CZ1599A3 - Pylově sterilní hybridní pšenice, způsob její přípravy založený na možnosti genového udržování pylově sterilní rodičovské linie pšenice a udržování linie, která se snadno a stabilně množí - Google Patents
Pylově sterilní hybridní pšenice, způsob její přípravy založený na možnosti genového udržování pylově sterilní rodičovské linie pšenice a udržování linie, která se snadno a stabilně množí Download PDFInfo
- Publication number
- CZ1599A3 CZ1599A3 CZ9915A CZ1599A CZ1599A3 CZ 1599 A3 CZ1599 A3 CZ 1599A3 CZ 9915 A CZ9915 A CZ 9915A CZ 1599 A CZ1599 A CZ 1599A CZ 1599 A3 CZ1599 A3 CZ 1599A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- chromosome
- plants
- allele
- pollen
- seeds
- Prior art date
Links
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 title claims abstract description 290
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 148
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 title claims abstract description 94
- 241000209140 Triticum Species 0.000 title claims abstract 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 91
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 837
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 704
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims abstract description 215
- 235000007264 Triticum durum Nutrition 0.000 claims abstract description 89
- 230000035558 fertility Effects 0.000 claims abstract description 74
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 37
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 645
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims description 123
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 90
- 244000098345 Triticum durum Species 0.000 claims description 89
- JXCGFZXSOMJFOA-UHFFFAOYSA-N chlorotoluron Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(C)C(Cl)=C1 JXCGFZXSOMJFOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 59
- 239000005494 Chlorotoluron Substances 0.000 claims description 40
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 claims description 33
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 24
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000010152 pollination Effects 0.000 claims description 23
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims description 23
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000010410 dusting Methods 0.000 claims description 21
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 21
- 240000000581 Triticum monococcum Species 0.000 claims description 20
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 18
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 claims description 17
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 15
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims description 15
- 241000209757 Aegilops searsii Species 0.000 claims description 14
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 claims description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 11
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 claims description 9
- 108010050181 aleurone Proteins 0.000 claims description 9
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 9
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 8
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 8
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 claims description 6
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims 10
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 2
- 101100024330 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MSB1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims 1
- 239000004071 soot Substances 0.000 claims 1
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 abstract description 16
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 abstract description 16
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 abstract description 8
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 241000209143 Triticum turgidum subsp. durum Species 0.000 abstract 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 83
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 83
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 52
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 41
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 35
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 28
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 241001677738 Aleuron Species 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 238000012552 review Methods 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 241000209756 Aegilops longissima Species 0.000 description 4
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 4
- 235000007251 Triticum monococcum Nutrition 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000209125 Thinopyrum elongatum Species 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 244000067538 Abutilon indicum Species 0.000 description 2
- 241000209758 Aegilops Species 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 241000209126 Thinopyrum ponticum Species 0.000 description 2
- 240000002805 Triticum turgidum Species 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 2
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 2
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 2
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 2
- XTKDAFGWCDAMPY-UHFFFAOYSA-N azaperone Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C(=O)CCCN1CCN(C=2N=CC=CC=2)CC1 XTKDAFGWCDAMPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 230000000646 gametocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000000661 isochromosome Anatomy 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- KGPGQDLTDHGEGT-JCIKCJKQSA-N zeven Chemical compound C=1C([C@@H]2C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C3=CC(O)=C4)C(=O)NCCCN(C)C)=O)[C@H](O)C5=CC=C(C(=C5)Cl)OC=5C=C6C=C(C=5O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O5)C(O)=O)NC(=O)CCCCCCCCC(C)C)OC5=CC=C(C=C5)C[C@@H]5C(=O)N[C@H](C(N[C@H]6C(=O)N2)=O)C=2C(Cl)=C(O)C=C(C=2)OC=2C(O)=CC=C(C=2)[C@H](C(N5)=O)NC)=CC=C(O)C=1C3=C4O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O KGPGQDLTDHGEGT-JCIKCJKQSA-N 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- LUBJCRLGQSPQNN-UHFFFAOYSA-N 1-Phenylurea Chemical class NC(=O)NC1=CC=CC=C1 LUBJCRLGQSPQNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001522110 Aegilops tauschii Species 0.000 description 1
- 240000003944 Arthrocnemum macrostachyum Species 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 244000077283 Distichlis palmeri Species 0.000 description 1
- 235000005422 Distichlis palmeri Nutrition 0.000 description 1
- 235000017335 Hordeum vulgare subsp spontaneum Nutrition 0.000 description 1
- 241001299819 Hordeum vulgare subsp. spontaneum Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 1
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 1
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 description 1
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 1
- 235000007249 Triticum timopheevi Nutrition 0.000 description 1
- 241000209153 Triticum timopheevii Species 0.000 description 1
- 235000007247 Triticum turgidum Nutrition 0.000 description 1
- 241000006770 Xenia Species 0.000 description 1
- 108091029474 Y RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000031016 anaphase Effects 0.000 description 1
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000024321 chromosome segregation Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 235000019239 indanthrene blue RS Nutrition 0.000 description 1
- UHOKSCJSTAHBSO-UHFFFAOYSA-N indanthrone blue Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=C4NC5=C6C(=O)C7=CC=CC=C7C(=O)C6=CC=C5NC4=C3C(=O)C2=C1 UHOKSCJSTAHBSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- VOVZXURTCKPRDQ-CQSZACIVSA-N n-[4-[chloro(difluoro)methoxy]phenyl]-6-[(3r)-3-hydroxypyrrolidin-1-yl]-5-(1h-pyrazol-5-yl)pyridine-3-carboxamide Chemical compound C1[C@H](O)CCN1C1=NC=C(C(=O)NC=2C=CC(OC(F)(F)Cl)=CC=2)C=C1C1=CC=NN1 VOVZXURTCKPRDQ-CQSZACIVSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002684 recombinant hormone Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
- A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
- A01H6/4678—Triticum sp. [wheat]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
- A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Cereal-Derived Products (AREA)
- Noodles (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Pylově sterilní hybridní pšenice, způsob její přípravy založený na možnosti genového udržování pylově sterilní rodičovské linie pšenice a udržování linie, která se snadno a stabilně množí
Oblast techniky
Předložený vynález se týká přípravy hybridních semen pšenice obecné a tvrdé, z níž se vyrábí lepková mouka používaná na výrobu těstovin, jejímž výsledkem jsou hybridní rostliny, které jsou vysoce heterozygotní a fenotypově jednotné. Ještě konkrétněji se předložený vynález týká nového způsobu přípravy založeném na chromozómovém inženýrství, který má udržet pylově sterilní samičí rodičovskou linii pro potřebu přípravy hybridních rostlin pšenice, jejichž samičí linie je homozygotní pro recesivní alelu mutanty pylové sterility, pro recesivní příznaky této alely a pro dominantní alelu, nesoucí sterilitu pylových zrn a dále nové udržovací linie pro množení samičí rodičovské linie, která má stejné genové vybavení jako samičí linie, ale obsahuje ještě jeden dodatečný cizorodý vložený chromozóm nesoucí dominantní alelu pro pylovou fertilitu, recesivní alelu pro pylovou sterilitu citlivou k navození pylové sterility přirozenou dominantní alelou pro pylovou sterilitu a dále dominantní alelu(y) se selekčními značkami (markéry). Všechny alely jsou v cizorodém chromozómovém rameni trvale spojeny, protože nedochází k párování a rekombinací mezi cizorodými vnesenými a vlastními chromozómy pšenice. Přítomnost recesivní alely pro pylovou sterilitu v cizorodém vloženém chromozómu zajišťuje, že všechny namnožené životaschopné samčí gamety tento chromozóm nebudou mít a následně tedy neponesou ani dominantní alelu pro samčí plodnost a alelu pro selekční markér. Na druhé straně 20 % až 50 % samičích gamet ponese cizorodý rekombinantní chromozóm. Jestliže selekční markér valele ovlivňuje výšku rostliny (rostliny nesoucí rekombinantní chromozóm jsou o 8 až 10 cm vyšší, než ty rostliny, které jej nenesou), je možné sklízet všechny vyšší rostliny odděleně od nízkých rostlin. Ze semen, která se vyvinou na vyšších rostlinách, jich 20 až 50% nese rekombinantní chromozóm, a proto se žních vyvinou rostliny s plodným pylem. U 50 až 80% rostlin chybí tento chromozóm, a tak se z nich vyvinou pylově sterilní rostliny. Možnost sklízet každý rok odděleně semena z rostlin s vyšším vzrůstem umožňuje udržovat konstantní podíl pylově fertilních rostlin v udržovací linii.
Je-li selekčním markérem gen pro rezistenci k herbicidu (to znamená například rezistenci k chlorotoluronu), je možné použít herbicid na potomstvo v samosprašném množení, a tím usmrtit všechny rostliny, které nemají rekombinantní chromozóm (pylově sterilní rostliny), zatímco přežívají pouze pylově fertilní namnožené rostliny. To umožňuje pěstovat v každé generaci pouze pylově fertilní rostliny v potomstvu samosprašného množení. Je-li selekčním markérem modrý aleuron (znak, který způsobuje zbarvení endospermu), je možné dělit semena vzniklá v udržovací linii na modrá, ze kterých odvodíme pylově fertilní rostliny ·· ·« • · · · • ♦ · · • · · « · · · • · « · · · ···· · · * • · · · · ······ 4 ······ ·«·····« · · · ·
-2(udržovací linie) a na přirozeně zbarvená (červená/bílá) semena, ze kterých se vyvinou pylově sterilní rostliny (samičí linie). Možnost oddělit semena samičí pylově sterilní linie přímo v potomstvu vzniklém samosprášením v udržovací linii zjednodušuje systém a výrazně redukuje výrobní cenu hybridních semou-Vynález-dále přináší nové-způsoby-pro-přípravu udržovací linie, nové způsoby pro přeměnu daného kultivaru v pylově sterilní samičí linii a nové způsoby udržovacího množení samičí linie, nový způsob přípravy hybridní pšenice, ve které jsou všechny rostliny vzniklého hybridu heterozygotní pro recesivní mutantní alelu pylové sterility a jsou proto pylově fertilní.
Dosavadní stav techniky
Je všeobecně známo, že mnoho hybridních rostlinných linií má vyšší výnosy, než linie vzniklé klasickým šlechtěním, dále také vykazují zlepšenou kvalitu a vyšší odolnost proti biotiekým stresům a stresům pocházejícím z okolního prostředí. Na rozdíl od kukuřice, kde jsou samčí a samičí květy fyzicky odděleny, pšenice obecná (chlebová) (Triticum aestivum var. aestivum. ) a tvrdá (T. turgidum var. dur um) (typ pšenice, z níž se vyrábí lepková mouka používaná na výrobu těstovin) jsou převážně samosprašné druhy a každý květ obsahuje jak samičí, tak samčí orgány. K vytvoření hybridních semen je proto nutné pylově sterilizovat samičí rodiče. Protože manuální navození pylové sterility je u pšenice nepraktické, pylová sterilita se vnáší aplikací chemických hybridizačních činidel (CHAs) nebo pomocí genetických prostředků. Užití CHAs k vytvoření rostlin pšenice, které jsou pylově sterilní je drahé, neúčinné a znečišťuje životní prostředí. Ve skutečnosti se užití CHAs běžně omezuje pouze na vědecké experimenty.
Vytvoření hybridních semen genetickou cestou vyžaduje následující podmínky:
1) Kompletní a stabilní pylovou sterilitu samičího rodiče,
2) Kompletní a stabilní obnovení fertility u samčího rodiče,
3) Snadné množení samičího (pylově sterilního) rodiče v udržovací linii.
Ačkoliv tyto podmínky byly známy i pro genetiku pšenice, nebyl v oblasti produkce hybridní pšenice učiněn v posledních 46 letech od popisu první pylově sterilní pšenice (Kihara,H.( 1951)Cytologia 16: strana 117 až 193) žádný pokrok.
Pro přípravu hybridních semen se využívají dva hlavní typy geneticky navozené pylové sterility: cytoplazmická pylová sterilita (CMS) v aloplasmických liniích, nebo liniích, kde proběhla jaderná substituce, způsobená nekompatibilní interakcí cizí cytoplazmy s jádrem pšenice obecné. Dalším typem je genová pylová sterilita (GMS) v euplazmických liniích, která je způsobená recesivní mutací nebo delecí jaderného genu(ů), která běžně způsobuje pylovou '· · φ φ · φ φ φ * · • φ · · · · · · • · φ · φ ···· ······· φφφ ··· ·ΦΙ·ΦΦΦ · ········ φ « φ · ·· φφ
-3sterilitu v cytoplazmě pšenice obecné. Poznamenejme, že v CMS, kde se využívá cizí cytoplazmy, dochází obvykle k redukci výsledné kapacity výtěžků hybridu, zatímco GMS, ve které se využívá nativní cytoplazmy, umožňuje normální expresi genomu a tím také nedochází Jke sníženLkapacity. výtěžku hybridu. ~ ———--------------------------—
Zatímco u mnoha komerčně pěstovaných plodin (jako je například kukuřice) se upřednostňuje genetický typ pylové sterility, tento typ nebyl ještě plně využit v případě pšenice obecné nebo tvrdé. Většina pokusů s obecným typem pšenice byla zaměřena právě na přípravu hybridních semen založenou na cytoplazmické pylové sterilitě. K těmto účelům se používá cytoplazma z dalších druhů pšenice (G cytoplazma), nejvíce využívána je Triticum timopheevii. Aloplazmické linie obsahující tuto cytoplazmu jsou pylově sterilní. Dalším typem cytoplazmy, která byla studována, je cytoplazma zAegilops variabilis (cytoplazma Sv). Tato cytoplazma způsobuje pylovou sterilitu v liniích, které jsou defícientní pro Sv restaurátor v části chromozómu IBS. Ale, jak bylo zmíněno výše, použití cizí cytoplazmy jako faktoru sterilizace u pšenice obecné má velkou nevýhodu v tom, že její různé důležité vlastnosti jsou negativně ovlivněny interakcí mezi jádrem pšenice obecné a cizí cytoplazmou. Co víc, je velmi obtížné nalézt stabilní geny, které jsou schopny obnovit fertilitu takovéto aloplazmické pylové sterilní linie, které by byly vysoce účinné v širokém rozsahu genotypů. Kromě toho, systém vyžaduje také šlechtění samčího rodiče (to znamená vložení genů, které mohou obnovit pylovou fertilitu v cizí cytoplazmě). To vše činí produkci hybridních semen dražší a limituje to počet samčích rodičů, které mohou být testovány na tyto kombinované vlastnosti (příspěvek k významné hybridní vitalitě).
Na druhé straně genetický typ pylové sterility probíhá v normální cytoplazmě pšenice obecné nebo tvrdé. Z tohoto důvodu se neočekávají žádné zhoubné vlivy na chování rostlin. Dále také, užitím samičího rodiče homozygotního v recesivni alele pro pylovou sterilitu, lze všechny kultivary, které jsou ve své podstatě homozygotní pro dominantní alelu odpovídající pylové sterilitě, využít jako samčího rodiče, který je schopen úplně obnovit pylovou fertilitu ve všech F1 hybridech. Není tedy třeba šlechtit samčí linii a neexistuje žádné omezení pro počet samčích rostlin, které mohou být kříženy s pylově sterilními samičími rostlinami, a tak se znásobí jejich užití pro křížení.
U pšenice obecné bylo popsáno několik ramen chromozómů nesoucích geny ovlivňující pylovou fertilitu, například ramena chromozómu skupiny 4: dlouhé rameno chromozómu 4A (4AL), krátké rameno chromozómu 4B (4BS) a krátké rameno chromozómu 4D (4DS), které nesou v tomto pořadí normální geny pro pylovou fertilitu Ms-Al, Ms-Bl a Ms-Dl. Dlouhá ramena 5. skupiny chromozómů: nesou MS-A2, Ms-B2 &Ms-D2 geny v tomto daném pořadí.
Avšak doposud pouze v místě Ms-Bl, v distální části chromozómového ramene 4BS • · « · • · · · Β
W · » • · · · • · · • · ··
I · · · » · · · • · · · · ·
-4(dříve 4AS), byly nalezeny nebo indukovány tři recesivní alely, které způsobují pylovou sterilitu. O těchto alelách, zvláště ms-Bl-a, ms-Bl-b a ms-Bl-c (často také v tomto pořadí nazývané msla, mslb a mslc), bylo známo, že nemají kromě pylové sterility žádný jiný vliv na vlastnosti rostlin (popsáno vWfeúnrP. a Drišcóíí, C.J: (1983) m 'W®řSlEgi7Kri(ěa0^onógRipKs on Theoretical and Applied Genetics, Vol.6, Heterosis, Springer-Verlag, strana 94 až 123).
Množení pylově sterilních samičích linií zůstává hlavní překážkou pro úspěšné zavedení systému produkujícího hybridy založeného na GMS. Snaha o množení pylově sterilních samičích rostlin se ubírala dvěma směry. Jeden byl užití „fertilní cytoplazmy,, a druhý využíval k množení principu cizí fertilní alely, která byla homologní k recesivní mutantě alely pro pylovou sterilitu, která se nepřenáší do samičí linie.
První přístup množení pylově sterilní samičí rostliny, to znamená užití „fertilní cytoplazmy,,, byl navržen již dávno Hermsenem (Hermsen, J.G. Th (1965) Euphytica 14: strana 221 až 224)), ale doposud nebyl podložen experimentálními výsledky. Autor popisuje možnost užití „fertilizační cytoplazmy,,, to znamená vlastní či cizí cytoplazmy, ve které se pylová sterilita v rostlinách homozygotních pro alelu pylové sterility neexprimuje a proto jsou linie fenotypicky pylově sterilní. Naneštěstí, takováto cytoplazma nebyla dosud nalezena. Systém navržený Hermsenem nemohl být prakticky realizován z důvodu neexistence dostatečné vnitrodruhové variability cytoplazmy u pšenice obecné, která může obnovit fertilitu pylově sterilního genotypu. Také cytoplazmy blízce příbuzných druhů pšenice nemohou usnadnit obnovení pylové sterility v pylově sterilním genotypu. Na druhé straně, cytoplazma vzdálenějších druhů obvykle způsobuje pylovou sterilitu, výjimkou jsou případy, kdy aloplazmická linie nese vhodný restaurátor(y). Avšak, z tohoto hlediska jejich vliv na pylovou sterilitu nebyl studován. Franckowiak a další (Franckowiak, J.D., Maan, S.S. a Williams, N.D. (1976) Crop Sci. 16: strana 725 až 728) popsal geny obnovující pylovou fertilitu v D genomu pšenice obecné(genom AABBDD) v Aegilops squarrosa (D) cytoplazma je pylově fertilní a aloplazmicka pšenice tvrdá (genom AABB) je pylově sterilní v D cytoplazmě. Byly indukovány mutace v aloplazmické linii pšenice obecné pomocí cytoplazmy D. Byl navržen produkční hybridní systém, ve kterém se množila tato aloplazmická pylově sterilní rodičovská linie pomocí euplasmického typu stejného kultivaru, to znamená samičí, pylově sterilní rodič ponese pylově fertilní mutovanou alelu a D cytoplazmu, udržovatel bude mít tutéž mutovanou alelu a nativní (B) cytoplazmu a samčí rodič bude mít normálně pylově fertilní alelu a B cytoplazmu.
i :
« * • te ·
-5Fertilita hybridu je potom obnovena křížením těchto samčích a samičích rodičeů. Všechny takovéto hybridy měly D cytoplazmu odvozenou od samičího rodiče, což byl nepřijatelný fakt z hlediska toho, že tato cytoplazma by mohla mít negativní vlivy na vlastnosti (výtěžek, životnost a tak dále) hybridů. — ---------------—
Kromě toho, ve výše zmíněném systému navrženém Franckowiakem a dalšími, udržovací linie pro získání pylově sterilních samičích rodičů v následných generacích, je linie nesoucí mutaci pro pylovou sterilitu a B cytoplazmu pro zajištění fertility množené linie. Tento systém se ukázal být velmi nepraktický, a to z hlavně z důvodu, že všechny mutanty, které byly získány, byly sterilní i vB cytoplazmě (Sasakuma, T., Maan, S.S. a Williams, N.D. (1978) Crop Science 18: strana 850 až853.
Potom tedy také navržená udržovací linie byla pylově sterilní a neměla prakticky žádnou cenu. Jelikož tedy chyběla vhodná udržovací linie, systém navržený Franckowiakem a dalšími byl opuštěn.
Podobným způsobem, jak je popsáno výše, Feldman a Millet (nepublikovaná data) objevili, že genotypy nesoucí alely pro pylovou sterilitu v B genomu chromozómů, to znamená 4B a 5B, jsou také pylově sterilní v alopasmických liniích obsahujících D a Sv cytoplazmy. Zdá se tedy, že návrh „fertilizační cytoplazmy,, (Hermsen, J.G. Th (1965) Euphytica 14: strana 221 až 224) nelze u pšenice realizovat.
Jako příklad druhého přístupu k množení pylově sterilních samčích rostlin je XYZ systém navržený Driscollem (Driscoll C.J. (1972) Crop Sci. 12: strana 516 až 517. Před dvěma desetiletími navrhoval přidat do pylově sterilní samčí linie Z (homozygotní pro recesivní mutantu alely ms-Bl-c) jeden další ( v linii Y) nebo pár (v linii X) cizích chromozomů nesoucích Ms homologní alelu, která uděluje fertilitu liniím X a Y. Cizorodý chromozóm se nepáruje s homologními chromozomy pšenice a v linii Y (udržovatel) je přenášen pylem jen s velmi malou četností výskytu, a tak tedy opylené pylově sterilní linie produkují semena, z nichž většina vyklíčí v pylově sterilní rostliny.
Ačkoli udržovatel (Y) netvoří pravou šlechtiltelskou linii, je produkován opylením pylově sterilní samičí (Z) pomocí dvojnásobného přidání disomické cizí linie (X). Tento systém je charakteristický dvěma hlavními problémy: některé přenosy cizího chromozómu vyskytující se v pylu udržovací linie mohou zavést pylovou fertilitu do nové generace pylově sterilní samičí linie a další problém je ve zhoršení čistoty linie X. Toto jsou pravděpodobně důvody, proč nebyl tento systém zaveden do komerční praxe.
-6Později Driscoll (Driscoll, C.J., (1985) Crop Sci. 25 strana 1115 až 1116) navrhl modifikaci výše popsaného XYZ systému produkujícího hybridní pšenici. V tomto navrženém systému, samosprašná linie Y nahradí Y linii a tak se produkuje pylově sterilní linie Z. Tato ' modifikace elimitrajuTižítíriinie X, která’ byla původně p0Tř5bHáirpíŤpTSv§Wělkéh~ďnmozštvíTr linie rostlin. Co více, nově navržená linie Y nese cizí isochromozóm, a tak jako příklad druhého přístupu k množení pylově sterilních samičích rostlin je XYZ systém navržený Driscollem (Driscoll, C.J. (1972) Crop Sci. 12: strana 516 až 5I7).Před dvěma desetiletími navrhoval přidat do pylově sterilní samičí linie Z (homozygotní pro recesivní mutantu alely ms-Bl-c) jeden další (v linii Y) nebo pár (v linii X) cizích chromozómů nesoucích dominantní Ms homologní alelu, která uděluje fertilitu liniím X a Y. Cizí chromozóm se nepáruje s homologními chromozómy pšenice a v linii Y (udržovatel) je přenášen pylem s velmi malou četností výskytu, a tak tedy opylené pylově sterilní linie produkují semena, z nichž většina vyklíčí v pylově sterilní rostliny.
Ačkoli udržovatel (Y) netvoří pravou šlechtitelskou je homologní alela kompenzující pylovou fertilitu ve dvou dávkách. I když modifikovaný systém XYZ vyžaduje méně křížení mezi různými rodičovskými liniemi pro udržení a namnožení pylově sterilních samičích rostlin než systém původní, nedostatky charakterizující původní systém však přetrvávají i v systému modifikovaném, a tak limitují jeho praktické komerční využití při výrobě hybridních semen.
Z výše uvedených skutečností je tedy zřejmé, že tradiční způsoby pro přípravu hybridních semen nejsou dostatečně účinné a jsou potřeba přístupy nové. Jeden takový nový způsob, založený na vylepšení výše Driscollem (1972) popsaného systému XYZ, je popsán v Mezinárodních patentových přihláškách PCT č. PCT/AU91/0013 (WO 92/01366) a PCT /AU93/00017 (WO93/13649), které se týkají produkce hybridních obilnin jako je pšenice obecná. V těchto publikacích jsou popsány rostlinné linie používané pro přípravu hybridů, které mají cizí chromozóm, nebo jeho část nesoucí dominantní gen pro pylovou fertilitu homoalelický k mutantní alele pylové sterility a gen pro barevný markér, který umožňuje vybarvení požadovaných semen v potomstvu. Množení pylově sterilních (samičích) rodičovských linií je dokonalé ve výběru semen v potomstvu na základě barevného třídění. Takto geneticky pozměněné rostliny pšenice obecné obsahují modifikovaný chromozóm s dominantní alelou pro normální pylovou fertilitu z diploidní pšenice Triticum monococcum, který je přidán nebo nahrazuje jeden ze 4B chromozómů pšenice. Modifikovaný chromozóm nese krátké rameno chromozómu 4Am z T. monococcum (4AmS) nesoucí alelu M-Aml a druhé rameno s proximálním segmentem z dlouhého ramena z vlastního chromozómu 4Am z T. monococcum (4AmL) nebo chromozóm 4E z Agropyron elongatum (4EL) s alelou (C) nesoucí barevnost a distální segment pšeničného chromozómového ramena 4BL. Část tohoto modifikovaného chromozómu je homologní k části pšeničného chromozómu 4B nesoucího tt «· φ* φφφφ ·· *· « φφφ · φ φ · φ φ · • φ φφ φ φ φφφ
Γ Φ····ΦΦΦΦΦ ΦΦΦ * '«φφφφφ* φφφφ φφφφ φφ ·* φφ · *
-7recesivní alelu pro pylovou sterilitu. Homologní část, to znamená distální oblast 4BL, se může párovat s normálním pšeničným 4BL, což umožní správné rozdělení při meiozi. Další možností je označit tento chromozóm nesoucí normální dominantní alelu pro pylovou fertilitu Ms-Aml — —ušitím genu udělujícího rostlinám v potomstvu-vyšší-v^ůs-f—— --—_
Avšak také tento, výše zmíněný systém pro přípravu hybridů, má řadu nevýhod co se týká účinnosti množení rodičovských linií. Za prvé, opylením samičích rostlin udržovatelem má za výsledek velké množství semen s rekombinantním cizorodým/4BL chromozómem, který podmiňuje vývoj pylově fertilních rostlin. Za druhé, množení pylově sterilního samičího rodiče zahrnuje komplex postupů třídění potomků založený na základě markerových genů. Za třetí, udržovací linie pro samičí (pylově sterilní) rodičovskou linii je také geneticky nestabilní linie, ve které je 20 párů chromozómů z normální pšenice, jeden 4B chromozóm nesoucí mutantní alelu pro pylovou sterilitu (ms-Bl-b) (známou jako „Probus,,) (Wilson a Driscoll, 1983) a jednu rekombinantní cizorodou skupinu 4/4BL chromozómu mající normální alelu pro pylovou fertilitu Ms-Aml a alelu pro obarvení semen. Tak je tedy udržovací linie pylově fertilní a podle opylení budou vznikat fertilní rostliny buď homozygotní nebo heterozygotní pro modifikovaný chromozóm. Bude tedy nemožné rozlišit mezi těmito dvěma genotypy na základě genu barevnosti nebo genu pro výšku rostlin. Tak je tedy množení udržovatele a jím poskytnuté pylově sterilní samičí linie velmi pracné a tudíž nevhodné pro komerční aplikaci ve velkém měřítku.
K překonání obtíží při mechanickém výběru nebo užití dalších nepřímých prostředků při selekci zaměřené proti cizímu chromozómu nesoucímu alelu pro pylovou fertilitu Ms, navrhl T. R. Endo z University v Kyotu v Japonsku,citováno Tsujimotem a Tsunewakim, (Tsujimoto, H. a Tsunewaki, K. (1983) Proč. 6th Int. Wheat Genet. Symp., Kyoto,Japan, strana 1077-1081.) užití gametocidního genu Gel a jeho připojení k allele nesoucí pylovou sterilitu ms. Gametocidní alela, původem z Ae. speltoides, vyvolává zničení gamet, které ji nenesou (nesou nativní recesivní alelu gCP). Podle Endova návrhu je pylově sterilní samičí linie homozygotní jak pro ms tak Gel, které jsou těsně spojeny, zatímco k opyleni samičí linie se použije pylově fertilní linie (udržovatel) isogenní k samičí linii, ale mající Ms a gel alely, vznikne tak dvojnásobně heterozygotní kombinace msMsGclgcl. Díky zničení gamet nesoucích gel, všechno potomstvo takovéto samosprašné linie bude homozygotní msmsGclGcl a identické k samičí liniíi. Avšak podle jejich návrhu by se také měla množit v systému produkujícím hybrid samčí linie, (R linie), obsahující alelu Gel, jinak by došlo ke snížení plodnosti F1 hybridu.
··'·· ·*···· ·* ·· • · Λ · · ♦ « · · · ♦ • · · · ♦ · · · · ···»«·· «··'··· • « * » · · · · «··· ···· ·· ** »· ··
-8Co více, Gel způsobuje ztrátu plodnosti jak u samičích tak samčích gamet, a proto se vyžaduje každý rok křížení (mezi samičí linií a udržovatelem) a jí samotnou (dvakrát hetrozygot), aby se obnovila zásoba samičích semen. To nese nevýhodu v časové a peněžní _náročnosti. Další -nevýhoda Endova návrhu-pramení-z-fektu,-že pyiowě-^teriJní-wničí rodičobsahuje cizorodý chromozómový segment nesoucí Gel alelu, která je odvozena zAe. speltoides.
Tato část může také nést alely s negativním efektem na vlastnosti samičí linie, zvyšuje cenu výroby hybridních semen a dokonce ovlivňuje i výtěžek hybridu.
Co se týká důležitosti výroby hybridu pšenice obecné, mělo by se poznamenat, že různé zprávy uvádějí u zavedení experimentálních hybridů zvýšení výnosu, u nejlepších hybridů až o 30 % nad výnosem nejlepších kultivarů (Wilson, P. and Driscoll, C.J. (1983) in Frenkel,
R. (ed.) Monographs on Theoretical and Applied Genetics, Vol.6, Heterosis, Springer-Verlag, strana. 94 až 123.
Dále se obecně ví, že mnoho hybridů vykazuje zlepšení kvality a větší odolnost kbiotickým stresům a stresům pocházejícím u okolního prostředí, než vykazují konvenční kultivary. Všeobecně se předpokládalo, že relativně malé výhody hybridní pšenice oproti pravým šlechtitelským liniím pramení z nepřetržitého výběru homozygotní germplazmy lepších vlastností.
Z tohoto důvodu se také předpokládá, že výběr heterozygotní germplasmy za účelem vylepšení vlastností by mohlo v krátkém čase vyústit ve značné zvýšení výnosů.
I když konstrukce hybridů je založena na běžných kultivarech, které se v průběhu času vylepšují metodami klasického šlechtění, bude výhodné každý nově vyvinutý, nebo nově zavedený kultivar změnit na potenciální samičí. Toto je nezbytné nejen pro přehled kombinačních schopností pro nově zavedené rostlinné materiály, ale co je důležitější, komerčně vyráběné nové hybridy zaplní mezeru mezi nově zavedenými čistými liniemi.
Definice
V celém popisu a uplatňování nároků vynálezu budou používány následující termíny a zkratky:
Pšenice obecná = chlebová pšenice, Triticum aestívum var. aestivum, je to hexaploidní druh (2n=42) mající tři genomy ABD.
Pšenice tvrdá = durum, Triticum turgidum var. áurum, je to alotetraploidní druh (2n - 28) mající dva genomy AB.
φφ · ·
J.
-9φ φ· φφφ *·<
» · φ « « φ φ · φ φ
Triticum monococcum = je to diploidní druh (2n = 14) zahrnující taxony: divoký (var. boeoticum) a kultivovaný (var. monococcum), blízce příbuzné diploidnímu dárci A genomu pro pšenici obecnou a tvrdou, mající genom A1’ jehož chromozóm 4Am je __homologní (částečně . homologní) ke chromozómu—4A a také—k-další - skupiněchromozómů pšenice obecné a tvrdé.
Aegilops longissima a Aegilops searsii = diploidní druhy (2n= 14) blízce příbuzné donoru B genomu pšenice obecné a tvrdé, mající genom S1 a nebo Ss, jehož chromozómy jsou homologní (částečně homologní) se stejnými chromozómy v pšenici obecné a tvrdé
Agropyron elongatum = komplex druhů zahrnujících taxony: diploid (2n = 14), tetraploid (2n = 28) a dekaploid (2n = 70), příbuzný pšenici obecné a tvrdé, mající genom E (polyploidní a autoploidní) jehož chromozómy jsou homologní s odpovídajícími chromozómy v pšenici obecné a tvrdé
4BS = krátké rameno chromozómu 4B (dříve 4A) pšenice obecné a tvrdé
6BL = dlouhé rameno chromozómu 6B pšenice obecné a tvrdé
4AmS a 4AmL = krátké a dlouhé rameno chromozómu 4Am z Triticum monococcum 4EL - dlouhé rameno chromozómu 4E Agropyron elongatum 4SsS = krátké rameno chromozómu 4Ss z Aegilops searsii 4S' S = krátké rameno chromozómu 4S1 z Aegilops longissima
6SSL = =dlouhé rameno chromozómu 6Ss Aegilops searsii
6S’L = dlouhé rameno chromozómu 6S1 z Aegilops longissima
Ms = dominantní alela zodpovědná za pylovou fertilitu pšenice
Ms-Bl = dominantní alela zodpovědná za pylovou fertilitu pšenice obecné a tvrdé, lokalizovaná na 4BS ms = recesivní mutanta alely Ms, která způsobuje pylovou sterilitu ms-Bl = recesivní mutanta alely Ms-Bl, vztahuje se k pylové sterilitě u pšenice obecné a tvrdé, je-li přítomna v homozygotním stavu ms-Bl-a = msla, je to „Pugsley,, mutanta ms-Bl alely ms-Bl-b = mslb, je to „Probus,, mutanta ms-Bl alely ms-Bl-c = mslc, je to „Comestone,, mutanta ms-Bl alely
Ms-S 1 = dominantní alela pro pylovou fertilitu, (homo)alelická k Ms-Bl na 4SsS
Ms-S11 = dominantní alela pro pylovou fertilitu, (homo)alelická k Ms-Bl na 4S!S
9 9 9 99 .
9 9 9 9 9
9 9 9
9 9 9 9
9 9 9
99999999 99 » · « • ·» · 9
-10Ms-Aml = dominantní alela pro pylovou fertilitu, (homo)alelická VMs-Bl na 4AmS
Ki-Bl = dominantní alela genu pro navození pylové sterility (pollen -killer) na 6BL z pšenice obecné, indukuje sterilitu pylu nesoucího ki-Bl-a nebo ki-S'1-a ki-Bl-a = recesivní alela genu pro navozeni pylové sterility na 6BL z pšenice obecné, pyl, který ji neseje v rostlinách majících Ki-BJ sterilní ki-Bl-n =neutrální alela genu pro navození pylové sterility na 6BL z pšenice obecné, pyl, který ji nese je buď v rostlinách majících Ki-Bl sterilní nebo indukuje sterilitu pylu nesoucího ki-Bl-a nebo Ki-S11-a
Ki-S11-a = alela pro navození pylové sterility na 6S'L zAegilops longissima, pyl, který ji nese je v rostlinách majících Ki-Bl sterilní
Rhtl a Rht2 = recesivní nebo částečně recesivní alely, lokalizované na chromozómových ramenech 4BS a 4DS, které indukují snížení vzrůstu rostliny rht = dominantní nebo semidominantní alela určující normální výšku rostliny (vysoká rostlina) rht-Rl = dominantní nebo semidominantní alela na 4SsS určující normální výšku rostliny (vysoká rostlina) rht -Aml - dominatní nebo semidominantní alela na 4AraS určující normální výšku rostliny (vysoká rostlina)
Su-Bl = dominantní alela na 6BL z hexaploidní nebo tetraploidní pšenice, vztahuje se k rezistenci k herbicidu chlortoluronu (3-(3-chloro-/?-tolyl)-l, 1-dimetylmočovina) su-Bl = recesivní alela z Su-Bl nalezená na 6BL hexaploidní a tetraploidní pšenice, rostliny, které ji nesou jsou vnímavé k působení chlortoluronu su-S11 = recesivní alela, homoalela k Su-Bl, nalezená na 6S'L zAegilops longissima, rostliny, které ji nesou jsou vnímavé k působení chlortoluronu
Su-S5! = dominantní alela, homoalelická k Su-Bl, nalezená na 6SlL zAegilops searsii, rostliny, které ji nesou jsou rezistentní k působení chlortoluronu
Ba = dominantní alela, určuje modrou barvu vrstvy aleuronu v 3n endospermu
Ba/Aml = dominantní alela pro modrou barvu aleuronu na 4AmL
Ba-El = dominantní alela pro modrou barvu aleuronu na 4EL
Phl = dominantní alela na dlouhém ramenu chromozómu 5B pšenice obecné a tvrdé, která potlačuje párování homologních chromozómů
4 4 » · · • 4 9 9 4 4 · 4 4
4«44
4 · 4
44444444 ··
-114 4 ' ··
4 4 4
4 4 4
444 444
4 · 4 4 phlb = recesivní mutantní alela, která umožňuje homologní párování cv. = kultivar
.........EQ -= vložený chromozóm.„sestávající z částí—odvozených _ze -dvou nebo—-více cizích chromozómů, nesoucí Ms alelu, Ki alelu a selektivní markér, pomocí kterého jsou rostliny nesoucí tento chromozóm vybírány
EC-H ~ vložený chromozóm nesoucí jako selekční markér alelu rht (výška rostliny)
EC-H1 = vložený chromozóm sestávající z 4SsS/6S1L nesoucí Ms-^1, rht-^1 a ki-Sl J-a (Obrázek 2a)
EC-HR = vložený chromozóm nesoucí jako selekční markéry alelu rht (výška rostliny) a alelu Su (rezistence k herbicidu chlortoluronu)
EC-HR1 = vložený chromozóm sestávající z 4SsS/6S1L nesoucí Ms-S^l, rht-Sfl, Su-S3J a kiS11-a (Obrázek 2b)
REC = rekombinantní vložený chromozóm sestávající zčásti odvozených ze dvou nebo více cizích chromozómů a z distálního segmentu ramena nativního chromozómu 6BL, nesoucí alelu Ms, ki-S11 -a a selekční marker(y), pomocí nichž může být tento chromozóm v rostlině identifikován
REC-H = rekombinantní vložený chromozóm nesoucí jako selekční markér alelu rht
REC-H1 = rekombinantní vložený chromozóm sestávající z 4SsS/6S1L/6BL nesoucí Ms-^1, rht-Ss 1 a ki-S‘ 1-a (Obrázek 2c)
REC-HR = rekombinantní vložený chromozóm nesoucí jako selekční markéry alely rht a Su
REC-HR1 = rekombinantní vložený chromozóm sestávající z dS^/óS^/óBL nesoucí Ms-Š31, rht-^J Su-Sfl a ki-S11 -a (Obrázek 2d)
IEC = vylepšený vložený chromozóm sestávající ze segmentů odvozených ze dvou nebo více cizorodých chromozómů nesoucích navíc alely Ms, ki a alelu pro selekční markér, pomocí něhož mohou být oddělena semena mající a nemající tento chromozóm
IEC-HC = vylepšený vložený chromozóm nesoucí jako selekční markéry alely rht (výška rostlin) a Ba (barva semen)
IEC-HC 1 = vylepšený vložený chromozóm sestávající z 4SsS/4EL/6S1L nesoucí Ms-S31, rhtSsJ, Ba-El a ki-S11-a (Obrázek 3a) ·· 9 · ·
·« ' ··
-12IEC-HC2= vylepšený vložený chromozóm sestávající z 4SsS/4AmEL/6S1L nesoucí Ms-Sfl, rht-S?l, Ba-Aml a ki-S11-a (Obrázek 4a)
IEC-HC3= vylepšený vložený chromozóm sestávající z 4AmS -4AmL/6S1L nesoucí Ms-Aml, rht- Aml, Ba-Aml a ki-S11-a (Obrázek 5a)
IREC = vylepšený vložený rekombinantní chromozóm sestávající z částí odvozených ze dvou nebo více cizorodých chromozómů a zdistálního segmentu ramene nativního chromozómu 6BL, nesoucí ještě alelu Ms, k\ a alely selekčního markéru, pomocí něhož mohou být oddělena semena mající a nemající tento chromozóm
IREC-HC = vylepšený vložený rekombinantní chromozóm nesoucí jako selekční markéry alely rht a Ba
IREC-HC 1 = vylepšený vložený rekombinantní chromozóm sestávající z 4SsS/4EL/6S1L/6BL nesoucí Ms-S^l, rht-S1 1, Ba-Eí a ki-S11-a (Obrázek 3b)
IREC-HC2 = vylepšený vložený rekombinantní chromozóm sestávající z 4SsS/4AmL/6S1L/6BL nesoucí Ms-Ssl, rht-Ss 1, Ba-Aml a ki-S11-a (Obrázek 4b)
IREC-HC3“ vylepšený vložený rekombinantní chromozóm sestávající z 4AmS4AmL/6S1L/6BL nesoucí Ms-Aml, rht- Aml, Ba-Aml a ki-S11-a (Obrázek 5b)
Udržovací linie = pylově fertilní linie isogenní k pylově sterilní samičí linii, která ale navíc obsahuje vložený chromozóm typu EC
Rekombinantní udržovací linie = pylově fertilní linie isogenní k pylově sterilní samičí linii, která je ale monosomická pro chromozóm 6B a obsahuje jako monosomický substituent vložený chromozóm typu REC
Vylepšená udržovací linie = pylově fertilní linie genově shodná s pylově sterilní samičí linii, která ale navíc obsahuje vložený chromozóm typu IEC
Vylepšená rekombinantní udržovací linie = pylově fertilní linie genově shodná s pylově sterilní samičí linii, která je ale monosmická pro chromozóm 6B a obsahuje jako monosomický substituent vložený chromozóm typu IREC.
Podstata vynálezu
S přihlédnutím k výše zmíněným nedostatkům, uvedeným v přehledu předchozího stavu výzkumu dané problematiky, je podstatou předloženého vynálezu způsob genetického
-13φφ φφ ·* • ΦΦΦ φ φ • φφφ • φφφφ φ φ φ · • ••••φφφ φφ • · φφ φφ φφ • · φ φ φ φ φ φ • φ · · · · • φ φ · « φ množení pylově sterilní rodičovské samičí linie kultivaru pšenice obecné a tvrdé. Zde uvedený způsob předkládá jednoduché postupy pro stabilní množení pylově sterilní samičí rodičovské linie.
Dále vynález popisuje získání udržovací linie pro použití ve výše zmíněném postupu, kterým se tato udržovací linie lehce, rychle a stabilně množí.
Vynález dále popisuje způsob přípravy výše zmíněné udržovací linie.
Vynález také popisuje uvedení nových způsobů přeměny jakéhokoli uvažovaného kultivaru pšenice obecné nebo tvrdé v pylově sterilní samičí linii a utvoření udržovací linie.
Předkládaný vynález umožňuje komerční výrobu hybridů u pšenice obecné a tvrdé. Z tohoto pohledu vynález uvádí novelizovaný způsob pro množení pylově sterilní samičí rodičovské linie (linie A ), která je homozygotní pro recesivní mutantní alelu pylové sterility (ms) a pro dominantní alelu genu pro navození pylové sterility (K,). Udržovatel (linie B ) (Obrázek 1) je isogenní k samičí linii a má další cizorodý vložený chromozóm nesoucí dominantní alelu pro pylovou fertilitu (Ms) spojenou s recesivní alelou genu pro navození pylové sterility (£,) a ještě nejméně jednu alelu pro selekční markér. Pylová zrna udržovatele, která obsahující vložený chromozóm (Ms a k,), jsou neaktivní. Několik typů vložených chromozómů nese jako selekční markér alelu rht (ovlivňující výšku rostlin), další nesou dva selekční markéry, alely rht a Sul (rezistence k chlortoluronu), každý pro každé rameno chromozómu, zatímco jiné typy nesou jako selekční markéry alely rht a Ba (indukuje modré zbarvení semen), každý markér pro každé rameno chromozómu.
V rámci předkládaného vynálezu byl vyvinut jednoduchý systém, pomocí něhož pylově sterilní samičí rodičovská linie (linie A) se množí jednak opylením pylem samčí fertilní udržovací linie (linie B) a veškeré vzniklé potomstvo obsahuje pouze pylově sterilní samičí rostliny (Obrázek la), v ještě výhodnějším uspořádání, výběrem ze samosprašného potomstva udržovatele, který je učiněn na základě rozdílné barevnosti semen, která se vyvinula v pylově sterilní samičí linii a semen která se vyvinula v samčí fertilní udržovací linii (Obrázek 1 b). Podobně, udržovací linie se sama lehce množí samosprášením, výsledkem je směs semen, ze kterých asi 20 % nese vložený chromozóm a je tedy pylově fertilní a 80 % semen, u kterých chybí tento chromozóm, je proto pylově sterilní. V těch udržovacích liniích, které nesou jen rht alelu jako selekční markér, je možné sklízet rostliny s vyšším vzrůstem, které obsahují vložený chromozóm. Možnost selektivní sklizně usnadňuje zachování konstantního množství pylově fertilních rostlin (kolem 20 % každý rok) v potomstvu samosprašného udržovatele, které samozřejmě zahrnuje také pylově sterilní rostliny. V těch udržovacích liniích, které nesou obě alely (rht a Sul) jako selekční markéry, je možné rostliny, které nemají vložený chromozóm odstranit chlortoluronem. Takto je zajištěno, že každý rok budou pěstovány v pokusech «4 4 4 44 4444 4 4 44
4 ♦ · ♦ 4 * 4444
4 4 4 4 4 44 4
4 44 4 44 444444 • 4 4444 4 4
4444 4*44 44 44 44 ··
-14s vysetým potomstvem samosprašného udržovatele pouze pylově fertilní rostliny udržovatele Na druhé straně, ve vylepšené udržovací linii nesoucí alelu Ba jako selekční markér, je možné oddělit pomocí třídění semen modrá semena, která se po vysevu vyvinou v pylově fertilní .rostliny,.. zatímco.....ze. sterilnL-£astUay»-Jrato......jednoduchá selekce umožní mít každý rok udržovací linii se 100% obsahem pylově fertilníeh rostlin.
Dle dalšího aspektu předloženého vynálezu jsou vložené chromozómy EC-H a ECHR přenesenými (translokovanými) chromozómy, které byly odvozeny ze dvou cizorodých chromozómů. Jedno jejich rameno nese Ms a rht alelu a další má alelu ki v EC-H a obě alely Su-1 a ki v EC-HR. Jelikož cizí ramena chromozómu netvoří pár s svými homologními chromozómy z pšenice, tři alely na EC-H a čtyři na EC-HR jsou propojeny a nejsou vzájemně odděleny. EC-H (Obrázek 2a) nebo EC-HR (Obrázek 2b) jsou tedy zavedeny do udržovatele v jedné dávce, to znamená, že udržovatel vytváří monosomickou linii. Funkční pylová zrna udržovatele neobsahují vložený chromozóm. Potom tedy, veškeré potomstvo vzniklé křížením mezi pylově sterilní samičí linií a udržovací linií je pylově sterilní, zatímco potomstvo vzniklé samosprášením udržovací linie obsahuje směs genotypů, z nichž je asi 20 % pylově fertilníeh a přibližně 80 % pylově sterilních.
Konstrukce EC v pšenici obecné je založena na novém zjištění vědců, že reeesivní alela genu pro navození pylové sterility ki-S! 1-a, která je umístěná na dlouhém rameni chromozómu 6 Ae. longissima (óS^), je přítomna v jedné kopii v rostlinách nesoucích dominantní alelu Ki-Bl pro gen navozující pylovou sterilitu na chromozómu 6BL pšenice obecné, tak jako v monosomatické přidané linii, není přenášena pylovými zrny (to znamená samčími gametami). Je tedy rozumné sestavit EC-H1, nesoucí obě alely spojené s pylovou fertilitou, Ms-S11-a rht- ó 1 zAe. searii a alelu genu navozujícího pylovou sterilitu Ki-S11-a zAe. longissima, což lze získat jako výsledek současných změn dělení chromozómů 4SS a 6S1 následovaným centrickou fózí 4SsS a 6S'L, které se potom vyskytují jako dvojnásobně monosomické přidání 4Ss a 6S1 pšenice obecné (Obrázek 7a).
Tento EC-H1 má krátké rameno 4. chromozómu z.Ae. searsii (4SsS) nesoucí alelu Ms-S5!, o které je známo, že odpovídá za pylovou fertilitu u hexaploidního genotypu homozygotního pro ms-Bl-c a rhl-S; 1 alelu, která způsobuje vyšší vzrůst rostlin. Dále EC-H1 obsahuje dlouhé rameno 6. chromozómu z Ae. longissima (6S'L) nesoucí reeesivní alelu kiS11-a, způsobující to, že pylová zrna, která tuto alelu obsahují, jsou neaktivní v přítomnosti alely Ki-Bl.
Protože se zřídka vyskytuje párování a rekombinace mezi cizorodými vloženými chromozómy a jejich homologními rameny v pšenici, jsou alely Ms-S5!, rht- S51 a ki- όώ7
-1544 44 • 4 4 4 4
4 4
4 4 4
4 4 •444 <4·4
4 4 4
4 4 4
4 4 4 ·4 4
4 spojeny a následně je tak zabráněno přenosu alely Ms-S! 1 pylovými zrny. To umožňuje přípravu udržovací linie, která je homozygotní pro Ki-Bl allelu na 6BL a dále homozygotní pro jednu ze známých recesivních mutantních alel způsobujících pylovou sterilitu (například /w5-,Ét/^c)gkteré.j-sau_u.mistěoymaJfxátkjéniJ^menju;hKmiazói)3u^Rr.^.le jejiebž-pylová^terilita se neexprimuje, to znamená, že udržovací linie je pylově fertilní díky přítomnosti vloženého chromozómu nesoucího alelu Ms-S31. Opylení pylově sterilní samičí linie linií udržovatele má za výsledek pouze pylově sterilní rostliny, zatímco samoopylení udržovací linie má za výsledek populaci skládající se z 20 % pylově fertilních rostlin a 80 % pylově sterilních rostlin.
Dalším bodem předkládaného vynálezu je zvýšení části (z 20 % na 50 %) pylově fertilního genotypu udržovatele v potomstvu samosprašné udržovací linie. Zatímco 20% zvýšení počtu semen je dostatečných pro udržovatele jako takového, zvyšuje však cenu produkce samičích semen, protože je potřeba osít větší plochu udržovatelem, aby bylo získáno ekonomicky efektivní množství samičích rodičů pro oplodnění udržovatelem. Tak se jeví jako velká výhoda, zvýšit podíl udržovatele v jeho vlastním potomstvu. Ten by měl být zvýšen až na 50 %, a to modifikací EC-H, to znamená sestojením vloženého rekombinantního chromozómu, zde označovaného jako RC-H1 (Obrázek 2b), který lze vytvořit v pšenici obecné následujícím způsobem (Obrázek 7b): distální segment chromozómového ramena 6BL je přenesen do óS^ ramena, tak, že translokační zlomový bod je distální kki-S'l-a alele, což mu umožňuje párování s chromozómem 6BL. Výsledky translokace z homologního párování v dvojnásobných monosomických podmínkách za nepřítomnosti Phl, to znamená genotypu phlbphlb, kdy se mohou spárovat a rekombinovat EC-H1 (4SsS/6S1L) a 6B, vyústí v produkci konstruktu REC-H1, to znamená 4SsS/6S1L/6BL. V liniích homozygotních pro Phl a monosomických pro normální 6B a majících jednu sadu REC-H1, dva chromozómové páry téměř v každém meiocytu v homologní oblasti (distální oblast 6BL) se oddělují k opačným pólům a vedou k zavedení REC-H1 do jedné poloviny gamet.
Vynález dále popisuje jak udržet konstantní poměr 1:4 rostlin pylově fertilních a pylově sterilních nebo 1:1 pylově fertilních ku pylově sterilním v potomstvu samosprašného udržovatele, které obsahuje buď EC-H1 nebo REC-H1. Během množení udržovatele samosprášením, část pylově sterilních rostlin v samosprašném potomstvu roste s počtem generací, protože pylově sterilní rostliny jsou získávány nejen z potomstva pylově fertilních rostlin, ale také ze všeho potomstva pylově sterilních rostlin, které byly opylovány pylově fertilními potomky z téže generace, kteří rostou s nimi ve směsi a jsou pylově sterilní. Z toho plyne, že část pylově fertilních rostlin (udržovatel) ve směsi klesá až k hranici, kdy je množství pylu nedostatečné k opylení celé samičí produkované populace, všech pylově sterilních samičích květů. Proto je velmi důležité udržet konstantní poměr pylově sterilních ku pylově fertilním rostlinám v každé generaci. Toho může být dosaženo odstraňováním (vytrháváním) ♦ · 9 · · · · 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9999999999999 9 9 9 9 9 9 9 9
9999 9999 99 99 · 9 99
-16pylově sterilních rostlin v samosprašném potomstvu udržovatele. Tento způsob je však velmi pracný a zvyšuje také náklady na pěstování samičích rodičovských semen. Je proto výhodnější využít přítomnosti alely rht na krátkém rameni 4Ss v EC-H1 nebo REC-H1. Tato alela, která je Trvale pnpojena.k^XfeS?Xak!ey~ovl!vňuje-SiÁO.u^pÍt0mnostUv.-rostlině její výšky~(to znamená výšku udržovatele). Rostliny, které ji mají, jsou vyšší (v průměru o 6 až 8 cm), než rostliny, které ji neobsahují (pylově sterilní samičí rostliny). Rozdíl ve výšce usnadňuje selektivní sklizeň udržovatele ze směsi.
Další výhodnou cestou, jak udržet konstantní podíl pylově fertilních rostlin k pylově sterilním rostlinám v potomstvu samosprašného udržovatele, je další vylepšení EC nebo REC. Toto vylepšení spočívá v začlenění dalšího selekčního markéru, jako je například rezistence k herbicidu, rezistence k chorobám nebo modré zbarvení semen, do každého z těchto dvou vložených chromozómů udržovatele. Zavedení alely pro rezistenci k chlorotoluronu Su-S81 do EC (vznikne REC-HR) (Obrázek 2b) nebo do REC (vznikne REC-HR) (Obrázek 2d) usnadní ve všech generacích selektivní zničení pouze pylově sterilních rostlin pomocí herbicidu. EC-HR se sestrojí následnými kroky (Obrázek 8): rostliny udržovatele kultivaru Chinese Spring (CS), které jsou homozygotní pro ms-Bl, su-Bl a Ki-Bl a nesou EC-H jsou opyleny linií Ae. searsii nesoucí Su-S'’l a F1 je zpětně zkřížena ve funkci samičího rodiče sCS. Ve vzniklém potomstvu zpětného křížení se vyberou rostliny rezistentní k herbicidu a ty se potom samospráší za vzniku BICi F2 potomstva. Rostliny udržovatele se vyberou zBlCi F2 podle počtu chromozómů (výběr pro 2n=43)a pomocí chlortoluronové rezistence. Obdobně, vložení alely pro rezistenci k chorobě do EC nebo REC umožní infikovat pole patogenem. Jen pylově sterilní rostliny jsou vnímavé k infekci a produkují méně semen, která jsou scvrklá a jsou odfouknuta kombajnem při sklizni. Zavedení alely pro modrý aleuron (Ba) jako součásti selekčního markéru zAgropyron elongatum nebo Triticum monococcum, nebo z jakéhokoli druhu Graminae do EC nebo REC je součástí výhodného provedení tohoto vynálezu, kde se jedná o sestrojení vylepšeného vloženého chromozómu (IEC) nebo vylepšeného vloženého rekombinatního chromozómu (IREC), které mohou obsahovat alelu Ms-Aml z chromozómu 4Am z T. monococcum, Ba-El alelu z chromozómu 6S1 zAgropyron elongalum a Ki-Bl-a alelu z chromozómu 6S1 zAe. longissima, což umožňuje pěstováni udržovatele se 100 % pylově fertilních rostlin Alela Ba určuje barvu (děje se to syntézou antokyanů) aleuronové vrstvy v 3n endospermu. Exprese alely Ba je závislá na množství alely: dvě Ba alely vnesené samičí gametou do 3 a endospermu určují změnu semen na modrou na rozdíl od typicky červené/bílé barvy semen pšenice. Markér pro barvu semen je trvale spojen s alelou Ms, a tak lze následně rozlišit mezi modrými semeny, která se po pěstování objeví v pylově fertilních rostlinách (udržovatel) a typickými ěervenými/bílými semeny, která se vyvinou v pylově sterilních rostlinách. Tyto dva druhy semen mohou být mechanicky odděleny pomocí roztřiďovacího zařízení.
• 4 ·4 ·4 ···· ·· 4 4 • 444 · · · 4 · 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4
444444444444 • 4 · · · · · · • ••4 4444 44 44 44 44
-17Výše zmíněné modifikace v EC a REC jsou označeny jako IEC-HC (Obrázek 3a, 4a a 5a) a IREC-HC (Obrázek 3b, 4b a 5b) a jsou připraveny následujícím způsobem : IEC-HC 1 nesoucí alely MS-S31 a rhí-S'l z Ae. searsii, alelu Ba-El z A. elongaíum a ki-S11-a alelu '/.Ae. „2oKgxssi?M/7„je^připravftw ve Jxoji...krocích (Obrázek _9 ^a=d)r_za_prvé.· se-_připraví chromozóms translokací 4SsS/4EL, a to jako výsledek současných poruch dělení chromozómů 4Ss a 4EL následované centrickou fúzí 4SsS a 4EL, které se vyskytují v dvojnásobných monosomických přidáních 4Ss a 4E do pšenice obecné. Druhý krok zahrnuje ozáření semen, ve kterých došlo k dvojnásobnému monosomickému přidání 4SsS/4EL a 4SsS/6S1L a selekci v potomstvu vykazujícím žádanou translokací připojení 4SsS/4EL/6S1L.
IEC-HC2 nesoucí alely MS-S31 a rht-S31 z Ae. searsii, Ba-P^l z T. monococcum a Ki-Sl 1 alelu /Ae. longissima byl připraven následujícím postupem (Obrázek 10): zaprvé se připraví chromozóm s translokací 4SsS/4AmL, a to jako výsledek současných poruch dělení chromozómů 4Ss a 4A m L následované centrickou tuzí 4SsS a 4Am L, které se vyskytují v dvojnásobných monosomických přidáních 4Ss a 4Am (nebo monosomických přidáních 4Ss a monosomické translokační substituce 4BS/4AmL) do pšenice obecné. Druhý krok zahrnuje ozáření semen, ve kterých došlo k dvojnásobnému monosomickému přidání 4SsS/4AmL a 4SsS/6S1L a selekci potomstva vykazujícího žádanou translokací 4SsS/4AmL/6S1L.
IEC-HC3 nesoucí alely Ms-Aml a rht-Aml a Ba-EEl z T. monococcum a Ki-S11-a alelu z Ae. longissima byly připraveny ozářením semen, ve kterých došlo k dvojnásobnému monosomickému přidání 4Am a 6S1 do pšenice obecné a selekci potomstva vykazujícího žádanou translokací (Obrázek 11). IEC-HC3 má krátké rameno a proximální část dlouhého ramene z chromozómu 4 z T monococcum (4Am), nesoucí Ms-Am 1 alelu odpovídající za pylovou fertilitu v hexaploidním genotypu homozygotním na ms-Bl-c, rht-Aml alelu, která je odpovědná za za výši vzrůstu rostliny a Ba-Am 1 alelu, která určuje modré zabarvení aleuronu a distální část dlouhého ramene chromozómu 6 z Ae longissima (6S1L) nesoucí recesivní alelu ki-S11-a.
Různé typy REC a IREC (Obrázky 2b, 2d, 3b, 4b a 5b) byly sestrojeny za účelem zvýšení podílu (z 20 % až na 50 %) pylově fertilního genotypu udržovatele v samosprašném potomstvu udržovatele a k zabránění příležitostného centrického poškození vloženého chromozómu, které může být způsobeno chybou při jeho centrickém dělení. Vytvoření těchto vložených rekombinantních chromozómů je docíleno indukcí rekombinace mezi jedním z následujících chromozómů EC-H1, EC-HR1, IEC-HC1, IEC-HC2 nebo IEC-HC3 a chromozómu 6B, cestou homologního párování. Při tomto procesu je distální segment 6BL translokován do 6S’L ramene (bod zlomu je distální k alele ki-S11-a). (Obrázky 7b a 12). Tato translokace umožňuje spárováni REC a IREC, a to téměř v každém meiocytu, s 6BL v liniích ·· ·» ·· *··*
-18pšenice obecné homozygotních pro Phl a monosomických pro 6B a REC nebo pro jeden z IREC. Tyto chromozómy se oddělují k opačným pólům a vedou k zavedení REC nebo IREC do poloviny gamet.
Nežádoucí centrické rozdělení vloženého chromozómu vede k centromerickému chybnému oddělení Ms-S’1 1 a rht-S1 1 od ki-S11-a v EC-H1 a oddělení Ms-Ssl a rhí-Sii od SuSfl a ki-S11-a v EC-HR1, což umožňuje přenos alely Ms-S;l samčími gametami. To může vest ke vzniku pylově fertilních potomků po opylení pylově sterilní samičí linií udržovatelem. Tyto rostliny, které nesou rht alelu jsou vyšší, než pylově sterilní rostliny a mohou být na tomto základě odděleny. Co více, protože se chybné centromerické dělení vyskytuje hlavně u nepárových chromozómů (univalentních), užitím REC nebo IREC, které se párují s přirozeně se vyskytujícím 6B téměř v každém meiocytu, dochází k prevenci tohoto nežádoucího jevu.
Vynález dále popisuje užití udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé pro množení pylově sterilní samičí rodičovské linie, která se používá pro vytvoření hybridní pšenice a způsoby jejich přípravy.
Další část předloženého vynálezu se týká selekce semen pylově sterilní samičí rodičovské linie přímo z potomstva samosprašného udržovatele nesoucího bud’ IEC-HC (Obrázek 15a) nebo IRE-HC (Obrázek 15b). Okolo 80 % semen produkovaných udržovatelem se zabudovaným IEC-HC není modrých, neobsahují tedy IEC-HC, a proto se po vypěstování vyvinou v pylově sterilní rostliny. 20 % semen je modrých, nesou tedy IEC-HC a po napěstování se v nich vyvinou semena pylově fertilních rostlin. Roztřídění samosprašných semen udržovatele pomocí přístroje na barevné rozlišení, oddělí semena samičí rodičovské (červená/bílá) od udržovatele, která jsou modrá. Využitím tohoto postupu jsou pylově sterilní samičí linie získány přímo ze samosprašné linie udržovatele, není tedy třeba odděleného pěstování udržovatele a získají se přímo požadované samičí linie a jejich výrobní cena je značně nižší.
Předkládaný vynález dále uvádí způsoby přeměny uvažovaného kultivaru pšenice obecné nebo tvrdé v pylově sterilní samičí rodičovskou linii a pylově fertilní udržovací linii pro zmíněnou samičí linii.
Dále se předložený vynález vztahuje ke způsobu přípravy hybridní rostlinné linie pšenice obecné nebo tvrdé, v němž je pylově sterilní samičí rodičovská linie křížená s kultivarem toho samého druhu (R linií), která je svými přirozenými vlastnostmi pylové
-19«· *» ♦ · ♦ · · · • · » * · • · · · * • « · · ♦ 99999999 99 99 ··
9 9 9
9 9 9
999 999 • ·
99 fertility homozygotní pro Ms-Bl alelu a vytváří Fi hybridní potomstvo, ve kterém jsou všechny rostliny fertilní a heterozygotní (Ms-Blms-BB).
Přehled obrázků na výkrese
Obrázky la až lc popisují obecná schémata pro množení pylově sterilní samičí rodičovské linie (linie A) buď : (la) opylením udržovací linii (linií B), nebo (lb) výběrem z potomstva samosprašného udržovatele (lc) nebo kombinací těchto dvou způsobů popsaných v la a lb a konečně produkcí (Fj) hybridních semen vznikých opylením linie A samčí linií (linie R)
Obrázek 2a až 2d ukazuje shematické obrázky vložených chromozómů EC-H1 (2a), EC-HR1 (2b) a dále na obrázku (2c) vložený chromozóm REC-H1 a REC-HR1 na obrázku (2d)
Obrázky 3a a 3b udávájí schematický nákres vylepšeného vloženého chromozómu IEC-HC1 (3a) EREC-HCl(3b)
Obrázky 4a a 4b udávají schematické nákresy vylepšených vložených chromozómů IEC-HC2 (4a) a IREC-HC2 (4b)
Obrázky 5a a 5b udávají schematické nákresy vylepšených vložených chromozómů IEC-HC3 (5a) a vylepšených rekombinantních vložených chromozómů IREC-HC3 (5b)
Obrázek 6 znázorňuje schematický proces přenosu recesivní alely pro pylovou sterilitu ms-Blc z Cornestonovy mutanty do 4Ss monosomické přidané linie pšenice obecné kultivaru Chinese Spring (CS)
Obrázky 7a a 7b znázorňují schémata postupu pro přípravu udržovací linie s vloženým chromozómem EC-Hl(7a) a s rekombinantím vloženým chromozómem REC-H1 (7b), nesoucími Ms-S'1 a rhl-tf 1 z 4SsS z Ae. searsii a ki-S11-a z 6S*L zAe. longissima, stejně jako je tomu v pylově sterilní samičí linii pšenice obecné kultivaru Chinese Spring. EC-H1 se připraví jako monosomické přidání v disomických 6B rostlinách a proto je také homozygotní pro Ki-Bl, REC-H1 je připraven monosomickou substitucí v monosomických 6B rostlinách a je proto hemizygotní pro Ki-Bl.
·· ·· φφ φφφφ φφ φφφφ φ φ φ φφφ « · · · φ Φ·· φ φφφφ φ· φφφ φ φ φφφφ φ φ φφφφ φφφφ φφ «φ φφ ··
-20Obrázky 8a a 8b znázorňují schémata postupů pro přípravu udržovací linie s vloženým chromozómem EC-HR1 (8a) a s rekombinantím vloženým chromozómem REC-HR1 (8b), nesoucími Ms-^1, rht-E1 z 4SsS z Ae. searsii, Su-Ss 1 z 6SsL Ae. searsii a ki............z „6S1!, z ^e„^/au^'5^.Wíi^,C-HKlT-se-^npraví-jak& monosomické přidánív disomických 6B rostlinách, a proto je také homozygotní pro Ki-Bl, REC-HR1 je připraven monosomickou substitucí v monosomických 6B rostlinách a je proto hemizygotní pro Ki-Bl.
Obrázek 9a až 9d popisují tři schémata postupů přípravy udržovací linie s vylepšeným vloženým chromozómem IEC-HC1 nesoucím Ms-Kl, rht-S?1 z 4SsS z Ae. searsii, Ba-El z 4EL z Ae. elongaíum a ki-S11-a z 6S’L zAe. longissima stejně jako pylově sterilní samičí linie v pšenici obecné kultivaru Chinese Spring. Dvojnásobné rozbití a opětné sesazení je indukováno dvojnásobným monosomickým přidáním EC-H1 a 4E chromozómu (9a), jednoduché poškození a sestavení je indukováno mezi EC-H1 a dříve již ozářeným translokovaným chromozómem 4SsS/4EL (9b), jednoduché poškození a sestavení je indukováno mezi EC-H1 a translokovaným chromozómem 4SsS/4EL, který byl získán jako výsledek poruchy dělení chromozómu a centrické fuze (9c), obrázek 9d ukazuje rozdíly mezi 9a, 9b a 9c.
Obrázek 10 znázorňuje schéma postupu pro přípravu udržovací linie s vylepšeným vloženým chromozómem IEC-HC2 nesoucím Ms-Š3! a rht- Π z 4SsS z Ae. searsii a Ba-Aml z 4Am L z T. monococcum, a ki-S11-a z 6S*L zAe. longissima, stejně jako je to v pylově sterilní samičí linii pšenice obecné kultivaru Chinese Spring.
Obrázek 11 znázorňuje schéma postupu pro přípravu udržovací linie s vylepšeným vloženým chromozómem IEC-HC3 nesoucím Ms-A™ 1 a rht-Am 1 z 4AmS z T. monococcum a Ba-Aml z 4AmL z T. monococcum, a ki-S11-a z 6S’L zAe. longissima stejně jako je tomu v pylově sterilní samičí linii pšenice obecné kultivaru Chinese Spring.
Obrázek 12 znázorňuje schéma postupu pro přípravu udržovací linie s vylepšeným vloženým rekombinantním chromozómem IREC-HC1 nesoucím Ms-S;l a rht-S;l z 4SsS z Ae. searsii a ki-S11-a z 6S*L zAe. longissima, stejně jako je tomu v pylově sterilní samičí linii pšenice obecné kultivaru Chinese Spring.
Obrázky 13a a 13b znázorňují schémata podle obrázku (la) pro pšenici obecnou nebo tvrdou, založené na geneticky získané pylové sterilitě, kde je linie A značena cv. „One,,, která je homozygotní pro recesivni alelu pylové sterility ms-Bl-c a pro dominantní alelu genu navozujícího pylovou sterilitu Ki-Bl.
Obrázek (13a): Linie B stejného kultivaru cv. „One,, je genově shodná s linií A, ale nese také vložený chromozóm EC-H1 (4SsS/6S*L) nesoucí dominantí alelu pro pylovou fertilitu
-21··
Φ· • · · • φ MW •ΦΦΦ φφφφ • φ « φφφ φ φ <
Φ Φ Φ 4
ΦΦ ΦΦ •'ΦΦ ΦΦ • Φ Φ Φ • Φ Φ Φ
ΦΦ
Ms-S3! a dominantní alelu rht na 4SsS a recesivní alelu genu navozujícího pylovou sterilitu Ki-S11 na 6S1 L. Linie R, zde značena jako cv. „Two„, je homozygotní pro alelu divokého typu pylové fertility Ms-Bl a pro recesivní alely genu navozujícího pylovou-sterilitu ki-Bl-a nebo h‘-fiX-j3uObrázdc43b:popis je stejný jako-pro 1-3ay-al& linie B nese vložený rekombinantní chromozóm REC-H1 místo EC-H1 a jen jednu dávku chromozómu 6B nesoucího Ki-Bl.
Obrázky 14a a 14b znázorňují schémata podle obrázku (la) pro pšenici obecnou a tvrdou založené na geneticky získané pylové sterilitě, kde je linie A značena cv. „One,,, která je homozygotní pro recesivní alelu pylové sterility ms-Bl-c, pro recesivní alelu citlivosti k herbicidu su-Bl a pro dominantní alelu genu navozujícího pylovou sterilitu Ki-Bl. Obrázek 14a; Linie B stejného kultivaru cv. „One,, je genově shodná s linií A, ale nese také vložený chromozóm EC-HR1 (4SsS/6S1L) nesoucí dominantí alelu pro pylovou fertilitu Ms-S:l a dominantní rht alelu na 4SsS, dominantní Su-S3! alelu a recesivní alelu genu navozujícího pylovou sterilitu ki-S' 1 na 6S1 L. Linie R je zde značena jako cv. „Two„, je homozygotní pro alelu divokého typu pylové fertility MsBl a recesivní pro jednu z alel genu navozujícího pylovou sterilitu ki-Bl-a nebo kiBl-n. Obrázek 14b: popis je stejný jako pro 14a, ale linie B nese vložený rekombinantní chromozóm REC-HR1 místo EC-HR1 a jen jednu dávku chromozómu 6B nesoucího Ki-Bl.
Obrázky 15a a 15b znázorňují schémata podle obrázku (lb) a (lc) pro pšenici obecnou nebo tvrdou, založené na geneticky získané pylové sterilitě, kde je linie A značena cv. „One,,, je homozygotní pro recesivní alelu pylové sterility ms-Bl-c a dominantní alelu Ki-Bl. Obrázek 15a; Linie B stejného kultivaru cv. „One,, je genově shodná s linií A, ale nese navíc vylepšený vložený chromozóm IEC-HC1 mající 4SsS/4EL/6S1L nesoucí alely Ms-S'1, rht-S3l, Ba-El, ki-S11-a. Linie R je zde značena jako cv. „Two„. Je homozygotní pro alelu divokého typu pylové fertility Ms-Bl a recesivní pro jednu z alel genu navozujícího pylovou sterilitu ki-Bl-a nebo ki-Bl-n. Obrázek 15b: popis je stejný jako pro 15a, ale linie B nese vylepšený vložený rekombinantní chromozóm IREC-HR1 místo EC-HC1 a jen jednu dávku Chromozómu 6B nesoucího Ki-Bl.
Obrázky 16a a 16b popisují schematické postupy přeměny uvažovaného kultivaru (cv. New) v pylově sterilní linii a udržovací líni nesoucí EC-H (16a) a přeměnu uvažovaného kultivaru (cv. New) v pylově sterilní linii a rekombinatní udržovací linii nesoucí RECH(16b) • 9 • · »· · · · ·
I · · · · · ·
-22Obrázky 17a a 17b popisují schematické postupy přeměny uvažovaného kultivaru (cv. New) v pylově sterilní linii a udržovací lini nesoucí EC-HR (17a) a přeměnu uvažovaného kultivaru (cv. New) v pylově sterilní linii a rekombinatní udržovací linii nesoucí RECHR(17b)
Obrázky 18a a 18b popisují schematické postupy přeměny uvažovaného kultivaru (cv. New) v pylově sterilní linii a vylepšenou udržovací lini nesoucí IEC-HC (18a) a přeměnu uvažovaného kultivaru (cv. New) v pylově sterilní linii a vylepšenou rekombinatní udržovací linii nesoucí IREC-HC (18b).
Podrobný popis vynálezu
V souladu s předloženým vynálezem byl vyvinut jednoduchý systém pro pšenici obecnou a tvrdou , který je znázorněn na Obrázcích la, 13a a 14a, pomocí něhož se pylově sterilní samičí linie (linie A) množí opylením linií udržovatele (linie B) a veškeré vzniklé potomstvo jsou pylově sterilní samičí rostliny. Obdobně, udržovací linie se sama lehce množí samosprášením, výsledkem je směs semen, ze kterých se kolem 20 % po výsevu vyvine v pylově fertilní rostliny, které jsou identické s udržovací linií a nesou vložený chromozóm, zbylých 80% se po výsevu vyvine v pylově sterilní rostliny, protože u nich chybí alela Ms-S?l. Užitím selekčních markérů k charakterizaci udržovatele se zachová v každé generaci potomstva samosprašné udržovací linie poměr 80 % pylově sterilních ku 20 % pylově fertilních rostlin.
Je-li selekčním markérem barevný selekční markér, jako je modrý aleuron nebo další vlastnost semene, předložený vynález poskytuje další alternativní vylepšený a výhodný systém pro množení obou linií, a to jak pylově sterilní samičí rodičovské linie (linie A), tak pylově fertilní linie udržovatele (linie B) (Obrázky lb, lc a 14a). Semena obou linií se získají samosprášením udržovatele : 80 % semen je červených/bílých a když se vysejí, poskytnou pylově sterilní rostliny (linie A) a 20 % semen je modrých a výsevu se vyvinou v pylově fertilní rostliny (linie B). Roztříděním semen samosprašné udržovací linie pomocí přístroje pro barevné třídění získáme dva druhy semen. V tomto výhodném uspořádání jsou semena pylově sterilní linie získávána přímo samosprášením udržovací linie, nemusí se zvlášť pěstovat udržovatel ani samičí linie, a tak se sníží výrobní náklady na získání samičího rodiče. Také se nesnižuje množství životaschopného pylu v udržovateli, protože všechny rostliny ve výsevu udržovatele jsou pylově fertilní.
Pro produkci pšeničných hybridů se pylově sterilní samičí rodičovská linie křížila s kultivarem pšenice obecné nebo tvrdé (linie R), který byl přirozeně pylově fertilní a • ·
-25• ·
• · ·
V dalším výhodném uspořádání vynálezu je popsán ještě další vylepšený způsob pro množení pylově sterilní rodičovské linie (Obrázek 15b) pšenice obecné a tvrdé za účelem přípravy Fi hybridů pšenice. Tento způsob zahrnuje :
a) samoopylení vylepšené udržovací linie, která je genově shodná sesamičí rodičovskou linií, to znamená, že je homozygotní pro kteroukoliv z recesivních alel pylovou sterilitu ms-Bl a monosomická pro chromozóm 6B nesoucí alelu Ki-Bl a pro vylepšený vložený rekombinantní chromozóm typu IREC-HC (Obrázky 3b, 4b, 5b), distální k ki-tfl-a alele. Distální oblast dlouhého ramene chromozómu 6B (6BL) se pravidelně páruje s homologní oblastí nativního chromozómu 6BL. Popsaný IREG-HC nese kromě toho ještě alely Ms, rht a ki-S11-a a také markér na selekci semen, to je Ba alelu pro modrou barvu semen. Z tohoto důvodu zde popsaný vylepšený vložený rekombinantní chromozóm zahrnuje vlastně IRECHC 1 (4SsS/4EL/6S1L/6BL) nesoucí Ms-S?l, rht-tfl, Ba-El a ki-^l-a, IRECHC2 (4SsS/4AmL/6S1L/6BL) nesoucí Ms-^I, rht-fl, Ba-Aml a ki-S81-a nebo IREC-HC3 (4AmS-4An’L/6S1L/6BL) nesoucí Ms-Aml, rht-Aml, Ba-Aml a ki-Čl-a a
b) sklízení semen ze samosprašného potomstva rostlin (a), které jsou všechny homozygotní pro uvedené alely pylové sterility a alely genu navozujícícho pylovou sterilitu, 50 % z nich je disomických pro chromozóm 6B a chybí jim IREC-HC, a proto jsou červeně/bíle zbarvená a po vypěstování se z nich vyvinou pylově sterilní rostliny. Zbylých 50 % semen je monosomických pro chromozóm 6B a monosomických pro IREC-HC, a proto jsou modře zbarvená. Po vypěstování dají pylově fertilní rostliny a poskytnou pro další generaci semena potomstva (a), ve kterém budou pylově fertilní rostliny vznikat samosprášením a budou také opylovat pylově sterilní rostliny a
c) sklízení semen z rostlin potomstva (b), která jsou všechna homozygotní pro uvedené alely pylové sterility, 75 % z nich je disomických pro chromozóm 6B a chybí jim IREC-HC, proto jsou červeně/bíle zbarvená a mohou být oddělena dělícím zařízením od modrých semen osahujících IREC-HC. Po výsevu se z nich vyvine pylově sterilní samičí linie.
Podle vynálezu se mohou užívat všechny alely pro pylovou sterilitu Ms-Bl, jako jsou například alely Ms-Bl-a, Ms-Bl-b a MS-Bl-c nebo další alely z tohoto lokusu nebo jiného lokusu pšenice obecné a tvrdé, které vyvolávají pylovou sterilitu. Podle vynálezu mohou být použity všechny alely Ba z jakéhokoli druhu Graminae, například Ba-Aml z T. monococcum, Ba-El z A. elongatum, Ba-Rl z rýže a Ba-Hl z ječmene. Podle vynálezu může být použita jakákoliv
ΒΒ ·· ······ • · · · · · · « · · Β Β
Β Β Β Β Β Β *
Β Β « Β · Β
ΒΒΒΒΒΒΒΒ Β · Β ·
-26alela ovlivňující vlastnosti semen. Podle vynálezu může být použita jakákoliv alela rht z jakéhokoliv druhu Graminae, například jako jsou rhl-tf1 zAe. Searsii, rht-^1 z Ae. longissima a rht-Am 1 z T. monococcum. Podle vynálezu může být použita jakákoliv alela —z-jakshokeliv -drubu-Graminae nesoucí-fezřsíeneHeherbicidůmrjako je napříkJad-ófo^/~z-7fe·· longissima. Podle vynálezu může být použita jakákoliv ki alela z jakéhokoliv druhu Graminae nesoucí citlivost k působení genů navozujících pylovou sterilitu, jako je například Ki-Bl.
V dalším uvedení vynálezu je popsán způsob získání pylově sterilní udržovací linie pšenice obecné a tvrdé za účelem množení pylově sterilní samičí rodičovské linie pro výrobu hybridní pšenice. Zmíněná udržovací linie je genově shodná se samičí rodičovskou linií a homozygotní pro kteroukoliv alelu pylové sterility ms-Bl a pro alelu Ki-Bl samičí rodičovské linie a nese ještě přidaný cizorodý vložený chromozóm EC-H1 (4SsS/6S1L) nesoucí Ms-S'!l, rht- ΚΊ a ki- Ssl-a alely. Jelikož není alela pro pylovou fertilitu přenášena pylovými zrny, všichni potomci vzniklí křížením mezi pylově sterilní samičí linií a pylově fertilní linií udržovatele jsou isogenní k samičím rodičům a jsou pylově sterilní.
V dalším uvedení vynálezu je popsán způsob získání pylově fertilní udržovací linie pšenice obecné a tvrdé za účelem množení pylově sterilní samičí rodičovské linie pro potřebu výroby hybridní pšenice. Popsaná udržovací linie je isogenní k samičí rodičovské linii a homozygotní pro kteroukoliv alelu pro pylovou sterilitu ms-Bl, pro alelu citlivosti k působení chlortoluronu su-Bl a pro alelu Ki-Bl genu navozujícího pylovou sterilitu samičí rodičovské linie a nese ještě přidaný cizorodý vložený rekombinantní chromozóm EC-HR1 (4SsS/6S1L) nesoucí Ms-Sfl, rht- ífl, Su-Š3! a ki-Kl-a alely. Jelikož není alela pro pylovou fertilitu udržovací linie přenášena pylovými zrny, všichni potomci vzniklí křížením mezi pylově sterilní samičí linií a pylově fertilní linií udržovatele jsou genově shodní se samičími rodiči a jsou pylově sterilní.
V ještě výhodnějším uvedení vynálezu je popsán způsob získání rekombinantní pylově fertilní udržovací linie pšenice obecné a tvrdé za účelem množení pylově sterilní samičí rodičovské linie pro potřebu výroby hybridní pšenice. Popsaná udržovací linie je genově shodná se samičí rodičovskou linií a homozygotní pro kteroukoliv alelu pylové sterility ms-Bl, ale je monosomická pro chromozóm 6B, a proto hemizigotní pro alelu Ki-Bl a nese ještě přidaný cizorodý vložený rekombinantní chromozóm REC-H1 (4SsS/6S'L/6BL), distalní k alele ki-^l-a. Vzdálená oblast 6BL se pravidelně páruje s homologní oblastí nativního chromozómu 6BL. Následně, REC bude obsažen v 50 % gamet. Jelikož není alela pro pylovou fertilitu rekombinantní udržovací linie přenášena pylovými zrny, všichni potomci vzniklí křížením mezi pylově sterilní samičí linií a rekombinantní pylově fertilní linií udržovatele budou genově shodní se samičím rodičem a budou pylově sterilní. Na druhé straně, 50 % potomstva
» · • ·
-27• · · · k · · 1 » · · « • · · · · « • a • · · · vzniklého samosprášením rekombinantního udržovatele bude obsahovat REC a bude proto pylově fertilní.
V dalším výhodném provedení vynálezu je popsán způsob získání rekombinantní pylově fertilní udržovací linie pšenice obecné a tvrdé za účelem množení pylově sterilní samičí rodičovské linie pro potřebu výroby hybridní pšenice. Popsaná udržovací linie je genově shodná se k samičí linii a homozygotní pro kteroukoliv alelu ms-Bl a pro alely su-Bl, ale je monosomická pro chromozóm 6B, a proto hemizigotní pro alelu Ki-Bl a nese ještě přidaný cizorodý vložený rekombinantní chromozóm REC-HR1 (4SsS/6S*L/6BL), distální k alele kiS3l-a. Vzdálená oblast 6BL1 se pravidelně páruje s homologní oblastí nativního chromozómu 6BL. Následně, REC-HR1 bude obsažen v 50 % gamet. Jelikož není alela pro pylovou fertilitu rekombinantní udržovací linie přenášena pylovými zrny, všichni potomci vzniklí křížením mezi pylově sterilní samičí linií a rekombinantní pylově fertilní linií udržovatele jsou genově shodní se samičím rodičem a jsou pylově sterilní. Na druhé straně, 50 % potomstva vzniklého samosprášením rekombinantního udržovatele bude obsahovat REC-HR1 a bude proto pylově fertilní.
V dalším výhodném provedení vynálezu je popsán způsob získání vylepšené udržovací linie pšenice obecné a tvrdé za účelem množení pylově sterilní samičí rodičovské linie pro potřebu výroby hybridní pšenice. Popsaná udržovací linie je genově shodná se samičí linií a homozygotní pro kteroukoliv alelu pylové sterility ms-Bl ά a pro alelu Ki-Bl genu navozujícího pylovou sterilitu samičího rodiče. Dále nese přidaný vylepšený vložený chromozóm IEC-HC, buď IEC-HC1 (4SsS/4EL/6S’L), IEC-HC2 (4SsS/4AmL/6S]L) nebo IEC-HC3 (4AmS4AmL/6S1L) nesoucí Ms-S^l, rht-S31, Ba-El &ki-S3l-a, Ms-Sfl, rht-S3 1, Ba-Aml ůki-S^I-a a, Ms-Aml, rht-Aml, Ba-Aml a ki- íf 1-a alely. Jakákoliv alela pro selekční maker může nahradit v IEC-HC Ba alelu. Je-li selekční markér pro semeno charakteristický, jako je barva semene, semena v potomstvu vzniklá samoopylením udržovatele se vyvinou v rostliny, které jsou genově shodné se samičí rodičovskou linií a jsou pylově sterilní. Tato semena mohou být oddělena od těch, která se vyvinou v pylově fertilní udržovací linii. Tak je možné množit pylově sterilní samičí rodičovskou linii samoopylením vylepšeného udržovatele obsahujícího selekční markér pro semena. 80 % semen vzniklých samoopylením vylepšené udržovací linie je červených/bílých a když se vypěstují, poskytnou pylově sterilní rostliny. 20 % semen je modrých, po vypěstování se vyvinou v pylově fertilní rostliny.
Dalším výhodným uvedením vynálezu je způsob získání vylepšené rekombinantní udržovací linie pšenice obecné a tvrdé za účelem množení pylově sterilní samičí rodičovské linie pro potřebu výroby hybridní pšenice. Popsaná udržovací linie je genově shodná se samičí linii a homozygotní pro kteroukoliv alelu ms-Bl-Bl, ale je monosomická pro chromozóm 6B, a proto hemizigotní pro alelu Ki-Bl a nese ještě přidaný vylepšený vložený cizorodý «· ·» ·* ···· ·· ··
9 9 9 ♦ · · 9 9 9 9
9 99 9 99·· « · ♦ · 9 99 999999
9 9 9 9 9 9 9
9999 9999 99 99 99 99
-28rekombinantní chromozóm IREC-HC, buď IREC-HC (4SsS/4EL/6S1L/6BL), IREC-HC2 (4SsS/4AmL/6S1L/6BL), nebo IREC-HC3 (4A,nS-4AmL/6S1L/6BL) nesoucí Ms-tfl, rht-tfl,
Ba-El a ki-^l-a, Ms-S?l, rht-tfl, Ba-Aml a ki-^l-a a, Ms-Aml, rht-Aml, Ba-Aml a ki-tfl-a alely- Všechny-obsahují 6BL část -pšeRtee-ebecnér Jakákoliv alela pro -selekční-maker může----— nahradit v IREC-HC Ba alelu.
Dalším výhodným uvedením vynálezu je způsob přípravy pylově sterilní udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé obsahující vložený chromozóm EC-H1 (Obrázek 7a) skládající se z :
a) křížení pylově sterilní samičí rodičovské linie odvozené z kultivaru Chinese Spring pšenice obecné, uvedená samičí rodičovská linie je homozygotní pro obě dominantní alely pylové sterility Ms-Bl umístěné na ramenu chromozómu 4BS a pro dominantní alelu Ki-Bl genu navozujícího pylovou sterilitu umístěné na 6BL a mající další cizorodý chromozóm 6S1, který nese na svém dlouhém rameni recesivní alelu pro pylovou sterilitu ki-S! 1-a se samčí rodičovskou linií, která je isogenní k samičí rodičovské linii, aleje homozygotní pro recesivní alelu pro pylovou sterilitu ms-Bl-c a též v ní chybí chromozóm 6S1’který je nahrazen cizorodým chromozómem 4Ss, který nese na své kratším rameni dominantní alely Ms-S51 a rht-tf 1.
b) sbírání semen potomstva z kříženi (a). Vypěstováním těchto semen se získají pylově fertilní rostliny Fb z nichž některé jsou dvojnásobně monosomické v přidání cizorodého chromozómu, to znamená, mají dva cizorodé chromozómy 4Ss, který nese Ms-E31 a rht- a 6S1 nesoucí ki-S11-a.
c) samosprášení uvedeného Fj potomstva (b), shromáždění velkého počtu jeho semen.
Jejich pěstováním se vytvořily F2 rostliny, z nichž některé jsou monosomické pro přidání cizorodého translokovaného vloženého chromozómu, 25 % z nich je homozygotních pro alelu pylové sterility ms-Bl-c. To jsou požadované rostliny.
d) vybrání požadovaných rostlin z (c) pomocí metody počítaní chromozómů a Cproužkováním, užitím DNA markérů a jejich samoopylením
e) sběru samoopylených semen potomstva (d). Jejich pěstováním se vytváří F3 rostliny, které jsou všechny homozygotní k alele pylové sterility ms-Bl-c. 20 % z nich je pylově sterilních, protože nesou také přidaný vložený chromozóm EC-H1. Takto se získá požadovaná udržovací linie rostlin.
f) výběru požadované udržovací linie rostlin z (e) počítáním chromozómů a užitím DNA markérů.
·· • · • · · · · · · · · · • ·· · · ♦ · · ·· · • · ·· · · · · · ···*··*«····· • * » · · · · · ········ ·· ·· ·· ··
-29Dalším výhodným uvedením vynálezu je způsob přípravy pylově sterilní udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé obsahující vložený chromozóm EC-HR1 (Obrázek 8a) skládající se z :
a) křížení pylově fertilní samičí rodičovské linie odvozené ze samčí fertilní udržovací linie kultivaru Chinese Spring pšenice obecné. Uvedená samičí rodičovská linie je homozygotní pro obě recesivní alely pylové sterility Ms-Bl, pro recesivní alelu citlivosti k chlortoluronu su-Bl a dominantní pro alelu Ki-Bl genu navozujícího pylovou sterilitu a mající jako monosomicé přidání vložený chromozóm EC-H1, který nese na svém krátkém rameni dominantní alelu pro pylovou fertilitu Ms-S5l a semidominantní alelu rht-S;l. Na jeho dlouhém rameni je recesivní alela citlivosti k chlortoluronu su-S11 a recesivní alela Ki-S11 genu navozujícího pylovou sterilitu. Ke křížení dochází s linií diploidních druhů Aegilops searsii, které máji vlastní dominantní alelu rezistence k chlortoluronu Su-S51 na 6SsL, stejně tak jako Ms-Ss 1 a rhl-íf 1 alely na4SsS.
b) sbírání semen potomstva z kříženi (a) a vypěstováním těchto semen se získají rostliny Fb z niehž některé mají 2n=29 chromozómů, to znamená, že mají jednu sadu chromozómů od CS, vložený chromozóm EC-H1 a sadu chromozómů z Aegilops searsii, mají tedy genotyp ms-BlMs-S;!Ms-S;7, ki-Blki- S11-a a su-Bl su-S1 ISu-S5!
c) vybírání Fi potomstva z (b) se vzorcem 2n=29 chromozómů a jejich zpětným křížením s CS jako samčí linií. Sbíráním semen tohoto potomstva a jejich pěstováním se vytváří BCi rostliny, z nichž některé jsou rezistentní k chlortoluronu a jsou monosomické pro přidaný vložený chromozóm EC-HR1. Všechny rostliny jsou heterozygotní k msBl Ms-Bl a homozygotní pro su-Bl a Ki-Bl. Toto jsou požadované rostliny.
d) výběru požadovaných rostlin z (c) pomocí počítaní chromozómů, metodou Cproužkování a užitím DNA markérů a jejich samoopylení
e) sběru samoopylených semen potomstva z (d) a jejich pěstováním se vytváří BCiF2 rostliny, z nichž je 20 % rezistentních k chlorotoluronu, to znamená, nesou vložený chromozóm, 25 % rostlin je homozygotních k ms-Bl, ale jsou pylově sterilní, protože nesou Ms-Ss 1 z vloženého chromozómu EC-HR1. Takto se získá požadovaná udržovací linie rostlin.
f) výběru požadované udržovací linie rostlin (e) pomocí jejich rezistence k chlorotoluronu a užitím DNA markérů.
4 • 444 · * · · • · · · · · · · · •44444· 999 999 • 4 4 4 4 · · 4 ·······» 44 4 4 44 ··
-30Dalším výhodným uvedením vynálezu je způsob přípravy pylově sterilní rekombinantní udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé obsahující rekombinantní vložený chromozóm RECH1 (Obrázek 7b) skládající se z :
a) křížení pylově fertilní samičí rodičovské linie odvozené z kultivaru Chinese Spring pšenice obecné, uvedená samičí rodičovská linie je homozygotní pro dominantní alelu pylové fertility Ms-Bl na rameni chromozómu 4BS a pro dominantní homologně se párující alelu supresoru Phl na rameni chromozómu 5BL, nulisomickou pro chromozóm 6B a tudíž i deficitní pro dominantní alelu Ki- B1 navozujícího pylovou sterilitu a mající pár chromozómů 6S1, které nesou recesivní alelu pro pylovou sterilitu Ki- S11 -a se samčím rodičem, který je genově shodný se samičím rodičem, ale je disomický pro 6B a tudíž homozygotní pro Ki-Bl, postrádající chromozóm 6S1, je také homozigotní pro mutantní homologně se párující alelu supresoru phlb.
b) sběru semen potomstva z kříženi (a). Výsevem těchto semen se získají pylově fertilní rostliny Fi (Ms-BlMs-Bl), které jsou heterozygotní pro homologně se párující alely supresoru (Phlphlb). Všechny jsou monosomické pro oba chromozómy, to znamená pro 6B
c) zpětné křížení Fi z (b) se samčím rodičem
d) sběru semen potomstva z křížení (c). Jejich pěstováním se vytváří BCi rostliny, z nichž všechny jsou pylově fertilní (Ms-BÍMs-Bl), 50 % je homozygotních pro alelu phlb, z nichž okolo 50 % je dvojnásobně monosomiekých pro oba chromozómy 6B a 6S1 (protože 6B se páruje s 6S1). Toto jsou požadované rostliny.
e) Vybírání požadovaných rostlin BCi z (d) užitím DNA markérů, analýzou párování chromozómů při meiozi. Jejich opylení ditelosomickou 6BS linií (to znamená linií deficitní pro 6BL ramena), která je genově shodná sBCi rostlinámi, ale je homozygotní k PhlPhl
f) sběru semen potomstva z křížení (e). Jejich pěstováním se vytváří rostliny, které jsou všechny monotelosomické pro rameno chromozómu 6BS, některé z nich jsou monosomické pro vložený chromozóm sestávající z krátkého ramene a blízké oblasti dlouhého ramene 6S1 (nesoucí ki-S11-a) a vzdálené oblasti chromozómu 6BL (bod rekombinace je distální kki-S11-a). Toto jsou požadované rostliny.
g) Výběru semen požadovaných rostlin z (f) pomocí metody C-proužkování, použitím DNA markérů a analýzami párování chromozómů a jejich křížení v roli samčí linie se samičí linií, která není rekombinantní udržovací linií. To znamená, že je homozygotní pro kteroukoliv z obou recesivních alel pro pylovou sterilitu ms-Bl a dominantní pro • * · 9 9 · 9 9 9 · 9 • · ·· · 9 9 9 9 ·············
9 · 9 9 9 · 9 ···· ···· ·· 99 ·· ··
-31alelu genu navozujícího pylovou sterilitu Ki-Bl a má vložený chromozóm EC-H1 nesoucí Ms-S3 1, rhí-^ 1 a ki-S3 1-a alely.
h) sběru semen potomstva z křížení (g) a jejich pěstování se vytváří Ft rostliny, z nichž některé jsou trojnásobně monosomické, to znamená monosomické pro 6B, pro cizí vložený chromozóm EC-H1 a pro rekombinantní chromozóm (óSVóBL) a jsou heterozygotní pro Ms-Blms-Bl, hemizygotní pro Ki-Bl a homozygotní ki-S! 1-akiS11-a. Toto jsou požadované rostliny
i) výběru požadovaných rostlin z (h) pomocí počítání chromozómů, C-proužkování, použitím DNA markérů. Jejich opylení, sběru semen potomstva a jejich výsevem se vytvoří rostliny F2, z nichž některé jsou dvojnásobně monosomické, obsahují chromozóm 6B a vložený rekombinantní chromozóm REC-H1 ((4SsS/6S1L/6BL), nesoucí alely Ms-S?7, rht-S; 1 a ki-$? 1-a. Toto je požadovaná udržovací linie rostlin.
Vynález se dále týká způsobu přípravy pylově sterilní rekombinantní udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé obsahující vložený rekombinantní chromozóm REC-HR1 (Obrázek 8b) skládající se z :
a) křížení pylově fertilní samičí rodičovské linie odvozené z pylově fertilní rekombinantní udržovací linie kultivaru Chinese Spring pšenice obecné, uvedená samičí rodičovská linie je monosomická pro 6B monosomické přidání REC-H1. Tato samičí rodičovská linie je homozygotní pro recesivní alelu pylové sterility ms-Bl na rameni chromozómu 4BS a hemizigotní pro recesivní alelu citlivosti k chlortoluronu su-Bl a dominantní pro alelu Ki-Bl genu navozujícího pylovou sterilitu a mající jako monosomické přidání vložený rekombinantní chromozóm REC-H1 (4Ssl/6S’L/6BL), který nese na svém krátkém rameni dominantní alelu pro pylovou fertilitu Ms-S31 a semidominantní alelu rhí-S3l. Na jeho dlouhém rameni je recesivní alela citlivosti k chlortoluronu suS11 a recesivní alela Ki-S11 genu navozujícího pylovou sterilitu. Křížení probíhá s linií diploidních druhů Aegilops searsii, které máji vlastní dominantní alelu rezistence k chlorotoluronu Su-S3 1 na 6SsL, stejně tak jako alely Ms-S31 a rht- S31
b) sbírání semen potomstva z kříženi (a). Vypěstováním těchto semen se získají rostliny Fb z nichž 50 % obsahuje vložený rekombinantní chromozóm, který se páruje s 4Ss a 6Ss, a tak tvoří trivalent při meiozi, který má genotyp ms-B 1 Ms-S31 Ms-S31, ki-S'1-a su-ďl a Su-S3J
c) výběru popsaného Fi potomstva z (b) a jeho zpětného křížení s cv. Chinese Spring jako samčí lini ·· «· ·· ···· ·· ·· ···· · · · · 0 · · . 0 0 00 0 000· • 0 0 0 0 9 9 9 9 9 99 9
9 9 9 9 9 9 9
9999 9999 9 9 9 9 9 9 · ·
-32d) sběru semen potomstva křížení (c) a jejich pěstováním se vytváří BCi rostliny, z nichž jsou všechny heterozygotní ms-BÍMs-Bl), a proto pylově fertilní, některé rostliny jsou monosomické pro 6B a tudíž hemizygotní pro su-Bl a Ki-Bl a mají vložený ~---------- rekombinantní- chromozóm REC-HR1 a jako mOTiosarífíckouSub'Stituci nesou Ms-S5/--a rht-S51 na krátkém rameni a Su-S1! a ki-S51-a na dlouhém rameni. Toto jsou požadované rostliny.
e) výběru semen požadovaných rostlin z (d) pomocí jejich rezistence k chlortoluronu a pomocí analýzy párování chromozómů v meiozi a jejich samoopylení
f) sběru semen ze samoopyleného potomstva z (e) a jejich pěstováním se připraví BCiF2 rostliny, 50 % z nich je monosomických na 6Β a mnosomických pro vložený rekombinantní chromozóm REC-HR1 sestávající z krátkého ramena 4Ss (nesoucího Ms-S11 a rht-S? 1) a z blízké oblasti dlouhého ramene chromozómu 6S1 (nesoucího Su-S5! a ki-S? 1-a) a z distální oblasti chromozómového ramene 6BL (rekombinantní bod je distální k ki-S11-a). 25 % těchto rostlin je homozygotních pro ms-Bl a hemizygotních pro su-Bl a Ki-Bl. Toto je požadovaná udržovací linie.
g) výběru požadovaných rekombinantních rostlin udržovací linie z (f) využitím jejich rezistence k chlortoluronu, užitím DNA markérů a metodou chromozómového párování.
Vynález se dále týká způsobu přípravy pylově fertilní vylepšené udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé obsahující vylepšený vložený chromozóm IEC-HC 1 (Obrázek 9a -b) skládající se z (a) křížení pylově fertilní samičí rodičovské linie odvozené z kultivaru Chinese Spring pšenice obecné ( uvedená samičí rodičovská linie je udržovací linií, to znamená že je homozygotní pro obě recesivní alely pro pylovou sterilitu ms-Bl na rameni chromozómu 4BS, dominantní pro alelu Ki-Bl genu pro navození pylové sterility na 6BL a mající vložený chromozóm EC-H1 nesoucí na svém krátkém rameni dominantní alely Ms-S11 a rhl-S11 a na dlouhém rameni recesivní alelu ki-S11-a) se samčím rodičem, který je isogenní se samičím rodičem, ale je homozygotní pro dominantní alelu pylové fertility Ms-Bl a obsahuje ještě další pár cizorodých chromozómů 4E, které nesou na svých dlouhých ramenech alelu pro modrou barvu aleuronu Ba-El.
(b) sbírání semen potomstva z kříženi (a), jež jsou všechna modrá, jejich ozáření pomalými neutrony. Výsevem těchto semen se získájí pylově fertilní Fj rostliny, všechny jsou heterozygotní pro MsBlms-Bl a homozygotní pro Ki-Bl. 20 % z nich je dvojnásobně monosomických pro přidání vloženého chromozómu EC-H1 a pro chromozóm 4E. To jsou požadované rostliny.
«« ···* • · · · 9 ·. · • · · · · · ·
Φ Φ · · · · · ······ φ Φ · · « · · ·
ΦΦΦΦΦΦΦΦ Φ · * · 9 · · ·
-33© výběru rostlin požadované Fi generace z (b) počítáním chromozómů a použitím DNA markérů a jejich samoopylení (d) sběru semen z potomstva (c), výběru modrých semen. Jejich výsevem dostaneme F2 rostliny, z nichž některé mají 43 chromozómů a některé z těchto obsahují vylepšený vložený chromozóm IEC-HC1, obsahující 4SsS/4EL/6S1L a nesoucí alely Ms- Kl, rht- ^1, Ba-El a ki- S11-a. To jsou požadované rostliny, zatímco další obsahují translokovaný chromozóm 4SsS/4EL (e) výběru požadovaných rostlin z (d) pomocí metody počítání chromozómů a DNA markérů a jejich samoopylení (f) Sběru semen ze samoopyleného potomstva (e) a výběru modiých semen, jejich pěstování se vyvinou pylově fertilní rostliny nesoucí vylepšený vložený chromozóm IEC-HC 1.
Toto je vylepšená požadovaná udržovací linie rostlin (g) jestliže se v kroku (d) nedostanou žádné požadované rostliny, potom výběrem rostlin z (d), které mají translokovaný chromozóm 4SsS/4EL (původem z modrých semen a jsou pylově fertilní), užitím metody počítání chromozómů a DNA markérů a jejich zpětným křížením ve funkci samčího rodiče s udržovací linii obsahující EC-H1 se získájí semena F, (h) výběru semen Fi z (g), která mají modrou barvu, jejich ozáření pomalými neutrony, jejich klíčení, výsevu a výběrům sazenic se 44 chromozómy, to znamená s obsahem dvou přidaných cizorodých vložených chromozómů 4SsS/4EL a 4SsS/6S’L a (i) opakování kroků (d) až (f), čímž získaná požadovaná vylepšená udržovací linie obsahuje vylepšený vložený chromozóm IEC-HC 1, který obsahuje 4SsS/4EL/6S’L nesoucí Ba-El a ki- S11-a
Vynález se dále týká způsobu přípravy pylově fertilní vylepšené udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé obsahující vylepšený vložený chromozóm IEC-HC 1 (Obrázek 9c) skládající se z :
(a)křížení pylově fertilní samičí rodičovské linie odvozené z kultivaru Chinese Spring pšenice obecné ( uvedená samičí rodičovská linie je homozygotní pro dominantní alelu pro pylovou fertilitu Ms-Bl pro dominantní alelu Ki- B1 genu navozujícího pylovou sterilitu a obsahující ještě další pár cizorodých chromozómů 4E, které nesou na svých dlouhých ramenech alelu pro modrou barvu aleuronu Ba-El se samčím rodičem, který je genově shodný se samičím rodičem, ale je homozygotní pro recesivní alelu pylové sterility ms• 4
4444 • 4 44
4 · · · 4 · 4 • 44 « «444
4 · 4 * 44 444*44
4 444» 4 4
4444 444» 44 ·4 44 44
-34Bl-c a nese přidaný cizí chromozóm 4Ss nesoucí na své krátkém rameni dominantní alely Ms- ČI a rht- ČI (b) sbírání semen potomstva z kříženi (a) a výsevu těchto semen se získají rostliny Fi, z nichž všechny jsou heterozygotní pro Ms-Blms-Bl a homozygotní pro Ki-BIKi-Bl, 25 % z nich má dvojnásobně monosomické přidáni chromozómů 4E a 4Ss. To jsou požadované rostliny.
(c) výběru požadovaných rostlin Fi z (b) pomocí metody počítání chromozómů a DNA markérů a jejich samoopylení (d) výběru modrých semen vzniklých samoopylením (c) a jejich vysevem se připraví F2 rostliny, některé z nich obsahují translokovaný chromozóm 4Ss/4EL. To jsou námi požadované rostliny.
(e) výběru požadovaných F2 rostlin z (d) pomocí metody počítání chromozómů a DNA markérů, . jejich křížení se samčí udržovací linií obsahující EC-H1 (48^/68^) a liní z F] semen, z nichž některá jsou modrá (f) výběru semen z (e), která mají modrou barvu, jejich ozáření pomalými neutrony. Jejich klíčením a pěstováním se získájí Fj rostliny, které jsou všechny homozygotní pro obě msBl-c a Ki-Bl, několik z nich obsahuje dvojnásobně monosomické přidání 4SsS/4EL a 4SsS/6S1L. Toto jsou požadované rostliny (g) výběru požadovaných rostlin z (f) pomocí metody počítání chromozómů a DNA markérů a jejich samoopylení (h) sběru semen z potomstva (g), výběru modrých semen a jejich pěstováním se získají F2 rostliny, všechny jsou homozygotní pro obě alely ms-Bl-c a Ki-B, některé mají 43 chromozómů. Z těchto rostlin některé obsahují vylepšený rekombinantní chromozóm IEC-HC1 obsahující 4SsS/4EL/6S1L nesoucí Ms- tfl, rht- $1, Ba-El a ki- S11. To jsou požadované rostliny.
(i) výběru požadovaných rostlin z (h) pomocí metody počítání chromozómů, C-proužkování a zkoušky pylové fertility a jejich samoopylení (j) sběru potomstva semen z (i), výběru modrých semen. Jejich pěstováním se získají pylově fertilní rostliny nesoucí IEC-HC1, to je požadovaná vylepšená udržovací linie rostlin.
Vynález se dále týká způsobu přípravy pylově fertilní vylepšené udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé obsahující vylepšený vložený chromozóm IEC-HC2 (Obrázek 10) skládající se z :
-35a)
b)
c)
d) (e) (f) (g) (h) ·· ♦· ·· • · Φ
9 9 9
9 · ······· « · ·· 99
9 9 ·
9 9 9 křížení disomicky substituované samčí rodičovské linie pšenice obecné cv. Chinese Spring, ve které nahrazuje chromozóm 4Am z T. monococcum 4B chromozóm pšenice obecné, a tudíž vzniklý samčí rodič je deficientní pro alelu pylové fertility Ms-Bl, homozygotní pro aielu Ki-Bl genu vnášejícího pylovou sterilitu a pro alely Ms-Aml a rht-Am na 4AmS a Ba-Aml na 4AraL. Křížení probíhá se samičím rodičem genově shodným se samčím rodičem, ale homozygotnim pro recesivní alelu pylové sterility ms-Bl & mající přidaný vložený cizorodý chromozóm 4Ss nesoucí na svém krátkém rameni dominantní alely Ms-SZ 1 &rhl-S3l.
sbírání semen potomstva z kříženi (a), všechna jsou modrá. Výsevem těchto semen se získají rostliny Fj, z nichž všechny jsou hemizygotní pro ms-Bl-c, některé z nich jsou trojnásobně monosomické pro 4B, 4Ss a 4Am. To jsou požadované rostliny.
výběru třikrát monosomických rostlin z (b) počítáním chromozómů, tak se připraví Fi rostliny a nechají se samosprášit sběru potomstva semen F2z (c), výběru modrých semen a pěstování těchto vybraných semen se získají F2 rostliny, dalším výběrem těchto F2 rostlin, které mají 44 chromozómů (ukazují 21 +2' vmeioze), tyto rostliny jsou ty, které jsou požadovaně dvojnásobně monosomické pro přidání 4Ss a 4A™ samoopylení výše popsaných požadovaných rostlin (d) se získají F3 semema, selekce modrých semen
Výběru semen z (e), která mají modrou barvu a výběrem rostlin se 43 chromozómy (21 ,,+l), která jsou pylově fertilní a produkují modrá semena, tyto rostliny mají translokovaný chromozóm 4SsS/4AmL a jsou to požadované rostliny křížení požadovaných rostlin z (f) jako samčí linie s udržovací linií, která je homozygotní pro ms-BímsBIKi-BIKiBl a mající EC-H1 (dS^/óSl·) nesoucí Ms- Člrht- S?lki- S'sla jako samičí linií, tak se získají semena Fj výběru semen z potomstva Fi z (f), která mají modrou barvu, jejich ozáření pomalými neutrony. Jejich klíčením a pěstováním a dále výběrem rostlin majících 44 chromozómů (21„ + 1,,), to znamená, že jsou disomické pro přidání krátkého ramene a dvojnásobně monosomické pro dlouhé rameno cizího chromozómu. Jejich samoopylením a (i) pěstováním modrých semen z (h) a dále výběrem pylově fertilních rostlin majících 43 chromozómů, které produkují modrá a červená/bílá semena. Tyto rostliny mají JEC-HC2 a jsou to požadované rostliny.
3644 44 44 4444 44 44 «444 44 4 «444
4 44 4 · 44 4
4 44 4 44 444444
4 4 4 4 4 4 4
4444 4444 '44 44 44 44 (j) samoopylení požadovaných rostlin z (i), sběru potomstva semen z (i), výběru modrých semen, a jejich pěstováním se získají pylově fertilní rostliny nesoucí IEC-HC2, to je požadovaná vylepšená udržovací linie rostlin.
Vynález se dále týká způsobu přípravy pylově fertilní vylepšené udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé obsahující vylepšený vložený chromozóm IEC-HC3 (Obrázek 11) skládající se z :
(a) křížení disomicky substituované samčí rodičovské linie pšenice obecné cv. Chinese
Spring, ve které nahrazuje chromozóm 4Am z T. monococcum 4B chromozóm pšenice obecné, a tudíž vzniklý samčí rodič je defieientní pro alelu pylové fertility Ms-Bl, homozygotní pro alelu Ki-Bl genu vnášejícího pylovou sterilitu a pro alely Ms-Am 1 a rht-Am 1 na 4AmS a Ba-Am 1 na 4AmL se samičím rodičem isogenním k samčímu rodiči, ale homozygotním pro recesivní alelu pylové sterility ms-Bl a mající přidaný cizorodý chromozóm 4Ss nesoucí na svém krátkém rameni dominantní alely Ms-S^l &rht-S;l.
(b) sbírání semen Fi potomstva z (a), která jsou všechna modrá. Výsevem těchto semen se získají rostliny Fb všechny jsou hemizygotní pro ms-Bl-c, a homozygotní pro Ki-Bl, z nichž je 75 % monosomických pro 4B a dále monosomických pro substituci 4Am nesoucí Ms-Aml, jsou tedy pylově fertilní. Použití rostlin s touto monosomicko-monosomickou substitucí k opylení samičího rodiče heterozygotního pro Ms-Blms-Bl a homozygotního pro Ki-Bl alely a majícího jako monosomické přidání chromozóm 6S1, zatímco samičí rodič byl získán z křížení samčího rodiče Chinese Spring 4Ss monosomického pro přidání ms-Blcms-Bl-c a samičího rodiče homozygotního pro Ms-Bl a Ki-Bl alely a majícího jako monosomické přidání chromozóm 6S1, 20 % potomstva má potom požadované složení (c) sbírání semen potomstva zkříženi (b), jež jsou všechna modrá, jejich ozáření pomalými neutrony a výsevem těchto semen se získájí Fi rostliny, které mají 43 (21,,+1 ) a 42 (20,,+ 2„) chromozómy. Dále dojde k samoopylení těchto rostlin a (d) výběru samoopylených semen z (c), která mají modrou barvu, jejich klíčením a pěstováním a výběrem se získájí rostliny, které jsou pylově fertilní, obsahují však okolo 20 % nefunkčního pylu a dávají modrá a červená/bílá semena a (e) pěstováním těchto semen z (d) a výběru modrých semen, která po vypěstování se vyvinou v pylově fertilní rostliny s IEC-HC3 (mající 43 chromozómů). To je požadovaná vylepšená udržovací linie rostlin.
-37·♦ ·· • 9 9 ♦
Β · • ·
99 • · · · ·
9 9 9 9 » 999 999
9 9 ··*· ·♦·· ····
Vynález se dále týká způsobu přípravy pylově fertilní vylepšené udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé obsahující vylepšený vložený rekombinantní chromozóm IREC-HC (Obrázek 12) skládající se z :
a) křížení pylově fertilní samičí rodičovské linie odvozené z kultivaru Chinese Spring pšenice obecné (uvedená samičí rodičovská linie je homozygotní pro dominantní alelu pylové fertility Ms-Bl na chromozómovém rameni 4BS a pro dominantní alelu homologně se párujícího supresoru Phl na chromozómovém rameni 5BL, nulisomická pro chromozóm 6B a proto také deficientní pro alelu Ki-Bl genu vnášejícího pylovou sterilitu. Linie dále obsahuje pár chromozómů 6S1 nesoucích recesivní alelu genu pro navození pylové sterility ki-S11-á) se samčí linií, která je genově shodná se samičí rodičovskou linii, ale je disomická pro 6B a proto homozygotní pro Ki-Bl, dále ji chybí chromozóm 6S1. Je též homozygotní pro mutantní alelu homologického párování phlb
b) sběru semen potomstva z křížení (a) a jejich pěstováním se připraví pylově fertilní (Ms-BÍMs-Bl) rostliny heterozygotní pro homologně se párující alely (Phlphlb), všechny rostliny jsou monosomické pro oba chromozómy 6B a 6S1
c) zpětné křížení popsaných F] rostlin (b) se samčím rodičem
d) sběru semen potomstva z křížení (c) a pěstováním zmíněných semen se vyprodukují BC( rostliny, které jsou všechny pylově fertilní (Ms-BÍMs-Bl), polovina z nich je homozygotní pro phlb alelu, z nichž je opět přibližně polovina (protože 6B se páruje s 6S1) dvojnásobně monosomická pro 6B a 6S1 chromozómy. To jsou požadované BCi rostliny.
e)
f)
g) výběru BCi rostlin z (d) pomocí párování chromozómů v meioze a pomocí DNA markérů, jejich opylením linií, která je ditelesomická 6BS (to znamená deficientní pro rameno 6BL) a genově shodná s rostlinami BCb ale homozygotní Phl Phl sběru semen potomstva z (e) a jejich pěstováním se získají rostliny, které jsou monotelosomické pro 6BS, některé z nich jsou také monosomické pro rekombinantní chromozóm sestávající z krátkého ramene a proximální oblasti dlouhého ramene 6S1 (nesoucím ki-S11-a) a distální oblasti chromozómového ramene 6BL (bod translokace je distální k ki-S11-á) a to jsou požadované rostliny výběru požadovaných rostlin z (f) pomocí metody C-proužkování, metodou párování chromozómů a užitím DNA markérů a jejich křížení ve funkci samčí linie se samičí, která je vylepšenou udržovací linií, to znamená je homozygotní pro kteroukoliv z následujících alel, a to pro recesivní alelu pylové sterility ms-Bl a dominantní alelu • ti • ••••ti··· • · · · ti ·· ··ti ··ti • · ti · ti ti · · ···· ···· ·· ·· ·· ti·
-38genu navozujícího pylovou sterilitu Ki-Bl a má jeden z vylepšených vložených chromozómů IEC-HC1 (4SsS/4EL/6S‘L), IEC-HC2 (4SsS/4AmL/6S*L) nebo IECHC3 (4Am S-dA^/óS^), které nesou Ms-ďl, rht-tfl, Ba-El a ki-S11 -a, Ms-Sfl,
...... rhí-^l;’Ba-Aml ndooki-S1 l-aa.Ms-ÁmŤpErň^7^,EB'(:t-Aml diki-Sll-a ^ ---h) sbírání semen potomstva z kříženi (g) a vysevu těchto semen se získají rostliny Fi, z nichž některé jsou trojnásobně monosomické to znamená monosomické pro 6B, dále pro jeden vylepšený vložený chromozóm IEC-HC1, IEC-HC2 nebo IEC-HC3 a pro rekombinantní chromozóm (óSVóBL) a jsou dále heterozygotní pro ms-BÍMs-Bl a hemizygotní pro Ki-Bl. To jsou požadované rostliny.
i) výběru rostlin z (h) počítáním chromozómů, pomocí metody C-proužkování a užitím DNA markérů, jejich samoopylení, sběru semen těchto vybraných rostlin a jejich pěstování. Některé jsou dvojnásobně monosomické, mají chromozóm 6B a vylepšený vložený rekombinantní chromozóm IREC-HC, a to bud’ IREC-HC 1 (4SsS/4EL/6S1L/6BL), IREC-HC2 ^SMAT/óS^/óBL) nebo IREC-HC3 (4Am S4AmL/6S1L/6BL). To je požadovaná udržovací linie rostlin s IREC-HC.
Dále vynález popisuje způsob pro udržení konstantního poměru mezi pylově fertilními a sterilními rostlinami v každé generaci udržovací linie nebo rekombinantní udržovací linie pšenice obecné a tvrdé. Způsob sestává z následujícího:
a) samoopylení pylově fertilní udržovací linie obsahující vložený chromozóm vybraný ze skupiny vložených chromozómů EC-H1 a vloženého rekombinantního chromozómu REC-H1, které mají navíc k alelám Ms-S8! a ki-S! 1-a ještě alelu rhl-B 1 jako selekční markér, který usnadňuje oddělenou sklizeň semen z pylově fertilního potomstva samosprašné udržovací linie. Semena se po vypěstování vyvinou v udržovací linii.
b) sbírání semen z potomstva (a) a pěstováním těchto semen vznikají rostliny, z nichž 20 % (potomstvo udržovací linie) má vložený chromozóm EC-H1 a 50 % (potomstvo udržovací linie s vloženým rekombinantním chromozómem REC-Hl)obsáhuje výše zmíněný vložený chromozóm, a tyto rostliny jsou tedy identické s udržovací linií a nesou alelu rht-tfl. Jsou vyšší (o 6 až 8 cm), než ty které tento chromozóm nemají
c) sklízení vyšších rostlin z (b), z nichž všechny jsou pylově fertilní. Získané potomstvo semen se skládá ze semen obsahujících z 20% (EC-H1) a z 50% (REC-H1) dané vložené rekombinantní chromozómy. Takto se udržuje poměr pylově fertilních ku pylově sterilním rostlinám v každé generaci udržovací linie nebo rekombinantní udržovací linie φφ φφφφ • φ φ φ φφφφ • φ φφφφφφφ φ φ φφ φ φφ φφφφφφ φ φ φφφφ φ φ
-39- ...........* ** ”
Dále vynález popisuje způsob pro udržení konstantního poměru mezi pylově fertilními a sterilními rostlinami v každé generaci udržovací linie nebo rekombinantní udržovací linie pšenice obecné a tvrdé. Způsob sestává z následujícího:
a) samoopylení pylově fertilní udržovací linie obsahující rekombinantní chromozóm vybraný ze skupiny vložených chromozómů EC-HR1 a vložených rekombinantních chromozómů REC-HR1, které mají navíc k alelám Ms-Sfj a ki-S' 1-a ještě alelu Su$;1 jako selekční markér, který usnadňuje výběr rostlin, které si udržely stejný genotyp jako pylově fertilní potomstvo v samosprašné udržovací linii
b) sběru semen z potomstva (a) a jejich klíčení a pěstování. Získají se sazenice potomstva, z nichž 20% (udržovací linie s vloženým chromozómem EC-HR1) a 50% (potomstvo udržovací linie s vloženým rekombinantním chromozómem REC-HR1) obsahuje řečený rekombinantní chromozóm, jejich postřiku herbicidem chlortoluronem, který zahubí všechny k němu citlivé rostliny, to znamená ty, které nemají EC-HR1 nebo REC-HR1 (c) sklízení rostlin z (b) odolných k působení chlortoluronu, z nichž všechny jsou pylově fertilní a nesou EC-HR1 a REC-HR1. Získané potomstvo semen se skládá ze semen obsahujících z 20% (EC-HR1) a z 50% (REC-HR1) dané vložené chromozómy. Tímto způsobem se udržuje poměr pylově fertilních ku pylově sterilním rostlinám v každé generaci udržovací linie nebo rekombinantní udržovací linie
Vynález popisuje ještě další způsob pro udržení konstantního poměru mezi pylově fertilními a sterilními rostlinami v každé generaci udržovací linie nebo rekombinantní udržovací linie pšenice obecné a tvrdé. Způsob sestává z následujícího:
a) samoopylení pylově fertilní udržovací linie obsahující vylepšený vložený chromozóm vybraný ze skupiny vložených chromozómů IEC-HCl a vylepšených vložených rekombinantních chromozómů IREC-HC 1, které mají navíc k alelám Ms-Sfl a ki-S1 Ια ještě alelu Ba (způsobuje modrou barvu semen) jako selekční markér, který usnadňuje výběr semen z pylově fertilního potomstva v samosprašné udržovací linii.
Tato semena se po výsevu vyvinou v požadovanou udržovací linii
b) sběru semen z potomstva (a), oddělení (pomocí třídícího zařízení) modrých semen nesoucích IEC-HCl nebo IREC-HC 1 od červených/bílých semen, které nemají tyto chromozómy
c) vypěstování modrých semen z (b), z nichž se všechna vyvinou v pylově fertilní vylepšenou udržovací linii rostlin nebo ve vylepšenou rekombinantní udržovací linii rostlin.
-40Vynález dále popisuje způsob zamezení poškození při chybném centrimerickém dělení rekombinantního chromozómu v meiozi na dva telocentrické chromozómy (jedno rameno), z nichž každý nese na krátkém rameni vloženého chromozómu buď alely Ms a rht nebo ki-S11-i2-a v případě£G-HR-feiké-a5elu Su, zatímco v případě íEC-aiekd-fe-na* dlouhérn^ratmemrOěieTtí — mezi Ms a ki-S11-a má za výsledek přenos Ms pylem. Z tohoto důvodu se vytváří po opylení samičí linie linií udržovací nebo vylepšenou udržovací linií jisté množství pylově fertilních samičích rostlin. V těchto dvou posledních případech semena nesoucí Ms, se po výsevu vyvinou v pylově fertilní rostliny, mající červená/bílá semena. Nemohou být proto oddělena od těch, která nenesou Ms. Jejich semena se po výsevu vyvinou v pylově sterilní rostliny.
V případě EC-HR, rostliny mají pouze krátké rameno z vloženého chromozómu, nesou Ms-S;l a rht- S: 1. Jsou tedy citlivé k působení chlortoluronu a mohou být odděleny na základě aplikace herbicidu. Užití rekombinantního udržovatele a vylepšeného rekombinantního udržovatele namísto udržovatele a vylepšeného udržovatele eliminuje nebezpečí přenosu Ms alely. V těchto rekombinantních liniích a vylepšených rekombinantních liniích se rekombibnantní chromozómy pravidelně párují s nativním chromozómem 6B a následně, se tak zabrání chybnému centromerickému dělení, které se nevyskytuje u párovaných chromozómů. Tento stav je podporován spojením mezi AA a ki-S11-a.
Vynález dále popisuje způsob přeměny uvažovaného kultivaru pšenice obecné a tvrdé v pylově sterilní samičí rodičovskou linii obsahující vložený chromozóm EC-H, toto pro samičí linii zobrazuje (Obrázek 16a). Popsanaá metoda se skládá z :
(a) křížení udržovací linie homozygotní pro ms-BlmsBIKi-BIKiBl a mající cizorodý vložený chromozóm EC-H1 (4SsS/6S1L) nesoucí Ms-S3l, rht-S'l a ki-S’l-a s požadovaným kultivarem, který je homozygotní pro Ms-BlMs-Blki-BlkiBl (b) sběru semen potomstva z křížení (a) a jejich pěstování se připraví pylově fertilní Fi rostliny. Všechny jsou heterozygotní pro ms-BlMs-BlKi-Blki-Bl-a. 1/4 z nich nese vložený chromozóm EC-H1. To jsou námi požadované rostliny (e) výběru Fi rostlin z (b) metodou počítání chromozómů a použitím DNA markérů a jejich opylením uvažovaným kultivarem se připraví BCj potomstvo, 1/16 z něj je heterozygotní k ms-BÍMs-BIKi-BIki-Bl-a a nese rekombinantní chromozóm EC-H1. To je požadovaný genotyp.
(d) pěstování výše popsaných rostlin BCi z © a jejich výběru podle genotypu metodou počítání chromozómů a DNA markérů a dalším zpětným křížením ve funkci samičího rodiče s uvažovaným kultivarem po čtyři následující generace za účelem získání páté generace potomstva zpětného křížení (BG5). Metodou počítání chromozómů a DNA markérů se • φφφ φφ φφφφ φφ φ φ φφφ φφφφφφφφφ φ φ φφ φ φφ φφφ φφφ • φ φφφφ φ φ φφφφ φφφφ φφ φφ φφ φφ
-41ν každé generaci vybrali potomci heterozygotní pro ms-BIMs-BlKi-Blki-Bl-a, kteří nesou rekombinantní chromozóm EC-H1.
(e) samoopylení výše popsaných rostlin BC5 z (d), sběru semen potomstva a jejich pěstováním dají popsaná semena vznik rostlinám BC5F2, z nichž 1/16 je pylově sterilní a homozygotní pro obě alely pylové sterility, ms-Bl a pro alelu genu navozujícího pylovou sterilitu Ki-Bl a to požadovaná pylově sterilní samičí linie. Další rostliny BC5F2 s podobným genotypem, ale mající rekombinantní chromozóm EC-H1 nesoucí Ms-ΚΙ, rht- S3! a ki-S11-a jsou námi požadované rostliny pylově fertilní udržovací linie rostlin.
Vynález dále popisuje způsob přeměny uvažovaného kultivaru pšenice obecné a tvrdé v pylově sterilní samičí rodičovskou linii a pylově fertilní udržovací linie obsahující rekombinantní chromozóm EC-HR. Toto pro samičí linii zobrazuje Obrázek 17a. Popsaná metoda se skládá z (a) křížení udržovací linie homozygotní pro ms-Bl ms-Bl Su-Bl Su-Bl Ki-Bl Ki-Bl a mající cizí rekombinantní chromozóm EC-HR1 nesoucí Ms- S?l, rht- Sfl, Su- Ssl a ki- S3l-a s požadovaným kultivarem, který je homozygotní Ms-BlMs-BlSu-BlSu-BlKi-Blki-Bl (b) sběru semen potomstva z křížení (a) a jejich pěstováním se připraví pylově fertilní F! rostliny, všechny jsou heterozygotní ms-Bl Ms-Bl Su-Bl Su-Bl Ki-Bl-a, z nichž jedna čtvrtina nese rekombinantní chromozóm EC-H1 a to jsou námi požadované rostliny (c) výběru Fi rostlin z (b) metodou počítání chromozómů a použitím DNA markérů a jejich opylením uvažovaným kultivarem se připraví BCi potomstvo, 1/32 z něj je heterozygotní pro ms-Bl Ms-Bl Su-Bl Su-Bl Ki-Bl Ki-Bl-a a nese rekombinantní chromozóm EC-HR1. To je požadovaný genotyp (d) pěstování výše popsaných rostlin BCi z (c) a jejich výběru podle genotypu metodou počítání chromozómů a DNA markérů a dalším zpětným křížením ve funkci samičího rodiče s uvažovaným kultivarem po čtyři následující generace za účelem získání páté generace potomstva zpětného křížení (BC5). Metodou počítáni chromozómů a DNA markérů se v každé generaci výbrali potomci heterozygotní pro ms-Bl Ms-Bl Su-Bl Su-Bl Ki-Bl—a, kteří nesou rekombinantní chromozóm EC-HR 1.
(e) samoopylení výše popsaných rostlin BC5 z (d), sběru semen potomstva a jejich pěstováním dají popsaná semena vznik rostlinám BC5F2, z nichž jedna šedesátičtvrtina je pylově sterilní a homozygotní pro obě alely pylové sterility, ms-Bl a pro alelu genu citlivosti k chlortoluronu su-Bl a genu pro návozem pylové sterility Ki-Bl, a to je požadovaná pylově sterilní samičí linie. Další rostliny BC5F2 s podobným genotypem, ale mající
-42·» ·» • · » * • · • · • ·
9 9 9999
9 9
9 9
9 9 9
9 9 ·
99
99
9 9 9
9 9 ·
999 999
9
99 rekombinantní chromozóm EC-HR1 nesoucí Ms-Rl, rht- SM, Su- Ssl a ki-S‘ 1-a. To jsou námi požadované rostliny pylově fertilní udržovací linie rostlin.
Vynález dále popisuje způsob přeměny uvažovaného kultivaru pšenice obecné a tvrdé v pylově sterilní samičí rodičovskou linii a pylově fertilní rekombinantní udržovací linii obsahující rekombinantní chromozóm REC-H. To pro samičí linii zobrazuje Obrázek 16b. Popsaná metoda se skládá z :
a) křížení udržovací linie obsahující REC-H1 ve funkci samičího rodiče, která je homozygotní pro ms-Blms-Bl a monosomická jak pro 6B (hemizygotní pro Ki-Bl), tak i pro rekombinantní chromozóm REC-H 1 (4SsS/6S1L/6BL) nesoucí Ms- ífl, rht,S) ά ki- S: 1-a s požadovaným kultivarem, který je homozygotní Ms-B IMs-B lkiBlkiBl
b) sběru semen potomstva z křížení (a) a jejich pěstováním se připraví pylově fertilní Fj rostliny, všechny jsou heterozygotní ms-BÍMs-Bl, z nichž jedna polovina nese rekombinantní chromozóm REC-H 1
c) výběru dvou typů Fj rostlin z (b) analýzou párování chromozómů a použitím DNA markérů a jejich opylením uvažovaným kultivarem se připraví dva typy BCj potomstva. Potomstvo odvozené zdisomických F, rostlin, z nějž je jedna čtvrtina heterozygotní k ms-BÍMs-Bl Ki-Bl Ki-Bl-a. Druhý typ potomstva odvozeného od monosomieké Fb z něhož je jedna čtvrtina dvojnásobně monosomická, heterozygotní pro ms-BÍMs-Bl a hemizygotní pro ki-Bl-a. Nesou také AA- S'1, rht- Ss 1 a ki- S’l-a z rekombinantního chromozómu REC-H1
d) výběru dvou skupin rostlin Fi potomstva z (c) metodou párování chromozómů a užitím DNA markérů a dalším zpětným křížením ve funkci samičího rodiče s uvažovaným kultivarem po čtyři následující generace za účelem získání páté generace dvou druhů potomstva zpětného křížení (BC5). Metodou párování chromozómů a DNA markérů se vybere v každé generaci potomstvo heterozygotní k ms-BÍMs-Bl Ki-Bl Ki-Bl-a v disomickém typu a pro ms-BÍMs-Bl v dvojnásobně monosomickém typu, který nese rekombinantní chromozóm REC-H1
e) opylení výše popsaných dvojnásobně monosomickýh rostlin BC5 z (d) rostlinami disomickými z BC5 z (d) vzniknou dvě skupiny rostlin BC5F2. Skupina disomických rostlin, z nichž jedna osmina je homozygotní pro ms-Blms-Bl a heterozygotní pro KiBl ki-Bl-a. Další skupinou jsou dvakrát monosomieké rostliny, z nichž jedna osmina je homozygotní pro ms-Blms-Bl a hemizygotní Ki-Bl a nese Ms-Ssl, rht- ó's7 a kiS11-a z rekombinantního chromozómu REC-H1, a proto je pylově fertilní. To jsou námi požadované rekombinantní udržovací linie
-43«« ··«# ·· ·* • · < · · · • * · · • · · · · • · · · · #·»«···« ·* ·· ·· * · · · • · · · ·«· *·· • · • Μ ·*
J) pěstování semen výše popsaného dvojnásobně monosomického potomstva BCsF2 z linie (e) a semen disomické linie BC5F2 z (e), následného výběru požadované pylově fertilní rekombinantní udržovací linie analýzou párování chromozómů a užitím DNA
..........markérů -......-.............. —----- --------------------------------------- -........—.....Vynález dále popisuje způsob přeměny uvažovaného kultivaru pšenice obecné a tvrdé v pylově sterilní samičí rodičovskou linii a pylově fertilní rekombinantní udržovací linii obsahující rekombinantní chromozóm REC-HR. To je pro samičí linni zobrazeno na Obrázeku 17b, Popsaná metoda se skládá z;
(a)křížení udržovací linie s REC-HR1 jako samičího rodiče, který je homozygotní pro msBlms-Bl a monosomický jak pro 6B (hemizygotní pro su-Bl a Ki-Bl), tak i pro rekombinantní chromozóm REC-HR1 nesoucí Ms- tfl, rht- S'l, Su- Ssl a ki- Sfl-a s požadovaným kultivarem, který je homozygotní Ms-BlMs-BlSu-BlSu-Blki-Blki-Bl (7ýsběru semen potomstva zkřížení (a) a jejich pěstováním se připraví pylově fertilní Fi rostliny, všechny jsou heterozygotní ms-BÍMs-Bl, z nichž jedna polovina je disomická pro chromozóm 6B a proto heterozygotní pro Su-Bl su-Bl Ki-Bl ki-Bl a druhá polovina je dvojnásobně monosomická, jednak pro chromozóm 6B a jednak pro REC-HR1 a je hemizygotní pro Su-Bl a ki-Bl-a a také nese Ms- Sfl, rht- f?l, Su- Ssl a ki- SFl-a z rekombinantního chromozómu REC-HR1 © výběru dvou typů Fi rostlin z (b) analýzou párování chromozómů a použitím DNA markérů a jejich opylením uvažovaným kultivarem se připraví dva typy BC, potomstva. Potomstvo odvozené z disomické Fj, z něhož je jedna čtvrtina heterozygotní k ms-BÍMs-Bl a druhého typu potomstva odvozeného od monosomické Fi, z něhož je jedna čtvrtina dvojnásobně monosomická, heterozygotní pro ms-BÍMs-Bl a hemizygotní pro Su-Bl a ki-Bl. Nesou také Ms- Ss 1, rht- ó's 7 a ki- Š3 1-a z rekombinantního chromozómu REC-HR 1 (b) pěstování výše popsaných rostlin BCi z © a jejich výběru metodou počítání chromozómů a užitím DNA markérů a dalším zpětným křížením ve funkci samičího rodiče s uvažovaným kultivarem po čtyři následující generace za účelem získání dvou typů potomstva páté generace zpětného křížení (BC5). Metodou počítání chromozómů a DNA markérů se v každé generaci vybrali potomci heterozygotní pro ms-BÍMs-Bl su-Bl Su-Bl Ki-Blki-Bl v disomickém typu a v dvojnásobně monosomickém typu, který nese rekombinantní chromozóm REC-HR1 pro msB1MS-B1 <c) opylení výše popsaných dvojnásobně monosomickýh rostlin BC5 z (d) disomickými rostlinami zBCs z (d) vzniknou dvě skupiny rostlin BC5F2. Skupina disomických rostlin z nichž jedna šestnáctina je homozygotní pro ms-Blms-Bl a
-44heterozygotní pro su-Bl Su-Bl Ki-Bl Ki-Bl, a to je skupina požadovaných disomických rostlin. Další skupinou jsou dvakrát monosomické rostliny, z nichž jedna šestnáctina homozygotní pro ms-Blms-Bl a hemizygotní su-Bl a Ki-Bl a nesou také Ms-^1, rht- 1, Su- Ssl& ki-S11-a z rekombifiantmho~chíOmóžomů REC-HR1, a proto je pylově fertilní. To jsou námi požadované rekombinantní udržovací linie (d) pěstování semen výše popsané dvojnásobně monosomické BC5F2 z (c) linie a semen disomické linie BC5F2 z (d) a výběru požadované pylově fertilní rekombinantní udržovací linie analýzou párování chromozómů a a odpovědí na působení chlortoluronu. Vzniklé linie jsou námi požadovaná pylově fertilní rekombinantní udržovací linie a pylově sterilní samičí linie (e) pěstování potomstva disomických rostlin, které jsou všechny homozygotní pro ms-Blms-Bl, a proto pylově sterilní, čtvrtina z nich je homozygotní pro su-Blsu-Bl a Ki-BIKI-Bl. To je námi požadovaná pylově sterilní samičí linie.
(f) pěstování výše popsaných disomických rostlin BC5F3 z (e) a výběru pomocí DNA markérů se vybere požadovaná pylově sterilní samičí linie.
Vynález dále popisuje způsob konverze uvažovaného kultivaru pšenice obecné a tvrdé v pylově sterilní samičí rodičovskou linii a pylově fertilní vylepšenou udržovací linii pro výše popsanou linii typu IEC-HC (Obrázek 18a), Popsaná metoda se skládá z :
(a)křížení vylepšené udržovací linie, která je homozygotní pro ms-Blms-Bl Ki-Bl Ki-Bl a mající vylepšený rekombinantní chromozóm buď typu IEC-HC1 (4SsS/4EL/6S1L) MsS5!, rht-Sfl, Ba-El a ki-S11-a), IEC-HC2 (4SsS/4AmL/6S1L) nesoucí Ms-tfl, rht-^J, Ba-Aml a ki-S‘l-a) nebo IEC-HC3 (4Am S-4AmL/6S1L) nesoucí Ms- Aml, rht- Aml, BaAm 1 a ki-S11-a s požadovaným kultivarem, který je homozygotní pro Ms-BlMs-BlkiBlki-Bl (b) sběru semen potomstva zkřížení (a) a jejich pěstováním se připraví pylově fertilní Fi rostliny, všechny jsou heterozygotní ms-BÍMs-Bl Ki-Bl Ki-B 1-a, z nichž jedna čtvrtina také nese vylepšený rekombinantní chromozóm typu IEC-HC ato jsou požadované rostliny (c) výběru Fi rostlin z (b) pomocí barvy semen a jejich opylením uvažovaným kultivarem se připraví dva typy BCi potomstva, , z něhož jedna šestnáctina je heterozygotní k msB lMs-B 1 Ki-Bl Ki-B 1-a, a také nese vylepšený rekombinantní chromozóm typu IEC-HC. To jsou rostliny s požadovaným genotypem • ·
-45• 44 4 « • · 4 « » 4 4 4 1
4 <
144444 44 (d)pěstování výše popsaných rostlin BCi z © a jejich výběru podle požadovaného genotypu pomocí barevnosti semen, metodou počítání chromozómů a užitím DNA markérů a dalším zpětným křížením ve funkci samičího rodiče s uvažovaným kultivarem po čtyři následující generace za účelem získání dvou typů potomstva páté generace zpětného křížení (BC5). Metodou třídění semen podle barvy, počítání chromozómů a DNA markérů se v každé generaci vybrali potomci heterozygotní pro ms-Bl Ms-Bl Ki-Bl KiBl-a a kteří také nesli vylepšený rekombinantní chromozóm typu IEC-HC.
(e) samoopylení výše popsaných rostlin BC5 z (d), sběru semen potomstva, z nichž některá jsou modrá a některá červená/bílá a jejich pěstováním vznikne linie BC5F2, z nichž jedna šestnáctina, pocházející z červených/bílých semen, je pylově sterilní a homozygotní pro alelu pylové sterility ms-Bl a pro alelu genu navozujícího pylovou sterilitu Ki-Bl, a to je skupina požadovaných pylově sterilních samičích rostlin. Další skupina z BC5F2 rostlin, mající původ v rostlinách s modrými sememny a nesoucí také vylepšený rekombinantní chromozóm typu IEC-HC, který obsahuje Ms, rht, Ba a ki-S1 a, to jsou námi požadované pylově fertilní vylepšené rekombinantní udržovací linie.
Vynález dále popisuje způsob konverze uvažovaného kultivaru pšenice obecné a tvrdé v pylově sterilní samičí rodičovskou linii a pylově fertilní vylepšenou udržovací linii pro výše popsanou linii typu IREC-HC (Obrázek 18bs), Popsaná metoda se skládá z :
a) křížení udržovací linie s IREC-HC ve funkci samičího rodiče, která je homozygotní pro ms-Bl ms-Bl ά monosomická jak pro 6B (hemizygotní pro Ki-Bl), tak pro jeden z vylepšených rekombinantních chromozómů IREC-HC1 (4SsS/4EL/6S1L/6BL) nesoucí Ms-tfl, rht-tfl, Ba-El a ki-S! 1-a), IREC-HC2 (4SsS/4AmL/6S1L/6BL) nesoucí Ms-S3l, rht-S3l, Ba-Am 1 a ki-S! 1-a) nebo IREC-HC3 (4Am SAA^/óS^/óBL) nesoucí Ms- Aml, rht- Aml, Ba-Aml a ki-S11-a s požadovaným kultivarem, který je homozygotní pro Ms-BÍMs-Blki-Blki-Bl
b) sběru semen potomstva zkřížení (a) a jejich pěstováním se připraví pylově fertilní Fi rostliny, všechny jsou heterozygotní ms-BÍMs-Bl, z nichž jedna polovina je disomická pro chromozóm 6B a proto hetrozygotní pro KiBl-Blki-Bl-a a druhá polovina je dvojnásobně monosomická, jednak pro chromozóm 6B a jednak pro rekombinantní chromozóm IREC-HC a je hemizygotní pro ki-Bl-a a také nese Ms, rht, Ba a ki- S3l-a alely z rekombinantního chromozómu
c) výběru dvou typů Fi rostlin z (b) podle barvy semen, analýzou párování chromozómů a použitím DNA markérů a jejich opylením uvažovaným kultivarem se připraví dva typy BCi potomstva. Potomstvo odvozené zdisomické Fb z nějž je jedna čtvrtina heterozygotní k ms-Bl Ms-Bl Ki-Bl Ki-Bl-a a druhého typu potomstva odvozeného od • · • ♦ · · *ί*ϊ ···*··· li · « · · · · ······ • · · ♦ · · · · — 4 ········ · · ·· * * * * dvojnásobně monosomické Fi, z něhož je jedna čtvrtina dvojnásobně monosomická, heterozygotní pro ms-BÍMs-Bl a hemizygotní pro ki-Bl-a. Nese také Af.v- £?1, rht- ífl a ki- Sfl-a z rekombinantního chromozómu typu IREC-HC
d) výběru požadovaných skupin rostlin ze dvou skupin rostlin z (c) pomocí barevnosti semen, metodou párování chromozómů a užitím DNA markérů a dalším zpětným křížením ve funkci samičího rodiče s uvažovaným kultivarem po čtyři následující generace za účelem získání dvou typů potomstva páté generace zpětného křížení (BC5).
Metodou tříedění semen podle barvy, počítání chromozómů a DNA markérů se v každé generaci výbrali potomci heterozygotní pro ms-Bl Ms-Bl Ki-Bl Ki-Bl-a vdisomickém typu rostlin a pro ms-BÍMs-Bl v dvojnásobně monosomickém typu, který také nesl vylepšený rekombinantní chromozóm typu IREC-HC.
e) opylení výše popsaných dvojnásobně monosomickýh rostlin BC5 z (d) disomickými rostlinami z BC5 z (d) vzniknou dvě skupiny rostlin BC5F2. Skupina disomickýeh rostlin z nichž jedna osmina je homozygotní pro ms-Blms-Bl a heterozygotní pro Ki-BlKi-Bla, to jsou rostliny, které vyrostly z červených/bílých semen. Jsou to požadované disomické rostliny. Další skupinou jsou dvakrát monosomické rostliny, vypěstované z modrých semen, z nichž jedna osmina je homozygotní pro ms-Blms-Bl a hemizygotní Ki-Bl a nesou také Ms, rht, Ba a ki-S11-a alely z rekombinantního chromozómu typu IREC-HC, a proto jsou pylově fertilní. To je námi požadovaná vylepšená rekombinantní udržovací linie
f) pěstování semen výše popsané dvojnásobně monosomické BC5F2 z (e) linie a semen disomické linie BC5F2 z (e) a výběru požadované pylově fertilní vylepšené rekombinantní udržovací linie a také pylově sterilní linie analýzou párování chromozómů a DNA markérů.
Ve výše zmíněných způsobech přípravy udržovací linie nebo přeměny uvažovaného kultivaru v pylově sterilní samičí rodičovskou linii a pylově fertilního udržovatele, výběr rostlin nesoucích uvažovanou alelu ms-Bl v kterékoli generaci potomstva se užívaly DNA sondy, které byly připraveny k mapování distálního konec chromozómu 4BS. Sloužily tak k označení všech mutantních alel pro pylovou sterilitu ms-Bl a umožňovaly výběr rostlin tyto mutantní alely nesoucích. K těmto účelům může být použita jakákoli sonda, která označí subterminální oblast 4BS, například PSR921 (M. D. Gale, Cambridge Lab orátory, Jíl, Norwich, U. K. )
Tyto DNA markéry se používají na základě faktu, že některé ze známých mutatntních alel mají zavedeny v 4BS terminální delece, a tyto delece zahrnují i místo pro mutantní alelu ms-Bl-c, a tak lze lehce identifikovat homozygotní rostliny (ms-Bl-cms-Bl-c) absencí markéru (nulový fenotyp). Potom také v křížení rostlin homozygotních pro normální dominantní alelu • · • · • · · ·
• » · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · ········ · · ·*
-47(Ms-BlMs-B7) jako samičího rodiče a rostlin heteroyzgotních pro mutantní alelu (Ms-B 1MsBl -c) jako samčího rodiče, 50 % Fi rostlin je homozygotních pro (Ms-BlMs-Bí) a 50 % hetrozygotních pro (Ms-Bl Ms-B 1-c). Podrobí-li se tato Fi generace zpětnému křížení, to znamená, že je opylena samčím rodičem (Ms-BlMs-B7-c), potom jedna osmina z potomstva vzniklého zpětným křížením (BCi) je homozygotní pro ms-Bl-cms-Bl-c. Tyto homozygotní rostliny se rozpoznávají a vybírají užitím DNA markérů. Každé další zpětné křížení má za výsledek 50 % úbytek homozygotních potomstva, které může být odděleno pomocí DNA markérů.
Ve výše zmíněných způsobech přípravy rostlin nesoucích žádanou alelu ki-S1-a v kterékoli generaci potomstva se užívaly DNA sondy, které byly připraveny k mapování místa pevně spojeného s výše zmíněnou alelou na όβ’Ε. Sloužily tak k označení této alely. Jako příklad takovéto sondy může být uvedena DNA sonda PSR915 (M. D. Gale, Cambridge Laboratory, Jíl, Norwich, U. K. ). Výběr rostlin nesoucích požadovanou alelu ki-S1-a lze také provést oddělením pylově nefunkčích zrn.
Vynález dále popisuje ještě jeden způsob přípravy hybridních rostlin pšenice obecné a tvrdé.
Způsob se skládá z:
a) křížení samčího rodiče s pylově sterilním samičím rodičem stejného druhu, kdy výše zmíněný samčí rodič se vybere z jakéhokoli uvažovaného kultivaru pšenice obecné a tvrdé, který je přirozeně homozygotní pro dominantní divoký typ alely pro pylovou fertilitu (Ms-Bl) a jako zmíněný pylově sterilní samičí rodič vystupuje popsaná linie druhu pšenice, která je homozygotní pro obě alely, jak pro recesivni alelu pylové sterility (ms-BI), tak pro dominantní alelu genu navozujícího pylovou sterilitu (KiBl). Zmíněná pylově sterilní samičí rodičovská linie se udržuje jako udržovací linie způsobu přípravy hybridních rostlin popsaném v tomto vynálezu
b) sběru semen potomstva z křížení (a), tato semena po vypěstování vytvoří potomstvo hybridních rostlin, z nichž všechny jsou pylově fertilní a heterozygotní pro zmíněnou mutantní alelu pylové sterility, to znamená ms-BlMs-Bl.
• ·
-48Příklady provedení vynálezu
Ve všech následujících příkladech jsou použité linie Aegilops liniemi Aegilops searsii Feldman a Kislev ex Hammer, obsahující alely Ms-S31 (pylová fertilita), rht- Kl (vyšší vzrůst rostlin) a Su-SÍ31 (rezistence k chlortoluronu), v tomto dokumentu je označená jako AES-5, semena byla získána z Yattiru, Jižní Judea, Izrael. Linie Aegilops longissima Schweinf. A Muschl. Obsahující alely ki- $3l-a (vnáší citlivost k efektu navození pylové sterility pocházejícím od alely Ki-Bl}, v tomto dokumentu je značená jako AEL-1, semena byla sebraná blízko Revivinmu, Centrální Negev, Izrael.
Semena AES-5 a AEL-1 jsou uložena podle pravidel Budapešťské dohody o Mezinárodním uznávání a ukládání mikroorganismů pro účely patentového řízení v NCIMB Ltd. , Aberdeen, Skotsko, Velká Britanie a byla jim přidělena čísla 40952 a 40953, dne 13. května 1998.
Vynález bude podrobněji popsán mimo jiné v následujících příkladech a přiložených obrázcích.
Příklad 1: Systém hybridů
Na Obrázku 1 jsou znázorněna tri schémata pro přípravu hybridních semen z pylově sterilního samičího rodiče a samčího rodiče. Podmínky vyžadované pro úspěšnouy přípravu hybridních semen pomocí genetických prostředků jsou následující: úplná a stabilní pylová sterilita samičího rodiče, který se nazývá A-linie, nebo samičí linie
2) kompletní a stabilní obnovitelnost pylové fertility u samčího rodiče, nazvaného Rlinie, nebo samčí linie
3) snadné množení samičí A-linie pomocí pylově fertilní udržovací linie, nazvané zde B-linie, či udržovací linie. Vytvořená Fi hybridní semena jsou všechna pylově fertilní. Samičí A-linie se množí buď opylením linií udržovací line B, samoopylením udržovací linie B, nebo oběma popsanými způsoby. Udržovací lie B se množí samosprášením a požadované pylově fertilní rostliny se vyberou ze samosprašného potomstva udržovatele v každé generaci užitím selekčních markérů, které jsou charakteristické pro udržovatele.
Příklad takovéhoto schématu pro přípravu hybridní pšenice obecné nebo tvrdé je detailněji znázorněn na Obrázcích 13, 14 a 15. Jako pylově sterilní samičí linie A je zde použit kultivar nazvaný cv. „One,,, vybavený geny pro pylovou sterilitu, to znamená homozygotní pro jednu z recesivních mutantních alel pro pylovou sterilitu (ms-Blms-Bl) umístěnou na krátkém rameni chromozómu 4B a homozygotní také pro dominantní alelu genu vnášejícího pylovou sterilitu (Ki-Bl), kféiTýenjfíušTěnáTiá^ přehledném článků Wilsona á
Driscolla (Wilson, P. and Driscoll, C.J. (1983) in Frenkel, R. (ed.) Monographs on Theoretical and Applied Genetics, Vol.6, Heterosis, Springer-Verlag, strana. 94123) byly popsány tři alely pro pylovou sterilitu. Tyto alely jsou: „Pugsley,, (Pugsley a Oram, 1959 -spontánní výskyt msBl-a) „Probus,, (Fossati a Ingold, 1970 - indukce X-paprsky, ms-Bl-b), „Cornestone,, (Driscoll 1977- indukce gama zářením, ms-Bl-c) Alely ms-Bl-b a ms-Bl-c jsou terminálními delecemi. Dříve bylo indukováno několik dalších přídavných mutantních alel, a to buď gama zářením nebo působením etylmetansulfonátem (EMS). Mutanty připravené působením EMS mohou být odlišeny od různých delecí v lokusu Ms-Bl, a to přítomností koncového C-proužku na 4BS. DNA markéry, jako je například Xpsr921, které jsou lokalizovány v distální oblasti 4BS, nejsou přítomny v ms-Bl-c a v několika našich mutantách vzniklých gama zářením (a možná také v ms-Bl-b), to znamená že jsou umístěny na deletovaných segmentech a jejich nepřítomnost je známkou homozygotnosti pro delece. Alela Ki-Bl, přítomná v kultivaru Chinese Spring, je lokalizovaná na dlouhém rameni chromozómu 6B, a to asi 50cM od centromery (Loegering, W.Q. a Sears, E.R. (1963) Can. J. Genet. Cytol. 5: strana 65 až 72. DNA markéry, jako například Xprs915, jsou pevně spojeny k allele ki-Bl. Je-li pylově sterilní samičí linie udržována pomocí udržovatele, který nese rekombinatní chromozóm typu EC-HR, samičí linie by měla být také homozygotní pro recesivní alelu citlivosti k chlortoluronu su-Bl. Tato alela, přítomná v kultivaru Chinese Spring pšenice obecné a v několika dalších genotypech tetraploidní pšenice, je lokalizovaná na dlouhém rameni chromozómu 6B, asi 0. 5cM od centromery (Snape, J.W., Leckie, D., Parker, B.B. and Něvo, E. (1991) v Casely, J.C., Cussans, G.W. and Atkin, R.K. (eds.) Herbicide Resistance in Weeds and Crops)
Udržovací linie B je odvozena z toho samého kultivaru jako linie A, to znamená z „cv. One,,, je homozygotní pro ty samé alely ms-Bl a Ki-Bl, které jsou přítomny také v linii A, ale má ještě přidaný cizí rekombinantní chromozóm typu EC-H (Obrázek 2a). Tento cizorodý chromozóm sestává z 4SsS zAegylops searsii, který nese dominatní alelu pro pylovou fertilitu Ms-S'3l a dominantní, nebo semidominantní alelu rht—X 1, která zodpovídfá za vyšší vzrůst rostlin, dále pak 6S’L z Ae. longissima, který nese recesivní alelu pro pylovou sterilitu ki- S1 Ια, která způsobuje, že pylová zrna, která ji obsahují, jsou přístupná destruktivnímu působení alely Ki-Bl, která se vyskytuje v pšenici obecné nebo tvrdé. Z důvodu přítomnopsti ki- S11 -a • ·
-50není cizí rekombinantní chromozóm přenášen pylovými zrny. Proto výsledkem opylení pylově sterilní samičí linie (linie A) linií udržovatele (linií B )je potomstvo , ve kterém jsou všichni jedinci identičtí se samičí linií a jsou pylově sterilní (Obrázek 13a). Naopak, vede samoopylení udržovací linie--k^ytvořem potomstva^· ve“které-je 89 %-pylově steritóch a 29-% pylově fertilních potomků (Obrázek 13a). V důsledku přítomnosti alely rht-ifl v rekombinantním chromozómu, je pylově fertilní potomstvo udržovatele vyšší v průměru o 6 až 8 cm, než potomstvo pylově sterilní. Tento výškový rozdíl usnadňuje selektivní sklizeň pylově fertilního potomstva pomocí kombajnu. Tímto se udržuje v každé generaci konstantní podíl mezi pylově fertilními potomky v samosprašné udržovací linii.
Podobně udržovací linie může být odvozena z téhož kultivaru jako linie A, ale je monosomická pro chromozóm 6B, to znamená že je homozygotní pro ms-Bl a hemizygotní pro Ki-Bl a má ještě přidanou jednu sadu cizího rekombinantního chromozómu typu REC-H (Obrázek 2c). Tento cizorodý chromozóm sestává z 4SsS zAegylops searsii, který nese dominatní alely Ms-Ss 1 a rhí-K; 1. Dále obsahuje 6S'L z Ae. longissima, který nese recesivní alelu pro pylovou sterilitu ki- S11-a, která způsobuje, že pylová zrna, která ji obsahují, jsou přístupná destruktivnímu působení alely Ki-Bl, která se vyskytuje v pšenici obecné nebo tvrdé . Další součástí je distální oblast chromozómového ramene 6BL. Pravidelné párování rekombinantního chromozómu REC-H s 6B umožňuje jeho oddělení a následně jeho výskyt v 50 % gamet. Z důvodu přítomnopsti ki- S11-a není cizí rekombinantní chromozóm přenášen pylovými zrny. Proto výsledkem opylení pylově sterilní samičí linie (linie A) linií udržovatele (linií B )je potomstvo , ve kterém jsou všichni jedinci identičtí se samičí linií a jsou pylově sterilní. Naopak, samoopylení udržovací linie rekombinantního udržovatele dává vzniknout 50 % pylově sterilních a 50 % pylově fertilních potomků (Obrázek 13b).
V důsledku přítomnosti alely rht-lf 1 v rekombinantním chromozómu, je pylově fertilní potomstvo udržovatele vyšší v průměru o 6 až 8 cm, než potomstvo pylově sterilní. Tento výškový rozdíl udržuje v každé generaci konstantní podíl mezi pylově fertilními a sterilními jedinci.
Obdobně ještě další linie udržovatele může být shodná s linií A ale je monosomická pro chromozóm 6B, to znamemá, že je homozygotní pro ms-Bl a hemizygotní pro su-Bl a KiBl a nese ještě jednu sadu cizího rekombinantního chromozómu typu REC-HR (Obrázek 2d) skládající se z 4SsS zAegilops searsii, který nese dominantní alely Ms- ΚΊ a rht-S;l. Dále se skládá z 6S’S zAegilops longissima, které nese dominantní alelu rezistence k chlortoluronu Su-S8!, jenž je přenesena z 6SsL zAe. searsii na 6S’L zAe. longissima. Dále obsahuje recesivní alelu pro pylovou sterilitu ki- S11-a, která způsobuje, že pylová zrna, která ji obsahují, jsou přístupná destruktivnímu působení alely Ki-Bl, která se vyskytuje v pšenici obecné nebo tvrdé. Další součástí je distální oblast chromozómového ramene 6BL. Pravidelné • · ·
·»«····· ·· • · · · • · ♦ · • · · · • ·· · ··· • · • · · · párování rekombinantního chromozómu REC-HR s 6B umožňuje jeho oddělení a následně jeho výskyt v 50 % gamet.
Z důvodu přítomnopsti ki- S11 -a není cizí rekombinantní chromozóm přenášen pylovými zrny. Proto výsledkem opylení pylově sterilní samičí linie (linie A) linií rekombinantního udržovatele je potomstvo , ve kterém jsou všichni jedinci identičtí se samičí linií a jsou pylově sterilní. Naopak, vede samoopylení rekombinantní udržovací linie k vytvoření potomstva, ve které je 50 % pylově sterilních a 50 % pylově fertilních potomků (Obrázek 14b).
V důsledku přítomnosti alely Su-Sfl v pylově fertilním potomstvu, je toto rezistentní k působení herbicidu chlortoluronu. Aplikací tohoto herbicidu na výsev udržovatele budou všichni pylově sterilní potomci, kteří nenesou rekombinantní chromozóm, zničeni. V linii udržovatele zůstanou pouze pylově fertilní rostliny.
Další udržovatelé obsahují vylepšený rekombinantní chromozóm typu IEC-HC (Obrázek 3a, 4a a 5a) nesoucí ještě navíc k alelám Ms, rht a ki- S11 -a selektivní markér, což je alela pro modrou barvu aleuronu (Ba), což způsobuje modré zabarvení semen. Byly připraveny tři typy těchto vylepšených chromozómů: (1) IEC-HC 1, sestávající z 4SsS (nese alely Ms- ó's1 a rht-SA), 4EL (nese alelu Ba-El ) a 6S*L (nese ki- S11-a; (2) IEC-HC2, sestávající z 4SsS(nese alely Ms- S'sl a rhl-Kl), 4AmL (nese alelu Ba-Aml); 6S'L (nese alelu ki- S11q);(3)IEC-HC3, sestávající z 4AmS (nese alely Ms-Am 1 a rht- Aml), 4AmL (nese alelu Ba-Aml) a óS^ (nese alelu ki- S’ 1-a).
Z důvodu přítomnosti ki-S11-a není vylepšený rekombinantní chromozóm přenášen pylovými zrny. Proto výsledkem opylení pylově sterilní samičí linie (linie A) linií udržovatele (linií B )je potomstvo , ve kterém jsou všichni jedinci identičtí se samičí linií a jsou pylově sterilní (Obrázek 15a). Naopak, vede samoopylení udržovací linie k vytvoření potomstva, ve kterém je 80 % pylově sterilních a 20 % pylově fertilních potomků (Obrázek 15a)c
Možnost oddělení červených/bílých semen udržovatele, ze kterých se vyvinou pylově sterilní rostliny (linie A), od modrých semen, která po se vypěstování vyvinou v pylově fertilní linii(linie B) (Obrázky lb a 15a), je alternativní a výhodnou cestou k získání semen pylově sterilní samičí linie přímo z potomstva samosprášením vzniklé linie udržovatele. Tento způsob značně snižuje peněžní náklady na získání samičích semen.
Další udržovatelé obsahují vylepšený rekombinantní chromozóm typu IREC-HC (Obrázky 3b, 4b a 5b nesoucí na dlouhém rameni vylepšeného rekombinantního chromozómu terminální segment chromozómového ramene 6BL, který se pravidelně páruje s nativním chromozómem 6B, který existuje jako monosomické přidání v této linii udržovatele. Toto pravidelné párování umožňuje správné oddělení vylepšených rekombinantních chromozómů • · · ·
-52během meioze a následně jejich výskyt v 50 % gamet. Z důvodu přítomnopsti ki- S' 1-a nejsou IREC chromozómy přenášeny pylovými zrny. Proto výsledkem opylení pylově sterilní samičí linie (linie A) linií udržovatele (linií B )je potomstvo , ve kterém jsou všichni jedinci identičtí se samičí linií a jsou pylově sterilní (Obrázek~i5b)r'Naopak7“samo^)ráŠ0rn~TekOínbinantňí udržovací linie dává vzniknout 50 % pylově sterilních a 50 % pylově fertilních potomků (Obrázek 15b). V důsledku přítomnosti alely Ráje proto snadné dělit semena pomocí třídícího stroje na červená/bílá a modrá. Tak se pěstováním pouze modrých semen v každé generaci zajistí, že všechny rostliny udržovatele budou pylově fertilní.
Jako u dalších trav, tak také u pšenice dochází příležitostně během meioze k příčnému dělení centomery univalentního (nezpárovaného )chromozómu. Tímto dělelením, na rozdíl od podélného dělení, vzniknou při dělení dva telocentrické, neboli izochromozómy. Četnost tohoto typu dělení v monosomickýeh rostlinách, nebo rostlinách s monosomickým přidáním, to znamená majících univalentní chromozóm v meioze, je obvykle nízká, pouze několik procent. Protože EC vEC-H, EC-HR a IEC-HC typech chromozómů existuje v udržovací linii jako monosomické přidání a jako takový zůstává během meioze nespárovaný, samosprášením vzniklá udržovací linie může obsahovat rostliny, které mají jen jedno rameno z EC. Rostliny, které mají pouze dlouhé rameno, ECL (nesoucí Ba a ki-S11-a alely), budou pylově sterilní. Na druhé straně, rostliny mající krátké rameno ECS (nesoucí Ms a rht alely) budou pylově fertilní. Protože rostliny s ECS nenesou alelu ki-S11-a, samčí gamety mající ECS budou funkční a buď opylením samičích rostlin nebo samosprášením budou kontaminovat samičí linii. V případě ECHR, rostliny mající krátké rameno a kterým chybí rameno dlouhé z EC, jsou citlivé k působení chlortoluronu a mohou být odděleny na základě aplikace tohoto herbicidu na potomstvo vzniklé samosprášením udržovatele. V případě IEC-HC, rostliny mající krátké rameno a kterým chybí rameno dlouhé z EC, produkují červená/bílá semena, která mohou být oddělena třídícím strojem od modrých semen v potomstvu vzniklém samosprášením udržovací linie.
Na druhé straně rekombinantní chromozóm zobou typů REC-H a IREC-HC se pravidelně během meioze páruje s nativním chromozómem 6B. Následně centromera prochází pouze podélným dělením v druhé meiotické anafázi, netvoří se centromery a samičí linie není kontaminována pylově fertilními rostlinami.
Ke zvýšení obsahu semen v potomstvu vzniklém samosprášením vylepšené rekombinantní linie, která se po vysevu vyvinou v pylově sterilní rostliny, je nutné samoopylit vylepšenou rekombinantní udržovací linii a pěstovat semena další sezónu. Tímto způsobem (vyznačeným na Obrázku 15b) se získá množství požadovaných semen dosahující až 70 %. Ve vylepšené rekombinantní udržovací linii obsahující typ IREC-HC je možné provést dvoukrokový výběr: v prvním kroku sklízet vyšší rostliny (nesoucí IREC-HC s rht alelou), • · · · · ·
-53» · · ·· • · ♦ · • ' ·
« · · · v druhém kroku nižší rostliny a jejich semena roztřídit podle barvy. Červená/bílá semena neobsahují EREC-HC a po vypěstování se z nich vyvine pylově sterilní samičí iinie.
Samčí rodič (linie R, cv. ,,Two„) je normální kultivar pšenice obecné nebo tvrdé, který je přirozeně homozygotní pro alelu pylové fertility Ms-Bl, dále homozygotní buď pro dominantní aielu Ki-Bl nebo pro jednu z recesivních alel ki-Bl (ki-Bl-a nebo ki-Bl-n).
Tak jak je ukázáno ve schématech na Obrázcích 13a-b, 14a-b a 15a-b, jsou hybridní semena pšenice obecné a tvrdé produkována rychle a účinně vFj potomstvu, všichni jedinci jsou heterozygotní pro alely pylové sterility (Ms-Blms-BI), a proto pylově fertilní. Dále, všechny kultivary zde používané jako samčí rodiče byly schopny plně obnovit pylovou fertilitu hybridů Fi.
Příklad 2: Testování exprese pylové fertility způsobené přítomností jedné sady pylově fertilní alely Ms-Ss-1 z Aegilops searsii v genotypu ms-Blms-Bl pšenice obecné
Z důvodu testování proveditelnosti výše zmíněného hybridního produkčního systému a udržení pylově sterilní samičí rodičovské linie (linie A) bylo nejprve nutné připravit cizorodou linii s monosomickým přidáním chromozómu, tak byl chromozóm 4Ss z Aegilops searsii přidán k plné genetické výbavě pšenice obecné, která je homozygotní pro alelu pylové sterility ms-Blc. To bylo provedeno křížením disomické linie 4Ss (odvozené z křížení Aegilops searsii acc. TE-10 s vysokou pšenicí obecnou, cv. Chinese Spring, laskavě poskytnutou Prof. G. Hartem, Soil and Crop Science, Texas A a M University, College Station, Texas). Tato linie je homozygotní pro Ms-Bl, rhtl a rht2 a nese dvě sady Ms-S51 a rht- S5 1. Druhá linie obsahuje kombinaci ms-Bl-cms-Bl-c RhílBhílrhí2rhl2, což je pylově sterilní genotyp polozakrslé pšenice obecné cv. Gamenia (laskavě poskytnutá Dr. M. MacKayem, kurátorem Australian Winter Cereal Collection, RRM 944, Calala Lané, Tamworth, NSW 2340, Austrálie). F] potomstvo vzniklé tímto křížením je celé heterozygotní pro Ms-Blms-Bl-c a nese jeden další přidaný chromozóm 4Ss sMs- ó0/ alelou. Tyto rostliny se podrobily samoopylení a byly vybrány F2 rostliny, které jsou homozygotní pro ms-Bl-c (jejich fenotyp byl určen pomocí DNA markérů). Jak se očekávalo, všechny euploidní homozygotní rostliny (ms-Bl-cms-Bl-c) byly pylově sterilní, ale všechny homozygotní rostliny, které obsahují přidaný 4Ss chromozóm nesoucí Ms- S;1 byly pylově fertilní, což ukazuje na úplnou dominanci Ms- !?1 nad dvěma sadami ms-Bl-c.
·· · » ♦ · ··
• ·
Příklad 3: Testování výškových rozdílů mezi rostlinami pšenice obecné, které jsou homozygotní pro alelu snižující výšku rostliny Rhtl nebo Rht2 a genově shodných rostlin, které mají chromozóm 4Ss zAe. searsii nesoucí rht-S? 1 alelu ---—
Aegilops searsii je rostlina s nízkým vzrůstem. Nicméně obsahuje alelu rht-S? 1, která podporuje výšku rostliny. Tato alela je homoalelická k alelám rht z pšenice obecné, které jsou umístěny na krátkém rameni 4. skupiny chromozómů, umístěných asi 15 cM od centromery (Mclntosh, R.A. (1998) Proč. 8th Int. Wheat Genet. Symp.,Beijing,China, strana 1333 až 1500). Alela rhl-S? 1 je spojena s alelou pro pylovou fertilitu Ms- S?l, která je umístěna v terminální oblasti. Jelikož se chromozóm 4Ss nepáruje se svým homologem v původní pšenici obecné, obě alely rht-S? 1 a Ms- S31 jsou v různých typech vložených cizorodých chromozómů stále spojeny. Existence alely rht-S? 1 na vloženém chromozómu může podporovat vyšší vzrůst rostlin, a proto může sloužit jako alela pro selekční markér, která usnadňuje oddělenou sklizeň pylově fertilních potomků udržovací linie, to znamená těch, kteří nesou vložený chromozóm. Takto se udržuje v každé generaci konstantní podíl pylově fertilních rostlin v samosprášením vzniklém potomstvu udržovatele.
K zjištění vlivu rht-S?1 na výšku rostlin pšenice obecné, která je homozygotní pro Rht alely, byla skřížena linie s disomickým přidáním 4Ss s polozakrslou linií pšenice obecné cv. Gamenia, obě byly popsány v Příkladu 2. Vzniklé Fi rostliny byly všechny heterozygotní pro jednu z alel Rht a nesly jeden přidaný chromozóm z 4Ss nesoucí alelu rht- S?l. Tyto rostliny byly samosprášeny a byly vybrány F2 rostliny, které byly buď homozygotní nebo heterozygotní pro Rht (to se indikovalo jejich výškou). Všechny euploidní rostliny byly menší ( v průměru o 6 až 8 cm) na rozdíl od těch, které obsahovaly přidaný chromozóm 4Ss s alelou rht- S?l. Toto bylo potvrzením, že přítomnost alely rht- S;1 v genotypu polozakrslé pšenice obecné podporuje vyšší vzrůst rostlin, což lze využít jako selekční markér.
Příklad 4: Testování vlivu chlortoluronu na rostliny pšenice obecné, které jsou homozygotními pro alelu Su-BI a na genově shodné rostliny, které mají vložený chromozóm nesoucí dominantní alelu pro rezistenci Su-S31
Různé kultivary pšenice obecné vykazují různé reakce na herbicid chlortoluron a další fenyl deriváty močoviny. Některé kultivary, které nesou dominantní alelu Su-Bl (například Cappele Desprez) jsou rezistentní, zatímco ostatní jsou nesoucí recesivní alelu su-Bl (například Chinese Spring) jsou citlivé (Snape a další, 1991). Gen je lokalizován na dlouhém rameni chromozómu 6B (6BL), asi 0. 5 cM od centromery. Různé linie diploidního druhů Aegilops, jejichž genom je • «
-55blízce příbuzný genomu B pšenice, také vykazují různé reakce na působení chlortoluronu: i když je většina linií citlivých kjeho působení, jedna linie z.Ae. searsii je rezistentní. Jelikož se chromozóm 6SsL z Ae. searsii páruje téměř pravidelně s óSÍ zAe. longissima, je možné přenést alelu rezistence do 6S!L ramene vloženého chromozómu EC-H (Obrázek 8a, b). Tak vznikne vložený chromozóm typu EC-HR. Jelikož se ramena chromozómů 4SsS a 6SsL nepárují se svými homology ze pšenice ve výchozí normální pšenici obecné, alela Su-S31 je trvale spojená s dalšími alelami vloženého chromozómu, to znamená s Ms- S? 1, rht- S?1 a KiS?l-a. Přítomnost alely rezistence k chlortoluronu ve vloženém chromozómu usnadňuje v každé generaci samoopylením vzniklého potomstva selektivní hubení pylově sterilních rostlin, které nemají tento vložený chromozóm, rostliny, které tento chromozóm mají, to znamená pylově fertilní udržovací linie, zůstává tímto herbicidem nedotčená. To je zárukou, že v každé generaci porostou pouze pylově fertilní potomci.
K testování vlivu chlortoluronu na různé genotypy jsme postříkali rostliny dvojnásobnou dávkou, než jaká je doporučená ke komerčnímu využití. Aplikace proběhla na pole s rostoucí pšenicí obecnou, která je homozygotní pro alelu citlivosti k herbicidu su-Bl a na polích s linií Ae. searsii nesoucí alelu rezistence k chlorotoluronu Su-S31. Všechny rostliny nesoucí recesivní alelu su-Bl byly vyhubeny 10 až 14 dní po postřiku, zatímco rostliny s dominantní alelou Su-S? 1 přežily.
Příklad 5: Vliv modrého aleuronu na barvu semene a oddělování modrých a červených/bílých semen
Barva semen pšenice obecné nebo tvrdé je červená nebo bílá, červená barva je výsledkem přítomnosti pigmentu v osemení. Několik druhů příbuzných k pšenici obecné a tvrdé, to znamená T. monococcum, A. elongatum, A. glaucum, A. tricophorum, A. juneeum, Secale monlanum, Secale cereale a Hordeum spontaneum, obsahují linie s modrými semeny. Modrá barva je výsledkem tvorby antokyanů v triploidní aleuronové vrstvě endospermu( pro přehled se podívej Zeven, A.C. (1991) Euphytica 56: 243-258)Modrá barva indikuje genotyp aleuronu, jev se nazývá xenia, to znamená rostliny s červenými/bílými semeny se opylují rostlinami se semeny s modrým aleuronem, vzniklá semena jsou modrá. Modrá barva semen je určena alelou pro modrý aleuron (Ba) (označení podle Keppenna a Baezingera, 1990, v souhlase s Dr. R. A. Mclntoshem, koordinátorem genových symbolů pro pšenici), která je lokalizovaná na dlouhém rameni chromozómu 4Am z I monococcum nebo na 4E z E. pontica (Zeven, A.C. (1991) Euphytica 56: strana 243 až 258). V ječmeni je místo pro Ba (zde značené Bl) položeno na dlouhém rameni chromozómu 4H, 29 cM od centomery (Grain Genes ···♦ ··
-56Database, ref. BCN-25-93). Proto z důvodu genové podobnosti existující mezi druhy Triticae, se předpokládá, že také v T. monococcum a E. pontica je tento gen lokalizován v přibližně stejné vzdálenosti od centromery. Semena, z linií vzniklých monosomickým přidáním 4Am nebo 4E do genomu pšenice obecné, jsou modrá a indikují tak přítomnost kompletní dominance alely Ba. Výsledná barva semen je závislá na množství přidání této alely, které se projevuje intenzitou zabarvení. Tři sady alely Ba dají semena tmavě modrá, dvě sady ( výsledek přenosu alely samičími gametami) dá semena středně modrá, jedna sada (výsledek přenosu alely samčí gametou) dá vzniknout semenům světle modrým. Prostředí, ve kterém jsou rostliny pěstovány, to znamená sucho a teplo během období nalévaní zrn, dále také rostlinný genetický základ, mohou redukovat expresi Ba alely, což způsobuje chybnou klasifikaci semen s jednou sadou Ba. Semena se dvěma či třemi sadami alely Ba jsou vždy klasifikována správně. Ba alela, buď s Ba-El nebo Ba-Aml, je translokovaná na cizorodém rekombinantním vloženém chromozómu, který se pravidelně nepáruje se svým homologem z pšenice. Protože je alela Ba trvale spojená s Ms-S3! a rht- £? 1 nebo &Ms-Aml a rht-Aml alelami, dále také s ki-S11-a alelou, může sloužit jako vynikající selekční markér. Modrá semena mohou být oddělena od červených/bílých pomocí třídícího zařízení ( jako je například Sortex 5000). Tento postup lze využít pro separaci velkého množství semen a má tedy komerční využití.
Příklad 6: Testování ničení pylu nesoucího alelu ki-tfl-a pomocí dominantní alely genu pro navození pylové sterility Ki-Bl z pšenice obecné
Loegering a Sears (1963) nalezli, že chromozómové rameno 6BL z kultivaru Chinese Spring pšenice obecné nese dominantní alelu pro gen navozující pylovou sterilitu, která ničí pylová zrna mající recesivní alelu ki (= ki-Bl-a) z kultivaru Timstein. V křížení několika kultivarů pšenice obecné s dvěma testovacími liniemi, a to Chinese Spring a Timstein, nalezli přinejmenším tři alely v místě pro alelu genu navozujícího pylovou sterilitu, a to: dominantní Ki(=Ki-BI), recesivní ki (= ki-Bl-a) a neutrální alelu (= ki-Bl-n).
Jelikož tato dominantní alela zabíjí jen pyl a nikoli vajíčka, může se využít pro zabránění přenosu pylu nesoucího cizí dominantní alelu pro pylovou sterilitu Ms-S8!. To vyžaduje stálé spojení mezi Ms-S81 a ki-Bl-a alelami. Tohoto spojení lze dosáhnout sestavením cizorodého chromozómu, který nese tyto dvě alely a který se pravidelně nepáruje se svým homologním chromozómem v pšenici. Podmínka, která musí být splněna před sestrojováním takovéhoto vloženého chromozómu, je dostupnost recesivní alely genu pro navození pylové sterility v jednom z divokých, pšenici příbuzných, druhů rostlin.
-57·· »·»·
·· ·« « · · · * • · 9 9
9 99 9 999 • * · • · · ·
Připravením řady linií vzniklých přidáním části z Ae. longissima do základní linie kultivaru Chinesse Spring autoři vynálezu zjistili, že chromozóm 6 z Ae. longissima (6S1) se přenáší pylem jen v případě rostlin defícientních pro chromozóm 6B. Analýzou životaschopnosti pylu, obarveníém pylu Alexandrovým reagens (Stain Technology, 44:117) u linie s monosomickým přidáním 6S1, se ukázalo, že bylo zničeno kolem 20 % pylových zrn, hlavně těch, které nesly 6S1 chromozóm, zatímco v linii s 6S!S monotelosomickým přidáním byla potracena jen 2 až 3 % pylových zrn. V potomstvu samosprášených rostlin s monosomickým přidáním nebyly nalezeny žádné rostliny s disomickým přidáním. To naznačuje, že zatímco přenos 6S1 vajíčky zůstává nedotčen, přenos 6S1 pylovými zrny je za přítomnosti 6B úplně zablokován, to znamená, v přítomnosti Ki-Bl. Předpokládá se, že chromozóm 6S1 z několika odrůd Ae. longissima nese recesivní pylovou alelu, zde značenou ki-S11-a, jejíž pylová yrna jsou citlivá k ničivému působení Ki-Bl alely z pšenice obecné.
Příklad 7: Sestrojení vloženého chromozómu EC-H1, který obsahuje 4SsS, který nese alely Ms-S5l a rht- Ss 1 a óSl·, který nese alelu ki-S11-a
Chromozóm, ať nativní, nebo cizí, který existuje v pšenici v jedné sadě jako monosomický přidaná linie, může postoupit, i když s malou četností výskytu, chybné centromerické dělení v meiozi. Dojde nikoli k podélnému rozdělení chromozómu, ale k příčnému dělení v centromeře, což se projeví vznikem jednoho nebo dvou stabilních telocentrických chromozómů. Jestliže existují dva nehomologní chromozómy každý v jedné sadě, současně prodělají příčné rozdělení, vzniknou telocentrické chromozómy, které mohou fúzovat za výsledku translokovaného chromozómu (Sears, E.R. (1972) Stadler Symposium 4: strana 23 až 38. Četnost této centrické fuze se pohybuje v rozmezí méně než 1 % (Sears, E.R. (1972) Stadler Symposium 4. 23-38) do více než 23 % (Lukaszewski, A.J. (1993) Genome 36: strana 821 až 824.
Autoři vynálezu využili tento jev při sestrojení vloženého chromozómu 4SsS/6S1L. Opylením linie s monosomických přidáním 6S‘L, která nese ki-S11-a s linií s disomickým 4Ss přidáním nesoucím Ms- £?1 a rht- 1 vznikne Fj potomstvo mající chromozóm 4Ss a jedna jeho čtvrtina obsahuje také chromozóm 6S1, to znamená, že se vytvořila dvojnásobně monosomický přidaná linie. Přítomnost 4Ss a 6S1 se v rostlinách určuje pomocí DNA sond PSR921 aPSR915.
Získalo se okolo 2000 rostlin F2, které všecnhy byly otestovány metodou počítání chromozómů. Rostliny obsahující monosomická přidání, zejména ty rostliny, které měly 2n=43, byly podrobeny dalšímu zkoumání pomocí DNA markérů, to proto, aby se vyloučily ty, které
-58• · · • · ···· φφφφ φφ φ φ • φ φ ·
Φ · · · φφφ «φ φ mají 4SsL a 6S'L. Metodou C-proužkování se potvrdila přítomnost požadované centrické fuze.
Jak se očekávalo, tento chromozóm se nepřenáší pylovými zrny a všechna opylení euploidních rostlin rostlinami, které nesou vložený chromozóm jako monosomicky přidáná linie, má za výsledek pouze euploidní rostliny, zatímco samoopylení monosomicky přidané linie dá vzniknout okolo 20 % rostlin se 43 chromozómy.
Příklad 8: Sestrojení vloženého chromozómu EC-HR 1, který obsahuje 4SsS, nesoucí alely Ms-Ss 1 a rht- a 6S’L, které nese alely Su-S11 ki-S11 -a
Sestrojení vloženého chromozómu EC-HR1 spočívá v přenosu dominantní alely pro rezistenci k chlortoluronu Su-S11 z ramene chromozómu 6SsL vybrané linie Ae. searsii do 6S*L ramene vloženého chromozómu EC-H1. Toho se dosáhne následujícím postupem: křížením pylově fertilní samičí rodičovské linie odvozené z pylově fertilní linie udržovací v pšenici obecné cv. Chinese Spring. Tento samičí rodič je homozygotní pro ms-Bl, su-Bl a Ki-Bl alely a má jako monosomické přidání vložený chromozóm EC-H1 (4SsS/6S1L) nesoucí na svém krátkém rameni alely Ms-S3! a rht- S31 a na svém dlouhém rameni alelu Su-S11 ki-S11-a, druhým partnerem v křížení je diploidní druh Ae. searsii nesoucí alelu pro rezistenci k chlortoluronu na dlouhém rameni chromozómu 6Ss, to znamená na 6SsL, dále potom alely Ms-S31 a rht- S3! na 4SsS. Asi 20 % z Fi potomstva má vložený chromozóm EC-H1 a obsahuje tedy 2n = 29 chromozómů a lze je odlišit od dalších F] rostlin majících 2n = 28. Rostliny zFi potomstva nesoucí vložený chromozóm vykazují 26 univalentních (26') a jeden trivalentní (1') chromozóm v metafázi, což je způsobeno párováním vloženého chromozómu (4SsS/6S‘L) s chromozómovým ramenem 4SsS a 6SsL z Ae. searsii. Párování 4Ss z EC s 4SsS z Ae. searsii nezmění alelické složení krátkého ramene EC, kde se mezí 6S’L a 6SsL po křížení mezi centromerou a místem Su a po druhém křížení mezi Su a místem ki vytvoří uvažovaný chromozóm EC-HR1. Opylením 2n = 29 Fi rostlin jednou nebo dvakrát s Chinese Spring vzniknou rostliny homozygotní pro su-Bl s 2n = 43 (21 + 1), které obshují požadovaný chromozóm EC-HR1 jako monosomické přidání. Aplikací chlortoluronu na potomstvo samosprášením vzniklých rostlin s monosomickým přidáním se vyhubí všechny rostliny s 2n = 42 (chybí EC-HR 1 a proto i alela rezistence k chlortoluronu) a zůstanou pouze rostliny s 2n = 43, to znamená ty, které obsahují EC-HR 1.
·· ··♦·
Příklad9:
Sestrojení cizorodého chromozómu pomocí centrické fuze 4SsS/ 4EL a 4SsS/4AmL
K vytvoření cizorodého chromozómu sestávajícího z 4SsS/ 4EL a 4SsS/4AmL lze také využít jevu centrické fuze. OpyFením linie s monosomickým přidáním 4E v pšenici obecné, která je heterozygotní pro Ms-Bl ms-Bl Ki-Bl Ki-Bl a nesoucí Ba-El s linií s 4Ss disomickým přidáním, která je homozygotní pro ms-Bl ms-Bl Ki-Bl Ki-Bl a nesoucí Ms-El a rht- £?1, vznikne potomstvo Fi mající chromozóm 4Ss a z něj má 1/4 také chromozóm 4E, to znamená má dvojnásobné monosomické přidání. Přítomnost 4E a 4Ss v těchto rostlinách byla potvrzena modrou barvou semen a pomocí DNA markérů. Modrá semena F2, která se vyvinula na Fb se oddělí, nechají vyklíčit a vypěstované rostliny se dělí pomocí počítání chromozómů. Linie obsahující monosomiícká přidání (2n = 43) se podrobí dalšímu zkoumání pomocí DNA markérů, to proto, aby se vyloučila ta, která mají chromozómová ramena buď 4SsL nebo 4ES. Bylo nalezeno několik rostlin majících obě ramena 4SsS a 4EL. Metodou C proužkování se potvrdilo, že zde došlo k centrické fúzi. V přípravě 4SsS/4AmL se opylila linie s 4Ss monosomickým přidáním linií disomicky substituovanou (4B)4Am. Vybrané rostliny F, potomstva jsou samosprášeny, tak se připraví dvojnásobně monosomicky přidaná linie na 4Ss a 4Am Přítomnost těchto chromozómů v rostlinách je potvrzena modrou barvou semen a pomocí DNA markérů.
Modrá semena potomstva F2 (na Fi rostlinách) byla naklíčena a po vypěstování byly sazenice zkoumány metodou počítaní chromozómů. Byly vybrány ty, které měly monosomické přidání (2n = 43) a byly dále zkoumány pomocí DNA markérů, aby se vyloučily ty, které mají buď 4SsL nebo 4AmS. Bylo nalezeno několik rostlin, které mají 4SsS a 4AmL. Analýzou pomocí C- proužkování se potvrdila přítomnost centrické fuze chromozómů.
Příklad 10: Sestrojení rekombinantního vloženého chromozómu REC-H1, který obsahuje 4SsS (nesoucí alely Ms-S3 1 a rht- í? 1), óSl·, který nese alely SuS11 ki-S11-a a distální oblast chromozómu 6BL
Homologní chromozómová ramena 6BL a 6S’l se nepárují v přítomnosti genu Phl z pšenice obecné. Tato dominantí alela, umístěná na dlouhém rameni chromozómu 5B zabraňuje párování homologních chromozómů, zatímco dovoluje pravidelné párování homologů. Recesivni mutace (phlb) byla indukována ve svém lokusu pomocí ozařování kultivaru Chinese Spring X-paprsky. V homozygotní formě nepotlačuje homologní párování (Sears, E.R. (1977) Can. J. Genet. Cyto 1.19:strana 585 až 593. Tato mutace byla využita k homolognímu párování a rekombinaci mezi 6BL a 6S*L.
·· ····
-60> · · 9
999 999
6S1 (6BL) disomicky substituovaná linie, ve které pár chromozómů 6S1 z Ale. longissima nahrazuje pár chromozómů 6B z pšenice obecné cv. Chinesse Spring, byla opylena mutantní linií phlbphlb. Fi hybrid, který je monosomický pro 6B monosomickou substituci 6S1 a heterozygotní Phlphlb, byl zpětně křížen v roli samičíhou^diče s mutantní linií. Pomocí DNA sondy WPG90 ( tato sonda byla připravena autory vynálezu a je zájemcům k dispozici) byli vybráni dvojnásobně monosomní jedinci, kteří byli homozygotní pro phlb. Takto vybrané BCi potomstvo bylo opyleno linií ditelosomickou pro 6BS. Vzniklé potomstvo, v němž někteří jedinci jsou monotelosomičtí pro 6BS a monosomičtí pro rekombinantní chromozóm óSÝóBL, to znamená rekombinantní chromozóm, který obsahuje krátké rameno 6S1, proximální část dlouhého ramene 6S1 a distální část 6BL ( translokační bod zlomu je distální k místu ki-S11 na 6SlL). Výběr jedinců s těmito translokovanými chromozómy se provádí na základě nemožnosti párování s 6BS a pomocí DNA markérů, které jsou určeny k značení 6S*L, distálně k ki-S11-a a DNA markérů na distální oblasti 6BL. Vybraný genotyp, jenž je monotelosomický 6BS a monosomický 6S’/6BL a homozygotní pro dominantní alelu pylové fertility Ms-Bl, deficientní pro Ki-Bl a hemizygotní pro ki-S11-a byl křížen jako samčí rodič s linií nesoucí jako monosomieké přidání vložený chromozóm EC-H1 (podívej se na Příklad 6). Někteří jedinci z potomstva jsou trojnásobně monosomičtí, to znamená monosomičtí pro 6B, 4SsS/6S1L a óS^/óBL. Mezi těmito rostlinami se vybrali pomocí DNA markérů jedinci heterozygotní pro ms-Bl-c Ms-Bl Ms-S8! a Ki-Bl ki-S11 -a. Ve vybraných rostlinách tohoto potomstva se objevuje párování v proximální oblasti 6S1 zobou translokovaných chromozómů, což se projeví vznikem rekombinantního vloženého chromozómu REC-H1 (4SsS/6S1L/6BL) Samosprášením vybraného potomstva vzniknou, mezi jinými, také dvojnásobně monosomieké rostliny mající 6B a REC-H1, jsou homozygotní pro ms-Bl-c ms-Bl-vc, hemizygotní pro KiBl a pro ki-S11-a.
Podobně, vybrané rostliny, které jsou monotelosomické 6BS-monosomické 6S*/6BL byly kříženy jako samčí rodič s linií nesoucí jako monosomieké přidání vylepšený rekombinantní vložený chromozóm IEC-HC 1, IEC-HC2 a IEC-HC3. Někteří jedinci z tohoto potomstva jsou v každém křížení třikrát monosomičtí, to znamená monosomičtí pro 6B, 6S'/6BL a pro vylepšený vložený chromozóm. Mezi těmito rostlinami se pomocí DNA markérů vybrali jedinci hetrozygotní pro ms-BÍMs-Bl a Ki-Bl Ki-Bl. U těchto vybraných rostlin existuje párování v proximální oblasti 6S1 u obou translokovaných chromozómů, což se projeví vznikem vylepšeného rekombinantního vloženého chromozómu IREC-HC 1 (4SsS/4EL/6S1l/6BL), IREC-HC2 (dS^MA^/óS^/óBL) a IREC-HC3 (4AmS4AmL/6S‘L/6BL). Samosprášením vybraných rostlin vzniknou, mezi ostatními, dvojnásobně monosomieké rostliny, které mají 6B a vylepšený rekombinantní vložený chromozóm, který je homozygotní pro ms-Bl-c ms-Bl-c a hemizygotní pro ki-S11-a.
• ·
-61Příklad 11:
Sestrojení rekombinantního vloženého chromozómu REC-HR1, který obsahuje 4SsS (nesoucí alely Ms-SA a rht- Ssl), 6S’L, který nese alely SuS' 1 ki-S11-a a distální oblast chromozómu 6BL
Příprava REC-HR1 se provádí křížením linie smonosomicky přidaným rekombinantním vloženým chromozómem REC-H1 s linií Ae. searsii nesoucí alelu rezistence k chlortoluronu Su-S;l, vybráním rostlin Fi potomstva majících 25'+ 1 a jejich opylením Chinese Spring (podobně jako v Příkladu 8).
Příklad 12: Příprava vylepšených vložených chromozómů EEC-HC1 (4SsS/4EL/6S1L),
IEC-HC2 (4SsS/4AmL/6S'L) a IEC-HC3 (4AmS-4AmL/6S1L/).
Příprava těchto vylepšených vložených chromozómů zahrnuje přípravu terminální translokace vzájemným vyměněním distálních oblastí 6SlL (obsahujících alelu ki-S11-a) s homologní oblastí ze 4EL nebo 4AmL z centricky fúzovaných chromozómů. Traslokovaný bod zlomu je mezi alelou Ba ze 4EL nebo 4AmL (taje lokalizovaná asi 30cM od centromery) a alelou ki-S11-a z óS^ (taje lokalizovaná asi 50cM od centromery)..
Terminální translokace jsou vyvolány při různých příležitostech ozářením semen nebo pylových zrn X-paprsky nebo pomalými neutrony (pro přehled se podívej do Keppenne, V.D. a Baenziger, P.S. (1990} Genome 33: strana 525 až 529, Sharma, D. a Knott, D.R.(1966} Can. J. Genet. Cytol. 8: strana 137 až 143. Pomalé neutrony jsou pro tyto účely více účinné a nezpůsobují žádné snížení klíčivosti.
Rostliny monosomicky přidané pro chromozóm vzniklý centrickou fůzí 4SsS/6S1L (podívej se do Příkladu 6), homozygotní pro alely ms-Bl a Ki-Bl, které nesou také Ms-Ssl, rhí- K’l a ki-S1 1-a, jsou opyleny buď (i) linií s monosomickým přidáním pro fúzovaný chromozóm 4SsS/4EL nebo 4SsS/4AmL, který je homozygotní pro ms-Bl a Ki-Bl a nese také Ms-S?l, rht- S11 a Ba-El nebo Ba-Am 1 nebo (ii) 4Am monosomicky přidanou linií, která nese AA- Aml, rht- Aml a Ba- Aml.
V závislosti na kombinacích rodičů, potomstvo Fi obsahuje také disomické přidání S a dvojnásobně monosomické přidání L v 4SsS/6S’L + 4SsS/4EL, 4SsS/6S!L + 4SsS/4AraL nebo 4SsS/6S1L + 4Am Byl vybrán velký počet modrých semen a ta byla ozářena 1013 Ntl' cm'2 termálními neutrony. Takto ošetřená semena byla naklíčena a pomocí metody počítání chromozómů a DNA sond pro monosomické přidání byla rozdělena. Vybrané rostliny se nechaly samosprášit a v jejich potomstvu se hledali potomci s modrými semeny. Po výsevu se z ·· ····
-62♦ · ·· • ♦ * · · · • · · · • · · · · • · · * · ···««»·· · · ·· 9 9 • · · · • · · · ·« · ··· těchto semen vyvinuly pylově fertilní rostliny, které všechny obsahovaly požadovanou translokaci.
Příklad 13: Přeměna uvažovaného kultivaru pšenice obecné a tvrdé v pylově sterilní samičí linii a udržovací linii mající buď EC-H, EC-HR nebo IEC-HC
Postup pro přeměnu uvažovaného kultivaru pšenice obecné na pylově sterilní samicí linii a udržovací linii, ve které je soubor alel existující v samičí a udržovací linii nahrazen doplňkem alel z uvažovaného kultivaru tak, aby byla vytvořena pylově sterilní samičí linie a udržovací linie nebo vylepšená udržovací linie, mající požadovaný doplněk alel z daného kultivaru. Tento postup je vysvětlen na Obrázcích 16a, 17a a 18a.
V tomto postupu, udržovací linie, mající buď EC-H1, EC-HR1 nebo jeden z typu chromozómů IEC-HC, je homozygotní pro recesivní alelu pylové sterility ms-Bl-c a pro dominantní alelu genu pro navození pylové sterility Ki-Bl. Dále má cizorodý vložený chromozóm 4SsS/6S1L, který nese dominantní alely Ms-S31 a rht- ffl a recesivní alelu genu pro navození pylové sterility ki-S11-a a v případě EC-HR 1 také Su- tfl, nebo v případě vylepšených vložených chromozómů 4SsS/4EL/6S1L, 4SsS/4AraL/6S1L nebo 4AraS4AmL/6S’L nesoucích jako monosomické přidání dominantní alely Ms-S3l a rht- fčl, dominantní alelu pro modrý aleuron Ba-El a recesivní alelu pro gen navozujícící pylovou sterilitu ki-S11-a, dále alely Ms-S31, rht- S? 1, Ba-Aml a ki-S11-a, nebo alely AA- Aml, rht- Aml, Ba- Am 1 a ki-S11-a. Tato udržovací linie je opylena uvažovaným kultivarem, který je homozygotní pro Ms-B IMs-B 1 a ki-Bl-aki-Bl-a. F( hybridy jsou všechny heterozygotní pro alely pylové sterility, Ms-Blms-Bl-c a pro alely genu navozujícího pylovou sterilitu Ki-BlkiBl-a, některé z nich nesou také vložený chromozóm. Tyto rostliny jsou vybrány a opyleny znovu požadovanou linií kultivaru, tak vznikne BCi potomstvo, z něhož 1/4 je heterozygotní pro Ms-B 1 ms-B 1-cKi-B lki-B 1-a, někteří potomci nesou také vložený chromozóm. Sazenice s monosomickým přidáním se vyberou pomocí metody počítání chromozómů (to je výběr rostlin s 2n=43). Heterozygotní chrakter obou míst je určen užitím metody DNA markérů a testem potomstva. Vybrané rostliny potomstva jsou dále zpětně kříženy ve funkci samičího rodiče s požadovaným kultivarem po čtyři další generace, až se získá v páté generaci zpětného křížení potomstvo BC5. V každé generaci je potomstvo zkoumáno postupy popsanými pro BCi a jsou vybrány rostliny, které jsou heterozygotní pro Ms-Blms-B 1-cKi-B lki-B 1-a a mají vložený chromozóm jako monosomické přidání. Samosprášením BC5 vznikne potomstvo, z něhož 3/64 jsou homozygotní pro ms-B 1-cms-Bl-cKi-BlKi-Bl. To je námi požadovaná pylově sterilní samičí linie. Další skupina, (1/80) tohoto potomstva, má podobný genotyp a má také vložený chromozóm. To je požadovaná udržovací linie.
-63• Β «Β·· ·· Β»
Β Β * · · · • Β · Β Β
Β · Β Β Β • Β Β Β Β
ΒΒΒΒΒΒΒΒ ·· · ·
ΒΒ ΒΒ • Β Β ·
Β Β Β Β
ΒΒ Β Β Β·
Β Β
Příklad 14: Přeměna uvažovaného kultivaru pšenice obecné a tvrdé v pylově sterilní samičí linii a udržovací linii mající buď REC-H, REC-HR nebo IREC-HC
Postup pro přeměnu uvažovaného kultivaru pšenice obecné na pylově sterilní samičí rodičovskou linii á rekombinantní udržovací linii, ve které je soubor alel existující v samičí a udržovací linii nahrazen doplňkem alel z uvažovaného kultivaru tak, aby byla vytvořena pylově sterilní samičí linie a rekombinantní udržovací linie nebo vylepšená udržovací linie, mající požadovaný doplněk alel z kultivaru. Tato postup je vysvětlen na Obrázcích 16b, 17b a 18b.
V tomto postupu, rekombinantní udržovací linie je monosomicky substituovaná pro 6B v 4SsS/6S1L/6BL, je homozygotní pro recesivní alelu pylové sterility ms-Bl-c, má dominantní alelu pylové fertility Ms-S31 a je hemizygotní pro recesivní alelu genu navozujícího pylovou sterilitu Ki-Bl a pro recesivní alelu pylové sterility ki-S11-a a v případě REC-HR1 také pro alelu Su- Sl 1. Nebo lze použít jednu z vylepšených rekombinantních udržovacích linií, která je monosomicky substituovaná pro vylepšené rekombinantní vložené chromozómy 4SsS/4EL/6S1L/6BL, 4SsS/4AmL/6S1L/6BL nebo 4AmS-4AmL/6S1L/6BL nesoucíh buď alely Ms-S3! , rht- tfl, Ba-El a ki-S11-a, nebo alely Ms-S31 , rht- S?l, Ba- Aml a ki-S11-a nebo alely Ms-Aml, rht- Aml, Ba- Am 1 a ki-S11-a, a ta je opylena uvažovaným kultivarem, který je homozygotní pro Ms-B IMs-B 1 a ki-Bl-aki-Bl-a. Fj hybridy jsou všechny heterozygotní pro alely navozující pylovou sterilitu (Ms-Blms-Bl-c), 1/2 z nich je dvojnásobně monosomická pro 6B (obdržely tento chromozóm od svého samčího rodiče, a proto jsou hemizygotní pro Ki-Bla) a pro REC nebo IREC, další 1/2 je disomická pro 6B a heterozygotní pro Ki-Bl ki-Bl-a. Disomické a dvojnásobně monosomické rostliny jsou vybrány a opyleny uvažovaným kultivarem. Tak vznikne potomstvo BCj, z něhož je polovina heterozygotní pro Ms-Blms-Blc. Toto BCi potomstvo vykazuje dva typy jedinců: typ první, odvozený z opylení dvojnásobně monosomických Fi rostlin, z něhož 1/2 je dvojnásobně monosomická pro 6B, a proto hemizygotní pro ki-Bl-a, dále pro REC a IREC, druhý typ , odvozený z opylení disomických Fj rostlin, z nichž 1/2 je heterozygotních Ki-Blki-Bl-a. Rostliny zBCi, které jsou heterozygotní pro Ms-Blms-Bl-c , které byly monosomické pro 6B a mající monosomickou substituci pro 6B v každém chromozómu 4SsS/6S1L/6BL, 4SsS/4EL/6S1L/6BL, 4SsS/4AmL/6S1L/6BL nebo 4AmS-4AmL/6S1L/6BL a dále rostliny, které jsou pro 6B disomické a jsou heterozygotní pro Ki-Blki-Bl-a, lze je vybrat pomocí DNA markérů a cytologickou analýzou a dále zpětně křížit ve funkci samičích rodičů s uvažovaným kultivarem po čtyři další generace, tak aby se získala pátá generace zpětného křížení (BC5). Potomstvo z každé generace je analyzováno podle postupu popsaného pro BCi. Jsou vybrány rostliny
-64·· ·· φ · · · • · • · • · *··· ···· ·· ···· • · » » · • · · • φ · · ·· *« ·· ·· • · · * • · · · φφφ φφφ • φ • 9 ·· heterozygotní pro Ms-Bl ms-Bl-c a buď hemizygotní ki-Bl-a, které mají REC nebo IREC jako monosomickou substituci, nebo disomické pro 6B, heterozygotní pro Ki-Blki-Bl-a. Vybrané rostliny, dvojnásobně monosomické pro 6B-REC nebo IRECBC5 jsou potom opyleny disomickými rostlinami z potomstva BC5. Tak vznikne BC2F2 potomstvo, z něhož je 1/8 dvojnásobně monosomická pro 6B-REC nebo IREC (nese ms-Bl-cms-Bl-c Ms-S'J Ki-Bl a ki-S11-a. To je buď požadovaná rekombinantní udržovací linie nebo vylepšená rekombinantní udržovací linie. Další 1/8 je disomická a má ms-Bl-cms-Bl-c a Ki-Blki-Bl-a. To je požadovaná pylově sterilní samičí linie.
Claims (6)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob udržování pylově sterilní samičí rodičovské linie pšenice tvrdé nebo obecné pro užití —v-produkci hybridní pšenice v y z n a ě u-jJjC-i-s e ti rn_,.že-zahmuje : — -----------------(a) křížení samičí rodičovské rostliny se samčí rodičovskou rostlinou, přičemž uvedená samičí rodičovská rostlina je pylově sterilní rostlina homozygotní jak v libovolné z recesivních alel pylové sterility ms-Bl na krátkém rameni chromozómu 4B (4BS), tak i v dominantní alele genu způsobujícího pylovou sterilitu Ki-Bl na dlouhém rameni chromozómu 6B (6BL), a přičemž uvedená samčí rodičovská rostlina je udržovací linií a je genově shodná se samičí rodičovskou rostlinou a homozygotní v týchž alelách ms-Bl a Ki-Bl samičí rodičovské rostliny, a zároveň nese dodatečný cizí vložený cizorodý chromozóm vybraný z: (i) vloženého chromozómu popisovaného jako EC, skládajícího se ze segmentů pocházejících ze dvou nebo více rozdílných cizích chromozómů, které nesou dominantní alelu pro pylovou plodnost Ms, recesivní alelu ki, která je citlivá vůči aktivitě nativní alely genu pro pylovou sterilitu na chromozómu 6BL a jeden nebo dva selekční markéry, pomocí nichž lze odlišit rostliny nesoucí tento chromozóm; a z (ii) vylepšeného vloženého chromozómu popisovaného jako IEC, který se skládá ze segmentů pocházejících ze dvou nebo více rozdílných cizích chromozómů, které kromě alel Ms, ki a selekčních markérů nesou ještě markér semene, který umožňuje odlišit semeno s tímto chromozomem a bez něj, a (b) sklizení semen kříženců podle (a), přičemž je toto semeno vesměs homozygotní v uvedené alele pro pylovou sterilitu a v genu způsobujícím pylovou sterilitu a nenese vložený cizorodý chromozóm EC nebo IEC, a přičemž lze z tohoto semene vypěstovat rostlinky uvedené pylově sterilní samičí linie,
- 2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím , že uvedený vložený cizorodý chromozóm nese jako selekční markér alelu rht určující normální vzrůst rostliny a je označován jako EC-H.Způsob podle nároku 1 vyznačující setím , že uvedený vylepšený vložený cizorodý chromozóm nese jako selekční markér alelu rht a jako markér semene alelu Ba určující modrou barvu semen, přičemž takový chromozóm je označován jako IECHC.
- 3.• · • · · · · ·-67> · · « » · · « • · · · ·« • 4 • · · ·
- 4. Způsob podle nároku 2vyznačující se tím , že uvedený vložený cizorodý chromozóm EC-H je rekombinantní chromozóm EC-H1 skládající se Ze segmentů 4S’S/6SL1, který nese alely Ms-S51 a rhl-S?1 na krátkém rameni a ki-S>l-a na dlouhém rameni:— ------ —----- — — - ---—------------5. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím , že uvedený vylepšený vložený cizorodý chromozóm IEC-HC je vybraný ze skupiny sestávající z romozómu IECHC 1, skládajícího se ze segmentů chromozómů 4SÍS/4EL/6SIL, nesoucích alely MsS?l, rht-S? 1, Ba-El a ki-S1!-^ chromozómu IEC-HC2 skládajícího se ze segmentů 4S'S/4AtnL/6SlL, nesoucích alely Ms-SK 1, rht-S? 1, Ba-EI a ki-S?\-a, a chromozómu IEC-HC3 skládajícího se ze segmentů 4Amv-4An'L/6SLl, nesoucích alely Ms-Aml, rhl-EPl, Kn-kml a ki-Stl-a.6. Způsob udržování pylově sterilní samicí rodičovské linie pšenice obecné nebo tvrdé pro užití v produkci hybridní pšenice vyznačující se tím , že zahrnuje:(a) zkřížení samičí rodičovské rostliny se samčí rodičovskou rostlinou, přičemž uvedená samičí rodičovská rostlina je pylově sterilní homozygot jak pro libovolnou z recesivních ms-Bl alel pro pylovou sterilitu na krátkém rameni chromozómu 4B (4BS), tak i pro dominantní alelu genu způsobujícího pylovou sterilitu Ki-BI2 na dlouhém rameni chromozómu 6B (6BL), a přičemž uvedená samčí rodičovská rostlina je udržovací linie, která je genově shodná se samičí rodičovskou rostlinou a homozygotní ve stejné ms-Bl alele jakou má i samičí rodičovská rostlina, ale je monosomatická jak v chromozómu 6B nesoucím Ki-Bl alelu tak i ve vloženém rekombinantním chromozómu vybraném z : (i) vloženého rekombinantního chromozómu, označovaného jako REC, který se skládá ze segmentů pocházejících od dvou nebo více rozdílných cizorodých chromozómů a z distálního segmentu nativního chromozómového ramene 6BL, nesoucího alelu Ms, alelu ki a jeden nebo dva selekční markéry pro výběr rostlin s tímto chromozómem; a z (ii) vylepšeného vloženého rekombinantního chromozómu, popisovaného jako IREC, který se skládá ze segmentů pocházejících od dvou nebo více rozdílných cizorodých chromozómů a z distálního segmentu nativního chromozómového ramene 6BL, nesoucího kromě alel Ms, ki, a selekčního markéru ještě markér semene, který umožňuje rozlišit semeno s tímto chromozomem a bez něj; a • · * · « · ·· · ···· · · · · · · · · · • · · « · ·· ······- _ «β···» · · — 68— ····»··· ·· ·· ·· ·· (b) sklizení semene kříženců podle bodu (a), přičemž je všechno toto semeno homozygotní v uvedených alelách pylové sterility a v genu způsobujícím pylovou sterilitu a nenese rekombinantní chromozóm REC nebo IREC, a přičemž se z- —íoheto-semene vyvinou rostlinky uvedenápylově-sterilní-samičHinie— *— —------------—7. Způsob podle nároku óvyznačujícíse tím , že uvedený vložený rekombinantní chromozóm, označovaný REC-H, nese jako selekční markér alelu rht určující normální vzrůst rostlin.8. Způsob podle nároku 6 vyznačující se tím , že vylepšený vložený rekombinantní chromozóm, označovaný IREC-HC, nese jako selekční markér alelu rht a jako markér semene Ba alelu určující modrá barva semen.9. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím , že uvedený vložený rekombinantní chromozóm REC-H je vložený rekombinantní chromozóm REC-H1, obsahující segmenty 4S5S/6SL1/6BL, nesoucí alely Ms-ΒΊ a rht-Bl na krátkém rameni a ki-Sl 1-a na dlouhém rameni.10. Způsob podle nároku 8 v y z n a č u j í c í se tím , že uvedený vylepšený vložený rekombinantní chromozóm IREC je vybrán ze skupiny skládající se z chromozómu IREC-HC 1, který obsahuje segmenty 4SÁS/4EL/6S'L/6BL nesoucí alely Ms-ΒΊ, rhíS7, Tta-Erl a ki-S> 1-a, chromozómu IREC-HC2 který obsahuje segmenty 4SsS/4AmL/6SLl/6BL nesoucí alely Ms-S* 1, rht-S? 1, Ba-A™ 1 'áki-tfl-a', a chromozómu IREC-HC3 který obsahuje segmenty 4AnlS-4AmL/6SlL/6BL nesoucí Ms-Aml, rht-AS7, Ba-Aml a ki-Sll-a.11. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím , že uvedený vložený cizorodý chromozóm EC-H nese alelu Su pro rezistenci k chlorotoluronu jako další selekční markér, přičemž je takový vložený cizorodý chromozóm označován jako EC-HR.12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že uvedený vložený cizorodý chromozóm EC-HR nese Ms-S57, rht-Sl, Su-Sl a ki-Sll-a, přičemž je takový vložený cizorodý chromozóm označován jako EC-HR.13. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím , že uvedený vložený rekombinantní chromozóm REC-H nese alelu Su pro rezistenci k chlorotoluronu jako • · • · · · • · · · • · · · · · · · · · • · ··· ···· • · · · · * ··· ··· • * · · · * · ___····· »· · · » » · ·-69další selekční markér, přičemž je takový vložený rekombinantní chromozóm označován jako REC-HR.14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že uvedený vložený rekombinantní chromozóm REC-HR se skládá ze segmentů dSŮS/óSÍ/óBL nesoucích alely Ms-ΒΊ, rht-Sd, Su-Sr'J a ki-S1 l-a, přičemž je takový vložený rekombinantní chromozóm označován jako REC-HR1.15. Způsob udržovaní pylově sterilní samičí rodičovské linie pšenice tvrdé nebo obecné pro užití v produkci hybridní pšenice vyznačující se tím , že zahrnuje:a) samosprášení udržovací linie, která je genově shodná se samičí rodičovskou rostlinou, tj. homozygotní jak v libovolné z recesivních alel ms-Bl pro pylovou sterilitu tak i v alele dominantního genu způsobujícího pylovou sterilitu ÁTz-Bi; a která má navíc dodatečný vylepšený vložený cizorodý chromozóm, označovaný jako IEC, nesoucí kromě navíc alel Ms, ki a selekčního markéru, ještě markér semene, který umožňuje rozlišit semeno s tímto chromozomem a bez něj;b) sklizení semene rostlin vniklých samosprášením podle (a), které je zcela homozygotní v uvedené pylové sterilitě a v alele genu způsobující pylovou sterilitu; ac) oddělení semena obsahujícího chromozóm IEC a tudíž i markér semene (20%) od semen neobsahujících chromozóm IEC a a tudíž i markér semene (80%), přičemž se uvedená semena bez markéru semene vyvinou po vysetí v uvedenou pylově sterilní samičí linii.16. Způsob podle nároku 15 vyznačující se tím, že uvedená alela markéru semene je alela Ba určující modrou barvu semene a modrá semena jsou oddělena pomocí třídicího zařízení od červených či bílých semen bez alely Ba.17. Způsob podle nároku 15 nebo 16 vyznačující se tím , že uvedený vylepšený vložený cizorodý chromozóm IEC je vybrán ze skupiny tvořené chromozómem IECHC1, který obsahuje 4SsS/4EL/6S’L nesoucí Ms-S1 1, rht-Sl, Hn-El a ki-Sll-a\ chromozómem IEC-HC2, který obsahuje 4SiS/4AmL/6SlL nesoucí Ms-S 1, rht-S 1, BaA7 a ki-S1l-a; a chromozómem IEC-HC3, který obsahuje 4AmS-4AmL/6SiL nesoucí Ms-Aml, rhí-Aml, Ba-Aml a ki-Šl-a.• ·· Β-70·· B< • · Β ♦ Β <• · · ·ΒΒ ·· * Β Β ΒΒ Β Β Β18. Způsob udržování pylově sterilní samičí rodičovské linie pšenice obecné nebo tvrdé pro užití v produkci hybridní pšenice vyznačující se tím , že zahrnuje:a) samosprášení vylepšené rekombinantní udržovací linie, která je genově shodná se samičí rodičovskou rostlinou, tj. je homozygotní v libovolné z recesivních alel pylově sterility ms-Bl na chromozómu 4BS, ale je monosomická jak v chromozómu 6B nesoucím alelu Ki-Bl tak i ve vylepšeném vloženém rekombinantním chromozómu, označovaném jako IREC, který nese, kromě alel Ms, ki a alely selekčního markéru, ještě markér semene, pomocí něhož lze odlišit semena s tímto chromozómem IREC a bez něj;b) sklizení semene rostlin vniklých samosprášením podle (a), které je zcela homozygotní v uvedené alele pylové sterility a z něhož 50 % je disomických s ohledem na chromozóm 6B a nemá chromozóm IREC a markér semene a 50 % obsahuje jak IREC tak i markér semene;(b) pěstování semene druhé generace podle (b) ve směsi, tak, aby bylo umožněno opylení pylově sterilních rostlin pylově fertilními, jakož i samoopylení pylově fertilních rostlin za vzniku směsného semene další generace; ac) odděleni přibližně 75 % semen disomických s ohledem na chromozóm 6B a zároveň bez chromozómu IREC a semenného markéru a vypěstování uvedené pylově sterilní samičí linie ze zbývajících 25 % semen obsahujících IREC a markér semene.19. Způsob podle nároku 18vyznačující se tím , že alela markéru samčího semene je Ba alela určující modrou barvu semene, a modrá semena jsou oddělena pomocí třídicího zařízení od červených či bílých semen bez Ba alely.20. Způsob podle nároku 18 nebo 19 vyznačující se tím , že uvedený vylepšená vložený rekombinantní chromozóm IREC je vybrán ze skupiny tvořené: chromozómem IREC-HC 1, který obsahuje segmenty dS^SMEL/óSÍ/óBL nesoucí alely Ms-Kl, rhlΚΊ, Ba-El a ki-tfl-a, chromozómem IREC-HC2, který obsahuje segmenty 4SíS/4AmL/6SlL/6BL nesoucí alely Ms-Kl, rht-SA, Ba-X”l a ki-Šl-a, a chromozómem IREC-HC3, který obsahuje segmenty 4Am5,-4AmL/6S1L/6BL nesoucí alely Ms-Aml, rhí-AEl, Ba-Eml a ki-tf 1-a.21. Udržovací linie vybraná z pylově fertilní udržovací linie a vylepšená pylově fertilní udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé pro údržbu pylově sterilní ženské rodičovské linie pro užití v produkci hybridní pšenice, která je genově shodná se samičí • ·-71·· ·· ► · * * k · · · • · · · · · rodičovskou rostlinou a homozygotní jak v libovolné z alel ms-Bl pro pylovou sterilita, tak i v alele nesoucí gen pro sterilitu pylu Á7-B1 samičí rodičovské rostliny, a mající vložený dodatečný cizorodý chromozóm vybraný ze skupiny tvořené: (i) chromozómem EC, který se “sfcláďá ze’ segmentů odvozených od dvou nebo více různých cizích chromozómů, a který nese dominantní alelu pylové fertilita Ms, recesivní alelu ki, která je citlivá vůči sterilizační aktivitě přirozené alely genu pro sterilitu pylu na chromozómu 6BL a selekční markér, pomocí kterého lze selektovat rostliny s tímto chromozómem; a (ii) chromozómem IEC, který se skládá ze segmentů odvozených od dvou nebo více různých cizích chromozómů, a který kromě alel Ms, ki a selekčního markéru nese markér semene který umožňuje rozlišit semeno s tímto chromozomem a bez něj.22. Udržovací linie vybraná z rekombinantní pylově fertilní udržovací linie a z vylepšené rekombinantní pylově fertilní udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé pro udržování pylově sterilní samičí rodičovské linie pro užití při produkci hybridní pšenice, přičemž uvedená udržovací linie nebo vylepšená udržovací linie je genově shodná se samičí rodičovskou rostlinou, tj. je homozygotní v libovolné z alel pylové sterility ms-Bl, ale je monosomická jak vzhledem k chromozómu 6B nesoucím alelu Ki-Bl a tak vzhledem k rekombinantnímu nebo vylepšenému vloženému rekombinantnímu chromozómu, vybranému ze skupiny tvořené: (i) chromozómem REC, skládajícím se ze segmentů odvozených od dvou nebo více různých cizích chromozómů a z distálního segmentu přirozeného chromozómového ramene 6BL, nesoucího alelu Ms a ki a selekční markér, pomocí kterého lze selektovat rostliny s tímto chromozómem; a (ii) chromozómem IREC, který se skládá ze segmentů odvozených od dvou nebo více různých cizích chromozómů a z distálního segmentu přirozeného chromozómového ramene 6BL, nesoucího kromě alel Ms, ki a selekčního markéru ještě markér semene, který umožňuje rozlišit semeno s tímto chromozomem a bez něj;23. Udržovací linie podle nároku 21 nebo 22, ve které uvedený vložený cizorodý chromozóm EC-H, IEC-HC, REC-H nebo IREC-HC obsahuje jako selekční markér alela rht určující normální vzrůst rostlin.24. Udržovací linie podle nároků 21 až 23, ve které uvedený vložený cizorodý chromozóm IEC-HC nebo IREC-HC nese jako selekční markér semene Ba alelu pro modrou aleuronovou barvu semene.φφφφ φφ φφ φ φφφφ • •φφφφφφφ φ φ · · φ φφ φφφφφφ φφφφφφ'φφ •ΦΦΦΦΦΦΦ «φ φ* φφ φφ-7225. Udržovací linie podle nároku 23 nebo 24, ve které je uvedený vložený cizorodý chromozóm vybrán ze skupiny tvořené: (i) chromozómem REC-H1, který nese alely Ms-Sl, rht-S 1 a ki-S11-a, a (ii) jedním z chromozómů IREC-HC, které nesou alely Ms-S1, rht-S 1, Ba-El- a ki-S1-a nebo Ms-Sl, rhl-Sl, Ba-El a ki-S 1-a nebo Ms-Aml, rhí-Aml, Ba-Kml a ki-S 1-a.26. Udržovací linie vybraná z pylově fertilní udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdě pro údržbu pylově sterilní ženské rodičovské linie pro užití v produkci hybridní pšenice, přičemž uvedená udržovací linie je genově shodná se samičí rodičovskou rostlinou a homozygotní jak v libovolné z alel ms-Bl pro pylovou sterilitu, tak v alele su-Bl pro citlivost k herbicidu chlorotoluronu tak i v alele genu pro sterilitu pylu Ki-Bl samičí rodičovské rostliny, a dále má vložený dodatečný cizorodý chromozóm vybraný ze skupiny tvořené chromozómy typu EC-HR, které se skládají ze segmentů odvozených od dvou nebo více různých cizích chromozómů, a který nese nesoucí dominantní alelu pylová fertility Ms, recesivní alelu ki, která nese citlivost ke sterilizační aktivitě přirozené alely genu pro sterilitu pylu na chromozómu 6BL a dva selekční markéry: alelu rht určující normální vzrůst rostlin a alelu Su určující rezistenci vůči chlorotoluronu, pomocí kterého lze selektovat rostliny s tímto chromozómem.27. Udržovací linie podle nároku 26, ve které uvedený vložený cizorodý chromozóm typu EC-HRL nese jako selekční markéry alely rht-S 1 a Su-S 1.28. Udržovací linie vybraná z pylově fertilní udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé pro údržbu pylově sterilní ženské rodičovské linie pro užití v produkci hybridní pšenice, přičemž uvedená udržovací linie je genově shodná se samičí rodičovskou rostlinou, tj. je homozygotní v libovolné z alel ms-Bl, aleje monosomická jak v chromozómu 6B nesoucím alely su-Bl a Ki-Bl, tak i ve vloženém rekombinantním chromozómu vybraném ze skupiny tvořené chromozómy typu REC-HR, které se skládají ze segmentů odvozených od dvou nebo více různých cizích chromozómů a z distálního segmentu přirozeného chromozómového ramene 6BL, které nese alely Ms, ki a selekční markéry, které umožňují rozlišit semeno s chromozómem REC-HR a bez něj.29. Udržovací linie podle nároku 28, ve které je uvedený vložený chromozóm typu RECHR1 a nese jako selekční markéry alelu rht-S 1, která určuje normální vzrůst rostlin a alelu Su-Sl, která uděluje rostlinám rezistenci k chlorotoluronu.• « • · • · *·-73·· • · 4 • * I • · · « · 1 • 4 • · · ·30. Způsob údržby stálého poměru mezi pylově fertilními a pylově sterilními rostlinami ve všech generacích udržovací linie nebo rekombinantní udržovací linie pšenice obecné a tvrdé, vyznačující se tím , žezahrnuje;a) samosprášení pylově fertilní udržovací linie obsahující vložený cizorodý chromozóm vybraný ze skupiny tvořené vloženým cizorodým chromozómem EC-H a vloženým rekombinantním chromozómem REC-H, který kromě alel Ms a ki nese alespoň jednu alelu pro selekční markér který usnadňuje selekci semen pylově fertilního, samosprášením vzniklého potomstva, přičemž uvedená udržovací linie vzniká pěstováním uvedených semen;b) sbírání semen podle bodu (a) a jejich pěstování za vzniku rostlin, ze kterých 20 % (to se týká potomstva udržovací linie s vloženým cizorodým chromozómem EC-H) a 50 % (to se týká potomstva udržovací linie s vloženým rekombinantním chromozómem RECH) obsahuje uvedený vložený chromozóm, a jsou identická s uvedenou udržovací linií a nesou tudíž alelu se selekčním markérem, která umožňuje rozlišit semeno s vloženým chromozómem a bez nějc) sklízení rostlin vykazujících projevy selekčního markéru podle bodu (b), a ze kterých jsou všechny pylově fertilní, a získávání semen další generace, které z 20 % (to se týká potomstva udržovací linie s vloženým cizorodým chromozómem EC-H) nebo z 50 % (to se týká potomstva udržovací linie s vloženým rekombinantním chromozómem RECH) nese uvedený vložený chromozóm, čímž se udržuje stálý poměr pylově fertilních a pylově sterilních rostlin v jednotlivých generacích udržovací linie nebo rekombinantní udržovací linie.31. Způsob podle nároku 30vyznačující se tím , že selekčním markérem je alela rht, která podporuje růst rostlin do výšky, čímž usnadňuje selektivní sklizeň semen pylově fertilní udržovací linie, uvedená semena, přičemž uvedená udržovací linie vzniká pěstováním uvedených semen.32. Způsob udržování stálého poměru mezi pylově fertilními a pylově sterilními rostlinami v jednotlivých generacích udržovací linie nebo rekombinantní udržovací linie pšenice obecné a tvrdé, vyznačující se tím , že zahrnuje:a) samosprášení pylově fertilní udržovací linie obsahující vložený chromozóm vybraný ze skupiny tvořené: vloženým chromozómem typu EC-HR a vloženým rekombinantním chromozómem typu REC-HR, který kromě na alel Ms-K 1 a ki-Sl1-a, nese jako selekční markér alelu rezistence k herbicidu, která z pylově fertilního, samosprášením udržovací ··♦·-74I · ti · · · ti • · ti · · ti • · ti» · · linie vzniklého potomstva, usnadňuje výběr rostlin majících stejný genotyp jako uvedená udržovací linie;b) sbírání semen další generace podle bodu (a), klíčení uvedených semen a jejich pěstování do stádia sazenic, ze kterých 20 % (týká se EC-HR) a 50 % (týká se RECHR) obsahuje uvedený vložený cizorodý chromozóm, a postřikování sazenic herbicidem tak, aby byly eliminovány všechny citlivé sazenice, tj. ty, které nenesou vložený cizorodý chromozóm; ac) sklízení rostlin odolných k herbicidům (b), které vesměs nesou uvedený vložený cizorodý chromozóm a jsou tudíž pylově fertilní, a získávání semen další generace které z 20 % (to se týká potomstva s vloženým chromozómem EC-H) nebo z 50 % (to se týká potomstva s vloženým chromozómem REC-H) nese uvedený vložený chromozóm, čímž se udržuje stálý poměr pylově fertilních a pylově sterilních rostlin v jednotlivých generacích udržovací linie nebo rekombinantní udržovací linie.33. Způsob podle nároku 32 vyznačující se tím , že alelou rezistence k selekčnímu herbicidu je alela Su-S5!, která nese rezistenci vůči chlorotoluronu.34. Způsob pěstování pouze pylově fertilních udržovacích rostlin v jednotlivých generacích vylepšené udržovací linie nebo vylepšené rekombinantní udržovací linie pšenice obecné a tvrdé, vyznačující se tím , že obsahuje:a) samósprášení pylově fertilní udržovací linie obsahující vložený chromozóm vybraný ze skupiny tvořené: vylepšeným vloženým chromozómem typu IEC-HC a vloženým vylepšeným rekombinantním chromozómem typu IREC-HC, který kromě na alel MsS5! a ki-S1J-a, nese jako selekční markér alelu rezistence k herbicidu, která z pylově fertilního, samosprášením udržovací linie vzniklého potomstva, usnadňuje výběr rostlin majících stejný genotyp jako uvedená udržovací linie;b) sbírání semen další generace podle bodu (a) a oddělení semen které vykazují uvedený markér od semen, které jej nevykazují pomocí třídicího zařízeni,c) pěstování semen vykazujících markér semene podle bodu (b), ze kterých se vesměs vyvinou pylově fertilní rostliny vylepšené udržovací linie nebo rostliny vylepšené rekombinantní udržovací linie.35. Způsob podle nároku 34 vyznačující se tím , že markérem semene je alela Ba, která určuje modrou barvu semene.-75• * » · » · · 4 - · ♦ • · 4 4 « 4 · · · • * «· ·«····«» 44 ♦ 4 4·36. Způsob produkce pylově fertilní udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé s vloženým cizorodým chromozómem typu EC-H1 vyznačující se tím , že zahrnuje:a) křížení pylově fertilní samičí rodičovské rostliny odvozené od pšenice obecné kultivaru Chinese Spring, přičemž je uvedená samičí rodičovská rostlina homozygotní jak v dominantní alele pylové fertility Ms-Bl na chromozómovém rameni 4BS, tak i v dominantní alele nesoucí gen pro sterilitu pylu Ki-Bl na chromozómu 6BL, přičemž má tato rostlina dodatečný cizorodý chromozóm 6S1, na jehož dlouhém rameni se nachází recesivní alela genu pro sterilitu pylu ki-tf 1-a, se samčí rodičovskou rostlinou, která je vzhledem k samičí rodičovské rostlině genově shodná a homozygotní v recesivní alele pylové sterility ms-Bl-c, a která má místo chromozómu 6S1 dodatečný cizí chromozóm 4S5, na jehož krátkém rameni se nacházejí dominantní alely Ms-K 1 a rht-K P,b) sbírání semene vzniklého křížením podle bodu (a) a pěstování uvedených semen za vzniku pylově fertilních Fj rostlin, z nichž některé nesou dvojitý monosomický přídavek, tj. mají dva cizí chromozómy a to chromozóm 4S'S nesoucí alely Ms-Kl a rht-Kl a chromozóm 6S1 nesoucí alelu ki-Sll-a,c) samosprášení uvedeného Fi potomstva podle bodu (b), sbírání velkého množství semen těchto rostlin a jejich pěstování za vzniku F2 rostlin, z nichž některé jsou monosomické vzhledem k vloženému cizorodému chromozómu EC-H1, z nichž 25 % tvoří požadované rostliny, které jsou homozygotní v alele ms-Bl-c pro pylovou sterilitu;d) selekci uvedených požadovaných rostlin (c) pomocí počítání chromozómů, Cproužkování a použití DNA markérů a jejich samosprášení;e) sbírání semen vzniklých samosprášením podle bodu (d) a pěstování uvedených semen, za vzniku F3 rostlin, které jsou vesměs homozygotní v alele ms-Bl-o, pro pylovou sterilitu, a 25 % z nich je pylově fertilních požadovaných rostlin udržovací linie, protože mají uvedený dodatečný vložený cizorodý chromozóm EC-HE1; af) selekci požadovaných rostlin udržovací linie podle bodu (e) pomocí metod počítání chromozómů a použití DNA markérů.37. Způsob produkce pylově fertilní udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé s vloženým rekombinantním chromozómem typu REC-H1 vyznačující se tím , že zahrnuje:a) křížení pylově fertilní samičí rodičovské rostliny odvozené od pšenice obecné kultivaru Chinese Spring, přičemž je uvedená samičí rodičovská rostlina homozygotní jak v dominantní alele pylové fertility Ms-Bl na chromozómovém rameni 4BS, tak i v dominantní alele supresoru homologního párování Phl na chromozómovém rameni-76·· · · · · ·· ·· » · · » · • · · · · « » · · · • · · · · ········ *♦ · · ·· ·« » · · » · · • · · ·« • · ·«
- 5BL, nulisomická v chromozómu 6B, díky čemuž je deficitní v dominantní alele Ki-B 1 pro pylovou sterilitu, a dále má tato rostlina pár dodatečných cizorodých chromozómů 6S1, na jehož dlouhém rameni se nachází recesivní alela genu pro sterilitu pylu ki-S'1-a, se samčí rodičovskou rostlinou, která je vzhledem k samičí rodičovské rostlině genově shodná, ale je disomická v chromozómu 6B a tudíž homozygotní v alele Ki-Bl, postrádá chromozóm 6S a je rovněž homozygotní v mutantní alele pro homologní párování phlb,b) sbírání semene vzniklého křížením podle bodu (a) a pěstování uvedených semen za vzniku pylově fertilních Fi rostlin (Ms-BÍMs-Bl), které jsou heterozygotní v alelách pro homologní párování (Phlphlb) a vesměs monosomické jak pro chromozóm 6B tak i 6S1c) zpětné kříženi uvedených Fi rostlin podle bodu (b) se samčí rodičovskou rostlinoud) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (c) a pěstování uvedených semen, za vzniku BCi rostlin, které jsou vesměs pylově fertilní (Ms-BÍMs-Bl), přičemž z nich je 50 % homozygotních v alele phlb a z nich je 50 % dvojitě monosomických vzhledem k chromozómům 6B a 6S1, což jsou požadované rostliny BC\;e) selekci požadovaných rostlin BCi podle bodu (d) pomocí DNA markérů a sledování párování chromozómů v průběhu meiozy, opylení těchto rostlin ditelosomickou 6BS linií, která je genově shodná s BCt rostlinami, aleje homozygotní v PhlPhlf) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (e) a pěstování uvedených semen, za vzniku rostlin, které jsou vesměs monotelosomické v chromozómovém rameni 6BS a některé z nich jsou požadované rostliny, které jsou monosomické vzhledem k rekombinantnímu chromozómu sestávajícímu z krátkého ramene a proximální oblasti dlouhého ramene chromozómu 6S1 (které nese kl's/7-a) a distální oblasti chromozómového ramene 6BL, přičemž bod rekombinace je distální k alele ki-S1!-a,g) selekci požadovaných rostlin podle bodu (f) pomocí C-proužkování, použití DNA markérů a analýzy párování chromozómů a jejich křížení jako samčích rostlin se samičí linií, což je nerekombinantní udržovací linie, tj. linie homozygotní jak v libovolné z recesivních alel pylové sterility ms-Bl tak i v dominantní alele genu pro sterilitu pylu Ki-Bl a mající vložený cizorodý chromozóm EC-H1;h) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (g) a pěstování uvedených semen, za vzniku Fi rostlin, z nichž některé jsou požadované rostliny, které jsou trojitě monosomické a to v chromozómu 6B, ve vloženém cizorodém chromozómu EC-H1 a v-77• * · ·4 · 4 « * · • · 4 · • ♦ · · ·4 4 * *4······» ·· • 4 99
- 9 9 9 9 9 • · 4 4 444 444 4444 4 « 444 44 4444 4444 rekombinantním chromozómu (6S‘/6BL), a které jsou heterozygotní v aiele Ms-BÍMsBl, hemizygotní v alele Ki-Bl a homozygotní v alele ki-tf l-aki-Sl 1-ai) selekci uvedených požadovaných rostlin podle bodu (h) pomocí počítání chromozómů, C-proužkování a použití DNA markérů a jejich samosprášení, sebrání jejich semen a vypěstování rostlin z těchto semen, z nichž vzniknou rostliny F2 generace, z nichž některé jsou požadované rostliny, které dvojitě monosomické, v chromozómu 6B a vloženém rekombinantním chromozómu REC-H1, nesou alely Ms-Sl, rhi-Sl a ki-S1 Ια.38) Způsob přípravy pylově fertilní udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé mající vložený cizorodý chromozóm typu EC-HR 1, vyznačující se tím , že zahrnuje;a) křížení pylově fertilní samičí rodičovské rostliny odvozené od pylově fertilní udržovací linie pšenice obecné cv. Chinese Spring, přičemž je uvedená samičí rodičovská rostlina homozygotní pro reeesivní v alele ms-Bl pro pylovou sterilitu, reeesivní v alele su-Bl pro citlivost k chlorotoluronu a v dominantní alele Ki-Bl nesoucí gen pro sterilitu pylu, a která má ve formě monosomického přídavku vložený cizorodý chromozóm EC-H1, který na svém krátkém rameni nese dominantní alelu Ms-SSl pro pylovou fertilitu a semi-dominantní alela rht-S 1 a na svém dlouhém rameni reeesivní alelu su-Sl 1 pro citlivost k chlorotoluronu a reeesivní alelu ki-S 1-a pro sterilitu pylu, s linií diploidního speciesxxdruhu Aegilops searsii, která obsahuje dominantní alelu genu pro rezistenci k chlorotoluronu Su-Sl na chromozómu 6S'L i alely Ms-S1 a rhí-Sl na chromozómu 4S*S;b) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (g) a pěstování uvedených semen, za vzniku Fj rostlin, z nichž některé mají 2n=29 chromozóm, tj. mají jednu sadu chromozómů z kultivaru Chinese Spring, vložený cizorodý chromozóm EC-H1 a sadu chromozómů z Aegilops searsii, přičemž mají genotyp tns-BlMs-SlMs-S 1, ki-BlkiS 1-a su-Blsu-S ISu-S 1,c) selekci uvedených rostlin F, generace podle bodu (b) s 2n=29 chromozómy a použití jejich pylu ke zpětnému křížení s rostlinami cv. Chinese Spring, sbírání semene vzniklého tímto křížením a pěstování rostlin z tohoto semene, za vzniku BCi rostlin,, z nichž některé, které jsou odolné vůči chlorotoluronu, jsou požadované rostliny, které jsou monosomické ve vloženém cizorodém chromozómu EC-HR 1, jsou vesměs heterozygotní v alele ms-BÍMs-Bl a homozygotní v alele su-Bl a Ki-Bl·,d) selekci uvedených požadovaných rostlin podle bodu (c) pomocí počítání chromozómů použití - DNA markérů poté jejich samosprášení;-78φφ φφφφΦ φ φ φ φφφφ φφφφ φφ φφ φ φ φ φ • φ φ · φφφ φφφ φ φ φ · φ φe) sbírání samosprášením vzniklého semene podle bodu (d) a pěstování uvedených semen, za vzniku BCiF2 rostlin, ze kterých je 20 % odolných vůči chlorotoluronu, tj. nesou vložený cizorodý chromozóm, 25 % z těchto odolných rostlin jsou rostliny požadované udržovací linie, které jsou-homozygotní v alele ms-Bl, ale jsou pylově fertilních protože nesou alelu Ms-K 1 z vloženého cizorodého chromozómu EC-HR1,f) selekci rostlin požadované udržovací linie podle bodu (e) na základě jejich chlorotoluronové rezistence a použití DNA markérů.39. Způsob přípravy pylově fertilní rekombinantní udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé s vloženým rekombinantním chromozómem typu REC-HR1, vyznačující se tím , žezahrnuje:(a) křížení pylově fertilní samičí rodičovské rostlina odvozené od pylově fertilní rekombinantní udržovací linie obecné pšenice kultivaru Chinese Spring, která je monosomická v chromozómech 6B a REC-H1, přičemž uvedená samičí rodičovská rostlina je homozygotní v recesivni alele ms-Bl pro pylovou sterilitu a hemizygotní v recesivni alele su-Bl pro citlivost k chlorotoluronu a v dominantní alele Ki-Bl nesoucí gen pro sterilitu pylu, a má monosomickou substituci tvořenou vloženým cizorodým chromozómem REC-H1, který na svém krátkém rameni nese dominantní alelu pro pylovou fertilita Ms-Kl a semidominantní alelu rhl-K 1 a svém dlouhém rameni recesivni alelu su-Sl 1 pro citlivost k chlorotoluronu a recesivni alelu ki-S11-a, genu pro sterilitu pylu, s linií diploidního speciesxxdruhu Aegilops searsii, která má dominantní alelu Su-SS pro rezistenci k chlorotoluronu jakož i alely Ms-Kl arhi-Kl, (b) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (a) a pěstování uvedeného semene, za vzniku Fi rostlin, ze kterých 50 % obsahuje rekombinantní vložený chromozóm, který se páruje s chromozómu 4SsS a 6SsS, takže při meióze dochází ke vzniku trivalentní formy s genotypem ms-BlMs-SalMs-Kl, ki-Sll-a su-S11 a Su-KL·, (c) selekci uvedeného Fj potomstva podle bodu (b) a použití jeho pylu ke zpětnému křížení s rostlinami cv. Chinese Spring;(d) sbírání semen vzniklých tímto zpětným a jeho pěstování za vzniku BCi rostlin, které jsou vesměs heterozygotní v alele ms-Bl Ms-Bl a proto tedy pylově fertilní, a některé z nich jsou požadované rostliny, které jsou monosomické v alele 6B a proto tedy hemizygotní v alelách su-Bl a Ki-Bl a mají jako monosomickou • * · · · ·-79··· ··· substituci vložený rekombinantní chromozóm REC-HR1, který nese alely Ms-Kl a rht-SKS na krátkém rameni a alely Su-S? 1 a ki-S‘1-a na dlouhém rameni;(e) selekci uvedených požadovaných rostlin podle bodu (c) na základě jejich rezistence vůči chlorotoluronu a analýzou párování chromozómů v meioze a jejich samosprášení;(f) sbírání samosprášením vzniklých semen podle bodu (d) a pěstování uvedených semen za vzniku BCiF2 rostlin, ze kterých je 50 % monosomickýeh v chromozómu 6B a monosomickýeh v rekombinantním chromozómu REC-HR1, který se skládá z krátkého ramene 4SS (nese alely Ms-S? 1 a rht-K/), proximální oblasti dlouhého ramene chromozómu 6S1 (nese alely Su-Kl a ki-tfl-a) a distální oblasti chromozómového ramene 6BL (bod rekombinace je distální vzhledem k alele kitfl-a), přičemž 25 % těchto rostlin jsou rostliny existence požadované udržovací linie, které jsou homozygotní v alele ms-Bl a hemizygotní v alelách su-Bl a Ki-Bl ; a (g) selekci rostlin požadované udržovací linie podle bodu (e) na základě jejich rezistence k chlorotoluronu a použití markérů DNA.40. Způsob přípravy pylově fertilní vylepšené udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé nesoucí vylepšený vložený cizorodý chromozóm IEC-HC 1, vyznačující se tím , že zahrnuje:a) křížení pylově fertilní samičí rodičovské rostliny odvozené od obecné pšenice kultivaru Chinese Spring, přičemž uvedená samičí rodičovská rostlina je udržovací linie, tzn. je homozygotní jak v recesivní alele ms-Bl pro pylovou sterilitu na chromozómovém rameni 4BS, tak v dominantní alele Ki-Bl pro sterilitu pylu na chromozómu 6BL, a nese dodatečný vložený cizorodý chromozóm typu EC-H1, který má na svém krátkém rameni dominantní alely Ms-K 1 a rht-K 1 a na svém dlouhém rameni recesivní alely kiS1Ί-a, se samčí rodičovskou rostlinou, která je genově shodná se samičí rodičovskou rostlinou, aleje homozygotní v dominantní alele pylové fertilitaMs-B 1 a má dodatečný pár cizích chromozómů 4E, které na svém dlouhém rameni nesou dominantní alely BaEl xx pro xx aleuronovou modř;b) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (a), které jsou vesměs jsou modrá, jejich ozáření termálními neutrony a pěstování uvedených semen za vzniku pylově fertilních Fi rostlin, které jsou vesměs heterozygotní v alele MsBlms-Bl a homozygotní v alele Ki-Bl, ze kterých je 20 % požadovaných rostlin s dvojitě monosomickým vloženým cizorodým chromozómem EC-H1 a chromozómem 4E;-80• ·* · ···· · · · ·♦ ·· • · ♦ · ♦ • · · · • · ··* ··· • · ·c) selekci uvedených požadovaných Fi rostlin podle budou (b) pomocí počítání chromozómů a za použití DNA markérů a jejich samosprášení;d) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (c), selekce modrých semen a jejich pěstování za vzniku F2 rostlin, ze kterých některé mají 43 chromozómů, a některé z nich jsou požadované rostliny, které mají vylepšený vložený cizorodý chromozóm IECHC1 obsahující 4SsS/4EL/6S’L a nesoucí alely Ms-K 1, rht-K1, Ba-El a ki-Sll, zatímco některé z ostatních rostlin obsahují translokovaný chromozóm 4S'S/4EL;e) selekci požadovaných rostlin podle bodu (d) pomocí počítání chromozómů a použití DNA markérů a jejich samosprášení;f) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu {e) a vybrání modrých semen, ze kterých se vyvinou rostliny požadované vylepšené udržovací linie, které jsou pylově fertilní a nesou vylepšený vložený cizorodý chromozóm IEC-HC1,;g) jestliže v kroku (d) nebyla získána žádná požadovaná rostlina, pak se přistoupí k selekci rostlin podle bodu (d), které mají translokovaný chromozóm 4S'S/4EL (a které pocházejí z modrých semen a jsou pylově fertilní) pomocí počítání chromozómů a použití DNA markérů a použití jejich pylu ke zpětnému křížení s udržovací linií s chromozómem EC-H1 za vzniku Fi semen;h) selekci modrých semen z uvedených Fj semen podle bodu (g), jejich ozáření pomocí termálních neutronů, jejich naklíčení a selekci sazenie se 44 chromozómy, tzn. sazenic, které mají dvě cizí chromozómy 4SÁS/4EL a EC-H1 (4SÍS/6S1L); ai) opakování kroků (d) až (f) za vzniku požadovaných rostlin vylepšené udržovací linie, které mají vylepšený vložený chromozóm IEC-HC1 obsahující 4SsS/4EL/6S'L a nesoucí alely Ms-Kl, rht-K7, Ba-El a ki-SJI.41. Způsob přípravy pylově fertilní vylepšené udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé s vylepšeným vloženým cizorodým chromozómem IEC-HC1, vyznačující se tím , že zahrnuje:a) křížení pylově fertilní samičí rodičovské rostliny odvozené od obecné pšenice kultivaru Chinese Spring, přičemž uvedená samičí rodičovská rostlina je homozygotní jak v dominantní alela Ms-Bl pro pylovou fertilitu tak i v dominantní alele Ki-Bl pro sterilitu pylu a má dodatečný pár cizorodých chromozómů 4E, které nesou na svém dlouhém rameni dominantní alelu Ba-El pro aleuronovou modř, se samčí rodičovskou rostlinou, která je genově shodná se samičí rodičovskou rostlinou, ale je homozygotní-81• ti titi ·· ti··· • ti ti ti ti ti ti • · ti ti · • · ti ti ti ti • ti ti ti ti ti • tititititititi titi titi • ti titi • ti ti • ti ti • titi titi ti • ti • ti titi v recesivní alele ms-Bl-c pro pylová sterilitu a má dodatečný cizorodý chromozóm 4S'\ který na svém krátkém rameni nese dominantní alely Ms-K1 a rht-K1;b) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (a) a pěstování uvedených semen za vzniku Fj rostlin, které jsou vesměs heterozygotní v alele Ms-Bl ms-Bl a homozygotní v alele Ki-BIKi-Bl, ze kterých je 25 % požadovaných rostlin, které jsou dvojitě monosomické v přidaných chromozómech 4E a 4S5;c) selekci uvedené požadované Fi rostliny podle bodu (b) pomocí počítání chromozómů a DNA markérů a jejich samósprášení;d) selekci modrých semen ze semen vzniklých samosprášením podle bodu (c) a pěstování uvedených semen za vzniku F2 rostlin, z nichž některé jsou požadované rostliny, které mají translokovaný chromozóm 4SÓS/4EL a;e) selekci uvedených požadované F2 rostlin (d) pomocí počítání chromozómů a DNA markérů a použití jejich pylu ke křížení s udržovací linií s chromozomem EC-H1 (4SAS/6S’L) a získání Fi semen, z nichž některá jsou modrá;í) selekci modrých semen podle bodu (e), jejich ozáření termálními neutrony a pěstování do Fi rostlin, které jsou vesměs jsou homozygotní a to jak alele ms-Bl-c tak i v alele Ki-Bl, a některé z nich mají dokonce dvojité monosomické přidání 4SsS/4EL a EC-H1 (dS^/áSÍ), což jsou požadované rostliny;g) selekci uvedených požadovaných rostlin podle bodu (f) pomocí počítání chromozómů a DNA markérů a jejich samósprášení;h) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (g), selekci modrých semen a jejich vypěstování do F2 rostlin, které jsou vesměs jsou homozygotní jak v alele /w.s-BI-c tak i v alele Ki-Bl, z nichž některé mají 43 chromozómů, a z nich některé jsou požadované rostliny, které mají vylepšený vložený chromozóm IEC-HC 1 obsahující 4SsS/4EL/6S1L nesoucí alely Ms-K 1, rht-K 1, Ba-EI a ki-S1 1;i) selekci požadovaných rostlin podle bodu (h) pomocí počítání chromozómů, Cproužkování a na základě pylové fertility a jejich samósprášení; aj) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (i) a selekci modrých semen, ze kterých se nechají vypěstovat pylově fertilní rostlin nesoucí chromozóm IEC-HC 1 přičemž takové rostliny jsou rostliny požadované vylepšené udržovací linie.4 4 444444 44 j 4 4 4 4 ·· 4 444·4 4 444 44444 4444 44444 4444 4 4444 4 4-82- ................42. Způsob přípravy pylově fertilní vylepšené udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé s vylepšeným vloženým cizorodým chromozómem IEC-HC2 vyznačující se tím že zahrnuje:a) křížení samčí rodičovské linie obecné pšenice cv. Chinese Spring s disomickou substitucí, ve které chromozóm 4Am T. monococcum nahrazuje chromozóm 4B obecné pšenice a proto tedy uvedená samčí rodičovská rostlina nemá alelu pylové fertility Ms-Bl, je homozygotní v alele nesoucí gen pro sterilitu pylu Ki-Bl a Ms-Aml a rht-K na chromozómu 4AmS a v alelách Ba-AP 1 na rameni 4AmL, se samičí rodičovskou rostlinou, která je genově shodná se samčí rodičovskou rostlinou, ale je homozygotní v recesivní alele ms-Bl pro pylovou sterilitu a má dodatečný cizorodý chromozóm 4S'\ na jehož krátkém rameni se nacházejí dominantní alely Ms-S* 1 a rhtS1!;b) sbírám semen vzniklých křížením podle bodu (a) které jsou vesměs modrá a pěstování uvedených semen za vzniku Fi rostlin, které jsou vesměs hemizygotní v alele ms-Bl-c a homozygotní v alele Ki-Bl a z nichž některé jsou požadované rostliny, které jsou trojitě monosomické v chromozómech 4B, 4SS a 4Am;c) selekci uvedených trojitě monosomiekých rostlin podle bodu (b) pomocí počítáni chromozómů, a samo-opylení těchto pylově fertilních Fi rostlin;d) sbírání F2 semen podle bodu (c), selekci modrých semen a pěstování uvedených vybraných semen za vzniku F2 rostlin a další výběr těch F2 rostlin, které mají 44 chromozómů (s uspořádáním 21+2' v meióze), což jsou požadované rostliny s dvojitým monosomickým přidáním 4S's a 4Am;e) samosprášení uvedených požadovaných rostlin podle bodu (d) za vzniku F3 semen a selekci modrých;f) pěstováni modrých semen podle bodu (e) a selekci rostlin majících 43 chromozómů (21+1); tyto rostliny jsou požadované pylově fertilní rostliny, tvoří modrá semena a mají translokovaný chromozóm 4S5S/4AmL;g) použití pylu požadovaných rostlin podle bodu (f) jako ke křížení s udržovací linií, kterou tvoří rostliny homozygotní v alelách ms-Blm&^Ki-BlKiBl a mající chromozóm EC-H1 (4S'VS/6S1L) nesoucí alely Ms-ΚΊ rhí-KlKi-£>1-a získávání F3 semena;h) selekci modrých semen ze semen Fj vzniklých křížením podle bodu (f), jejich ozáření termálními neutrony a jejich pěstování, a další selekci rostlin majících 44 chromozómů-83• · ··· · ··· • · • · • * * · · «* · · ·· »♦ 9999 999 9 9 99 9 9 99 99 9 999 • · «· ·· (21+1), tj. těch, které jsou disomické v krátkém rameni a dvojitě monosomické v dlouhém rameni cizorodého přidaného chromozómu, a jejich samosprášení;i) pěstování modrých semen podle bodu (h) a selekci požadovaných, pylově fertilnich rostlin, majících 43 chromozómů a vytvářejících modrá a červeno-bílá semena, a která mají chromozóm IEC-HC2;j) samosprášení požadovaných rostlin podle bodu (i), sběr vzniklých semen a výběr modrých semen, ze kterých lze vypěstovat rostliny požadované vylepšené udržovací linie, které jsou pylově fertilní rostliny a mají chromozóm IEC-HC2.43. Způsob přípravy pylově fertilnich rostlin vylepšené udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé s vloženým vylepšeným chromozómem IEC-HC3 vyznačující se tím , že zahrnuje:a) křížení samčí rodičovské rostliny z linie obecné pšenice cv. Chinese Spring s disomickou substitucí, ve které je chromozóm 4B obecné pšenice nahrazen chromozómem 4Am T.monococcum a proto uvedená samčí rodičovská rostlina neobsahuje alelu pro pylovou fertilitu Ms-Bl, je homozygotní v alele pro sterilitu pylu Ki-Bl a v alelách Ms-Aml a rht-Knl na chromozómech 4AmS a v alele Βα-ΜΊ na 4AmL, se samičí rodičovskou rostlinou, která je se samčí rodičovskou rostlinou genově shodná, ale je homozygotní v recesivní alele ms-Bl pro pylovou sterilitu a má dodatečný cizí chromozóm 4S', který nese na svém krátké rameni dominantní alely Ms-Kl a rht-Kl;b) sbírání Fi semen vzniklých křížením podle bodu (a), která jsou vesměs jsou modrá a pěstování uvedených semen, která jsou vesměs hemizygotní v alelách ms-Bl-z a homozygotní v alelách Ki-Bl, a ze kterých je 75 % monosomických v chromozómu 4B a mají monosomickou substituci 4Am na němž se nachází alela Ms-Aml a jsou proto pylově fertilní, a použití uvedeného pylu s monosomicko-monosomickou substituci k opylení samičí rodičovské rostliny heterozygotní v alelách Ms-Bl ms-Bl a homozygotní v alele Ki-Bl a nesoucí chromozóm 6S1 jako monosomické přidání, přičemž uvedená samičí rodičovská rostlina je získaná křížením pylu rostliny cv. Chinese Spring s monosomickým přidáním 4S' ms-Bl-z ms-Bl-z se samičí rodičovskou rostlinou homozygotní v alelách Mš-Bl a Ki-Bl a nesoucí chromozóm 6SI jako monosomické přidání, přičemž se získá 20% požadovaného potomstva;c) sběr modrých Fi semen vzniklých křížením podle bodu (b) a jejich ozáření termálními neutrony, jejich pěstování a selekci takových Fj rostlin, které mají 43 (21+Γ) a 42 (20+2') chromozómů a samosprášení těchto rostlin;4* 444444 444 44 4 4 4 4 4 44 44 4 444 44444 444 4 44 4444444 4 4444 4 44444 4444 44 44 44 44-84d) selekci modrých semen vzniklých samosprášením podle bodu (c) a jejich pěstování a selekci pylově fertilních rostlin, které mají přibližně 20 % neživotaschopného pylu a tvoří modrá a červeno/bílá semena; ae) pěstování semena podle bodu (d) a oddělení modrých semen, z nichž lze vypěstovat požadované rostliny vylepšené udržovací linie, které jsou pylově fertilni a mají chromozóm 1EC-HC3 (mají 43 chromozómů).44. Způsob přípravy pylově fertilni vylepšené udržovací linie pšenice obecné nebo tvrdé s vylepšeným vloženým rekombinantním chromozómem IREC-HC vyznačující se tím , že zahrnuje:a) křížení pylově fertilni samičí rodičovské rostliny odvozené od obecné pšenice kultivaru Chinese spring, přičemž je uvedená samičí rodičovská rostlina homozygotní v dominantní alele Ms-Bl pro pylovou fertilitu na chromozómovém rameni 4BS a v dominantní alele Phl suprimující homologní párování na chromozómovém rameni 5BL, nulisomická pro chromozóm 6B a tudíž postrádající dominantní alelu Ki-Bl pro sterilitu pylu, a má pár 6S1 chromozómů nesoucích recesivní alelu ki-tfl-a pro sterilitu pylu, se samčí rodičovskou rostlinou, která je genově shodná se samičí rodičovskou rostlinou aleje disomická v chromozómu 6B a tudíž homozygotní v alele Ki-Bl, nemá chromozóm 6S1, a je také homozygotní v mutantní alele phlb pro homologní párování;b) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (a) a pěstování uvedeného semene, za vzniku pylově fertilních (Ms-Bl Ms-Bl) Fi rostlin heterozygotních v alele Phlphlb pro homologní párování, které jsou vesměs monosomické jak v chromozómu 6B tak v 6S1;c) zpětné křížení uvedených Fi rostlin (b) se samčí rodičovskou rostlinou;d) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (c) a pěstování uvedeného semene, za vzniku BCi rostlin, které jsou vesměs pylově fertilni (Ms-BlMs-B 1), a 1/2 z nich je homozygotní v alele phlb, a z nich je dále přibližně 1/2 (protože chromozóm 6B se páruje s 6S1) požadovaných BCi rostlin, které jsou dvojitě monosomické jak v chromozómu 6B tak v chromozómu 6S1e) selekci požadovaných BCi rostlin podle bodu (d) pomocí párování chromozómů v meióze a pomocí DNA markérů a jejich opylení je ditelosomickou 6BS linií (tj. linií bez 6BL ramen), která je genově shodná se BCi rostlinami, aleje homozygotní v alele PhlPhl·, af) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (e) a pěstování uvedeného semene za vzniku rostlin, které jsou monotelosomické v 6BS, z nichž některé jsou požadované-85»· • · · · • · ···· ·«·· • · · • · · • · » · * 9 9 99 9 99 ·* ····99 999 9 9 99 9 9 9 rostliny, které jsou také monosomické v rekombinantním chromozómu skládajícího se z krátkého ramene a proximální oblasti dlouhého ramene 6S1 (nese alelu ki-S11-a) a z distální oblasti chromozómového ramene 6BL (bod translokace je distální k alele kióíř-a) a jsou -------g) selekci uvedených požadovaných rostlin podle bodu (f) pomocí C-proužkování a pomocí analýzy párování chromozómů a DNA markérů a použití jejich pylu ke křížení se samičí linií, kterou je vylepšená udržovací linie, tj. linie homozygotní jak v libovolné z recesivních alel pro pylovou sterilitu ms-Bl, tak i v dominantní alele Ki-Bl pro sterilitu pylu a má jeden z vylepšených vložených chromozómů typu BEC-HC2 (4SÍS/4EL/6S1L), typu IEC-HC2 (4S'S/4AmL/6SlL) nebo IEC-HC3 (4AmS4AmL/6S1L)h) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (g) a pěstování uvedených semen za vzniku Fi rostlin, z nichž některé jsou požadované rostliny, které jsou trojitě monosomické, tzn. jsou monosomické v chromozómu 6B, v jednom z vylepšených vložených cizorodých chromozómů typu IEC-HC2, IEC-HC2 nebo IEC-HC-3 a v rekombinantním chromozómu 6S’/6BL a jsou heterozygotní v alele ms-BÍMs-Bl a hemizygotní v alele Ki-ΒΓ, ai) selekci uvedených požadovaných rostliny podle bodu (h) pomocí počítání chromozómů, C-proužkování a DNA markérů a jejieh samosprášení, sbírání semen vzniklých tímto samosprášením a pěstování uvedených semen, z nichž jsou některé dvojitě monosomické v chromozómu 6B a ve vylepšeném vloženém rekombinantním chromozómu typu IREC-HC, tzn. mají bud’ IREC-HC 1 (4S''S/4EL/6S1L/6BL), IRECHC2 (4SiS/4AmL/6S1L/6BL) nebo IREC-HC3 (4Ams-4AmL/6SlL/6BL), což jsou rostliny požadované udržovací linie s chromozómem IREC-HC.45. Způsob konverze požadovaného kultivaru pšenice obecné nebo tvrdé na pylově sterilní ženskou rodičovskou linie a pylově fertilní udržovací linii pro uvedenou ženské linii podle nároku 21 v y zna čující se tím , že zahrnuje:a) křížení udržovací linie homozygotní v alelách ms-Blms-Bl Ki-Bl Ki-Bl a mající vložený cizorodý chromozóm EC-H1, který nese alely Ms-^ 1 a ki-S11-a jako samičí rostliny s pylem požadovaného kultivaru homozygotního v alelách Ms-BlMs-BlkiBlki-Bl,00 ·»·-860· 00 0 0 0 00 0 0 0 • 0 00*0 00000 0 00 0·0 0 00 »0 000 0000 00 0 0 0 00 0 0 00*0 0·00 000 00b) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (a) a pěstování uvedených semen za vzniku pylově fertilních Fi rostlin, které jsou vesměs heterozygotní v alelách msBTMS-BÍKi-Blki-Bl-a, a z nichž 20 % tvoří požadované rostliny, které rovněž nesou vložený cizorodý chromozóm typu EC-H1 a —---------c) selekci uvedených požadovaných Fj rostlin podle bodu (b) pomocí počítání chromozómů a DNA markérů a jejich opylení požadovaným kultivarem za vzniku potomstvo BCi, z něhož je 1/16 rostlin požadovaného genotypu, tzn. jsou heterozygotní v alelách Ms-BIms-BlKi-Blki-Bl-a a nesou vložený cizorodý chromozóm EC-H1d) pěstování BCi rostlin podle bodu (c) a selekci rostlin s požadovaným genotypem pomocí počítání chromozómů a užití DNA markérů a jejich další zpětné křížení jako samičích rostlin s požadovaným kultivarem po čtyři následující generace za vzniku potomstva páté generace BC5, přičemž v každé generaci byly pomocí počítání chromozómů a užitím DNA markérů vybírány rostliny heterozygotní v alelách MsBlms-BlKi-Blki-Bl-a a s vloženým cizorodým chromozómem EC-H1; ae) samosprášení požadovaných BC5 rostlin podle bodu (d), sbírání jejich semen a pěstování uvedených semen za vzniku rostoucí BC5F2 rostlin, z nichž 1/20 tvoří pylově sterilní rostliny homozygotní jak v alele ms-Bl pro pylovou sterilitu a v alele Ki-Bl nesoucí gen pro sterilitu pylu což jsou rostliny požadované pylově sterilní samičí linie, a další jsou rostliny požadované pylově fertilní udržovací linie BC5F5 s podobným genotypem, ale mající rovněž vložený chromozóm EC-H1, požadovaná pylově fertilní udržovací linie.46. Způsob podle nároku 45 vyznačující se tím , že rostliny udržovací linie jsou rostliny vylepšené udržovací linie s chromozómem IEC-HC, uvedená samičí linie odpovídá nároku 21a selekce podle bodu (d) na přítomnost IEC-HC v jednotlivých generacích (Fb BC1-BC5, BC5F5) se provádí pomocí modré barvy semene.47. Způsob konverze požadovaného kultivaru pšenice obecné nebo tvrdé na pylově sterilní samičí rodičovskou linii a na pylově fertilní rekombinantní udržovací linii pro uvedenou samičí linii podle nároku 22, vyznačující setím , že zahrnuje:'a) křížení vajíček rostlin udržovací linie s cizorodým vloženým rekombinantním chromozómem REC-H1, přičemž jsou rostliny této linie homozygotní v alele ms-Blms-87·· ·· • « · · • · • · * • · ···· ···· • · · • · · • · · · • · · ·4· ·· •o ···· ·· ··Λ * · ·9 · · 9 ··· ··· • · ·« ··B1 a monosomické jak pro v chromozómu 6B tak i ve vloženém rekombinantním chromozómu REC-H1. ^SČS/óS 1L/6BL) nesoucím alely Ms-Kl a ki-S!l-a, s požadovaným kultivarem, který je homozygotní v alelách Ms-BÍMs-Blki-Blki-Blb) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (a) a pěstování uvedených semen, za vzniku pylově fertilních Fi rostlin, které jsou vesměs heterozygotní v alelách /w.s-77/MSBl, 1/2 z nich je disomická v chromozómu 6B a je tudíž heterozygotní v alelách KiBl ki-B 1-a, a z nich 1/2 je dvojitě monosomická v chromozómu 6B a ve vloženém rekombinantním chromozómu REC-H1 a hemizygotní v alele ki-B 1-a, ale rovněž nese alely Ms-S1 1 a ki-S11-a na vloženém rekombinantním chromozómu;c) selekci uvedených dvou druhů potomstva Fj podle bodu (b) pomocí analýzy párování chromozómů a použití DNA markérů, a jejich opylení rostlinami požadovaného kultivaru za vzniku dvou druhů BCi rostlin, z nichž jedny jsou odvozené od disomickýeh Fi rostlin a 1/4 z nich je heterozygotní v alelách ms-B 1 Ms-Bl Ki-B lki-Β Ια druhé jsou odvozené od dvojitě monosomických Fi rostlin a 1/4 z nich jsou dvojitě monosomické, heterozygotní v alele ms-BÍMs-Bl a hemizygotní v alele ki-Bl-a a nésou rovněž alely Ms-ΚΊ a ki-S11-a na vloženém rekombinantním chromozómu RECHl;d) selekci uvedených požadovaných rostlin obou skupin podle bodu (c) pomocí analýzy párování chromozómů a použitím DNA markérů, a jejich další zpětné křížení jako samičích rostlin s pylem požadovaného kultivaru po čtyři následující generace za vzniku dvou druhů páté generace potomstva BC5i přičemž se provádí selekce v jednotlivých generacích na heterozygotnost v alelách ms-BlMs-BIKi-BlKi-B 1-a u disomického typu a v alelách ms-BÍMs-Bl ve dvojitě monosomickém typu s vloženým rekombinantním chromozómem REC-Hl a to pomocí párování chromozómů a použitím DNA markérůe) opylení požadovaných dvojitě monosomických BC5 rostlin podle bodu (d) požadovanými disomickými BC5 rostlinami podle bodu (d) za vzniku dvou skupin BC5F5 disomickýeh rostlin, z nichž 1/8 je homozygotní v alele ms-Blms-Bl a heterozygotní v alele Ki-Blki-Bl-a což jsou požadované disomické rostliny a další skupina je dvojitě monosomická, z nichž 1/8 tvoří rostliny požadované udržovací linie, které jsou homozygotní v alele ms-Blms-Bl a hemizygotní v alele Ki-Bl a také nesou alely Ms-K 1 a ki-S11-a z vloženého rekombinantního chromozómu REC-Hl a jsou tudíž pylově fertilní a;f) pěstování uvedených dvojitě monosomických BC2F2 semen podle bodu (e) a disomickýeh BC2F2 semen podle bodu (e) a selekci požadované pylově fertilní ·· ·»· ·-88• 4» β · udržovací linie respektive pylově sterilní samičí linie pomocí párování chromozómů a použitím DNA markérů.48. Způsob podle nároku 47 v y z n a č u j i c i se tím , že rostliny udržovací linie jsou rostliny rekombinantní udržovací linie s vylepšeným vloženým rekombinantním chromozómem IREC-HC, uvedená samičí linie odpovídá nároku 24 a selekce podle bodu (d) na přítomnost IREC-HC v jednotlivých generacích (Fb BC1-BC5, BC5F5) se provádí pomocí modré barvy semene.49. Způsob konverze požadovaného kultivaru pšenice obecné nebo tvrdé na pylově sterilní samičí rodičovskou linii a na pylově fertilní rekombinantní udržovací linii pro uvedenou samičí linii podle nároku 26, v y z n a č u j i c i se tím , že zahrnuje:(a) křížení rostlin udržovací linie homozygotní v alelách ms-Blms-Blsu-Blsuti lKi-Bl Ki-Bl a s vloženým cizorodým chromozómem EC-HR1, nesoucím alely Ms-Kl, rht-ΚΊ, Su-K 1 a ki-Sll-a s požadovaným kultivarem, který je homozygotní v alelách Ms-BlMs-BlSu-BlSu-Blki-Blki-ΒΓ, (b) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (a) a pěstování uvedených semen za vzniku pylově fertilních Fi rostlin, které jsou vesměs z nichž heterozygotní v alelách ms-Bl Ms-Bl Su-Blsu-BlKi-Blki-Bl, 20% z nich jsou požadované rostliny, které rovněž nesou vložený cizorodý chromozóm; a (c) selekci uvedených požadovaných Fj rostlin podle bodu (b) počítáním chromozómů a použitím DNA markérů a jejich opylení je požadovaným kultivarem za vzniku BCi potomstva, z něhož 1/32 tvoří rostliny požadovaného genotypu, které jsou heterozygotní v alelách ms-BlMs-BlSu-Blsu-BlKi-Blki-Bl a nesou vložený cizorodý chromozóm EC-HR1;(d) pěstování uvedených BCj rostlin podle bodu (c) a selekci rostlin s uvedeným požadovaným genotypem pomocí počítání chromozómů a použitím DNA markérů, a jejich další zpětné křížení jako samičích rostlin s pylem požadovaného kultivar po čtyři následující generace za vzniku páté generace potomstva zpětného křížení (BC5) přičemž se provádí v jednotlivých generacích selekce potomstva heterozygotního v alelách ms-BlMs-BlSu-Blsu-Ki-BlKi-Bl s vloženým chromozómem EC-HR1 a to počítáním chromozómů a použitím DNA markérů;(e) samosprášení požadovaných BC5 rostlin podle bodu (d), sbírání semen vzniklých tímto samosprášením a pěstování uvedených semen za vzniku BC5F2 • · · ·-89rostlin, z nichž 1/64 tvoři rostliny požadované pylově sterilní samičí linie, které jsou homozygotní jak v alele pro pylovou sterilitu ms-Bl, tak i v alele pro citlivost k chlorotoluron su-Bl a v alele nesoucí gen pro sterilitu pylu Ki-Bl a jsou, a další jsou BC5F2 rostliny požadované pylově fertilní udržovací hriie-s—podobným genotypem, ale mající rovněž vložený chromozóm EC-HR1 nesoucí alely Ms-Sl, rht-S 1, Su-Sl a ki-S 1-a,50. Způsob konverze požadovaného kultivaru pšenice obecné a tvrdé na pylově sterilní samičí rodičovskou linie a pylově fertilní rekombinantní udržovací linii s vloženým rekombinantním chromozómem REC-HR, pro uvedenou samičí linii podle nároku 28, vyznačující se tím , že zahrnuje:a) křížení samičích rostlin udržovací linie s chromozómem REC-HR 1, které jsou homozygotní v alele ms-BÍMs-Bl a monosomické jak v chromozómu 6B (hemizygotní v alelách su-Bl a Ki-Bl) a tak i ve vloženém rekombinantním chromozómu REC-HR 1, nesoucím alely Ms-Sl, rhl-Sl, Su-Sl a ki-S 1-a s požadovaným kultivarem, který je homozygotní v alelách Ms-BÍMs-Bl Su-BISu-Bl ki-Blki-Bl;b) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (a) a pěstování uvedených semen za vzniku pylově fertilních Fi rostlin, které jsou vesměs heterozygotní v alelách ms-Bl MsBl a 1/2 z nich je disomických v chromozómu 6B a jsou tedy heterozygotní v alelách Su-Bl su-Bl Ki-Bl ki-Bl a 1/2 z nich je dvojitě monosomických v chromozómu 6B a ve vloženém rekombinantním chromozómu REC-HR1 a jsou hemizygotní v alelách Su-Bl a ki-Bl-a, ale rovněž nesou alely Ms-Sl, rht-S 1, Su-Sl a ki-S 1-a z vloženého rekombinantního chromozómu REC-HR 1;c) selekci uvedených dvou typů Fi potomstva podle bodu (b) pomocí analýzy párování chromozómů a použitím DNA markérů, jeho opylení požadovaným kultivarem za vzniku dva typů BCi potomstva, přičemž jeden je odvozen od disomických Ft rostlin, 1/4 rostlin tohoto typu je heterozygotních alele ms-BÍMs-Bl a druhý typ je odvozen od dvojitě monosomických rostlin Fb 1/4 rostlin tohoto typuje dvojitě monosomická, heterozygotní v alele ms-BÍMs-Bl a hemizygotní v alelách Su-Bl a ki-Bl a nese rovněž alely Ms-Sl, rhl-Sl, Su-Sl a ki-S 1-a z vloženého rekombinantního chromozómu REC-HR1;d) pěstování uvedených BCi rostlin podle bodu (c) a selekci uvedených požadovaných rostlin obou skupin podle bodu (c) pomocí analýzy párování chromozómů a pomocí DNA markérů, a jejich další zpětné křížení jako samičích rostlin s požadovaným kultivarem po čtyři následující generace za vzniku dvou druhů potomstva páté generace « 9 • · ·-90zpětného křížení (BC5), přičemž se v jednotlivých generacích provádí pomocí analýzy párování chromozómů a použitím DNA markérů selekce rostlin heterozygotních v alelách ms-Bl Ms-B lsu-BlSu-BlKi-Blki-Bl u disomického typu a v aleleh ms-BlMsB1 u dvojitého monosomického typu, který má vložený rekombinantní chromozóm REC-HR1;e) opylení požadovaných dvojitě monosomických BC5 rostlin podle bodu (d) požadovanými disomickými BC5 rostlinami podle bodu (d) za vzniku dvou skupin BC5F2 rostlin, přičemž v první skupině jsou disomické rostliny, z nichž 1/16 je homozygotní v alele ms-Blms-Bl a heterozygotní v alelách su-B13m-B1Kí-B lki-B 1 což jsou požadované disomické rostliny a v druhé skupině jsou dvojitě monosomické rostliny, z nichž 1/16 tvoří rostliny požadované rekombinantní udržovací linie, které jsou homozygotní v alele ms-Bl ms-Bl a hemizygotní v alelách su-Bl a Ki-Bl a také nesou alely Ms-Kl, rhí-Kl, Su-ΒΊ a ki-S11-a na vloženém rekombinantním chromozómu REC-HRL a jsou tedy pylově fertilní; af) pěstování semen uvedené dvojitě monosomické BC5F2 linie podle bodu (e) a disomických BC5F2 semen podle bodu (e) a selekci požadované pylově fertilní rekombinantní udržovací linie a pylově sterilní samičí linie pomocí analýzy párováni chromozómů a odpovědí k působení chlorotoluronem;g) pěstování potomstva disomických rostlin, které jsou vesměs homozygotní v alele ms-Bl ms-Bl a tudíž pylově sterilní, 1/4 z nich je homozygotní v alelách su-Blsu-Bl a KiBl Ki-Bl což jsou rostliny požadované pylově sterilní samičí linie; ah) pěstování uvedených disomických BC5F3 rostlin podle bodu (g) a selekci požadované pylově sterilní samičí linie pomocí DNA markérů51. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 20 a 30 až 50 v y z n a č u j i c i se tím , že alela pro pylovou sterilitu ms-Bl je vybrána ze skupiny tvořené alelami ms-B 1-a, ms-Blb a ms-Bl-z nebo libovolnými další alelami MS-ZU.52. Udržovací linie podle libovolného z nároků 21 až 29, ve které je alela pro pylovou sterilitu ms-Bl je vybrána ze skupiny tvořené alelami ms-Bl-a, ms-Bl-b a ms-Bl-z nebo libovolnými další alelami MS-B/53. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 20 a 30 až 50 vyznačující se tím, že alela ki, citlivá na aktivitu Ki-Bl nebo libovolného jiného genu způsobujícího sterilitu pylu, je vybraná ze alel libovolného druhu Gramineae.• · • · · ·-91···· ···* • · · · · 1 • 4 • · ··54. Udržovací linie podle libovolného z nároků 21 až 29 a 52, ve které je alela ki, citlivá na aktivitu Ki-Bl nebo libovolného jiného genu způsobujícího sterilitu pylu, je vybraná z alel libovolného druhu Gramineae.55. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 20 a 30 až 51 a 53 vyznačující se tím, že alela rht nebo libovolná jiná alela genu podporujícího vzrůst je vybraná ze skupiny tvořené alelami libovolného druhu Gramineae.56. Udržovací linie podle libovolného z nároků 21 až 29, 52 a 54, ve které je alela rht nebo libovolná jiná alela genu podporujícího vzrůst je vybraná ze skupiny tvořené alelami libovolného druhu Gramineae.57. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 20 a 30 až 51 a 53 vyznačující se t í m , že alela Su je vybraná z alel libovolného druhu Gramineae.58. Udržovací linie podle libovolného z nároků 21 až 29, 52 a 54, ve které je Su nebo libovolná jiná alela pro rezistenci k herbicidům vybraná ze skupiny tvořené alelami libovolného druhu Gramineae.59. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 20 a 30 až 51 a 53 vyznačující se t í m , že alela Ba je vybraná z alel libovolného druhu Gramineae.60. Udržovací linie podle libovolného z nároků 21 až 29, 52 a 54, ve které je alela Ba vybraná z alel libovolného druhu Gramineae.61. Způsob přípravy hybridní linie pšenice obecné nebo tvrdé, vyznačující se tím , že zahrnuje:a) křížení samčí rodičovské rostliny s pylově sterilní samičí rodičovskou rostlinou stejných druhů, přičemž uvedená samčí rodičovská rostlina je vybraná ze skupiny tvořené libovolným požadovaným kultivarem pšenice obecné nebo tvrdé, který je přirozeně homozygotní v dominantní alele pro přirozeně se vyskytující pylovou fertilita (Ms-Bl), a uvedená pylově sterilní samičí rodičovská rostlina je linie uvedené pšenice homozygotní v aleiách jak pro libovolnou z recesivních mutantních alel pro pylová sterility (ms-Bl') a tak pro dominantní alelu genu způsobujícího sterilitu pylu (Ki-Bl), * · ·· · ·-92»··· · ··· • · · • · · · · · • · ·· <· přičemž uvedená pylově sterilní samičí rodičovská rostlina se udržuje pomocí udržovací linií podle libovolného z nároků 21 až 29 ; ab) sbírání semen vzniklých křížením podle bodu (a), z nichž lze vypěstovat hybridní potomstvo, které je vesměs pylově fertilní aje heterozygotní v alele ms-BÍMs-Bl.62. Hybridní linie pšenice obecné nebo tvrdé, které byly získány způsobem podle nároku 61.B-linie A-linie
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL12083597A IL120835A0 (en) | 1997-05-15 | 1997-05-15 | Method for production of hybrid wheat |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ1599A3 true CZ1599A3 (cs) | 1999-07-14 |
Family
ID=11070131
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ9915A CZ1599A3 (cs) | 1997-05-15 | 1998-05-14 | Pylově sterilní hybridní pšenice, způsob její přípravy založený na možnosti genového udržování pylově sterilní rodičovské linie pšenice a udržování linie, která se snadno a stabilně množí |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6407311B1 (cs) |
| EP (1) | EP0923283B1 (cs) |
| JP (1) | JP2000514664A (cs) |
| CN (1) | CN1234722A (cs) |
| AT (1) | ATE221308T1 (cs) |
| AU (1) | AU743525B2 (cs) |
| BG (1) | BG103090A (cs) |
| BR (1) | BR9804915A (cs) |
| CA (1) | CA2259949A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ1599A3 (cs) |
| DE (1) | DE69806890T2 (cs) |
| EA (1) | EA199900103A1 (cs) |
| ES (1) | ES2182302T3 (cs) |
| HU (1) | HUP0001941A3 (cs) |
| IL (1) | IL120835A0 (cs) |
| NZ (1) | NZ333633A (cs) |
| PL (1) | PL331258A1 (cs) |
| SK (1) | SK2099A3 (cs) |
| TR (1) | TR199900125T1 (cs) |
| WO (1) | WO1998051142A1 (cs) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002246937A1 (en) * | 2001-01-04 | 2002-08-06 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Maintenance of genic male-sterile female parental lines using a maintainer line with a stable engineered chromosome |
| WO2002052924A2 (en) * | 2001-01-04 | 2002-07-11 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Method to maintain a genic male-sterile female parental lines for the production of hybrid wheat |
| WO2003057848A2 (en) * | 2001-12-31 | 2003-07-17 | Yeda Research And Development Co., Ltd | A method to maintain a genic male-sterile female parental line of wheat through selfing of the maintainer line |
| JP2013516187A (ja) * | 2010-01-06 | 2013-05-13 | エスジー バイオフューエルズ，エルティーディー． | 雌株のみの形質によるジャトロファハイブリッド |
| CN102334415A (zh) * | 2010-07-23 | 2012-02-01 | 沈天民 | 一种高产小麦品种的设计方法 |
| WO2012142106A1 (en) | 2011-04-11 | 2012-10-18 | Targeted Growth, Inc. | Identification and the use of krp mutants in plants |
| US9516824B2 (en) * | 2012-02-14 | 2016-12-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method for modulating the number of archesporial cells in a developing anther |
| BR112015009001A2 (pt) | 2012-10-23 | 2017-12-05 | Univ Montana State | processos de produção de plantas de trigo duro |
| AU2015321591B2 (en) * | 2014-09-26 | 2022-03-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Wheat MS1 polynucleotides, polypeptides, and mehtods of use |
| CN107267527B (zh) * | 2016-07-25 | 2021-03-19 | 未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司 | 雄性育性的保持方法及其应用 |
| GB2552657A (en) * | 2016-07-29 | 2018-02-07 | Elsoms Dev Ltd | Wheat |
| WO2018067977A1 (en) | 2016-10-07 | 2018-04-12 | Kansas State University Research Foundation | Genetic system for promoting recombination and gene transfer in wheat |
| EP3675623A1 (en) | 2017-08-29 | 2020-07-08 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Improved blue aleurone and other segregation systems |
| CN108342502A (zh) * | 2018-02-05 | 2018-07-31 | 西南大学 | 鉴定小麦ms1b隐性不育基因的PCR引物对和引物对组合及其检测方法 |
| WO2019165199A1 (en) * | 2018-02-22 | 2019-08-29 | Elsoms Developments Ltd | Methods and compositions relating to maintainer lines |
| WO2020056259A1 (en) * | 2018-09-14 | 2020-03-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Fertility restoration in plants |
| CN111557237A (zh) * | 2020-06-02 | 2020-08-21 | 西藏自治区农牧科学院农业研究所 | 一种小麦育种的亲本选配方法 |
| AU2022319873A1 (en) * | 2021-07-26 | 2024-01-18 | Elsoms Developments Limited | Methods and compositions relating to maintainer lines for male-sterility |
| CN113557957B (zh) | 2021-07-28 | 2023-03-14 | 西南大学 | 一种蓝标型两系法杂交小麦系统的选育方法及应用 |
| CN114369679B (zh) * | 2022-01-19 | 2024-04-02 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 十倍体长穗偃麦草分子标记及其串联重复探针的开发与应用 |
| EP4311430A1 (en) | 2022-07-28 | 2024-01-31 | Limagrain Europe | Chlorotoluron tolerance gene and methods of use thereof |
| CN117044616A (zh) * | 2023-05-23 | 2023-11-14 | 贵州师范大学 | 一种用尾状山羊草高分子谷蛋白提高小麦品质的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4143486A (en) * | 1977-09-15 | 1979-03-13 | Research Corporation | Hybrid wheat |
| JPS6174526A (ja) * | 1984-09-18 | 1986-04-16 | 住友化学工業株式会社 | 条件的細胞質雄性不稔による一代雑種小麦品種の育種法 |
| GB9015671D0 (en) | 1990-07-17 | 1990-09-05 | Pacific Seeds Pty Limited | Production of hybrid cereal crops |
| WO1993013649A1 (en) | 1992-01-16 | 1993-07-22 | Pacific Seeds Pty. Ltd. | Genetically modified wheat plants and progeny and method for production of hybrid wheat |
-
1997
- 1997-05-15 IL IL12083597A patent/IL120835A0/xx unknown
-
1998
- 1998-05-14 US US09/214,914 patent/US6407311B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-14 CN CN98800970A patent/CN1234722A/zh active Pending
- 1998-05-14 PL PL98331258A patent/PL331258A1/xx unknown
- 1998-05-14 CA CA002259949A patent/CA2259949A1/en not_active Abandoned
- 1998-05-14 DE DE69806890T patent/DE69806890T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-14 AT AT98920720T patent/ATE221308T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-05-14 WO PCT/IL1998/000220 patent/WO1998051142A1/en not_active Application Discontinuation
- 1998-05-14 EP EP98920720A patent/EP0923283B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-14 SK SK20-99A patent/SK2099A3/sk unknown
- 1998-05-14 BR BR9804915-1A patent/BR9804915A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-05-14 JP JP10548999A patent/JP2000514664A/ja active Pending
- 1998-05-14 AU AU73495/98A patent/AU743525B2/en not_active Ceased
- 1998-05-14 ES ES98920720T patent/ES2182302T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-14 HU HU0001941A patent/HUP0001941A3/hu unknown
- 1998-05-14 TR TR1999/00125T patent/TR199900125T1/xx unknown
- 1998-05-14 NZ NZ333633A patent/NZ333633A/xx unknown
- 1998-05-14 CZ CZ9915A patent/CZ1599A3/cs unknown
- 1998-05-14 EA EA199900103A patent/EA199900103A1/ru unknown
-
1999
- 1999-01-15 BG BG103090A patent/BG103090A/bg unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR9804915A (pt) | 1999-09-14 |
| PL331258A1 (en) | 1999-07-05 |
| IL120835A0 (en) | 1997-09-30 |
| JP2000514664A (ja) | 2000-11-07 |
| EP0923283B1 (en) | 2002-07-31 |
| TR199900125T1 (xx) | 1999-10-21 |
| SK2099A3 (en) | 2000-03-13 |
| EP0923283A1 (en) | 1999-06-23 |
| WO1998051142A1 (en) | 1998-11-19 |
| US6407311B1 (en) | 2002-06-18 |
| BG103090A (bg) | 2000-06-30 |
| HUP0001941A3 (en) | 2002-04-29 |
| ES2182302T3 (es) | 2003-03-01 |
| CN1234722A (zh) | 1999-11-10 |
| ATE221308T1 (de) | 2002-08-15 |
| EA199900103A1 (ru) | 1999-10-28 |
| NZ333633A (en) | 2000-09-29 |
| DE69806890T2 (de) | 2003-03-27 |
| CA2259949A1 (en) | 1998-11-19 |
| AU743525B2 (en) | 2002-01-31 |
| DE69806890D1 (de) | 2002-09-05 |
| AU7349598A (en) | 1998-12-08 |
| HUP0001941A2 (hu) | 2000-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ1599A3 (cs) | Pylově sterilní hybridní pšenice, způsob její přípravy založený na možnosti genového udržování pylově sterilní rodičovské linie pšenice a udržování linie, která se snadno a stabilně množí | |
| Sharma et al. | Current status of wide hybridization in wheat | |
| Banks et al. | The use of cell culture for subchromosomal introgressions of barley yellow dwarf virus resistance from Thinopyrum intermedium to wheat | |
| Multani et al. | Development of monosomic alien addition lines and introgression of genes from Oryza australiensis Domin. to cultivated rice O. sativa L. | |
| Watanabe et al. | The effects of homoeologous group 3 chromosomes on grain colour dependent seed dormancy and brittle rachis in tetraploid wheat | |
| Friebe et al. | Standard karyotype of Triticum searsii and its relationship with other S-genome species and common wheat | |
| JP6328569B2 (ja) | Ｔｓｗｖ耐性トウガラシ植物体 | |
| Daunay et al. | Crossability and diversity of eggplants and their wild relatives | |
| Peffley et al. | Bulb-type onion introgressants posessing Allium fistulosum L. genes recovered from interspecific hybrid backcrosses between A. cepa L. and A. fistulosum L. | |
| Speckmann et al. | The production of alien monosomic additions in Beta vulgaris as a source for the introgression of resistance to beet root nematode (Heterodera schachtii) from Beta species of the section Patellares | |
| Ward et al. | Hybridization between invasive populations of Dalmatian toadflax (Linaria dalmatica) and yellow toadflax (Linaria vulgaris) | |
| Link et al. | Detection and characterization of two new CMS systems in faba bean (Vicia faba) | |
| US20030014773A1 (en) | Cytoplasmic male sterility-based system for hybrid wheat plant and seed production | |
| NZ519156A (en) | Methods for stabilizing and controlling apomixis | |
| US20060080748A1 (en) | Cross-incompatibility traits from teosinte and their use in corn | |
| US20210029956A1 (en) | Diploid, fertile and highly homozygous potato line solyntus | |
| JP6669347B2 (ja) | 通年開花ルピナス | |
| Ward | A new source of restorable cytoplasmic male sterility in quinoa | |
| Wheelwright et al. | Minimal loss of genetic diversity and no inbreeding depression in blueflag iris (Iris versicolor) on islands in the Bay of Fundy | |
| Ramanathan | Applied genetics of oilseed crops | |
| WO2002059269A2 (en) | Maintenance of genic male-sterile female parental lines using a maintainer line with a stable engineered chromosome | |
| Namazova | INTERSPECIFIC HYBRIDIZATION BETWEEN BREAD WHEAT AND AEGILOPS TRIUNCIALIS L. | |
| McGuire | Status of an attempt to transfer the barley yellow dwarf virus resistance gene Yd2 of barley to hexaploid wheat | |
| Sehgal | Studies on Incorporation of Karnal Bunt Resistance and Productivity Traits from Aegilops Tauschii Coss. Into Wheat (Triticum Aestivum L.). | |
| EP0872173A1 (en) | Hybrid seeds of globe artichoke for seed planting and method of producing same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |