的雄性不育母本系,所述保持系与所述母本等基因并对任何一个ms-B1雄性不育等位基因纯合、对母本的雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合,且具有一条附加的改进异源工程化染色体IEC-HC,该染色体或者为IEC-HC1(4SsS/4EL/6SlL)、IEC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL)或者IEC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL),它们分别携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a,Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a以及Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a等位基因。任何选择标记都可以置换IEC-HC中的Ba等位基因。当选择标记是种子特征例如种子颜色时,将发育成为与母本等基因且雄性不育的植株的自交保持系的子代种子可以与那些将发育成为雄性可育保持系的种子分离。因此可以通过所述具有这种种子选择标记的改进保持系自交,保持雄性不育母本;自交改进保持系子代种子的80%为红/白色,当生长时将发育成为雄性不育母本植株,20%为蓝色,当生长时将发育成为雄性可育改进保持系植株。
本发明还提供普通小麦或硬粒小麦替代改进重组雄性可育保持系以保持用于杂交小麦生产的雄性不育母本系,所述保持系与所述母系等基因并对任何一个ms-B1等位基因纯合、但对染色体6B为单体并因此对Ki-B1等位基因为半合子,而且具有一条附加的改进重组工程化染色体IREC-HC,该染色体或者为IREC-HC1(4SsS/4EL/6SlL/6BL)、IREC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL/6BL)或者IREC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL/6BL),它们分别携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a;Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-S1-a;以及Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a等位基因,且都具有普通小麦6BL的远端节。任何选择标记都可以置换IREC-HC中的Ba等位基因。
在本发明的另一个方面,提供产生具有工程化染色体EC-H1的普通小麦或硬粒小麦雄性可育保持系的方法(图7a),所述方法包含:
(a)用源自普通小麦栽培品种中国春的雄性可育母本与父本杂交,所述母本对染色体臂4BS上显性Ms-B1雄性能育性等位基因和6BL上的显性Ki-B1雄配子杀伤等位基因纯合,并且具有在其长臂上携带隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a的附加异源染色体6Sl,所述父本与母本等基因但对隐性ms-B1-c雄性不育等位基因纯合、缺少染色体6Sl,而具有在其短臂上携带显性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的一条附加的异源染色体4Ss;
(b)从所述(a)的杂交收获子代种子,并种植所述种子,由此产生雄性可育F1植株,一部分为双单体附加,即它们具有二条异源染色体,即携带MS-Ss1和rht-Ss1的4Ss和携带ki-Sl1-a的6Sl;
(c)自交(b)的F1子代,收集其大量的子代种子并种植所述种子,由此产生F2植株,其一部分是异源易位工程化染色体单体附加,其25%对ms-B1-c雄性不育等位基因纯合并且是目的植株;
(d)通过染色体计数、C-带和使用DNA标记选择(c)的所述目的植株,并将其自交;
(e)收集(d)的自交子代种子并种植所述种子,由此产生F3植株,它们都对ms-B1-c雄性不育等位基因纯合,20%由于它们亦具有所述附加的工程化染色体EC-H1而为雄性可育,这些即是目的保持系植株;和
(f)通过染色体计数和使用DNA标记选择(e)的目的保持系植株。
本发明亦提供产生具有工程化染色体EC-HR1的普通小麦或硬粒小麦雄性可育保持系的方法(图8a),所述方法包含:
(a)用源自普通小麦栽培品种中国春中的雄性可育保持系的雄性可育母本与二倍体物种Aegilops searsii品系杂交,所述母本对隐性ms-B1雄性不育等位基因、隐性绿麦隆敏感等位基因su-B1和显性Ki-B1雄配子杀伤等位基因纯合,并且具有做为单体附加的工程化染色体EC-H1,该染色体在其短臂上携带显性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和半显性rht-Ss1等位基因、在其长臂上携带隐性绿麦隆敏感等位基因su-Sl1和隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a,所述二倍体物种Aegilops searsii品系在6SsL上具有显性绿麦隆抗性等位基因Su-Ss1并在4SsS上具有Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因;
(b)从所述(a)的杂交收集子代种子,并种植所述种子,由此产生F1植株,其中一部分具有2n=29染色体,即它们具有CS的一套染色体、工程化染色体EC-H1和Aegilops searsiii的一套染色体,基因型为ms-B1Ms-Ss1Ms-Ss1,ki-B1ki-Sl1-a和su-B1su-Sl1Su-Ss1;
(c)选择具有2n=29染色体的(b)的F1子代,将其与做为父本的cv.CS回交,收集其子代种子并种植所述种子,由此产生BC1植株,其一部分对绿麦隆抗性的植株是工程化染色体EC-HR1单体附加,它们均是ms-B1MS-B1杂合并对su-B1和Ki-B1纯合,是目的植株;
(d)通过染色体计数和使用DNA标记选择(c)的所述目的植株,并将其自交;
(e)收集(d)的自交子代种子并种植所述种子,由此产生BC1F2植株,其20%对绿麦隆抗性,即携带所述工程化染色体,25%的抗性植株对ms-B1纯合,但是由于它们携带工程化染色体EC-HR1的Ms-Ss1而为雄性可育,这些即是目的保持系植株;和
(f)通过对绿麦隆抗性和使用DNA标记选择(e)的目的保持系植株。
本发明再提供产生具有重组工程化染色体REC-H1的普通小麦或硬粒小麦雄性可育重组保持系的方法(图7b),所述方法包含:
(a)用源自普通小麦栽培品种中国春的雄性可育母本与父本杂交,所述母本对染色体臂4BS上显性Ms-B1雄性能育性等位基因和染色体臂5BL上的显性部分同源配对抑制基因等位基因Ph1纯合,对染色体6B为缺对染色体并因此缺乏显性Ki-B1雄配子杀伤等位基因,并且具有一对携带隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a的6Sl染色体,所述父本与母本等基因但却是二体6B并因此对Ki-B1纯合、缺乏染色体6Sl,亦对突变部分同源配对等位基因ph1b纯合;
(b)从(a)的杂交收集子代种子,并种植所述种子,由此产生对部分同源配对等位基因杂合的(Ph1ph1b)雄性可育(Ms-B1Ms-B1)F1植株,它们对6B和6Sl染色体均为单体;
(c)将所述(b)的F1植株与父本回交;
(d)收集(c)杂交的子代种子并种植所述种子,由此产生BC1植株,它们均为雄性可育(Ms-B1Ms-B1),其50%对ph1b等位基因纯合,其中约50%(因为6B与6Sl配对)对6B和6Sl均为双单体,是目的BC1植株;
(e)通过使用DNA标记并分析减数分裂时染色体配对,选择(d)的目的BC1植株,将其用与BC1植株等基因但为纯合Ph1ph1的双末端体6BS品系(即缺少6BL臂)授粉;
(f)收集(e)的杂交子代种子并种植所述种子,由此产生植株,其全部对染色体臂6BS为单末端体,其中一部分亦对由6Sl的短臂和长臂的近端区(携带ki-Sl1-a)和染色体臂6BL的远端区组成的重组染色体(重组点居ki-Sl1-a远端)为单体,即是目的植株;
(g)通过C-带、使用DNA标记和分析染色体配对选择(f)的所述目的植株,将它们做为父本与母系杂交,该母系是非重组保持系,即对任何一个隐性雄性不育等位基因ms-B1和显性雄配子杀伤等位基因Ki-B1均纯合,具有携带Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a的工程化染色体EC-H1;
(h)收获(g)的杂交子代种子,并种植所述种子,由此产生F1植株,其中一部分为三单体,即它们对6B、异源工程化染色体EC-H1和重组染色体(6Sl/6BL)为单体,是杂合Ms-B1ms-B1、半合子Ki-B1和纯合ki-Sl1-aki-Sl1-a,并是目的植株;和
(i)通过染色体计数、C-带和利用DNA标记选择(h)的所述目的植株,将其自交,收集子代种子并种植所述种子,由此产生F2植株,其中一部分为双单体,具有染色体6B和重组工程化染色体REC-H1(4SsS/6SlL/6BL),携带Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a,这些即是目的保持系植株。
本发明亦提供产生具有重组工程化染色体REC-HR1的普通小麦或硬粒小麦雄性可育重组保持系的方法(图8b),所述方法包含:
(a)用源自普通小麦栽培品种中国春中的雄性可育重组保持系的雄性可育母本与二倍体物种的Aegilops searsii品系杂交,该母本是单体6B单体附加REC-H1,所述母本对染色体臂4BS上隐性ms-B1雄性不育等位基因纯合、对隐性绿麦隆敏感等位基因su-B1和显性Ki-B1雄配子杀伤等位基因为半合子,并且具有做为单体置换的工程化染色体REC-H1(4SsS/6SlL/6BL),该染色体在其短臂上携带显性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和半显性rht-Ss1等位基因、在其长臂上携带隐性绿麦隆敏感等位基因su-Sl1和隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a,所述二倍体物种Aegilods searsii品系具有显性绿麦隆抗性等位基因Su-Ss1以及Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因;
(b)收集(a)的杂交子代种子,并种植所述种子,由此产生F1植株,其中50%含有重组工程化染色体,该染色体与4SsS和6SsS配对,因此在减数分裂时形成三价体,具有基因型ms-B1Ms-Ss1Ms-Ss1,ki-Sl1-a su-Sl1和Su-Sl;
(c)选择(b)的F1子代并将其与做为父本的cv.中国春回交;
(d)收集其子代种子并种植所述种子,由此产生BC1植株,它们均为杂合ms-B1Ms-B1并因此为雄性可育,其中一些植株是单体6B并由此对su-B1和Ki-B1为半合子,并具有做为单体置换的在短臂上携带Ms-Ss1和rht-Ss1、在长臂上携带Su-Ss1和ki-Sl1-a的重组工程化染色体REC-HR1,是目的植株;
(e)通过对绿麦隆抗性和通过分析减数分裂时染色体配对选择(c)的所述目的植株,将其自交;
(f)收集(d)的自交子代种子并种植所述种子,由此产生BC1F2植株,其中50%是单体6B并对重组染色体REC-HR1为单体,该染色体由4Ss的短臂(携带Ms-Ss1和rht-Ss1)、6Sl的长臂近端区(携带Su-Ss1和ki-Sl1-a)和染色体臂6BL的远端区组成(重组点居ki-Sl1-a远端),这些植株的25%对ms-B1纯合,对su-B1和Ki-B1为半合子,这些即是目的保持系植株;和
(g)通过绿麦隆抗性、使用DNA标记和分析染色体配对选择(e)的目的重组保持系植株。
本发明再提供产生具有改进工程化染色体IEC-HC1的普通小麦或硬粒小麦雄性可育改进保持系的方法(图9a-b),所述方法包含:
(a)用源自普通小麦栽培品种中国春的雄性可育母本与父本杂交,所述母本是保持系,即对染色体臂4BS上隐性ms-B1雄性不育等位基因和染色体臂6BL上的显性Ki-B1雄配子杀伤等位基因纯合,并且具有一条在其短臂上携带显性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1、在其长臂上携带隐性等位基因ki-Sl1-a的附加的工程化染色体EC-H1,所述父本与母本等基因但对显性雄性能育性等位基因Ms-B1纯合,具有附加的一对异源染色体4E,所述染色体在其长臂上携带显性蓝糊粉等位基因Ba-E1;
(b)收集(a)的杂交子代种子,所有的种子都是蓝色的,用热中子辐射种子并种植所述种子,由此产生雄性可育F1植株,它们均为杂合Ms-B1ms-B1并对Ki-B1纯合,其20%是工程化染色体EC-H1和染色体4E的双单体附加并是目的植株;
(c)通过染色体计数和通过使用DNA标记选择(b)的所述目的植株,将其自交;
(d)收集(c)子代种子,选择蓝色种子并种植所述种子,由此产生F2植株,其一部分有43条染色体,这些植株的一部分具有改进工程化染色体IEC-H1并且是目的植株,该染色体含有4SsS/4EL/6SlL、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a,其它一些则具有易位染色体4SsS/4EL;
(e)通过染色体计数和通过使用DNA标记选择(d)的目的植株,将其自交;
(f)收集(e)的子代种子并选择蓝色种子,这些种子生长时发育成为雄性可育植株,它们携带改进工程化染色体IEC-HC1,这些是目的改进保持系植株;
(g)如果步骤(d)未得到目的植株,则通过染色体计数和通过DNA标记选择具有易位染色体4SsS/4EL的(d)的植株(源自蓝色种子,雄性可育),将它们做为父本与具有EC-H1的保持系回交以产生F1种子;
(h)从(g)的F1种子中选择蓝色种子,将其用热中子辐射并萌发,选择具有44条染色体的苗,即具有二条异源附加染色体4SsS/4EL和4SsS/6SlL;和
(i)重复步骤(d)-(f),由此得到具有改进工程化染色体IEC-HC1的目的改进保持系,该染色体含有4SsS/4EL/6SlL,携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a。
本发明再提供产生具有改进工程化染色体IEC-HC1的普通小麦或硬粒小麦雄性可育改进保持系的另一方法(图9c),所述方法包含:
(a)用源自普通小麦栽培品种中国春的雄性可育母本与父本杂交,所述母本对显性雄性能育性等位基因Ms-B1和显性雄配子杀伤等位基因Ki-B1纯合,并且具有一对在其长臂上携带显性蓝糊粉等位基因Ba-E1的异源染色体4E,所述父本与母本等基因,但对隐性雄性不育等位基因ms-B1-c纯合、具有在其短臂上携带显性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的附加异源染色体4Ss;
(b)收集(a)的杂交子代种子,并种植所述种子,由此产生F1植株,它们均为杂合Ms-B1ms-B1和纯合Ki-B1Ki-B1,其25%是携带染色体4E和4Ss的双单体附加,是目的植株;
(c)通过染色体计数和通过使用DNA标记选择(b)的所述目的F1植株,将其自交;
(d)选择(c)自交种子中的蓝色种子并种植所述种子,由此产生F2植株,其中一部分具有易位染色体4SsS/4EL,是目的植株;
(e)通过染色体计数和通过使用DNA标记选择(d)的所述目的F2植株,将它们做为父本与具有EC-H1(4SsS/6SlL)的保持系回交得到F1种子,其中一些是蓝色的;
(f)选择(e)的蓝色种子,将它们用热中子辐射并使其生长为F1植株,它们均对ms-B1-c和Ki-B1纯合,其中少数具有4SsS/4EL和4SsS/6SlL双单体附加,是目的植株;
(g)通过染色体计数和使用DNA标记选择(f)的所述目的植株,将其自交;
(h)收集(g)的子代种子,选择蓝色种子并种植所述种子,由此产生F2植株,它们均对ms-B1-c和Ki-B1等位基因纯合,其中一部分有43条染色体,这些植株的一部分具有改进工程化染色体IEC-H1并且是目的植株,染色体IEC-HC1含有4SsS/4EL/6SlL、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1;
(i)通过染色体计数、C-带和雄性能育性选择(h)的目的植株,将其自交;和
(j)收集(i)的子代种子并选择蓝色种子,所述种子生长时发育成为携带IEC-HC1的雄性可育植株,这些是目的改进保持系植株。
本发明亦提供产生具有改进工程化染色体IEC-HC2的普通小麦或硬粒小麦雄性可育改进保持系的方法(图10),所述方法包含:
(a)将普通小麦栽培品种中国春二体置换品系父本与母本杂交,在父本品系中一粒小麦的染色体4Am置换了普通小麦的染色体4B,因此所述父本缺少雄性能育性等位基因Ms-B1、对雄配子杀伤等位基因Ki-B1和4AmS上的Ms-Am1和rht-Am以及4AmL上的Ba-Am1纯合,所述母本与父本等基因、对隐性ms-B1雄性不育等位基因纯合,并且具有一条在其短臂上携带显性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的附加的异源染色体4Ss;
(b)收集(a)的杂交子代种子并种植所述种子,由此产生F1植株,它们均为半合子ms-B1-c并对Ki-B1纯合,其中一些是三单体4B、4Ss和4Am并是目的植株;
(c)通过染色体计数选择(b)的所述三单体植株,由此产生雄性可育F1植株,使其自花授粉;
(d)收集(c)F2种子,选择蓝色种子并种植所述选择的种子,由此产生F2植株,进一步从这些F2植株中选择那些具有44条染色体(在减数分裂时显示21”+2’)的植株,这些植株是目的双单体附加4Ss和4Am;
(e)自交(d)的所述目的植株,由此得到F3种子,选择蓝色种子;
(f)种植(e)的蓝色种子,选择具有43条染色体(21”+1)的植株,它们为雄性可育并产生蓝色种子,这些植株具有易位染色体4SsS/4AmL,是目的植株;
(g)将(f)的目的植株做为父本与做为母本的纯合ms-B1msB1Ki-B1KiB1并具有EC-H1(4SsS/6SlL)、携带Ms-Ss1rht-Ss1ki-Sl1-a的保持系杂交得到F1种子;
(h)从(f)的F1子代种子中选择蓝色种子,将其用热中子辐射并种植,再选择具有44条染色体(21”+1”)的植株,即对异源附加染色体的短臂为二体、对其长臂为双单体的植株,将其自交;
(i)种植(h)的蓝色种子,选择具有43条染色体、产生蓝色和红/白色种子的雄性可育植株,这些植株具有IEC-HC2,是目的植株;和
(j)自交(i)的目的植株,收集其种子并分离蓝色种子,所述种子当生长时,发育成为具有IEC-HC2的雄性可育植株,这些即是目的改进保持系植株。
本发明亦提供产生具有改进工程化染色体IEC-HC3的普通小麦或硬粒小麦雄性可育改进保持系的方法(图11),所述方法包含:
(a)将普通小麦栽培品种中国春二体置换系父本与母本杂交,在二体置换系中一粒小麦的染色体4Am置换了普通小麦的染色体4B,因此所述父本缺少雄性能育性等位基因Ms-B1、对雄配子杀伤等位基因Ki-B1和4AmS上的Ms-Am1和rht-Am1以及4AmL上的Ba-Am1纯合,所述母本与父本等基因,但对隐性ms-B1雄性不育等位基因纯合,并且具有一条在其短臂上携带显性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的附加的异源染色体4Ss;
(b)收集(a)的F1种子,它们均为蓝色并种植所述种子,它们均为半合子ms-B1-c并对Ki-B1纯合,其中75%是单体4B和携带Ms-Am1的4Am单体置换,由此为雄性可育,使用所述单体-单体置换、对杂合Ms-B1ms-B1和纯合Ki-B1等位基因并具有做为单体附加的染色体6Sl的母本授粉,其中所述母本通过将附加4Ss单体的ms-B1-cms-B1-c中国春做为父本,与对Ms-B1和Ki-B1等位基因纯合并具有做为单体附加的染色体6Sl的母本杂交得到,20%的子代具有目的构造;
(c)收集(b)杂交的蓝色F1种子,用热中子辐射,将其种植并从F1植株中选择那些具有43条(21”+1’)和42条(20”+2’)染色体的植株并使这些植株自交;
(d)从(c)的自交种子选择蓝色种子并种植所述种子,选择雄性可育、有约20%不存活花粉并产生蓝色和红/白色种子的植株;和
(e)种植(d)的种子,分离蓝色种子,所述种子当生长时,发育成为具有IEC-HC3的雄性可育植株(具有43条染色体),这些即是目的改进保持系植株。
本发明再提供产生具有改进重组工程化染色体IREC-HC的普通小麦或硬粒小麦雄性可育保持系的方法(图12),所述方法包含:
(a)将源自普通小麦栽培品种中国春的雄性可育母本与父本杂交,所述母本对染色体臂4BS上显性Ms-B1雄性能育性等位基因和染色体臂5BL上的显性部分同源配对抑制基因等位基因Ph1纯合,对染色体6B为缺对染色体并因此缺乏显性Ki-B1雄配子杀伤等位基因,并且具有一对携带隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a的6Sl染色体,所述父本与母本等基因但却是二体6B,并因此对Ki-B1纯合、缺少染色体6Sl、亦对突变部分同源配对等位基因ph1b纯合;
(b)收集(a)的杂交子代种子,并种植所述种子,由此产生对部分同源配对等位基因杂合的(Ph1ph1b)雄性可育(Ms-B1Ms-B1)F1植株,它们对6B和6Sl染色体均为单体;
(c)将所述(b)的F1植株与父本回交;
(d)收集(c)杂交的子代种子并种植所述种子,由此产生BC1植株,它们均为雄性可育(Ms-B1Ms-B1),其1/2对ph1b等位基因纯合,其中约1/2(因为6B与6Sl配对)对6B和6Sl为双单体,是目的BC1植株;
(e)通过减数分裂时染色体配对和通过DNA标记选择(d)的目的BC1植株,将其用与BC1植株等基因但为纯合Ph1Ph1的双末端体6BS品系(即缺少6BL臂)授粉;
(f)收集(e)的杂交子代种子并种植所述种子,由此产生植株,它们全部对染色体臂6BS为单末端体,其中一部分亦对由6Sl的短臂和长臂近端区(携带ki-Sl1-a)和染色体臂6BL的远端区组成的重组染色体(重组点居ki-Sl1-a远端)为单体,即是目的植株;
(g)通过C-带、通过分析染色体配对和使用DNA标记选择(f)的所述目的植株,将它们做为父本与母系杂交,该母系是改进保持系,即对任何一个隐性雄性不育等位基因ms-B1和显性雄配子杀伤等位基因Ki-B1纯合,具有下述改进工程化染色体之一:IEC-HC1(4SsS/4EL/6SlL)、IEC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL)或者IEC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL),它们分别携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a,Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1或ki-Sl1-a以及Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a;
(h)收集(g)的杂交子代种子,并种植所述种子,由此产生F1植株,其中一部分为三单体,即它们对6B、改进工程化染色体IEC-HC1、IEC-HC2或IEC-HC3之一和重组染色体(6Sl/6BL)为单体,是杂合Ms-B1ms-B1、半合子Ki-B1,是目的植株;和
(i)通过染色体计数、C-带和通过使用DNA标记选择(h)的所述目的植株,将其自交,收集子代种子并种植所述种子,其中一部分为双单体,具有染色体6B和改进重组工程化染色体IREC-HC,该染色体或者为IREC-HC1(4SsS/4EL/6SlL/6BL)、IREC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL/6BL)或者IREC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL/6BL),这些即是具有IREC-HC的目的保持系植株。
在另一方面,本发明提供在普通小麦或硬粒小麦的保持系或重组保持系每个世代中保持雄性可育与雄性不育植株比例恒定的方法,包含:
(a)使含有工程化染色体的雄性可育保持系自交,该染色体选自工程化染色体EC-H1和重组工程化染色体REC-H1,除携带Ms-Ss1和ki-Sl1-a等位基因之外,还携带做为选择标记的rht-Ss1等位基因,该标记便于从该自交保持系的雄性可育子代中分离收获的种子,所述种子生长时发育成为所述保持系;
(b)收集(a)的子代种子并种植所述种子,由此产生植株,其20%(具有工程化染色体EC-H1的保持系子代)和50%(具有重组工程化染色体REC-H1的保持系子代)含有所述工程化染色体,并与所述保持系相同,因此携带rht-Ss1等位基因,并比缺少所述工程化染色体的那些植株高(6-8cm);和
(c)收获(b)的较高的植株,它们都是雄性可育,得到的子代种子中有20%(EC-H1)或50%(REC-H1)的种子携带所述工程化染色体,由此保持保持系或重组保持系每个世代中雄性可育与雄性不育植株的比例恒定。
本发明再提供在普通小麦或硬粒小麦的保持系或重组保持系每个世代中保持雄性可育与雄性不育植株比例恒定的方法,包含:
(a)使含有工程化染色体的雄性可育保持系自交,该染色体选自工程化染色体EC-HR1和重组工程化染色体REC-HR1,除携带Ms-Ss1和ki-Sl1-a等位基因之外,还携带做为选择标记的Su-Ss1等位基因,该标记便于从该自交保持系的雄性可育子代中选择具有同样所述保持系基因型的植株;
(b)收集(a)的子代种子,萌发所述种子成为子代苗,其20%(具有工程化染色体EC-HR1的保持系子代)和50%(具有重组工程化染色体REC-HR1的保持系子代)含有所述工程化染色体,用除草剂绿麦隆喷洒所述苗,由此杀死所有的敏感苗,即那些缺少EC-HR1或REC-HR1的苗;和
(c)收获(b)的绿麦隆抗性植株,它们都携带EC-HR1或REC-HR1并因此是雄性可育,得到的子代种子中有20%(EC-HR1)或50%(REC-HR1)的种子携带所述工程化染色体,由此保持保持系或重组保持系每个世代中雄性可育与雄性不育植株的比例恒定。
本发明亦提供在普通小麦或硬粒小麦的改进保持系或改进重组保持系每个世代中保持雄性可育与雄性不育植株恒定比例的方法,包含:
(a)使含有工程化染色体的雄性可育保持系自交,该染色体选自工程化染色体IEC-HC1和重组工程化染色体IREC-HC1,除携带Ms-Ss1和ki-Sl1-a等位基因之外,还携带做为选择标记的Ba等位基因(诱导种子蓝色),该标记便于从该自交保持系的雄性可育子代中选择种子,所述种子生长时发育成为所述保持系;
(b)收集(a)的子代种子并借助分选装置分离携带IEC-HC1或IREC-HC1的蓝色种子与缺少这些染色体的红/白色种子;和
(c)种植(b)的蓝色种子,它们均发育成为雄性可育改进保持系或改进重组保持系植株。
在另一方面,本发明提供防止工程化染色体通过减数分裂时着丝粒错分裂断裂成为二个具端着丝粒(一个臂)染色体的方法,这二个具端着丝粒染色体携带或者该工程化染色体短臂的Ms和rht等位基因或者长臂的ki-Sl1-a等位基因和Su等位基因(在EC-HR的情况下)和Ba等位基因(在IEC的情况下)。Ms与ki-S1-a之间的分离可以导致Ms的雄性传递,并且因此在用保持系或改进保持系对该母系授粉时或在该改进保持系自交时,产生一定数量的雄性可育雌株。在后二者情况下,携带Ms的种子生长时发育成为雄性可育植株,所述种子将是红/白色,不能与缺乏Ms的那些种子分离,缺乏Ms的那些种子生长时发育成为雄性不育植株。在EC-HR的情况下,仅具有工程化染色体短臂、携带Ms-Ss1和rht-Ss1的植株对绿麦隆敏感,并可以在施用除草剂时被选择。使用重组保持系或改进重组保持系而不是保持系或改进保持系,消除了Ms等位基因雄性传递的危险。在这些保持系中,重组或改进重组工程化染色体规则地与天然6B染色体配对,因此防止了在配对染色体中通常不发生的着丝粒错分裂。这维持了Ms与Ki-Sl1-a之间的连锁。
在另一方面,本发明提供将普通小麦或硬粒小麦目的栽培品种转化成为雄性不育母本系和用于所述母系的具有工程化染色体EC-H的雄性可育保持系的方法(图16a),所述方法包含:
(a)将保持系与目的栽培品种杂交,所述保持系为纯合ms-B1ms-B1Ki-B1Ki-B1并具有异源工程化染色体EC-H1(4SsS/6SlL)、携带Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a,所述栽培品种是纯合Ms-B1Ms-B1ki-B1ki-B1;
(b)收集(a)杂交的子代种子并种植所述种子,由此产生雄性可育F1植株,其全部是杂合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a,其1/4亦携带工程化染色体EC-H1,是目的植株;
(c)通过染色体计数和利用DNA标记选择(b)的所述所需F1植株,用目的栽培品种对其授粉产生BC1子代,其1/16是杂合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a并携带工程化染色体EC-H1,是目的基因型;
(d)种植(c)的所述BC1植株,通过染色体计数和通过使用DNA标记选择所述目的基因型,再将它们做为母本与目的栽培品种回交四个连续世代,产生第五代回交子代(BC5),通过染色体计数和通过使用DNA标记在每个世代选择具有工程化染色体EC-H1的杂合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a后代;和
(e)自交(d)的目的BC5植株,收集其子代种子并种植所述种子,由此生长BC5F2植株,其1/16是雄性不育并对雄性不育ms-B1和雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合,是目的雄性不育母系,其它具有类似基因型但亦具有携带Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a的工程化染色体EC-H1的BC5F2植株是目的雄性可育保持系植株。
本发明亦提供将普通小麦或硬粒小麦目的栽培品种转化成为雄性不育母本系和用于所述母系的具有工程化染色体EC-HR的雄性可育保持系的方法(图17a),所述方法包含:
(a)将保持系与目的栽培品种杂交,所述保持系为纯合ms-B1ms-B1su-B1su-B1Ki-B1Ki-B1并具有异源工程化染色体EC-HR1、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a,所述所需栽培品种是纯合Ms-B1Ms-B1Su-B1Su-B1ki-B1ki-B1;
(b)收集(a)杂交的子代种子并种植所述种子,由此产生雄性可育F1植株,其全部是杂合ms-B1Ms-B1Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1-a,其1/4亦携带工程化染色体,是目的植株;
(c)通过染色体计数和利用DNA标记选择(b)的所述目的F1植株,用目的栽培品种对其授粉产生BC1子代,其1/32是杂合ms-B1Ms-B1Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1-a并携带工程化染色体EC-HR1,是目的基因型;
(d)种植(c)的所述BC1植株,通过染色体计数和通过使用DNA标记选择所述目的基因型,再将它们做为母本与目的栽培品种回交四个连续世代,产生第五代回交子代(BC5),通过染色体计数和通过使用DNA标记在每个世代选择具有工程化染色体EC-HR1的杂合ms-B1Ms-B1Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1-a后代;和
(e)自交(d)的目的BC5植株,收集其子代种子并种植所述种子,由此生长BC5F2植株,其1/64是雄性不育并对雄性不育ms-B1、绿麦隆敏感性su-B1和雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合,是目的雄性不育母系,其它具有类似基因型但亦具有携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a的工程化染色体EC-HR1的BC5F2植株是目的雄性可育保持系植株。
本发明再提供将普通小麦或硬粒小麦目的栽培品种转化成为雄性不育母本系和用于所述母系的具有重组工程化染色体REC-H的雄性可育重组保持系的方法(图16b),所述方法包含:
(a)将具有REC-H1的保持系做为母本与目的栽培品种杂交,所述保持系为纯合ms-B1ms-B1、对6B(对Ki-B1为半合子)和重组工程化染色体REC-H1(4SsS/6SlL/6BL)为单体、携带Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a,所述栽培品种是纯合Ms-B1Ms-B1ki-B1ki-B1;
(b)收集(a)杂交的子代种子并种植所述种子,由此产生雄性可育F1植株,其全部是杂合ms-B1Ms-B1,其1/2对染色体6B为二体,并因此是杂合Ki-B1ki-B1-a,其1/2对染色体6B和重组工程化染色体REC-H1为双单体、对ki-B1-a为半合子,但亦携带重组工程化染色体的Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a;
(c)通过分析染色体配对和使用DNA标记选择(b)的所述二种类型的F1子代,用目的栽培品种对其授粉产生二种类型的BC1子代,那些源自二体F1的子代的1/4是杂合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a,那些源自双单体F1的子代的1/4是双单体、杂合ms-B1Ms-B1、半合子ki-B1-a,并亦携带重组工程化染色体REC-H1的Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a;
(d)通过分析染色体配对和通过使用DNA标记选择(c)的二组所述目的植株,再将它们做为母本与目的栽培品种回交四个连续世代,产生二种类型的第五代回交子代(BC5),通过染色体配对分析和通过使用DNA标记在每个世代选择具有重组工程化染色体REC-H1的二体类型中的杂合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a和双单体类型中的杂合ms-B1Ms-B1的后代;
(e)用(d)的目的二体BC5对(d)的目的双单体BC5植株授粉,产生二组BC5F2,一组为二体植株,其1/8是纯合ms-B1ms-B1和杂合Ki-B1ki-B1-a,是目的二体植株,一组为双单体植株,其1/8是纯合ms-B1ms-B1、半合子Ki-B1,并亦携带重组工程化染色体REC-H1的Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a,因此为雄性可育且是目的重组保持系;
(f)分别种植(e)的所述双单体BC5F2种子和(e)的二体BC5F2种子,通过染色体配对分析和通过使用DNA标记选择目的雄性可育重组保持系和雄性不育母系。
本发明亦提供将普通小麦或硬粒小麦目的栽培品种转化成为雄性不育母本系和用于所述母系的具有重组工程化染色体REC-HR的雄性可育重组保持系的方法(图17b),所述方法包含:
(a)将具有REC-HR1的保持系做为母本与目的栽培品种杂交,所述保持系为纯合ms-B1ms-B1、对6B(对su-B1和Ki-B1为半合子)和重组工程化染色体REC-HR1为单体、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a,所述栽培品种是纯合Ms-B1Ms-B1Su-B1Su-B1ki-B1ki-B1;
(b)收集(a)杂交的子代种子并种植所述种子,由此产生雄性可育F1植株,其全部是杂合ms-B1Ms-B1,其1/2对染色体6B为二体,并因此是杂合Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1,其1/2对染色体6B和重组工程化染色体REC-HR1为双单体、对Su-B1和ki-B1-a为半合子但亦携带重组工程化染色体REC-HR1的Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a;
(c)通过分析染色体配对和使用DNA标记选择(b)的所述二种类型的F1植株,用目的栽培品种对其授粉产生二种类型的BC1子代,那些源自二体F1的子代的1/4是杂合ms-B1Ms-B1,那些源自双单体F1的子代的1/4是双单体、杂合ms-B1Ms-B1、半合子Su-B1和ki-B1-a并亦携带重组工程化染色体REC-HR1的Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a;
(d)种植(c)的所述BC1子代,通过分析染色体配对和通过使用DNA标记选择(c)的二组所述目的植株,再将它们做为母本与目的栽培品种回交四个连续世代产生二种类型的第五代回交子代(BC5),通过染色体配对分析和通过使用DNA标记在每个世代选择具有重组工程化染色体REC-HR1的二体类型中的杂合ms-B1Ms-B1su-B1Su-B1Ki-B1ki-B1和双单体类型中的杂合ms-B1Ms-B1的后代;
(e)用(d)的目的二体BC5对(d)的目的双单体BC5植株授粉,产生二组BC5F2,一组为二体植株,其中1/16是纯合ms-B1ms-B1和杂合su-B1Su-B1Ki-B1ki-B1,是目的二体植株,一组为双单体植株,其中1/16是纯合ms-B1ms-B1、半合子su-B1和Ki-B1,并亦携带重组工程化染色体REC-HR1的Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-S1-a,因此为雄性可育且是目的重组保持系;
(f)种植(e)的所述双单体BC5F2种子和(e)的二体BC5F2种子,通过染色体配对分析和通过对绿麦隆的反应选择目的雄性可育重组保持系和雄性不育母系;
(g)种植二体植株的子代,其全部是纯合ms-B1ms-B1并因此为雄性不育,其中1/4是纯合su-B1su-B1和Ki-B1Ki-B1,是目的雄性不育母系;和
(h)种植(g)的所述二体BC5F3,通过使用DNA标记选择目的雄性不育母系。
本发明亦提供将普通小麦或硬粒小麦目的栽培品种转化成为雄性不育母本系和用于所述母系的IEC-HC类型的雄性可育改进保持系的方法(图18a),所述方法包含:
(a)将改进保持系与目的栽培品种杂交,所述保持系为纯合ms-B1ms-B1Ki-B1Ki-B1并具有下述改进工程化染色体之一,即或者为IEC-HC1(4SsS/4EL/6SlL、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a)、IEC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a)或者IEC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL、携带Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a),所述栽培品种是纯合Ms-B1Ms-B1ki-B1ki-B1;
(b)收集(a)杂交的子代种子并种植所述种子,由此产生雄性可育F1植株,其全部是杂合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a,其1/4亦携带IEC-HC类型的改进工程化染色体,是目的植株;
(c)通过种子颜色选择(b)的所述目的F1植株,用目的栽培品种对其授粉产生BC1子代,其1/16是杂合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a并携带IEC-HC类型的改进工程化染色体,是目的基因型;
(d)种植(c)的所述BC1植株,通过种子颜色、染色体计数和通过使用DNA标记选择所述目的基因型,再将它们做为母本与目的栽培品种回交四个连续世代,产生第五代回交子代(BC5),通过种子颜色、染色体计数和通过使用DNA标记在每个世代选择具有IEC-HC类型的改进工程化染色体、杂合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a后代;和
(e)自交(d)的目的BC5植株,收集其子代种子,其中一些是蓝色、一些是红/白色,种植所述种子,由此生长BC5F2植株,其1/16是雄性不育并对雄性不育ms-B1和雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合,它们源自红/白色种子并且是目的雄性不育母系,其它具有类似基因型但是源自蓝色种子,因此亦具有携带Ms、rht、Ba和ki-Sl1-a的IEC-HC类型的改进工程化染色体的BC5F2植株是目的雄性可育改进保持系植株。
本发明再提供将普通小麦或硬粒小麦目的栽培品种转化成为雄性不育母本系和用于所述母系的IREC-HC类型的雄性可育改进重组保持系的方法(图18b),所述方法包含:
(a)将具有IREC-HC的保持系做为母本与目的栽培品种杂交,所述保持系为纯合ms-B1ms-B1、对6B(对Ki-B1为半合子)和以下改进重组工程化染色体之一为单体:IREC-HC1(4SsS/4EL/6SlL/6BL、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a)、IREC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL/6BL、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a)和IREC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL/弦BL、携带Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a),所述栽培品种是纯合Ms-B1Ms-B1ki-B1ki-B1;
(b)收集(a)杂交的子代种子并种植所述种子,由此产生雄性可育F1植株,其全部是杂合ms-B1Ms-B1,其1/2对染色体6B为二体,并因此是杂合Ki-B1ki-B1-a,其1/2对染色体6B和IREC-HC类型的重组工程化染色体为双单体、对ki-B1-a为半合子,但亦携带该重组工程化染色体的Ms、rht和ki-Sl1-a等位基因;
(c)通过种子颜色、分析染色体配对和使用DNA标记选择(b)的所述二种类型的F1子代,用目的栽培品种对其授粉,产生二种类型的BC1子代,那些源自二体F1的子代的1/4是杂合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a,那些源自双单体F1的子代的1/4是双单体、杂合ms-B1Ms-B1、半合子ki-B1-a,并亦携带IREC-HC类型的重组工程化染色体的Ms、rht和ki-Sl1-a等位基因;
(d)通过种子颜色、分析染色体配对和通过使用DNA标记选择(c)的二组所述目的植株,再将它们做为母本与目的栽培品种回交四个连续世代,产生二种类型的第五代回交子代(BC5),通过种子颜色、染色体配对分析和通过使用DNA标记在每个世代选择具有IREC-HC类型的改进重组工程化染色体的二体类型中的杂合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a和双单体类型中的杂合ms-B1Ms-B1的后代;
(e)用(d)的目的二体BC5对(d)的目的双单体BC5植株授粉,产生二组BC5F2,一组为二体植株,其1/8是纯合ms-B1ms-B1和杂合Ki-B1ki-B1-a,它们源自红/白色种子,是目的二体植株,一组为双单体植株,源自蓝色种子,其1/8是纯合ms-B1ms-B1、半合子Ki-B1,并亦携带IREC-HC类型的改进重组工程化染色体的Ms、rht和ki-Sl1-a等位基因,因此为雄性可育且是目的改进重组保持系;和
(f)分别种植(e)的所述双单体BC5F2种子和(e)的二体BC5F2种子,通过染色体配对分析和通过使用DNA标记选择目的雄性可育重组保持系和雄性不育母系。
在本发明产生保持系或将目的栽培品种转化成为雄性不育母本系和雄性可育保持系的方法中,通过使用DNA探针在任何一个子代世代中选择携带目的ms-B1等位基因的植株,该探针定位于染色体臂4BS远端末端,用于标记任何突变雄性不育ms-B1等位基因,使得可以选择携带所述突变等位基因的植株。可以使用标记4BS次末端区的任何DNA探针,例如PSR921(M.D.Gale,Cambridge Laboratory,JII,Norwich,英国)。
使用这些DNA标记是鉴于这样一个事实:一些已知的突变等位基因涉及4BS的末端缺失,由于产生突变体等位基因ms-B1-c的缺失亦包括这些标记的基因座,可以通过这些DNA标记的缺失(无标记表现型(null phenotyp))容易地鉴别纯合植株(ms-B1-c ms-B1-c)。因此,在将显性正常等位基因纯合的植株(Ms-B1Ms-B1)做为母本与做为父本的该突变等位基因杂合的植株(Ms-B1ms-B1-c)杂交时,F1的50%是纯合的(Ms-B1Ms-B1),50%是杂合的(Ms-B1ms-B1-c)。将这些F1植株回交,即用父本(Ms-B1ms-B1-c)授粉,预期产生的1/8的回交子代(BC1)对ms-B1-cms-B1-c纯合。通过使用DNA标记鉴别和选择这些纯合的植株。每次增加的回交产生50%的纯合隐性子代,可以通过使用上述标记选择该子代。
在本发明的上述方法中,通过使用DNA探针在任何一个子代世代中选择携带目的ki-Sl1-a等位基因的植株,该探针定位于与6SlL上所述等位基因紧密连锁的一个基因座,用于标记所述等位基因。这种DNA探针的实例是PSR915(M.D.Gale,Cambridge Laboratory,JII,Norwich,英国)。亦通过败育花粉粒的比例选择携带目的ki-Sl1-a等位基因的植株。
本发明的再一方面是产生普通小麦或硬粒小麦杂种植株的方法,包含:
(a)将父本与同一物种的雄性不育母本杂交,其中所述父本选自任何目的普通小麦或硬粒小麦栽培品种,该父本天然地对显性野生型雄性能育性(Ms-B1)等位基因纯合,所述雄性不育母本是所述小麦种的品系,其对任何一个隐性突变体雄性不育(ms-B1)等位基因和显性雄配子杀伤(Ki-B1)等位基因纯合,通过如上述的本发明的保持系保持所述雄性不育母本;和
(b)收集(a)杂交的子代种子,所述种子当生长时发育成为子代杂种植株,所有植株均为雄性可育并对所述突变雄性不育等位基因杂合,即ms-B1Ms-B1。
实施例
在以下实施例中,所使用的山羊草属品系是Aegilops searsiiFeldman & Kislevex Hammer品系,具有Ms-Ss1(雄性可育)、rht-Ss1(较高植株)和SuSs1(绿麦隆抗性)等位基因,本文命名为AES-5,采集于以色列的Yattir,Southern Judea,以及高大山羊草Schweinf.&Muschl.品系,具有ki-Sl1-a(对Ki-B1的雄配子杀伤效应敏感)等位基因,本文命名为AEL-1,采集于以色列的Revivim,Central Negev附近。
按照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯特条约,AES-5和AEL-1的种子于1998年5月13日保藏于NCIMB Ltd.,Aberdeen,Scotland,英国,保藏号分别是40952和40953。
将在以下非限制性实施例和其附图中更详细地描述本发明。实施例1:杂种系统
在图1中总的描绘了从雄性不育母本和一父本产生杂种种子的三个方案。通过遗传手段成功产生杂种种子所需的条件如下:1)称为‘A-系’或‘母系’的母本的雄性不育性完全且稳定;2)用称为‘R-系’或‘雄系’的父本完全且稳定地恢复雄性能育性;和3)通过称为‘B-系’或‘保持系’的雄性可育保持系容易地繁殖母系A-系。产生的F1杂种种子都是雄性可育的。或者通过用保持系B-系授粉、通过保持系B-系自交或者通过这二种方法繁殖母系A-系,而保持系自身B-系通过自交保持,自交保持系子代中雄性可育植株的目的比例通过使用鉴定保持系特征的选择标记在每个世代中保持。
用于生产杂交普通小麦或硬粒小麦的这种方案的实例在图13、14和15中更具体地显示。做为雄性不育雌A系使用的是本文命名为cv.‘1’的栽培品种,其具有雄性不育基因,即对染色体4B短臂上的雄性不育隐性突变体等位基因之一纯合(ms-B1ms-B1)、对6B长臂上的显性雄配子杀伤等位基因(Ki-B1)纯合。已描述了三个这种雄性不育等位基因(综述于Wilson和Driscoll,1983)。这些等位基因是‘Pugsley’(Pugsley和0ram,1959-自发出现;ms-B1-a)、‘Probus’(Fossati和Ingold,1970-X射线诱导;ms-B1-b)和‘Cornerstone’(Driscoll,1977-伽吗射线诱导;ms-B1-c)。等位基因ms-B1-b和ms-B1-c是末端缺失。我们先前或者通过伽吗辐射或者通过用甲磺酸乙酯((EMS)处理诱导了几种另外的突变体等位基因。凭借在这些突变体中在4BS上存在末端C带,将EMX处理的突变体与Ms-B1基因座的各种缺失区分开来。诸如位于4BS远端区的Xpsr921的DNA标记不存在于ms-B1-c和几个我们的伽吗辐射突变体(亦有可能ms-B1-b)中,即它位于缺失的节中,其不存在可以标记所述缺失的纯合性。存在于栽培品种中国春中的Ki-B1等位基因位于染色体6B长臂上,距着丝粒约50cM(Loegering和Sears,1963)。诸如Xpsr915的DNA标记与ki-B1等位基因紧密地连锁。当由携带EC-HR类型的工程化染色体的保持系保持雄性不育母系时,该母系亦应对隐性绿麦隆敏感等位基因su-B1纯合。存在于普通小麦栽培品种中国春和几种其它基因型的四倍体小麦中的该等位基因位于染色体6B长臂,距着丝粒约0.5cM(Snape等,1991)。
保持系B-系是与A-系相同的栽培品种,即cv.‘1’,它对存在于A-系中相同的ms-B1和Ki-B1等位基因纯合,但具有一条附加的EC-H类型的异源工程化染色体(图2a),该染色体由Aegilopssearsii的4SsS(其携带显性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和使得植株较高的显性或半显性rht-Ss1等位基因)和高大山羊草的6SlL(携带隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a,使得携带它的花粉粒易被普通小麦或硬粒小麦的Ki-B1等位基因杀伤)组成。由于存在ki-Sl1-a,该异源工程化染色体不通过花粉粒传递。因此,用保持系(B-系)对雄性不育母系(A-系)授粉产生子代,所有的子代都与母系相同并且为雄性不育(图13a)。另一方面,保持系自花授粉产生80%的雄性不育和20%雄性可育后代(图13a)。由于在该工程化染色体中存在rht-Ss1等位基因,保持系的雄性可育后代比雄性不育后代高6-8cm。这种高度差利于用联合收割机选择性收获雄性可育后代,由此在每个世代中保持自交保持系子代中雄性可育植株的比例恒定。
一个替代保持系B-系是与A-系相同的栽培品种,即cv.‘1’,它对存在于A-系中相同的ms-B1、su-B1和Ki-B1等位基因纯合,但具有一条附加的EC-HR类型的异源工程化染色体(图2b),该染色体由Aegilops searsii的4SsS(携带显性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和显性或半显性rht-Ss1等位基因)和Aegilops slongissima的6SlS(携带显性绿麦隆抗性等位基因Su-Ss1,已发现它赋予对该除草剂的出色抗性并从Ae.searsii的6SsL转移至高大山羊草的6SlL,还携带隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a,它使得携带它的花粉粒易被普通小麦或硬粒小麦的Ki-B1等位基因杀伤)组成。由于存在ki-Sl1-a,该异源工程化染色体不通过花粉粒传递。因此,用保持系(B-系)对雄性不育母系(A-系)授粉产生子代,所有的子代都与母系相同并且为雄性不育(图14a)。另一方面,保持系自花授粉产生80%的雄性不育和20%雄性可育后代(图14a)。由于在该工程化染色体中存在Su-Ss1等位基因,保持系的雄性可育后代对除草剂绿麦隆和其它苯脲衍生物具有抗性,而雄性不育后代则对其敏感。该抗性利于在每个世代中杀死自交保持系子代中缺乏该工程化染色体的敏感苗。
或者,保持系可以与A-系相同,但对染色体6B为单体,即它对ms-B1纯合、对Ki-B1为半合子,并具有一条REC-H类型的重组工程化染色体(图2c),该染色体由Aegilops searsii的4SsS(其携带显性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1)、高大山羊草的6SlL(携带隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a,使得携带它的花粉粒易被普通小麦或硬粒小麦的Ki-B1等位基因杀伤)和与天然单条6B染色体同源区规则配对的染色体臂6BL的远端区组成。重组工程化染色体REC-H与6B的规则配对确保平均分离,由此使之被包含于50%的配子中。由于存在ki-Sl1-a,该重组工程化染色体不通过花粉粒传递。因此,用该重组保持系对雄性不育母系(A-系)授粉产生子代,所有的子代都与母系相同并且雄性不育。另一方面,该重组保持系自花授粉产生1/2的雄性不育和1/2雄性可育后代(图13b)。
雄性可育后代具有rht-Ss1等位基因,比雄性不育后代高6-8cm,因此可以分别收获。这在每个世代中保持自交保持系子代中雄性可育植株的比例恒定。
另一种保持系可以与A-系相同,但对染色体6B为单体,即它对ms-B1纯合、对su-B1和Ki-B1为半合子,具有一条REC-HR类型的重组工程化染色体(图2d),该染色体由Aegilops searsii的4SsS(其携带显性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1)、高大山羊草的6SlL(携带显性绿麦隆抗性等位基因Su-Ss1-a等位基因,它从Ae.searsii的6SsL转移至至高大山羊草的6SlL,还携带隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a,它使得携带它的花粉粒易被普通小麦或硬粒小麦的Ki-B1等位基因杀伤)和与天然单条6B染色体同源区规则配对的染色体臂6BL的远端区组成。重组工程化染色体REC-HR与6B的规则配对确保平均分离,由此使之被包含于50%的配子中。由于存在ki-Sl1-a,该重组工程化染色体不通过花粉粒传递。因此,用该重组保持系对雄性不育母系(A-系)授粉产生子代,所有的子代都与母系相同并且雄性不育。另一方面,该重组保持系自花授粉产生1/2的雄性不育和1/2雄性可育后代(图14b)。
雄性可育后代具有Su-Ss1等位基因,对绿麦隆抗性。对保持系小区施用该除草剂将杀死所有的缺少该工程化染色体的雄性不育后代,仅留下雄性可育保持系植株。
其它保持系含有一条IEC-HC类型的改进工程化染色体(图3a、4a和5a),该染色体除携带Ms、rht和ki-Sl1-a等位基因之外,还携带做为选择标记的、赋予种子蓝色的蓝糊粉(Ba)等位基因。产生了三种类型的这种改进工程化染色体:(1)IEC-HC1,由4SsS(携带Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因)、4EL(携带Ba-E1等位基因)和6SlL(携带ki-Sl1-a)组成;(2)IEC-HC2,由4SsS(携带Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因)、4AmL(携带Ba-Am1等位基因)和6SlL(携带ki-Sl1-a)组成;(3)IEC-HC3,由4AmS(携带Ms-Am1和rht-Am1等位基因)、4AmL(携带Ba-Am1等位基因)和6SlL(携带ki-Sl1-a)组成。由于存在ki-Sl1-a,所述改进工程化染色体不通过花粉粒传递。因此,用保持系(B-系)对雄性不育母系(A-系)授粉产生子代,所有的子代都与母系相同并且雄性不育(图15a)。另一方面,保持系自花授粉产生80%的雄性不育和20%雄性可育后代(图15a)。由于存在Ba等位基因,可以通过分选装置分离红/白色种子和蓝色种子,红/白色种子生长时发育成为雄性不育植株,蓝色种子生长时发育成为雄性可育植株。因此,在每个世代中仅种植蓝色种子确保所有的保持系植株都是雄性可育。
分离保持系的生长时发育成为雄性不育植株(A-系)红/白色种子与生长时发育成为雄性可育系(B-系)(图1b和15a)的可能性提供了替代的优选方法,以直接从自交保持系的子代得到雄性不育母系的种子。此方法显著降低了母系种子的生产成本。
其它保持系含有一条IREC-HC类型的改进重组工程化染色体(图3b、4b和5b),该改进染色体长臂上携带染色体臂6BL的末端节,该节与该保持系中做为单体附加存在的天然6B染色体规则地配对。这种配对确保所述改进重组工程化染色体在减数分离期间规则分离,由此使之被包含于50%的配子中。由于存在ki-Sl1-a,IREC不通过花粉粒传递。因此,用改进重组保持系(B-系)对雄性不育母系(A-系)授粉产生子代,所有的子代都与母系相同并且雄性不育(图15b)。另一方面,重组保持系自花授粉产生50%的雄性不育和50%雄性可育后代(图15b)。由于存在Ba等位基因,可以通过分选装置分离红/白色种子和蓝色种子,因此,在每个世代中仅种植蓝色种子确保所有的保持系植株都是雄性可育。
在许多其它禾本科植物中和在小麦中,减数分裂时单价(未配对)染色体的着丝粒有时进行横断分裂(错分裂)而不是正常的纵裂,导致单价染色体断裂成为二条具端着丝粒染色体或等臂染色体。单体或单体附加植株即在减数分裂是具有单价染色体的植株中此事件的频率通常较低(几个百分点)。由于EC-H、EC-HR和IEC-HC类型的EC做为单体附加存在于保持系中,它在减数分裂时保持未配对,保持系的自交子代可能有仅具有EC的一条臂的植株。具有长臂ECL(携带Ba和ki-Sl1-a)的植株将是雄性不育的。另一方面,具有短臂ECS(携带Ms和rht等位基因)的植株将是雄性可育的。由于具有ECS的植株未携带ki-Sl1-a等位基因,具有ECS的雄配子可以有功能,或者通过对雌株授粉或者通过自交而由此污染母系。在EC-HR的情况下,具有EC的短臂而缺少长臂的植株对绿麦隆敏感,可以通过对自交保持系的子代施用该除草剂而被选择。在IEC-HC的情况下,具有EC的短臂而缺少长臂的植株产生红/白色种子,可以通过分选装置在自交保持系的子代中从蓝色种子分离。
另一方面,REC-H和IREC-HC类型的重组工程化染色体在减数分裂时与天然6B染色体规则地配对,因此其着丝粒在第二次减数分裂后期仅进行纵裂,不形成具端着丝粒染色体,母系不受雄性可育植株污染。
为增加自交改进重组保持系中生长时发育成为雄性不育植株的种子的比例,有必要将所述改进重组保持系自交,并将子代种子再生长一个季节。此方法中(如图15b描绘)目的种子的数量可以超过70%。在具有IREC-HC类型的改进重组保持系中,可以进行二步选择:首先收获高植株(携带具有rht等位基因的IREC-HC)。在第二次收获中收获矮植株,用种子分选机基于种子的颜色分离它们的种子。红/白色种子缺少IREC-HC,当生长时,发育成为雄性不育母系。
父本(R-系,cv.‘2’)是任何正常的普通小麦或硬粒小麦栽培品种,其天然对雄性能育性Ms-B1等位基因纯合,并且或者对显性Ki-B1等位基因或者对隐性ki-B1等位基因之一(ki-B1-a或ki-B1-n)纯合。
因此,通过示于图13a-b、14a-b和15a-b的流程,快速和有效地生产做为F1子代的普通小麦或硬粒小麦的杂种种子,其全部对雄性不育等位基因杂合(Ms-B1ms-B1)并因此为雄性可育。迄今为止,所有用做父本的栽培品种都可以完全恢复F1杂种的雄性能育性。实施例2:测试普通小麦ms-B1ms-B1基因型中由单份Aegilops searsii的雄性能育性等位基因Ms-Ss1带来的雄性能育性的表达
为测试上述杂种生产系统和雄性不育母本(A-系)保持的可行性,首先有必要产生异源单体附加系,其中将Aegilops searsii的染色体4Ss附加至对雄性不育等位基因ms-B1-c纯合的普通小麦的全套染色体中。这通过将二体4Ss附加系(源自Aegilops searsii acc.TE-10与普通高秆小麦栽培品种中国春的杂交,由Soil and CropScience,Texas A&M University,College Station,Texas的G.Hart教授友好地提供)与半矮普通小麦栽培品种Gamenia的ms-B1-cms-B1-c Rht1Rht1rht2rht2雄性不育基因型(澳大利亚AustralianWinter Cereal Collection,RRM944,Calala Lane,Tamworth,NSW2340的管理者M.MacKay博士友好地提供)杂交而进行,所述二体附加系对Ms-B1、rht1和rht2纯合、携带二份Ms-Ss1和rht-Ss1。得到的F1植株均为杂合Ms-B1ms-B1-c,并携带一条具有Ms-Ss1等位基因的附加的4Ss染色体。将这些植株自交,选择对ms-B1-c纯合的F2植株(由DNA标记的表现型标明)。如预期的那样,所有的整倍体纯合ms-B1-cms-B1-c都是雄性不育的,但那些具有携带Ms-Ss1的一条附加4Ss染色体的纯合植株全都是雄性可育的,表明Ms-Ss1对二份ms-B1-c的完全显性。实施例3:测试对降低高度等位基因Rht1或Rht2纯合的普通小麦植株与等基因但具有携带rht-Ss1等位基因的Ae.searsii的染色体4Ss的植株之间的高度差异
Aegilops searsii是矮高度植物。然而它含有促进增进高度的rht-Ss1等位基因。该等位基因与位于第4组染色体短臂上、距着丝粒约15cM的普通小麦rht等位基因近同源等位(McIntosh,1993)。所述rht-Ss1与位于4SsS末端区的雄性能育性Ms-Ss1等位基因连锁。因为在正常普通小麦背景中,染色体4Ss不与其小麦部分同源染色体配对,所以rht-Ss1和Ms-Ss1等位基因在异源工程化染色体的不同类型中都永久性地连锁。该工程化染色体上存在rht-Ss1等位基因可以促进植株较高,因此可以做为选择标记等位基因,便利于保持系雄性可育后代的差异收获,即收获那些携带工程化染色体的后代。这将在每个世代中在自交保持系的子代中保持雄性可育植株的比例恒定。
为测试rht-Ss1对Rht等位基因之一纯合的普通小麦植株高度的影响,我们将二体4Ss附加系与半矮普通小麦栽培品种Gamenia杂交,在实施例2中对这二者都进行了描述。产生的F1植株都是对Rht等位基因之一杂合并携带具有rht-Ss1等位基因的一条附加的4Ss染色体。将这些植株自交,选择对Rht或者纯合或者杂合的F2植株(由植株高度标明)。所有的整倍体植株都比那些具有携带rht-Ss1等位基因的附加4Ss染色体的植株矮(平均矮6-8cm),表明半矮普通小麦基因型中rht-Ss1的存在促进较高植株的高度,其可以做为选择标记使用。实施例4测试绿麦隆对绿麦隆敏感等位基因su-B1纯合的普通小麦植株和对等基因且亦具有携带显性抗性等位基因Su-Ss1的工程化染色体的植株的影响
普通小麦的不同栽培品种显示对除草剂绿麦隆和尿素的其它苯基衍生物不同的反应;几个携带显性等位基因Su-B1的栽培品种(例如,Cappelle Desprez)是抗性的,而其它携带隐性等位基因su-B1的栽培品种(例如,中国春)是敏感的(Snape等,1991)。该基因位于染色体6B的长臂(6BL)上,距着丝粒约0.5cM。二倍体山羊草属物种(其基因组与小麦的B基因组紧密相关)的不同品系亦展示对绿麦隆的不同反应;虽然绝大多数品系对该除草剂敏感,Ae.searsii的一个品系对该化合物有抗性。由于Ae.searsii的染色体6SsL几乎规则地与高大山羊草的6SlL配对,可以将抗性等位基因转移至工程化染色体EC-H的6SlL臂(图8a、b),由此产生EC-HR类型的工程化染色体。由于染色体臂4SsS和6SsL在正常普通小麦背景中不与它们的小麦部分同源染色体配对,所以Su-Ss1等位基因永久性地与工程化染色体的其它等位基因即Ms-Ss1、rht-Ss1和Ki-Sl1-a连锁。工程化染色体上存在绿麦隆抗性等位基因利于选择性地在自交保持系的子代的每个世代中杀死缺少该工程化染色体的雄性不育植株,而不影响雄性可育保持系植株(具有该工程化染色体)。这将确保在每个世代中仅自交保持系的雄性可育后代可以生长。
为测试绿麦隆对各种基因型的影响,我们以二倍于商业小区推荐的比率将该除草剂喷洒于对除草剂敏感等位基因su-B1纯合的普通小麦和携带绿麦隆抗性等位基因Su-Ss1的Ae.searsii品系的植株。所有携带隐性su-B1等位基因的植株在喷洒后10-14天内死亡,而那些携带显性Su-Ss1等位基因的植株存活。实施例5:蓝糊粉对种子颜色的影响和蓝色种子和红/白色种子之间的分离
普通小麦或硬粒小麦的种子颜色是红色或白色;红色是由于种皮中色素的存在。几个与普通小麦或硬粒小麦相关的物种有蓝色种子品系,这些物种例如一粒小麦、长穗鹅冠草、A.glaucum、A.tricophorum、A.junceum、Secale montanum、黑麦(Secale cereale和Hordeum spontaneum。蓝色色素是由于在胚乳的三倍体糊粉层中产生花色素苷(有关综述参见Zeven,1991)。蓝色素表明糊粉的基因型,该现象已知为异粉性,即用蓝糊粉植株对红/白色种子的植株授粉产生蓝色种子。蓝色由蓝糊粉(Ba)等位基因(在Keppenne和Baenziger1990,按照小麦基因符号共同颁布者R.A.McIntosh博士命名)决定,该等位基因位于一粒小麦染色体4Am或E.pontica的4E的长臂上(Zeven,1991)。大麦中Ba基因座(命名为B1)位于染色体4H的长臂上,距着丝粒29cM(Grain Genes数据库,ref:BCN-25-93)。因此,基于小麦科(Triticeae)物种中存在的基因syntheny,设想在一粒小麦和E.pontica中该基因亦位于距着丝粒大约相同的距离。普通小麦的4Am或4E单体附加系的种子是蓝色的,表明Ba等位基因完全显性。该等位基因有剂量效应,由颜色的强度度揭示:三份Ba产生深蓝色种子,二份(由该等位基因通过雌配子传递形成)产生中等蓝色种子,而一份(由该等位基因通过雄配子传递造成)产生浅蓝色种子。植株生长的环境(例如灌浆期干燥和温暖条件)以及植株的遗传背景可以降低Ba等位基因的表达,导致具有一份Ba的种子的一些错分类。具有二份或三份Ba的种子一向分类正确。将或者为Ba-E1或者为Ba-Am1的Ba等位基因易位至原先不与其小麦部分同源染色体配对的异源重组工程化染色体。因此,可以将与Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因或与Ms-Am1和rht-Am1等位基因以及与ki-Sl1-a等位基因永久连锁的Ba等位基因用做优秀的选择标记。通过使用分选装置(例如Sortex 5000)将蓝色种子与红/白色种子分离。它可以用于分离大量的种子,因此可以用于商业应用。实施例6:测试由普通小麦显性雄配子杀伤等位基因Ki-B1杀伤携带ki-Sl1-a的花粉
Loegering和Sears(1963)发现普通小麦栽培品种中国春的染色体臂6BL携带杀伤栽培品种Timstein的具有隐性ki等位基因(=ki-B1-a)的花粉粒的显性雄配子杀伤等位基因。在用二个测试品系中国春和Timstein杂交几个普通小麦栽培品种时,他们发现了雄配子杀伤基因基因座有至少三个等位基因:显性Ki(=Ki-B1)、隐性ki(=ki-B1-a)和中性(=ki-B1-n)等位基因。
由于该显性等位基因仅杀伤花粉而不杀伤卵细胞,可以将它用于阻断携带异源显性雄性不育等位基因Ms-Ss1的花粉的传递。这需要在Ms-Ss1和ki-B1-a等位基因之间建立永久连锁。可以通过构建携带这二个等位基因并且一般不与其小麦部分同源染色体配对的异源染色体达到这种连锁。构建这种工程化染色体的必要条件是在一个小麦的野生亲缘之一中隐性雄配子杀伤等位基因的可获得性。
在中国春的背景中产生一系列高大山羊草附加系的同时,本发明人注意到高大山羊草的6号染色体(6Sl)仅在缺乏染色体6B的植株中通过花粉传递。在6Sl单体附加系中在用Alexander试剂(StainTechnology,44:117)染色的花粉中分析花粉败育,显示约20%的败育花粉粒,可假定是那些携带6Sl染色体的花粉粒,而在6SlS单末端体附加系中仅观察到2-3%败育花粉。在自交单体附加植株的子代中未发现二体附加植株。这表明虽然6Sl通过卵细胞的传递未受影响,但存在6B时(即存在Ki-B1时)6Sl通过花粉的传递完全被阻断。假定高大山羊草的几个增加的染色体6Sl携带隐性雄配子杀伤等位基因(本文命名为ki-Sl1-a),携带它的花粉粒易被普通小麦的Ki-B1等位基因杀伤。实施例7:构建包含携带Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因的4SsS和携带ki-Sl1-a等位基因的6SlL的工程化染色体EC-H1
以单份存在于普通小麦中的或者天然或者异源染色体,如在单体或单体附加系中,在减数分裂时可以以低频率进行着丝粒错分裂,即着丝粒的横分裂而不是纵分裂,导致产生一条或二条稳定的具端着丝粒染色体。如果均以单份存在的二条非同源染色体同时进行错分裂,则产生的不同染色体的具端着丝粒染色体可以融合产生易位染色体(Sears,1972)。这种着丝粒融合的频率从小于1%(Sears,1972)至超过23%(Lukaszewski,1993)变化。
我们在构建工程化染色体4SsS/6SlL中利用了这一现象。用携带Ms-Ss1和rht-Ss1的4Ss二体附加系对携带ki-Sl1-a的单体6Sl附加系授粉,产生具有染色体4Ss的F1子代,其1/4亦具有染色体6Sl,即双单体附加系。通过使用DNA探针PSR921和PSR915分别确认了这些植株中4Ss和6Sl的存在。
得到约2000个F2植株,首先通过染色体计数筛选。将单体附加即那些具有2n=43的苗通过DNA标记进行进一步的筛选,以去除那些具有或者4SsL或者6SlS的苗。发现几个植株具有4SsS和6SlL。C-带分析确认目的着丝粒融合的存在。
如所预期的,该染色体不通过花粉粒传递,由那些携带所述工程化染色体做为单体附加系的植株对整倍体植株授粉仅产生整倍体子代,而单体附加系自交产生的约20%的苗具有43条染色体。实施例8:构建包含携带Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因的4SsS和携带Su-Ss1 ki-Sl1-a等位基因的6SlL的工程化染色体EC-HR1
为构建工程化染色体EC-HR1,将显性绿麦隆抗性等位基因Su-Ss1从选择的Ae.searsii品系的染色体臂6SsL转移至工程化染色体EC-H1的6SlL中。这通过杂交源自普通小麦栽培品种中国春中的雄性可育保持系的雄性可育母本完成。该母本对ms-B1、su-B1和Ki-B1等位基因纯合,并具有做为单体附加的工程化染色体EC-H1(4SsS/6Sl),该染色体在其短臂上携带Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因、在其长臂上携带su-Sl1ki-Sl1-a等位基因,与其杂交的是二倍体物种Ae.searsii品系,其在染色体6Ss长臂上即在6SsL上携带绿麦隆抗性等位基因、在4SsS上携带Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因。约20%的F1子代具有工程化染色体EC-H1,因此具有2n=29染色体,可以与其它2n=28的F1植株区分。具有工程化染色体的F1植株在第一减数分裂中期时由于工程化染色体(4SsS/6SlL)与Ae.searsii的染色体臂4SsS和6SsL配对而展示26条单价染色体(26’)和一条三价染色体(1”’)。由于EC的4Ss与Ae.searsii的4SsS配对不改变6SlL与6SsL之间EC短臂的等位基因构成,在着丝粒和Su基因座之间交换(cross)和Su与ki位点之间的第二次交换之后,产生了目的EC-HR1染色体。用su-B1纯合的中国春对2n=29的F1植株授粉一次或二次,产生了2n=43(21”+1’)、具有做为单体附加的目的工程化染色体EC-HR1的植株。向自交单体附加植株的子代施用绿麦隆杀死了2n=42的所有植株(缺少EC-HR1并因此缺少绿麦隆抗性等位基因),仅那些2n=43即那些携带EC-HR1的植株未受影响。实施例9:通过着丝粒融合构建异源染色体4SsS/4EL和4SsS/4AmL
我们亦利用着丝粒融合现象产生具有4SsS/4EL和4SsS/4AmL构成的异源染色体。用纯合ms-B1ms-B1Ki-B1Ki-B1并携带Ms-Ss1和rht-Ss1的4Ss二体附加系对具有杂合Ms-B1ms-B1Ki-B1Ki-B1并附加携带Ba-E1等位基因的4E单体的普通小麦附加系授粉,产生具有染色体4Ss的F1子代,其1/4亦具有染色体4E,即双单体附加。分别通过蓝色种子和通过DNA标记确认了4E和4Ss在这些植株中的存在。选择蓝色F2种子(在F1植株上),将其萌发,并通过染色体计数选择目的植株。通过DNA标记对单体附加(2n=43)进行进一步的筛选,以去除那些具有染色体臂4SsL或4ES的植株。发现几个植株具有4Ss和4EL。C-带分析确认了目的着丝粒融合的存在。在产生4SsS/4AmL中,我们用二体(4B)4Am置换系对4Ss单体系授粉,在F1中选择三单体组合:单体4B、4Ss和4Am双单体附加。将选择的F1植株自交,产生双单体4Ss和4Am附加。通过DNA标记和蓝色种子颜色确认了4Ss和4Am在这些植株中的存在。
萌发蓝色F2种子(在F1植株上),通过染色体计数筛选苗。选择单体(2n=43)附加,并通过DNA标记进一步筛选,以去除具有4SsL或4AmS的植株。发现几个植株具有4SsS和4AmL。C-带分析确认了存在目的着丝粒融合染色体。实施例10:包含4SsS(携带Ms-Ss1和rht-Ssl)、6SlL(携带ki-Sl1-a)和6BL的远端区的重组工程化染色体REC-H1的产生存在普通小麦Ph1基因时部分同源染色体臂6BL和6SlL不配对。该显性等位基因位于染色体5B的长臂上,它防止部分同源染色体配对,而允许同源染色体规则配对。通过X射线辐射栽培品种中国春在此基因座诱导隐性突变(ph1b),该突变在纯合条件下不抑制部分同源配对(Sears,1977)。使用该突变诱导部分同源配对和6BL与6SlL之间的重组。
用突变体品系ph1bph1b对其中高大山羊草的一对染色体6Sl置换了普通小麦栽培品种中国春的一对染色体6B的二体6Sl(6B)置换系授粉。将6B单体-6Sl单体置换和杂合Ph1ph1b的F1杂种做为母本与所述突变体品系回交,通过使用DNA探针WPG90(该探针由我们制备,如有需要可以提供)选择ph1b纯合的双单体。用双末端体6BS品系对这些被选择的BC1子代植株授粉产生子代,一些子代是单末端体6BS并对重组染色体6Sl/6BL为单体,即该重组染色体包含6Sl的短臂、6Sl长臂的近端区和6BL的远端区(易位断点距6SlL上ki-Sl1-a的基因座远端)。通过缺乏与6BS配对和通过位于6SlL上、距ki-Sl1-a远端的DNA标记以及6BL远端区的DNA标记对该易位染色体进行选择。将此单末端体6BS-单体6Sl/6BL和显性雄性能育性等位基因Ms-B1纯合、缺少Ki-B1、半合子ki-Sl1-a的选定基因型做为父本,与携带做为单体附加的工程化染色体EC-H1(参见实施例6)的品系杂交。一些子代是三单体,即对6B、4SsS/6SlL和6Sl/6BL为单体,在这些植株中使用DNA标记选择杂合ms-B1-c Ms-B1 Ms-Ss1和Ki-B1ki-Sl1-a。在这些被选择的子代植株中,在这二条易位染色体的6Sl的近端区发生配对,导致产生重组工程化染色体REC-H1(4SsS/6SlL/6BL)。该选择的子代的自交产生有具有6B和REC-H1的双单体植株,它们是纯合ms-B1-c ms-B1-c、半合子Ki-B1和ki-Sl1-a。
类似地,将选定的单末端体6BS-单体6Sl/6BL做为父本与携带做为单体附加的改进工程化染色体IEC-HC1、IEC-HC2和IEC-HC3的品系杂交。每个杂交的一些子代是三单体,即对6B、6Sl/6BL和改进工程化染色体为单体,在这些植株中使用DNA标记选择杂合ms-B1Ms-B1和Ki-B1Ki-B1。在这些被选择的植株中,在这二条易位染色体的6Sl的近端区发生配对,导致产生改进重组工程化染色体IREC-HC1(4SsS/4EL/6SlL/6BL)、IREC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL/6BL)和IREC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL/6BL)。所述选择的植株的自交产生有具有6B和改进重组工程化染色体的双单体植株,它们是纯合ms-B1-cms-B1-c、羊合子Ki-B1和ki-Sl1-a。实施例11:包含4SsS(携带Ms-Ss1和rht-Ss1)、6SlL(携带Su-Ss1和ki-Sl1-a)和6BL的远端区的重组工程化染色体REC-HR1的产生
通过将携带重组工程化染色体REC-H1的单体附加系与携带绿麦隆抗性等位基因Su-Ss1的Ae.searsii品系杂交,选择具有25’+1”的F1植株,并用中国春对它们授粉完成REC-HR1的制备(与实施例8类似)。实施例12:制备改进工程化染色体IEC-HC1(4SsS/4EL/6SlL)、IEC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL)和IEC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL)
制备这些改进工程化染色体涉及产生6SlL的远端区(携带ki-Sl1-a等位基因)与着丝粒融合染色体的4EL或4AmL部分同源区之间的末端易位互换。易位断点位于4EL或4AmL的Ba等位基因(距着丝粒约30cM)与6SlL的ki-Sl1-a等位基因(距着丝粒约50cM)之间。
在几种情况下,通过使用X射线或热中子辐射种子或花粉粒诱导末端易位(有关综述参见Keppenne和Baenziger,1990;Sharma和Knott,1966)。热中子在诱导易位方面更有效,并且不引起萌发减少。
对着丝粒融合染色体4SsS/6SlL为单体附加(参见实施例6)、对ms-B1和Ki-B1等位基因纯合、携带Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a的植株由以下之一授粉,(ⅰ)融合染色体4SsS/4EL或4SsS/4AmL单体附加、ms-B1和Ki-B1纯合并分别携带Ms-Ss1、rht-Ss1和Ba-E1或Ba-Am1,或(ⅱ)4Am单体附加并亦携带Ms-Am1、rht-Am1和Ba-Am1。根据亲本的组合,F1子代亦具有二体S附加和双单体L附加4SsS/6SlL+4SsS/4EL、4SsS/6SlL+4SsS/4AmL或4SsS/6SlL+4Am。选择了大量的蓝色种子并用1013Nth cm-2的热中子辐射。萌发处理的种子,通过染色体计数和通过DNA标记选择单体附加。使这些植株自交,在其子代中选择蓝色种子,所述种子生长时发育成为雄性可育植株,所有的植株都携带目的易位。实施例13:将目的普通小麦或硬粒小麦栽培品种转化成为雄性不育母系和具有或者EC-H、EC-HR或者IEC-HC的保持系
在图16a、17a和18a中图解描述了将目的普通小麦栽培品种转化成为雄性不育母本系和保持系的程序,其中现有的母系和保持系的等位基因互补物被目的栽培品种的等位基因互补物取代,以提供具有目的栽培品种等位基因互补物的雄性不育母系和保持系或改进保持系。
在此程序中,用纯合Ms-B1Ms-B1和ki-B1-aki-B1-a纯合的目的栽培品种对具有EC-H1、EC-HR1或一种类型的IEC-HC的保持系授粉,该保持系对隐性雄性不育等位基因ms-B1-c和对显性雄配子杀伤等位基因Ki-B1纯合、具有做为单体附加的携带显性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1以及隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a的异源工程化染色体4SsS/6SlL(在EC-HR1的情况下亦携带Su-Ss1等位基因)、或分别携带显性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1、显性蓝糊粉Ba-E1和隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a,Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a等位基因或Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a等位基因的改进工程化染色体4SsS/4EL/6SlL、4SsS/4AmL/6SlL或4AmS-4AmL/6SlL。F1杂种均对雄性不育等位基因Ms-B1m-B1-c和对雄配子杀伤等位基因Ki-B1ki-B1-a杂合,一些亦携带工程化染色体。选择这些植株并用目的栽培品种再次授粉产生BC1子代,其1/4为杂合Ms-B1ms-B1-cKi-B1ki-B1-a,其一部分亦具有工程化染色体。通过染色体计数选择单体附加苗(即选择具有2n=43的苗)。通过使用DNA标记和子代测试确定这二个基因座的杂合性。将所选择的子代植株做为雌株与目的栽培品种进一步回交四个连续世代,产生第五代回交子代(BC5)。在每个世代如对BC1子代所述分析子代,选择杂合Ms-B1ms-B1-cKi-B1ki-B1-a、具有做为单体附加的工程化染色体的植株。BC5自交产生子代,其3/64是纯合m-B1-cms-B1-cKi-B1Ki-B1,是目的雄性不育母系。所述子代的另一组(1/80)具有类似的基因型并具有工程化染色体,是目的保持系。实施例14:将目的普通小麦或硬粒小麦栽培品种转化成为雄性不育母系和具有或者REC-H、REC-HR或者IREC-HC的重组保持系
在图16b、17b和18b中图解描述了将目的普通小麦栽培品种转化成为雄性不育母本系和重组保持系的程序,其中现有的母系和保持系的等位基因互补物被目的栽培品种的等位基因互补物取代,以提供具有目的栽培品种等位基因互补物的雄性不育母系和重组保持系。
在此程序中,用纯合Ms-B1Ms-B1和ki-B1和ki-B1-aki-B1-a纯合的目的栽培品种对6B单体-4SsS/6SlL/6BL单体置换的重组保持系授粉,该保持系对隐性雄性不育等位基因ms-B1-c纯合、具有显性雄性能育性等位基因Ms-Ss1、对显性雄配子杀伤等位基因Ki-B1以及隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a(在REC-HR1的情况下亦对Su-Ss1等位基因)为半合子、或是改进重组工程化染色体单体置换的改进重组保持系之一,所述改进重组工程化染色体是分别携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a等位基因,Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a等位基因或Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a等位基因的或者4SsS/4EL/6SlL/6BL、4SsS/4AmL/6SlL/6BL或4AmS-4AmL/6SlL/6BL。F1杂种均对雄性不育等位基因杂合(Ms-B1ms-B1-c),其1/2对6B(从其父本接受该染色体,因此对ki-B1-a为半合子)和REC或IREC为双单体,1/2为二体6B和杂合Ki-B1ki-B1-a。选择这些二体和双单体植株,并用目的栽培品种授粉产生BC1子代,其1/2为杂合Ms-B1ms-B1-c。该BC1子代包含二种类型:一种类型源自对双单体F1植株授粉,其1/2对6B(因此对ki-B1-a为半合子)和REC或IREC为双单体;另一种类型源自对二体F1植株授粉,其一半是杂合Ki-B1ki-B1-a。将通过细胞学分析和通过使用DNA标记选择的杂合Ms-B1ms-B1-c BC1植株做为雌株与目的栽培品种进一步回交四个连续世代产生第五代回交子代(BC5),其中所述BC1植株为6B单体-或者4SsS/6SlL/6BL、4SsS/4EL/6SlL/6BL、4SsS/4AmL/6SlL/6BL或4AmS-4AmL/6SlL/6BL单体置换和杂合Ki-B1ki-B1-a的二体6B。在每个世代如对BC1子代所述分析子代,选择杂合Ms-B1ms-B1-c和或者半合子ki-B1-a、具有做为单体附加的REC或IREC或者二体6B、杂合Ki-B1ki-B1-a的植株。然后用二体6B BC5对所选择的双单体6B-REC或IREC BC5植株授粉产生BC5F2子代,其1/8是双单体6B-REC或IREC、携带ms-B1-cms-B1-c Ms-Ss1 Ki-B1和ki-Sl1-a,分别或者是目的重组保持系或者是改进重组保持系,1/8是具有ms-B1-cms-B1-c和Ki-B1ki-B1-a的二体,是目的雄性不育母系。
参考文献Driscoll,C.J.(1972)Crop Sci.12:516-517.Driscoll,C.J.,(1985)Crop Sci.25,1115-1116.Franckowiak,J.D.,Maan,S.S.和Williams,N.D.(1976)Crop.Sci.16:725-728.Hermsen,J.G.Th(1965)Euphytica 14:221-224.Keppenne,V.D.和Baenziger,P.S.(1990)Genome 33:525-529.Kihara,H.(1951)Cytologia 16:117-193.Loegering,W.Q.和Sears,E.R.(1963)Can.J.Genet.Cytol.5:65-72.Lukaszewski,A.J.(1993)Genome 36:821-824.McIntosh,R.A.(1998)Proc.8th Int.Wheat Genet.Symp.,Beijing,China.1333-1500页.Sasakuma,T.,Mann,S.S.和Williams,N.D.(1978)Crop Science18:850-853.Sears,E.R.(1972)Stadler Symposium 4:23-38.Sears,E.R.(1977)Can.J.Genet.Cytol.19:585-593.Sharma,D.和Knott,D.R.(1966)Can.J.Genet.Cytol.8:137-143.Snape,J.W.,Leckie,D.,Parker,B.B.和Nevo,E.(1991)载于Casely,J.C.,Cussans,G.W.和Atkin,R.K.(编辑)杂草和作物的除草剂抗性,Butterworth-Heinemann,Oxford,第305-317页.Tsujimoto,H.和Tsunewaki,K.(1983)Proc.6th Int.Wheat Genet.Symp.,Kyoto,日本.第1077-1081页Wilson,P.和Driscoll,C.J.(1983)载于Frenkel.R.(编辑)理论和应用遗传学专题,第6卷,Heterosis,Springer-Verlag,第294-123页.Zeven,A.C.(1991)Euphytica 56:243-258[有关Pugsley和Oram,1959;Fossatii和Ingold,1970;和Driscoll,1977参见Wilson和Driscoll,1983的上述综述]
Claims (62)
1.保持普通小麦或硬粒小麦雄性不育母本系以用于杂交小麦生产的方法,所述方法包括:
(a)用父本杂交母本,所述母本是对染色体4B短臂(4BS)上的任何一个隐性ms-Bl雄性不育等位基因纯合并对染色体6B长臂(6BL)上的显性雄配子杀伤Ki-Bl等位基因纯合的雄性不育植株,所述父本是保持系并与母本等基因,且对母本相同的ms-Bl和Ki-Bl等位基因纯合,并且具有选自以下的一条附加的异源工程化染色体:(ⅰ)本文称为EC的工程化染色体,由源自二条或多条不同的异源染色体的节组成,携带显性雄性能育性等位基因Ms、对6BL上的天然雄配子杀伤等位基因的杀伤作用敏感的隐性等位基因ki以及一个或二个通过其可以选择具有该染色体的植株的选择标记;和(ⅱ)本文称为IEC的改进工程化染色体,由源自二条或多条不同的异源染色体的节组成,除携带Ms、ki和选择标记等位基因之外,还携带种子标记,通过该种子标记可以将具有该染色体的种子与不具有该染色体的种子分离;和
(b)从(a)的杂交收获子代种子,所有的种子均对所述雄性不育和雄配子杀伤等位基因纯合,并且缺乏所述工程化染色体EC或IEC,所述种子当生长时发育成为雄性不育母系。
2.按照权利要求1的方法,其中本文命名为EC-H的所述工程化染色体携带决定正常植株高度的选择标记rht等位基因。
3.按照权利要求1的方法,其中本文命名为IEC-HC的所述改进工程化染色体携带做为选择标记的rht等位基因和做为种子标记的决定种子蓝色的Ba等位基因。
4.按照权利要求2的方法,其中所述工程化染色体EC-H是由4SsS/6SlL组成、在短臂上携带Ms-Ss1和rht-Ss1、在长臂上携带ki-Ss1-a的工程化染色体EC-H1。
5.按照权利要求3的方法,其中所述改进工程化染色体IEC-HC选自IEC-HC1、IEC-HC2和IEC-HC3,IEC-HC1由4SsS/4EL/6SlL组成,携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a;IEC-HC2由4SsS/4AmL/6SlL组成,携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和和ki-Sl1-a;IEC-HC3由4AmL-4AmL/6SlL组成,携带Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a。
6.保持普通小麦或硬粒小麦雄性不育母本系以用于杂交小麦生产的方法,所述方法包括:
(a)用父本杂交母本,所述母本是对染色体4B短臂(4BS)上任何一个隐性ms-B1雄性不育等位基因纯合并对染色体6B长臂(6BL)上的显性雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合的雄性不育植株,所述父本是保持系并与母本等基因,且对母本的同一ms-B1等位基因纯合,但对携带Ki-B1等位基因的染色体6B和选自以下的重组工程化染色体为单体:(ⅰ)本文称为REC的重组工程化染色体,由源自二条或多条不同的异源染色体的节和天然染色体臂6BL的远端节组成,携带Ms等位基因、ki等位基因和一个或二个通过其可以选择具有该染色体的植株的选择标记;和(ⅱ)本文称为IREC的改进重组工程化染色体,由源自二条或多条不同的异源染色体的节和天然染色体臂6BL的远端节组成,除携带Ms、ki和选择标记等位基因之外,还携带种子标记,通过该种子标记可以将具有该染色体的种子与不具有该染色体的种子分离;和
(b)从(a)的杂交收获子代种子,所有的种子均对所述雄性不育和雄配子杀伤等位基因纯合,并且缺乏重组工程化染色体REC或IREC,所述种子当生长时发育成为雄性不育母系。
7.按照权利要求6的方法,其中本文命名为REC-H的所述重组工程化染色体携带决定正常植株高度的选择标记rht等位基因。
8.按照权利要求6的方法,其中本文命名为IREC-HC的所述改进重组工程化染色体携带做为选择标记的rht等位基因和做为种子标记的决定种子蓝色的Ba等位基因。
9.按照权利要求7的方法,其中所述重组工程化染色体是REC-H是由4SsS/6SlL/6BL组成、在短臂上携带Ms-Ss1和rht-Ss1、在长臂上携带ki-Ss1-a的重组工程化染色体REC-H1。
10.按照权利要求8的方法,其中所述改进重组工程化染色体IREC-HC选自IREC-HC1、IREC-HC2和IREC-HC3,IREC-HC1由4SsS/4EL/6SlL/6BL组成,携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a;IREC-HC2由4SsS/4AmL/6SlL/6BL组成,携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a;而IREC-HC3由4AmL-4AmL/6SlL/6BL组成,携带Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a。
11.按照权利要求2的方法,其中所述工程化染色体EC-H携带做为再一选择标记的绿麦隆抗性等位基因Su,所述工程化染色体本文命名为EC-HR。
12.按照权利要求11的方法,其中所述工程化染色体EC-HR携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a,所述工程化染色体本文命名为EC-HR1。
13.按照权利要求7的方法,其中所述重组工程化染色体REC-H携带做为再一选择标记的绿麦隆抗性等位基因Su,所述重组工程化染色体本文命名为REC-HR。
14.按照权利要求13的方法,其中所述重组工程化染色体REC-HR由携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a的4SsS/6SlL/6BL组成,所述重组工程化染色体本文命名为REC-HR1。
15.保持普通小麦或硬粒小麦雄性不育母本系以用于杂交小麦生产的方法,所述方法包括:
(a)将保持系自交,所述保持系与母本等基因,即对任何一个隐性ms-Bl雄性不育等位基因和显性雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合,并且具有本文命名为IEC的一条附加的改进工程化染色体,除携带Ms、ki和选择标记等位基因之外,还携带种子标记,通过该种子标记可以将具有所述染色体IEC的种子与不具有该染色体的种子分离;
(b)从(a)的自交植株收获子代种子,所有的种子均对所述雄性不育和雄配子杀伤等位基因纯合;和
(c)分离具有IEC并因此具有种子标记的种子(20%)与不具有IEC因此缺少种子标记的种子(80%),所述缺少该种子标记的种子生长时发育成为雄性不育母系。
16.按照权利要求15的方法,其中所述种子标记等位基因是决定蓝色种子颜色的Ba等位基因,通过分选装置分离蓝色种子与缺少Ba等位基因的红/白色种子。
17.按照权利要求15或16的方法,其中所述改进工程化染色体IEC选自IEC-HC1、IEC-HC2和IEC-HC3,IEC-HC1由4Ss/4EL/6SlL组成,携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a; IEC-HC2由4Ss/4AmL/6SlL组成,携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a;IEC-HC3由4AmL-4AmL/6SlL组成,携带Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a。
18.保持普通小麦或硬粒小麦雄性不育母本系以用于杂交小麦生产的方法,所述方法包括:
(a)将改进重组保持系自交,所述保持系与母本等基因,即对4BS上的任何一个隐性ms-B1雄性不育等位基因纯合,但对携带Ki-B1等位基因的染色体6B和对本文命名为IREC的改进重组工程化染色体为单体,所述IREC除携带Ms、ki和选择标记等位基因之外,还携带种子标记,通过该种子标记可以将具有所述染色体IREC的种子与不具有该染色体的种子分离;
(b)从所述(a)的自交植株收获子代种子,所有的种子均对所述雄性不育等位基因纯合,50%的种子对染色体6B为二体且缺乏IREC和种子标记,50%具有IREC并显示该种子标记。
(c)种植混合的(b)的子代种子,使雄性可育植株对雄性不育植株授粉并使雄性可育植株自花授粉,产生混合的子代种子;和
(d)分离约75%的对染色体6B二体并且缺乏IREC和种子标记、生长时发育成为所述雄性不育母系的种子和剩余的25%具有IREC和种子标记的种子。
19.按照权利要求18的方法,其中所述父系(male)种子标记等位基因是决定蓝色种子颜色的Ba等位基因,通过分选装置分离蓝色种子与缺少Ba等位基因的红/白色种子。
20.按照权利要求18或19的方法,其中所述改进重组工程化染色体IREC选自IREC-HC1、IREC-HC2和IREC-HC3,IREC-HC1由4SsS/4EL/6SlL/6BL组成,携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a;IREC-HC2由4SsS/4AmL/6SlL/6BL组成,携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a;而IREC-HC3由4AmS-4AmL/6SlL/6BL组成,携带Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a。
21.选自普通小麦或硬粒小麦雄性可育保持系和改进雄性可育保持系,以保持用于杂交小麦生产的雄性不育母本系的保持系,所述保持系或改进保持系与所述母本等基因,并对母本的任何一个ms-B1雄性不育等位基因、雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合,且具有一条附加的异源工程化染色体,该染色体选自:(ⅰ)EC,由源自二条或多条不同异源染色体的节组成,携带显性雄性能育性等位基因Ms、对6BL上的天然雄配子杀伤等位基因的杀伤作用敏感的隐性等位基因ki和通过其可以选择具有所述染色体EC的植株的选择标记;和(ⅱ)IEC,由源自二条或多条不同异源染色体的节组成,除携带Ms、ki和选择标记等位基因之外,还携带通过将其可以选择具有所述染色体IEC的种子与不具有该染色体的种子分离的种子标记;
22.选自普通小麦或硬粒小麦重组雄性可育保持系和改进重组雄性可育保持系,以保持用于杂交小麦生产的雄性不育母本系的保持系,所述保持系或改进保持系与所述母本等基因,并对任何一个ms-B1雄性不育等位基因纯合、但对携带Ki-B1等位基因的染色体6B和重组或改进重组工程化染色体为单体,该染色体选自:(ⅰ)REC,由二条或多条不同异源染色体的节和天然染色体臂6BL远端节组成,携带Ms等位基因、ki等位基因和通过其可以选择具有所述染色体REC的植株的选择标记;和(ⅱ)IREC,由源自二条或多条不同异源染色体的节和天然染色体臂6BL远端节组成,除携带Ms、ki和选择标记等位基因之外,还携带通过其可以将具有所述染色体IREC的种子与不具有该染色体种子分离的种子标记;
23.按照权利要求21或22的保持系,其中所述工程化染色体EC-H、IEC-HC、REC-H或IREC-HC携带做为选择标记的决定正常植株高度的rht等位基因。
24.按照权利要求21-23的保持系,其中所述染色体IEC-H或IREC-HC携带做为选择种子标记的蓝糊粉颜色的Ba等位基因。
25.按照权利要求23或24的保持系,其中工程化染色体选自:(ⅰ)REC-H1,携带Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a;和(ⅱ)IREC-HC之一,携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a或Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a或Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a。
26.用于保持用于杂交小麦生产的雄性不育母本系的选自普通小麦或硬粒小麦雄性可育保持系的保持系,所述保持系与所述母本等基因,并对母本的任何一个ms-B1雄性不育等位基因、绿麦隆除草剂敏感性等位基因su-B1和雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合,且具有选自EC-HR类型的一条附加的异源工程化染色体,该染色体由源自二条或多条不同异源染色体的节组成,携带显性雄性能育性等位基因Ms、对6BL上的天然雄配子杀伤等位基因的杀伤作用敏感的隐性等位基因ki和二个选择标记rht(决定正常植株高度)和Su(决定对绿麦隆抗性)等位基因,通过所述选择标记可以选择具有所述染色体EC-HR的植株。
27.按照权利要求26的保持系,其中所述工程化染色体是携带做为选择标记的rht-Ss1和Su-Ss1等位基因的EC-HR1类型。
28.用于保持用于杂交小麦生产的雄性不育母本系的选自普通小麦或硬粒小麦雄性可育重组保持系的保持系,所述保持系与所述母本等基因,即对任何一个ms-B1雄性不育等位基因纯合、但对携带su-B1和Ki-B1等位基因的染色体6B和选自REC-HR类型的重组工程化染色体为单体,该重组工程化染色体由源自二条或多条不同异源染色体的节和天然染色体臂6BL的远端节组成,携带Ms等位基因、ki等位基因和选择标记,通过所述选择标记可以选择具有所述染色体REC-HR的植株。
29.按照权利要求28的保持系,其中所述工程化染色体是携带做为选择标记的决定正常植株高度的rht-Ss1等位基因和赋予对绿麦隆抗性的Su-Ss1等位基因的REC-HR1类型。
30.在普通小麦或硬粒小麦的保持系或重组保持系每个世代中保持雄性可育与雄性不育植株比例恒定的方法,包括:
(a)使具有工程化染色体的雄性可育保持系自交,该染色体选自工程化染色体EC-H和重组工程化染色体REC-H,除携带Ms和ki等位基因之外,还携带至少一个选择标记等位基因,该标记便于从该雄性可育自交保持系的子代中选择种子,所述种子生长时发育成为所述保持系;
(b)收集(a)的子代种子并种植所述种子,由此产生植株,其20%(具有工程化染色体EC-H的保持系子代)和50%(具有重组工程化染色体REC-H的保持系子代)具有所述工程化染色体,与所述保持系相同,因此携带所述选择标记等位基因,通过该选择标记等位基因可以从缺少所述工程化染色体的那些植株选择它们;和
(c)收获(b)的展示选择标记的植株,它们都是雄性可育,得到子代种子中有20%(具有工程化染色体EC-H的保持系子代)或50%(具有重组工程化染色体REC-H的保持系子代)的种子携带所述工程化染色体,由此保持保持系或重组保持系每个世代中雄性可育与雄性不育植株的比例恒定。
31.按照权利要求30的方法,其中所述选择标记是增进植株高度的rht等位基因,由此便于选择性收获雄性可育保持系的种子,所述种子生长时发育成为所述保持系。
32.在普通小麦或硬粒小麦的保持系或重组保持系每个世代中保持雄性可育与雄性不育植株比例恒定的方法,包括:
(a)使具有工程化染色体的雄性可育保持系自交,该染色体选自工程化染色体EC-HR和重组工程化染色体REC-HR,除携带Ms-Ss1和ki-Sl1-a等位基因之外,还携带做为选择标记的除草剂抗性等位基因,该标记便于从该自交保持系的雄性可育子代中选择具有同样所述保持系基因型的植株;
(b)收集(a)的子代种子,萌发所述种子成为子代苗,其20%(EC-HR)和50%(REC-HR)具有所述工程化染色体,用除草剂喷洒所述苗,由此杀伤所有的敏感苗,即那些缺少所述工程化染色体的苗;和
(c)收获(b)的除草剂抗性植株,它们都携带所述工程化染色体并因此是雄性可育,得到子代种子中有20%(EC-HR)或50%(REC-HR)的种子携带所述工程化染色体,由此保持保持系或重组保持系每个世代中雄性可育与雄性不育植株的比例恒定。
33.按照权利要求32的方法,其中所述可选择除草剂抗性等位基因是赋予对绿麦隆抗性的Su-Ss1等位基因。
34.在普通小麦或硬粒小麦的改进保持系或改进重组保持系中仅种植雄性可育保持系植株的方法,包括:
(a)使具有工程化染色体的雄性可育保持系自交,该染色体选自改进工程化染色体IEC-HC和改进重组工程化染色体IREC-HC,除携带Ms-Ss1和ki-Sl1-a等位基因之外,还携带种子标记,通过该标记可以在自交雄性可育的所述保持系的子代中从不具有所述工程化染色体的种子选择具有该染色体的种子,所述种子生长时发育成为所述保持系;
(b)收集(a)的子代种子并借助分选装置从未展示所述标记的种子分离展示该种子标记的种子;和
(c)种植(b)的展示种子标记的种子,它们均发育成为雄性可育改进保持系或改进重组保持系植株。
35.按照权利要求34的方法,其中所述种子标记是决定种子蓝色的Ba等位基因。
36.产生具有工程化染色体EC-H1的普通小麦或硬粒小麦雄性可育保持系的方法,所述方法包括:
(a)将源自普通小麦栽培品种中国春的雄性可育母本与父本杂交,所述母本对染色体臂4BS上显性Ms-B1雄性能育性等位基因和6BL上的显性Ki-B1雄配子杀伤等位基因纯合,并且具有在其长臂上携带隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a的附加异源染色体6Sl,所述父本与母本等基因但对隐性ms-B1-c雄性不育等位基因纯合、并而具有在其短臂上携带显性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的一条附加的异源染色体4Ss,而不是缺少染色体6Sl;
(b)从(a)的杂交收集子代种子,并种植所述种子,由此产生雄性可育F1植株,一部分为双单体附加,即它们具有二条异源染色体,携带MS-Ss1和rht-Ss1的4Ss和携带ki-Sl1-a的6Sl;
(c)自交(b)的所述F1子代,收集其大量的子代种子并种植所述种子,由此产生F2植株,其一部分是异源易位工程化染色体EC-H1单体附加,其25%对ms-B1-c雄性不育等位基因纯合并且是所需植株;
(d)通过染色体计数、C-带和使用DNA标记选择(c)的所述所需植株,将其自交;
(e)收集(d)的自交子代种子并种植所述种子,由此产生F3植株,它们都对ms-B1-c雄性不育等位基因纯合,25%由于它们亦具有所述附加的异源工程化染色体EC-H1而为雄性可育,这些即是所需保持系植株;和
(f)通过染色体计数和使用DNA标记选择(e)的所需保持系植株。
37.产生具有重组工程化染色体REC-H1的普通小麦或硬粒小麦雄性可育重组保持系的方法,所述方法包括:
(a)将源自普通小麦栽培品种中国春的雄性可育母本与父本杂交,所述母本对染色体臂4BS上显性Ms-B1雄性能育性等位基因和染色体臂5BL上的显性部分同源配对抑制基因等位基因Ph1纯合,对染色体6B为缺对染色体并因此缺乏显性Ki-B1雄配子杀伤等位基因,并且具有一对携带隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a的6Sl染色体,所述父本与母本等基因,但却是二体6B并因此对Ki-B1纯合、缺少染色体6Sl,亦对突变部分同源配对等位基因ph1b纯合;
(b)从(a)的杂交收获子代种子,并种植所述种子,由此产生对部分同源配对等位基因杂合的(Ph1ph1b)雄性可育(Ms-B1Ms-B1)F1植株,它们对6B和6Sl染色体均为单体;
(c)将所述(b)的F1植株与父本回交;
(d)收集(c)杂交的子代种子并种植所述种子,由此产生BC1植株,它们均为雄性可育(Ms-B1Ms-B1),其50%对ph1b等位基因纯合,其中约50%对6B和6Sl染色体为双单体,是所需BC1植株;
(e)通过使用DNA标记和分析减数分裂时染色体配对选择(d)的所需BC1植株,用与BC1植株等基因但为纯合Ph1Ph1的双端着丝粒6BS品系对其授粉;
(f)收集(e)的杂交子代种子并种植所述种子,由此产生植株,其全部对染色体臂6BS为单端着丝粒,其一部分亦对由6Sl的短臂和长臂的近端区(携带ki-Sl1-a)和染色体臂6BL的远端区组成的重组染色体(重组点居ki-Sl1-a远端)为单体,是所需植株;
(g)通过C-带、使用DNA标记和分析染色体配对选择(f)的所述所需植株,将它们做为父本与母系杂交,该母系是非重组保持系,即对任何一个隐性雄性不育等位基因ms-B1和显性雄配子杀伤等位基因Ki-B1纯合,并具有工程化染色体EC-H1;
(h)从(g)的杂交收获子代种子,并种植所述种子,由此产生F1植株,其一部分为三单体,即对6B、异源工程化染色体EC-H1和重组染色体(6Sl/6BL)为单体,是杂合Ms-B1ms-B1、半合子Ki-B1和纯合ki-Sl1-aki-Sl1-a,是所需植株;和
(i)通过染色体计数、C-带和通过使用DNA标记选择(h)的所述所需植株,将其自交,收集子代种子并种植所述种子,由此产生F2植株,其一部分为双单体,具有染色体6B和重组工程化染色体REC-H1,携带Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a,这些即是所需保持系植株。
38.产生具有工程化染色体EC-HR1的普通小麦或硬粒小麦雄性可育保持系的方法,包括:
(a)将源自普通小麦栽培品种中国春中的雄性可育保持系的雄性可育母本与二倍体物种Aegilops searsii的品系杂交,所述母本对隐性ms-B1雄性不育等位基因、隐性绿麦隆敏感性等位基因su-B1和显性Ki-B1雄配子杀伤等位基因纯合,并且具有做为单体附加的工程化染色体EC-H1,该染色体在其短臂上携带显性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和半显性rht-Ss1等位基因、在其长臂上携带隐性绿麦隆敏感性等位基因su-Sl1和隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a,所述二倍体物种Aegilops searsii在6SsL上具有显性绿麦隆抗性等位基因Su-Ss1并在4SsS上具有Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因;
(b)从(a)的杂交收获子代种子并种植所述种子,由此产生F1植株,其一部分具有2n=29染色体,即它们具有中国春的一套染色体、工程化染色体EC-H1和Aegilops searsiii的一套染色体,基因型为ms-B1Ms-Ss1Ms-Ss1,ki-B1ki-Sl1-a和su-B1su-Sl1Su-Ss1;
(c)选择(b)的具有2n=29染色体的所述F1子代,将其与做为父本的cv.CS回交,收集其子代种子并种植所述种子,由此产生BC1植株,其一部分对绿麦隆抗性的植株是工程化染色体EC-HR1单体附加,它们均是ms-B1Ms-B1杂合并对su-B1和Ki-B1纯合,是所需植株;
(d)通过染色体计数和使用DNA标记选择(c)的所述所需植株,将其自交;
(e)收集(d)的自交子代种子并种植所述种子,由此产生BC1F2植株,其20%对绿麦隆有抗性,即携带所述工程化染色体,25%的抗性植株对ms-B1纯合,但是由于它们携带工程化染色体EC-HR1的Ms-Ss1而为雄性可育,这些即是所需保持系植株;和
(f)通过对绿麦隆的抗性和使用DNA标记选择(e)的所需保持系植株。
39.产生具有重组工程化染色体REC-HR1的普通小麦或硬粒小麦雄性可育重组保持系的方法,包括:
(a)用源自普通小麦栽培品种中国春中的雄性可育重组保持系的雄性可育母本与二倍体物种Aegilops searsii的品系杂交,该母本是单体6B单体附加REC-H1,所述母本对隐性ms-B1雄性不育等位基因纯合、对隐性绿麦隆敏感性等位基因su-B1和显性Ki-B1雄配子杀伤等位基因为半合子,并且具有做为单体附加的工程化染色体REC-H1,该染色体在其短臂上携带显性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和半显性rht-Ss1等位基因、在其长臂上携带隐性绿麦隆敏感性等位基因su-Sl1和隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a,所述二倍体物种Aegilops searsii品系具有显性绿麦隆抗性等位基因Su-Ss1以及Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因;
(b)从(a)的杂交收获子代种子并种植所述种子,由此产生F1植株,其50%具有所述重组工程化染色体,该染色体与4SsS和6SsS配对,因此在减数分裂时形成三价染色体,具有基因型ms-B1Ms-ss1Ms-Ss1,ki-sl1-a Su-Sl1和Su-Sl;
(c)选择(b)的所述F1子代并将其与做为父本的cv.中国春回交;
(d)收集其子代种子并种植所述种子,由此产生BC1植株,它们均为杂合ms-B1Ms-B1并因此为雄性可育,一些植株是单体6B并由此对su-B1和Ki-B1为半合子,并具有做为单体置换的在短臂上携带Ms-Ss1和rht-Ss1、在长臂上携带Su-Ss1和ki-Sl1-a的重组工程化染色体REC-HR1,是所需植株;
(e)通过对绿麦隆的抗性和通过分析减数分裂时染色体配对选择(c)的所述所需植株,将其自交;
(f)收集(d)的自交子代种子并种植所述种子,由此产生BC1F2植株,其50%是单体6B并对重组染色体REC-HR1为单体,染色体REC-HR1由4Ss的短臂(携带Ms-Ss1和rht-Ss1)、6Sl的长臂近端区(携带Su-Ss1和ki-Sl1-a)和染色体臂6BL的远端区组成(重组点居ki-Sl1-a远端),这些植株的25%对ms-B1纯合,对su-B1和Ki-B1为半合子,这些即是所需保持系植株;和
(g)通过绿麦隆的抗性和使用DNA标记选择(e)的所需保持系植株。
40.产生具有改进工程化染色体IEC-HC1的普通小麦或硬粒小麦雄性可育改进保持系的方法,所述方法包括:
(a)将源自普通小麦栽培品种中国春的雄性可育母本与父本杂交,所述母本是保持系,即对染色体臂4BS上隐性ms-B1雄性不育等位基因和染色体臂6BL上的显性Ki-B1雄配子杀伤等位基因纯合,并且具有一条在其短臂上携带显性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1、在其长臂上携带隐性等位基因ki-Sl1-a的附加的工程化染色体EC-H1,所述父本与母本等基因,但对显性雄性能育性等位基因Ms-B1纯合,具有附加的一对异源染色体4E,该染色体在其长臂上携带显性蓝糊粉等位基因Ba-E1;
(b)收集(a)的杂交子代种子,所有的种子都是蓝色的,用热中子辐射种子并种植所述种子,由此产生雄性可育F1植株,它们均为杂合Ms-B1ms-B1并对Ki-B1纯合,其20%是工程化染色体EC-H1和染色体4E的双单体附加,并是所需植株;
(c)通过染色体计数和通过使用DNA标记选择(b)的所述所需F1植株,将其自交;
(d)收集(c)子代种子,选择蓝色种子并种植所述种子,由此产生F2植株,其一部分有43条染色体,这些植株的一部分具有改进工程化染色体IEC-H1,该染色体含有4SsS/4EL/6SlL、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a,是所需植株,其它一些则具有易位染色体4SsS/4EL;
(e)通过染色体计数和通过使用DNA标记选择(d)的所需植株,将其自交;
(f)收集(e)的子代种子并选择蓝色种子,这些种子生长时发育成为雄性可育植株,该植株携带改进工程化染色体IEC-HC1,这些是所需改进保持系植株;
(B)如果步骤(d)未得到所需植株,则通过染色体计数和通过DNA标记选择具有易位染色体4SsS/4EL的(d)的植株(源自蓝色种子,雄性可育),将它们做为父本与具有EC-H1的保持系回交以产生F1种子;
(h)从(g)的所述F1种子中选择蓝色种子,将其用热中子辐射并萌发,选择具有44条染色体的苗,即具有二条异源附加染色体4SsS/4EL和EC-H1(4SsS/6SlL);和
(i)重复步骤(d)-(f),由此得到具有改进工程化染色体IEC-HC1的所需改进保持系,IEC-HC1具有4SsS/4EL/6SlL,携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a。
41.产生具有改进工程化染色体IEC-HC1的普通小麦或硬粒小麦雄性可育改进保持系的方法,所述方法包括:
(a)将源自普通小麦栽培品种中国春的雄性可育母本与父本杂交,所述母本对显性雄性能育性等位基因Ms-B1和显性雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合,并且具有一对在其长臂上携带显性蓝糊粉等位基因Ba-E1的异源染色体4E,所述父本与母本等基因,但对隐性雄性不育等位基因ms-B1-c纯合、具有在其短臂上携带显性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的附加异源染色体4Ss;
(b)收集(a)的杂交子代种子,并种植所述种子,由此产生F1植株,它们均为杂合Ms-B1ms-B1和纯合Ki-B1Ki-B1,其25%是携带染色体4E和4Ss的双单体附加系,是所需植株;
(c)通过染色体计数和通过使用DNA标记选择(b)的所述所需F1植株,将其自交;
(d)选择(c)自交种子中的蓝色种子并种植所述种子,由此产生F2植株,其一部分具有易位染色体4SsS/4EL,是所需植株;
(e)通过染色体计数和通过使用DNA标记选择(d)的所述所需F2植株,将它们做为父本与具有EC-H1(4SsS/6SlL)的保持系杂交得到F1种子,一些种子是蓝色的;
(f)选择(e)的蓝色种子,将它们用热中子辐射并使其生长为F1植株,它们均对ms-B1-c和Ki-B1纯合,少数具有双单体附加4SsS/4EL和EC-H1(4SsS/6SlL),是所需植株;
(g)通过染色体计数和使用DNA标记选择(f)的所述所需植株,将其自交;
(h)收集(g)的子代种子,选择蓝色种子并种植所述种子,由此产生F2植株,它们均对ms-B1-c和Ki-B1纯合,其一部分有43条染色体,这些植株的一部分具有改进工程化染色体IEC-H1,该染色体含有4SsS/4EL/6SlL、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和kj-Sl1,是所需植株;
(i)通过染色体计数、C-带和雄性能育性选择(h)的所需植株,将其自交;和
(j)收集(i)的子代种子并选择蓝色种子,所述种子生长时发育成为携带IEC-HC1的雄性可育植株,这些是所需改进保持系植株。
42.产生具有改进工程化染色体IEC-HC2的普通小麦或硬粒小麦雄性可育改进保持系的方法,所述方法包括:
(a)将普通小麦栽培品种中国春二体置换品系父本与母本杂交,在父本中一粒小麦的染色体4Am置换了普通小麦的染色体4B,因此所述父本缺少雄性能育性等位基因Ms-B1、对雄配子杀伤等位基因Ki-Bl和对4AmS上的Ms-Am1和rh-Am1以及4AmL上的Ba-Am1纯合,所述母本与父本等基因,对隐性ms-B1雄性不育等位基因纯合,并且具有一条在其短臂上携带显性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的附加的异源染色体4Ss;
(b)收集(a)的杂交子代种子,它们均为蓝色,种植所述种子,由此产生F1植株,它们均为半合子ms-B1-c并对Ki-B1纯合,一些是三单体4B、4Ss和4Am并是所需植株;
(c)通过染色体计数选择(b)的所述三单体植株,由此产生雄性可育F1植株,使其自花授粉;
(d)收集(c)的F2种子,选择蓝色种子并种植所述选择的种子,由此产生F2植株,进一步从这些F2植株中选择那些具有44条染色体的植株(在减数分裂时显示21”+2’),这些植株是所需4Ss和4Am双单体附加系;
(e)自交(d)的所述所需植株,由此得到F3种子,选择蓝色种子;
(f)种植(e)的蓝色种子,选择具有43条染色体(21”+1)的植株,它们为雄性可育并产生蓝色种子,这些植株具有易位染色体4SsS/4AmL,是所需植株;
(g)将(f)的所需植株做为父本与做为母本的纯合ms-B1msB1Ki-B1KiB1并具有EC-H1(4SsS/6SlL)、携带Ms-Ss1rht-Ss1ki-Sl1-a的保持系杂交得到F1种子;
(h)从(f)的F1子代种子中选择蓝色种子,将其用热中子辐射并种植,再选择具有44条染色体(21”+1”)的植株,即对异源附加染色体的短臂为二体、对其长臂为双单体,将其自交;
(i)种植(h)的蓝色种子,选择具有43条染色体、产生蓝色和红/白色种子的雄性可育植株,这些植株具有IEC-HC2,是所需植株;和
(j)自交(i)的所需植株,收集其种子并分离蓝色种子,所述种子当生长时,发育成为具有IEC-HC2的雄性可育植株,这些即是所需改进保持系植株。
43.产生具有改进工程化染色体IEC-HC3的普通小麦或硬粒小麦雄性可育改进保持系的方法,所述方法包括:
(a)将普通小麦栽培品种中国春二体置换品系父本与母本杂交,在父本中一粒小麦的染色体4Am置换了普通小麦的染色体4B,因此所述父本缺少雄性能育性等位基因Ms-B1、对雄配子杀伤等位基因Ki-B1和对4AmS上的Ms-Am1和rht-Am1以及4AmL上的Ba-Am1纯合,所述母本与父本等基因、但对隐性ms-B1雄性不育等位基因纯合,并且具有一条在其短臂上携带显性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的附加的异源染色体4Ss;
(b)收集(a)的F1种子,它们均为蓝色并种植所述种子,它们均为半合子ms-B1-c并对Ki-B1纯合,其中75%是单体4B和携带Ms-Am1的4Am单体置换,由此为雄性可育,使用所述单体-单体置换、对杂合Ms-B1ms-B1和纯合Ki-B1等位基因并具有做为单体附加的染色体6Sl的母本授粉,其中通过将附加4Ss单体的ms-B1-cms-B1-c中国春做为父本与Ms-B1和Ki-B1等位基因纯合并具有做为单体附加的染色体6Sl的母本杂交得到所述母本,20%的子代具有所需构造;
(c)收集(b)杂交的蓝色F1种子,用热中子辐射,种植这些种子,从F1植株中选择那些具有43条(21”+1’)和42条(20”+2’)染色体的植株并使这些植株自交;
(d)从(c)的自交种子选择蓝色种子并种植所述种子,选择雄性可育、有约20%不存活花粉并产生蓝色和红/白色种子的植株;和
(e)种植(d)的种子,分离蓝色种子,所述种子当生长时,发育成为具有IEC-HC3的雄性可育植株(具有43条染色体),这些即是所需改进保持系植株。
44.产生具有改进重组工程化染色体IREC-HC的普通小麦或硬粒小麦雄性可育改进保持系的方法,所述方法包括:
(a)将源自普通小麦栽培品种中国春的雄性可育母本与父本杂交,所述母本对染色体臂4BS上显性Ms-B1雄性能育性等位基因和染色体臂5BL上的显性部分同源配对抑制基因等位基因Ph1纯合,对染色体6B为缺对染色体并因此缺乏显性Ki-B1雄配子杀伤等位基因,并且具有一对携带隐性雄配子杀伤等位基因ki-Sl1-a的6Sl染色体,所述父本与母本等基因但却是二体6B并因此对Ki-B1纯合、缺少染色体6Sl、亦对突变部分同源配对等位基因ph1b纯合;
(b)从(a)的杂交收集子代种子并种植所述种子,由此产生对部分同源配对等位基因杂合的(Ph1ph1b)雄性可育(Ms-B1Ms-B1)F1植株,它们对6B和6Sl染色体均为单体;
(c)将(b)的所述F1植株与父本回交;
(d)收集(c)杂交的子代种子并种植所述种子,由此产生BC1植株,它们均为雄性可育(Ms-B1Ms-B1),其1/2对ph1b等位基因纯合,其中约1/2(因为6B与6Sl配对)对6B和6Sl染色体为双单体,是所需BC1植株;
(e)通过减数分裂时染色体配对和通过DNA标记选择(d)的所需BC1植株,将其用与BC1植株等基因但为纯合Ph1Ph1的双端着丝粒6BS品系(即缺少6BL臂)授粉;
(f)收集(e)的杂交子代种子并种植所述种子,由此产生植株,其全部对染色体臂6BS为单端着丝粒,一部分亦对由6Sl的短臂和长臂的近端区(携带ki-Sl1-a)和染色体臂6BL的远端区组成的重组染色体(易位点居ki-Sl1-a远端)为单体,即是所需植株;
(g)通过C-带、通过分析染色体配对和使用DNA标记选择(f)的所述所需植株,将它们做为父本与母系杂交,该母系是改进保持系,即对任何一个隐性雄性不育等位基因ms-B1和显性雄配子杀伤等位基因Ki-B1纯合,并具有下述改进工程化染色体之一:IEC-HC1(4SsS/4EL/6SlL)、IEC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL)或者IEC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL);
(h)从(g)的杂交收集子代种子并种植所述种子,由此产生F1植株,其中一部分为三单体,即它们对6B、改进工程化染色体IEC-HC1、IEC-HC2或IEC-HC3之一和重组染色体(6Sl/6BL)为单体,是杂合Ms-B1ms-B1、半合子Ki-B1,是所需植株;和
(i)通过染色体计数、C-带和通过使用DNA标记选择(h)的所述所需植株,将其自交,收集子代种子并种植所述种子,其一部分为双单体,具有染色体6B和改进重组工程化染色体IREC-HC,该染色体或者为IREC-HC1(4SsS/4EL/6SlL/6BL)、IREC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL/6BL)或者IREC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL/6BL),这些即是具有IREC-HC的所需保持系植株。
45.将普通小麦或硬粒小麦所需栽培品种转化成为雄性不育母本系和用于所述母系的权利要求21中定义的雄性可育保持系的方法,所述方法包括:
(a)将保持系与所需栽培品种杂交,所述保持系做为母本、为纯合ms-B1ms-B1Ki-B1Ki-B1并具有异源工程化染色体EC-H1、携带Ms-Ss1和ki-Sl1-a,所述栽培品种是纯合Ms-B1Ms-B1ki-B1ki-B1;
(b)收集(a)杂交的子代种子并种植所述种子,由此产生雄性可育F1植株,其全部是杂合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a,其20%亦携带工程化染色体EC-H1,是所需植株;
(c)通过染色体计数和通过DNA标记选择(b)的所述所需F1植株,用所需栽培品种对其授粉产生BC1子代,其1/16是杂合Ms-B1ms-B1Ki-B1ki-B1-a并携带工程化染色体EC-H1,是所需基因型;
(d)种植(c)的所述BC1植株,通过染色体计数和通过使用DNA标记选择所述所需基因型,再将它们做为母本与所需栽培品种回交四个连续世代产生第五代回交子代(BC5),通过染色体计数和通过使用DNA标记在每个世代选择具有工程化染色体EC-H1的杂合Ms-B1ms-B1Ki-B1ki-B1-a后代;和
(e)自交(d)的所需BC5植株,收集其子代种子并种植所述种子,由此生长BC5F2植株,其1/20是雄性不育并对雄性不育ms-B1和雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合,是所需雄性不育母系,其它具有类似基因型但亦具有工程化染色体EC-H1的BC5F2植株是所需雄性可育保持系植株。
46.按照权利要求45的方法,其中该保持系是定义于权利要求21中的用于所述母系的改进保持系,具有染色体IEC-HC,通过蓝色种子标记协助在步骤(d)中的每个世代(F1、BC1-BC5、BC5F2)选择IEC-EC的存在。
47.将普通小麦或硬粒小麦所需栽培品种转化成为雄性不育母本系和权利要求22中定义的用于所述母系的雄性可育重组保持系的方法,所述方法包括:
(a)将具有异源重组工程化染色体REC-H1的保持系做为母本与所需栽培品种杂交,所述保持系为纯合ms-B1ms-B1、对6B和重组工程化染色体REC-H1(4SsS/6SlL/6BL)为单体、携带Ms-Ss1和ki-Sl1-a,所述栽培品种是纯合Ms-B1Ms-B1ki-B1ki-B1;
(b)收集(a)杂交的子代种子并种植所述种子,由此产生雄性可育F1植株,其全部是杂合ms-B1Ms-B1,其1/2对染色体6B为二体,并因此是杂合Ki-B1ki-B1-a,其1/2对染色体6B和重组工程化染色体REC-H1为双单体、对ki-B1-a为半合子,但亦携带该重组工程化染色体的Ms-Ss1和ki-Sl1-a;
(c)通过分析染色体配对和使用DNA标记选择(b)的所述二种类型的F1植株,用所需栽培品种对其授粉产生二种类型的BC1子代,那些源自二体F1的子代的1/4是杂合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a,那些源自双单体F1的子代的1/4是双单体、杂合ms-B1Ms-B1、半合子ki-B1-a并亦携带重组工程化染色体REC-H1的Ms-Ss1和ki-Sl1-a;
(d)通过分析染色体配对和通过使用DNA标记选择(c)的二组所述所需植株,再将它们做为母本与所需栽培品种回交四个连续世代产生二种类型的第五代回交子代(BC5),通过染色体配对分析和通过使用DNA标记在每个世代选择二体类型中的杂合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a和双单体类型中的杂合ms-B1Ms-B1、具有重组工程化染色体REC-H1的后代;
(e)用(d)的所需二体BC5对(d)的所需双单体BC5植株授粉,产生二组BC5F2一组为二体植株,其1/8是纯合ms-B1ms-B1和杂合Ki-B1ki-B1-a,是所需二体植株,一组为双单体植株,其1/8是纯合ms-B1ms-B1、半合子Ki-B1并亦携带重组工程化染色体REC-H1的Ms-Ss1和ki-Sl1-a,因此为雄性可育且是所需保持系;和
(f)分别种植(e)的所述双单体BC5F2种子和(e)的二体BC5F2种子,通过染色体配对分析和通过使用DNA标记选择所需雄性可育保持系和雄性不育母系。
48.按照权利要求47的方法,其中该保持系是定义于权利要求24中的用于所述母系的改进重组保持系,具有改进重组工程化染色体IREC-HC,通过蓝色种子标记协助在步骤(d)中的每个世代(F1、BC1-BC5、BC5F2)选择IREC-HC的存在。
49.将普通小麦或硬粒小麦所需栽培品种转化成为雄性不育母本系和权利要求26中定义的用于所述母系的具有工程化染色体EC-HR的雄性可育保持系的方法,所述方法包括:
(a)将保持系与所需栽培品种杂交,所述保持系为纯合ms-B1ms-B1su-B1su-b1Ki-B1Ki-B1并具有异源工程化染色体EC-HR1、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a,所述栽培品种是纯合Ms-B1Ms-B1Su-B1Su-B1ki-B1ki-B1;
(b)收集(a)杂交的子代种子并种植所述种子,由此产生雄性可育F1植株,其全部是杂合ms-B1Ms-B1Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1-a,其20%亦携带该工程化染色体,是所需植株;
(c)通过染色体计数和通过使用DNA标记选择(b)的所述所需F1植株,用所需栽培品种对其授粉产生BC1子代,其1/32是杂合ms-B1Ms-B1Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1并携带工程化染色体EC-HR1,是所需基因型;
(d)种植(c)的所述BC1植株,通过染色体计数和通过使用DNA标记选择所述所需基因型,再将它们做为母本与所需栽培品种回交四个连续世代产生第五代回交子代(BC5),通过染色体计数和通过使用DNA标记在每个世代选择具有工程化染色体EC-HR1的杂合ms-B1Ms-B1Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1后代;和
(e)自交(d)的所需BC5植株,收集其子代种子并种植所述种子,由此生长BC5F2植株,其1/64是雄性不育并对雄性不育ms-B1、绿麦隆敏感性su-B1和雄配子杀伤Ki-B1等位基因纯合,是所需雄性不育母系,其它具有类似基因型但亦具有携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a的工程化染色体EC-HR1的BC5F2植株是所需雄性可育保持系植株。
50.将普通小麦或硬粒小麦所需栽培品种转化成为雄性不育母本系和权利要求28中定义的用于所述母系的具有重组工程化染色体REC-HR的雄性可育重组保持系的方法,所述方法包括:
(a)将具有REC-HR1的保持系做为母本与所需栽培品种杂交,所述保持系为纯合ms-B1ms-B1、对6B(对su-B1和Ki-B1为半合子)和重组工程化染色体REC-HR1为单体、携带Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a,所述栽培品种是纯合Ms-B1Ms-B1Su-B1Su-B1ki-B1ki-B1;
(b)收集(a)杂交的子代种子并种植所述种子,由此产生雄性可育F1植株,其全部是杂合ms-B1Ms-B1,其1/2对染色体6B为二体,并因此是杂合Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1,其1/2对染色体6B和重组工程化染色体REC-HR1为双单体、对Su-B1和ki-B1-a为半合子但亦携带重组工程化染色体REC-HR1的Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a;
(c)通过分析染色体配对和使用DNA标记选择(b)的所述二种类型的F1子代,用所需栽培品种对其授粉产生二种类型的BC1子代,那些源自二体F1的子代的1/4是杂合ms-B1Ms-B1,那些源自双单体F1的子代的1/4是双单体、杂合ms-B1Ms-B1、对Su-B1和ki-B1为半合子,并亦携带重组工程化染色体REC-HR1的Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a;
(d)种植(c)的所述BC1子代,通过分析染色体配对和通过使用DNA标记选择(c)的二组所述所需植株,再将它们做为母本与所需栽培品种回交四个连续世代产生二种类型的第五代回交子代(BC5),通过染色体配对分析和通过使用DNA标记在每个世代选择二体类型中的杂合ms-B1Ms-B1su-B1Su-B1Ki-B1ki-B1和双单体类型中的杂合ms-B1Ms-B1、具有重组工程化染色体REC-HR1的后代;
(e)用(d)的所需二体BC5对(d)的所需双单体BC5植株授粉,产生二组BC5F2,一组为二体植株,其1/16是纯合ms-B1ms-B1和杂合su-B1Su-B1Ki-B1ki-B1,是所需二体植株,一组为双单体植株,其1/16是纯合ms-B1ms-B1、半合子su-B1和Ki-B1,并亦携带重组工程化染色体REC-HR1的Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a,因此为雄性可育且是所需重组保持系;
(f)种植(e)的所述双单体BC5F2种子和(e)的二体BC5F2种子,通过染色体配对分析和通过对绿麦隆的反应选择所需雄性可育重组保持系和雄性不育母系;
(g)种植二体植株的子代,其全部是纯合ms-B1ms-B1并因此为雄性不育,其1/4是纯合su-B1su-B1和Ki-B1Ki-B1,是所需雄性不育母系;和
(h)种植(g)的所述二体BC5F3,通过使用DNA标记选择所需雄性不育母系。
51.按照权利要求1-20和30-50的任何一项的方法,其中ms-B1雄性不育等位基因选自ms-B1-a、ms-B1-b和ms-B1-c或Ms-B1的任何其他等位基因。
52.按照权利要求21-29的任何一项的保持系,其中ms-B1雄性不育等位基因选自ms-B1-a、ms-B1-b和ms-B1-c或Ms-B1的任何其他等位基因。
53.按照权利要求1-20和30-50的任何一项的方法,其中对Ki-B1或任何其它雄配子杀伤基因的作用敏感的ki等位基因选自禾本科的任何物种的等位基因。
54.按照权利要求21-29和52的任何一项的保持系,其中对Ki-B1或任何其它雄配子杀伤基因的作用敏感的ki等位基因选自禾本科的任何物种的等位基因。
55.按照权利要求1-20、30-51和53的任何一项的方法,其中rht等位基因或任何其它增进高度的基因选自禾本科的任何物种的等位基因。
56.按照权利要求21-29、52和54的任何一项的保持系,其中rht等位基因或任何其它增进高度的基因选自禾本科的任何物种的等位基因。
57.按照权利要求1-20、30-51和53的任何一项的方法,其中Su等位基因选自禾本科的任何物种的等位基因。
58.按照权利要求21-29、52和54的任何一项的保持系,其中Su或任何其它除草剂抗性等位基因选自禾本科的任何物种的等位基因。
59.按照权利要求1-20、30-51和53的任何一项的方法,其中Ba等位基因选自禾本科的任何物种的等位基因。
60.按照权利要求21-29、52和54的任何一项的保持系,其中Ba等位基因选自禾本科的任何物种的等位基因。
61.产生普通小麦或硬粒小麦杂种植株的方法,包括:
(a)将父本与同一物种的雄性不育母本杂交,其中所述父本选自任何所需普通小麦或硬粒小麦栽培品种,该父本天生即对显性野生型雄性能育性(Ms-B1)等位基因纯合,所述雄性不育母本是所述小麦物种的品系,其对任何一个隐性突变雄性不育(ms-B1)等位基因和显性雄配子杀伤(Ki-B1)等位基因纯合,通过按照权利要求21-29的任何一个保持系保持所述雄性不育母本;和
(b)收集(a)的杂交的子代种子,所述种子当生长时发育成为子代杂种植株,所述植株均为雄性可育并是杂合ms-B1Ms-B1。
62.通过按照权利要求61的方法得到的普通小麦或硬粒小麦的杂种植物品系。
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