CN114369679B - 十倍体长穗偃麦草分子标记及其串联重复探针的开发与应用 - Google Patents

十倍体长穗偃麦草分子标记及其串联重复探针的开发与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了十倍体长穗偃麦草分子标记及其串联重复探针的开发与应用。本发明所公开的长穗偃麦草分子标记，为序列表中序列1所示的DNA分子，其探针的序列为序列表中序列1、序列4、序列5、序列6或序列7，带有荧光基团或荧光染料。本发明通过特异位点扩增片段测序(SLAF‑seq)的方法，开发长穗偃麦草特异分子标记及串联重复序列探针，进而获得长穗偃麦草特异的寡核苷酸(Oligo)探针，该探针为在小麦背景下高效鉴定偃麦草染色体片段奠定基础。

Description

十倍体长穗偃麦草分子标记及其串联重复探针的开发与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，十倍体长穗偃麦草分子标记及其串联重复探针的开发与应用。
背景技术
小麦(TriticumaestivumL.)是世界上最重要的三大粮食作物之一。据不完全统计，全球小麦种植面积占全球粮食种植总面积(2.17亿公顷)的17.0％(FAO,2012)。2019年，我国小麦种植面积为2.37千万公顷，占全年粮食播种总面积(11.61千万公顷)的20.41％(http://www.stats.gov.cn/)。据相关专家预测，至2050年全球人口总数将突破100亿，小麦单产需增长70％才能满足人口增长所带来的需求(Tilman et al.2002；Foley et al.2011)。因此，研发并应用小麦育种新技术对保证我国及全球粮食安全尤为重要(Hickey etal.,2019)。
普通小麦是异源六倍体，染色体组组成为AABBDD，共包括42条染色体。在漫长的人工驯化过程中，小麦的很多特征、特性逐步符合人们的需求。然而强大的选择压力，特别是逐步建立和发展的育种操作，使得现代小麦品种的遗传多样性显著降低(郝晨阳等,2005)。自建国以来，我国已育成的小麦品种多达3000份，而它们多是由21个骨干亲本衍生而来的(Hao et al.,2020)。狭窄的遗传基础使得小麦新品种对干旱、盐碱等非生物胁迫以及病虫害等生物胁迫的抗性显著降低。小麦野生近缘种中含有众多的抗病、耐逆基因，充分挖掘和利用这些优良基因，并通过新技术、新方法导入现有的小麦品种，可以有效扩宽小麦的遗传基础，丰富小麦的种质资源，为小麦新品种的培育奠定坚实的基础(董玉琛,2001)。
十倍体长穗偃麦草的染色体数目为70条，具有多年生习性，再生能力强。它耐寒抗旱，抗病性强。多年抗病鉴定试验证明，长穗偃麦草对小麦锈病和白粉病完全免疫，对赤霉病具有很强的抵抗能力(钟冠昌等,2002)。近年来，随着研究的不断深入，多个长穗偃麦草抗病基因被发现并命名，包括抗白粉病基因Pm51(Zhan et al.,2014)，抗叶锈病基因Lr19(Friebe et al.,1994)、Lr24(McIntosh et al.,1977)和Lr29(Procunier et al.,1995)，抗秆锈病基因Sr24(Sears 1973)、Sr25(McIntosh et al.,1977)、Sr26(Friebe et al.,1994)、 Sr43(Kim et al.,1993)和SrB(Mago et al.,2019)及抗赤霉病基因Fhb7(Zhanget al., 2011)。其中，赤霉病抗性基因Fhb7，秆锈病抗性基因Sr26和Sr61(SrB)被成功克隆。Fhb7 编码一种谷胱甘肽转移酶，通过脱环氧化作用去除禾谷镰刀菌侵染产生的毒素(Wang et al., 2020)。Sr26和Sr61均为NLR基因，两者结合显著增强其秆锈病抗性能力(Zhang et al.,2021)。
通过远缘杂交和染色体工程技术，将野生近缘种中的优良基因转移至小麦被认为是小麦遗传改良的有效途径。小麦与偃麦草杂交的首创者是苏联的齐津院士，他通过偃麦草改良小麦，并育成了小麦-偃麦草杂种599和186等新品种。在我国，小麦与偃麦草的杂交工作始于上世纪五十年代，陶湛、朱光焕、孙善澄、李振声、郝水等老一辈科学家先后报导了相关工作(李振声等,1977)。研究实践表明，在小麦背景下，如何高效检测长穗偃麦草染色体片段始终是小麦染色体工程材料创制过程中至关重要的问题，目前主要依赖基因组原位杂交技术(Genomic in situ hybridization,GISH)。该技术是以带有荧光基团的长穗偃麦草基因组DNA作为探针，以小麦基因组DNA作为封阻，经过变性与复性，使得探针和长穗偃麦草基因组DNA结合，长穗偃麦草染色体片段显现荧光。然而，由于小麦与长穗偃麦草的亲缘关系较近，利用小麦基因组DNA作为封阻，并不能完全抑制探针与小麦基因组DNA结合，因此常常会在小麦染色体上产生荧光信号。重复序列探针A05、B08、B11及pThp3.93等可以在不使用封阻的情况下分辨出长穗偃麦草染色体及染色体片段(姚涵等,2016；Liu et al.2018)，但是该技术耗时费力，成本较高，限制了外源片段的鉴定效率。
开发长穗偃麦草特异的寡核苷酸(Oligonucleotide,Oligo)探针被认为是高效鉴定小麦背景下外源信号的新方法。利用重复序列进行荧光原位杂交(Fluorescence insitu hybridization,FISH)需要DNA序列的变性与复性，而利用Oligo探针则不需要。因此依赖Oligo探针的非变性荧光原位杂交技术(non-denaturing FISH,ND-FISH)逐渐替代传统的 FISH技术(Cuadrado et al.2009；Huang et al.2018)。其中Oligo-B11和Oligo-pThp3.93 能够在小麦背景下有效地鉴定偃麦草的染色体片段(Xi et al.2019)，其杂交信号弥散分布于偃麦草基因组中。弥散的杂交信号虽然可以指示偃麦草染色体，但由于缺乏明显的杂交谱带，不能用于区分不同的偃麦草染色体。基于串联重复序列开发的Oligo探针能够在染色体上产生点状杂交信号，形成明显的杂交谱带，可以区分不同的染色体。例如Oligo-6VS-1和 Oligo-6VS-35组合可以区分簇毛麦(Haynaldiavillosa,2n＝14)7对染色体(Lei et al., 2020)。目前在偃麦草属，中间偃麦草(Thinopyrum intermedium,2n＝42)和百萨偃麦草(Thinopyrumbessarabicum,2n＝14)已有相关Oligo探针开发的报道。其中Liet al.(2016)通过特异位点扩增片段测序(Specific-locusamplifiedfragmentsequencing,SLAF-seq)的方法，选择reads数目多的序列进行开发，获得中间偃麦草特异Oligo探针Oligo-pSt122。 Du et al.(2016)通过对百萨偃麦草基因组测序，选择在4JL染色体臂测序数据中高拷贝的序列作为候选序列进行Oligo探针的开发及验证，最终获得4个百萨偃麦草特异的Oligo探针DP4J24903，DP4J27982，DP4J31304和DP4J28086。虽然关于长穗偃麦草重复序列探针的开发已有报道，但尚未见利用长穗偃麦草串联重复序列开发Oligo探针的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测长穗偃麦草或其后代。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了长穗偃麦草分子标记及能扩增出长穗偃麦草的特异序列，所述长穗偃麦草分子标记为序列表中序列1所示的DNA分子。
本发明还提供了检测所述长穗偃麦草分子标记的物质，所述物质包括：能特异识别序列1所示的DNA分子的探针，或，能特异扩增序列表中序列1所示DNA分子或其片段或含有序列1所示的DNA分子的DNA片段的引物对。
上述物质中，所述探针的序列可为序列表中序列1、序列4、序列5、序列6或序列7。
上述物质中，所述探针的带有荧光基团(如FAM(6-羧基荧光素))或荧光染料(如Texas-red-5-dCTP)。所述荧光基团可在所述探针的末端。所述荧光染料具体可用带有荧光染料的核苷酸标记，如Texas-red-5-dCTP。
上述物质中，所述引物对可由序列表中序列2和3所示的两条单链DNA组成。
上述物质可为所述能特异识别序列1所示的DNA分子的探针或所述引物对。
本发明还提供了所述长穗偃麦草分子标记在检测或辅助检测长穗偃麦草或其后代中的应用；
或，所述长穗偃麦草分子标记在检测或辅助检测长穗偃麦草染色体或其片段中的应用；
或，所述长穗偃麦草分子标记在小麦育种中的应用。
本发明还提供了所述检测长穗偃麦草分子标记的物质在检测或辅助检测长穗偃麦草或其后代中的应用；
或，所述检测长穗偃麦草分子标记的物质在制备检测或辅助检测长穗偃麦草或其后代产品中的应用；
或，所述检测长穗偃麦草分子标记的物质在检测或辅助检测长穗偃麦草染色体或其片段中的应用；
或，所述检测长穗偃麦草分子标记的物质在制备检测或辅助检测长穗偃麦草染色体或其片段产品中的应用；
或，所述检测长穗偃麦草分子标记的物质在小麦育种中的应用。
上述应用中，应用所述长穗偃麦草分子标记或所述检测长穗偃麦草分子标记的物质检测长穗偃麦草染色体或其片段可包括：待测样本以荧光标记的长穗偃麦草基因组为探针，中国春基因组为封阻进行GISH；而后利用所述探针进行标记完成长穗偃麦草染色体或其片段的检测。
应用所述长穗偃麦草分子标记或所述检测长穗偃麦草分子标记的物质检测长穗偃麦草染色体或其片段也可包括：利用所述引物对对待测样本进行PCR扩增，得到PCR产物，检测 PCR产物，能得到目的扩增片段的待测样本含有或候选含有长穗偃麦草染色体或其片段，不能得到目的扩增片段的待测样本不含有或候选不含有长穗偃麦草染色体或其片段。检测PCR 产物可通过检测其大小或序列完成。
上述应用中，所述长穗偃麦草的后代可为长穗偃麦草与非长穗偃麦草杂交的后代。所述长穗偃麦草的后代的染色体含有序列1所示的DNA片段。
在本发明的一个实施例中，所述长穗偃麦草的后代为易位系DT80。在本发明的另一个实施例中，所述长穗偃麦草的后代为小偃7430。
上述应用中，所述非长穗偃麦草可为小麦。
本发明通过SLAF-seq的方法，开发长穗偃麦草特异分子标记及重复序列探针，进而获得长穗偃麦草特异的Oligo探针，该探针为在小麦背景下高效鉴定偃麦草染色体片段奠定基础。
附图说明
图1重复序列探针pThp80.1在小偃7430外源染色体上的信号分布。
(a)小偃7430的GISH分析，以荧光标记好的长穗偃麦草基因组DNA为探针，以中国春基因组DNA为封阻，整条染色体信号亮的为长穗偃麦草染色体；(b)他人开发的两个探针(重复序列探针pAs1和pSc119.2)在小偃7430外源染色体上的信号分布；(c)重复序列探针pThp80.1在小偃7430染色体中的信号分布，用数字标注的染色体即是长穗偃麦草染色体，在其中8条染色体上有点状信号。数字1-6分别指示小偃7430的6对来源于长穗偃麦草的外源染色体，Bar＝20μm。
图2重复序列探针pThp80.1在小偃7430中6对来源于长穗偃麦草的外源染色体上的信号分布。
图3Oligo-pThp80.1-2在DT80染色体上的信号分布。
(a)ND-FISH的结果，箭头指示Oligo-pThp80.1-2在DT80染色体上的信号分布；(b)GISH 的结果，箭头指示DT80的外源染色体片段，以长穗偃麦草基因组DNA标上荧光染料为探针，以中国春基因组DNA为封阻进行GISH分析。
图4寡核苷酸探针Oligo-pThp80.1-2在长穗偃麦草染色体中的信号分布。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
实施例1、十倍体长穗偃麦草分子标记及其探针的开发
1.易位系DT80外源片段特异分子标记的开发
发明人发现了一个DT80外源片段的特异分子标记，记为pThp80.1，其序列(5’-3’)如下：
GTACGGTCCGGAATTTCGTTTCCCGCCCAAAGTTTCGTCTCCCGCTTGAAATACAGTCTCGCGCCCGTTCTTCAA ATTTGGATCCCTCCATTTTGTATTTTTTTGGTATATTATTTTTTTGTGTCGGGGAGAGGCCGTGGCAATGGTGAACAATATATAGCACACCCAAATTTGGCATGACGGCGAAATTTTCCCGCCCAAAATCACGAAAAAGTGACCACGGCCGCGAGTGT CTCAAATCGCTCCC(序列表中序列1)。
该分子标记可利用引物对MWTT80-1(由名称分别为MWTT80-1F和MWTT80-1R的单链DNA 组成)扩增得到，MWTT80-1F和MWTT80-1R序列(5’-3’)如下：
MWTT80-1F：GTACGGTCCGGAATTTCGTT(序列表中序列2)；
MWTT80-1R：GGGAGCGATTTGAGACACTC(序列表中序列3)。
利用引物对MWTT80-1分别对长穗偃麦草、中国春、易位系DT80(杨国堂,小偃麦易位系的分子细胞遗传学及抗病性鉴定[D]。中国科学院大学，2018：19-23.)及其小麦亲本密穗小麦、郑优7号、矮抗58和小偃81基因组DNA为模板进行扩增，只在长穗偃麦草和易位系DT80有目的扩增产物且片段大小一致，扩增产物序列均为序列表中序列1，而在其余小麦品种中无扩增产物。
PCR反应体系如表1所示，PCR扩增条件如表2所示。其中，金牌Mix(Green)为北京擎科生物科技有限公司的产品，货号为TSE101。
表1 PCR反应体系
表2 PCR扩增条件
2.长穗偃麦草特异重复序列探针的开发
将步骤1得到的长穗偃麦草的扩增产物利用Sanprep柱式PCR产物纯化试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：B518141-0100)进行纯化，得到纯化产物，将所得纯化产物(即序列1)进行探针标记，得到重复序列探针pThp80.1，探针标记体系如表3所示。将标记好的荧光探针在长穗偃麦草、易位系DT80和中国春中进行GISH和FISH验证。
表3 探针标记体系
其中，10×NEB buffer2和DNA polymerase I(E.coli)均为NewEngland BioLabs股份有限公司产品，货号为M0209L，Texas-red-5-dCTP为Invitrogen公司产品，货号为NEL426001EA。
500μLdNTPs的配方：dTTP、dGTP和dATP各加10μL到1.5mL离心管中，再加入灭菌水470μL。
配置好的DNase是将10μL的Dnase I加入190μL的缓冲液中，Dnase I的货号是000000004536282001。缓冲液的制备：加1M的Tris-HCl(PH＝7.5)2.5mL,1M的MgCl2 250 μL,3％的牛血清白蛋白(BSA)167μL，加水定容至25mL，然后再加100％的甘油25mL. 混匀后分装190μL。氯化镁的货号：J35083-500g，BSA的货号：0332-10g，甘油的货号： G8190-500ml。1M Tris-HCl(PH＝7.5)的配置：首先称取121.1g Tris，将其溶于800mL 去离子水中，然后加浓盐酸调节PH值至7.5，最后定容至1L。1M MgCl2的配置：称取20.33 gMgCl2溶于100mL去离子水中。3％的BSA的配置：称取0.3g牛血清白蛋白溶于10mL去离子水中。
长穗偃麦草、易位系DT80和中国春根尖有丝分裂中期细胞的制备：首先将种子置于带有滤纸的培养皿里，向培养皿里加入适量的去离子水并置于23℃恒温培养箱。24h后将培养皿里的水吸出，将种子腹沟朝下，并规律摆放。24h后待根长至2cm，剪取1cm左右根尖，置于湿润并透气的0.5ml离心管中。将离心管置于笑气罐中，冲入笑气，根尖处于10atm 压强下处理2h。处理完成后取出根尖，90％乙酸浸泡8min，之后切其根尖分生组织，并用 2％纤维素酶和1％果胶酶酶解，在38℃水浴锅中温水浴46min左右。之后将根尖碾碎，加入冰醋酸，取10μL混匀的样品滴到载玻片的中心位置。最后镜检，选取有丝分裂中期分裂相好的细胞进行下一步试验。纤维素酶为日本Yakult公司产品，货号：L0012-10g，果胶酶为日本Yakult公司产品，货号：L0042-10g。
GISH步骤如下：
以荧光标记的长穗偃麦草基因组为探针，中国春基因组为封阻，探针与封阻的质量比为 1:200，配置杂交液，吸取10μL杂交液(含有116.2ng探针，再加入相应的封阻和2×SSC 和1×TE缓冲液)滴于染色体分裂相好的细胞处。先置于沸水中煮5min使其变性，杂交完成后置于55℃烘箱使其复性。复性时间应大于6h，复性完成后用2×SSC和1×TE缓冲液清洗，随后滴加含4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)的抗褪色剂,置于荧光显微镜下观察，选择染色体形态好的细胞进行拍照。(抗褪色剂由美国Vector公司生产，货号： H-1200)。1×TE：首先配置10×TE(PH＝7.6)：分别称取Tris(三羟甲基氨基甲烷) 12.1g，乙二胺四乙酸二钠2.9g，将其溶于1000mL水中，并用浓盐酸调节PH值为7.6，即得到10×TE(PH＝7.6)，稀释10倍即为1×TE。20×SSC：分别称取175.3g氯化钠和88.2g柠檬酸钠，将其溶于800mL去离子水中，用浓盐酸调节PH值为7.0，然后用去离子水定容至1L。2×SSC：20×SSC稀释10倍。2×SSC和1×TE缓冲液：即2×SSC 和1×TE等体积混合。
FISH步骤如下：
将拍完照的细胞进一步进行FISH分析，首先配置杂交液，每张载玻片滴加10μL杂交液，包括1μL pThp80.1探针(含有83ng探针)和9μL2×SSC和1×TE缓冲液。然后置于沸水中煮5min使其变性,杂交完成后置于55℃烘箱使其复性，复性时间应大于6h，复性完成后取出载玻片，用2×SSC和1×TE缓冲液清洗后滴加含DAPI的抗褪色剂,并对相应的细胞观察并拍照。
经GISH和FISH后，若探针在长穗偃麦草和易位系DT80的外源片段上有明显信号，而在中国春的染色体上无信号，则判断该探针为长穗偃麦草的特异探针。经检测，所得重复序列探针pThp80.1可以在长穗偃麦草染色体和易位系DT80外源片段上产生点状荧光信号，而在中国春染色体上无信号，说明所得重复序列探针pThp80.1为长穗偃麦草特异的荧光探针。
3.长穗偃麦草特异寡核苷酸探针的开发
根据重复序列pThp80.1的DNA序列，选取4条55-60bp的序列进行寡核苷酸探针的合成，并在每条序列的5’端加一个6-FAM荧光基团，探针由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。这四条探针分别记为Oligo-pThp80.1-1、Oligo-pThp80.1-2、Oligo-pThp80.1-3、Oligo-pThp80.1-4，具体信息如表4。
表4 长穗偃麦草特异寡核苷酸探针的序列信息
各探针合成后每OD加1000μL的1×TE，即先加100μL，再稀释十倍，得到探针溶液。
ND-FISH：
以长穗偃麦草和中国春小麦的根尖有丝分裂中期细胞为待测细胞，将置于载玻片上的待测细胞先在紫外交联仪中进行交联，然后每张片子上滴加10μL的杂交混合液，杂交混合液由1μL探针溶液和9μL的2×SSC和1×TE缓冲液组成。将片子放于湿润的铝盒中，再放入42℃恒温箱孵育2h。随后经2×SSC和1×TE缓冲液清洗后再滴加DAPI，最后在荧光显微镜下观察。经ND-FISH后，再对上述细胞进行GISH分析，综合判断这4条Oligo 探针均在长穗偃麦草染色体上有点状信号，而在中国春染色体上没有，由此推断上述4条均为长穗偃麦草特异的Oligo探针。其中Oligo-pThp80.1-2探针在长穗偃麦草染色体上的信号最强，因此后续选用该探针进行长穗偃麦草染色体的检测。
实施例2、利用重复序列探针pThp80.1区分八倍体小偃麦小偃7430的6对外源染色体
小偃7430(Zheng et al.2014,2015；Li et al.2016)是原中国科学院西北植物研究所利用长穗偃麦草与普通小麦远缘杂交而来的八倍体小偃麦。分子细胞学鉴定结果表明，它具有44条小麦染色体和12条长穗偃麦草染色体。抗病性调查发现，它对秆锈病、条锈病和白粉病具有很好的抵抗能力。发明人课题组利用染色体工程创制出来源于小偃7430的高抗 Ug99的小偃麦异附加系Xiaoyan85和易位系Xiaoyan447(Li et al.2016)。随后对Xiaoyan85 进行花粉辐射，进一步创制出小片段易位系Xiaoyan851、Xiaoyan852和Xiaoyan853(Li et al.2019)，为我国抵御Ug99提供重要的种质资源。
利用实施例1步骤2的重复序列探针pThp80.1，进行GISH和FISH检测，实验步骤同实施例1中步骤2。
结果显示，重复序列探针pThp80.1可以区分小偃7430的6对外源染色体，如图1(c)和2所示。2号和5号染色体短臂顶端均有点状信号，2号染色体上的信号明显强于5号染色体。4号染色体短臂近端部有较弱的点状信号，长臂末端有较强的点状信号。6号染色体长臂末端有较弱的点状信号。1号和3号染色体上均无点状信号，核型分析数据表明3号染色体为亚中部着丝粒染色体，而1号染色体为中部着丝粒染色体，因此可以进行区分。综上所述，利用重复序列探针pThp80.1，可以区分小偃7430上的所有外源染色体。
实施例3、长穗偃麦草特异寡核苷酸探针Oligo-pThp80.1-2在小麦背景下鉴定外源染色体片段
制备易位系DT80有丝分裂中期分裂相细胞，以实施例1步骤3的Oligo-pThp80.1-2为探针进行ND-FISH分析，实验步骤同实施例1步骤3。
结果显示，易位系DT80染色体的外源片段上存在点状信号，表明Oligo-pThp80.1-2探针可用于追踪易位系DT80的外源染色体片段(图3)。
实施例4、长穗偃麦草寡核苷酸探针Oligo-pThp80.1-2在长穗偃麦草染色体中的信号分布
制备长穗偃麦草有丝分裂中期分裂相细胞，利用实施例1步骤3的Oligo-pThp80.1-2 进行ND-FISH分析，实验步骤同实施例1步骤3。
结果如图4所示，在40条长穗偃麦草染色体上均具有明显的杂交信号，多数分布于染色体长臂或短臂的末端。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
参考文献:
1、Cuadrado A,Golczyk H,Jouve N(2009)A novel,simple and rapidnondenaturing FISH(ND-FISH)technique for the detection of planttelomeres.Potential used and possible target structures detected.ChromosomeRes 17:755-762.
2、Foley JA,Ramankutty N,Brauman KA,Cassidy ES,Gerber JS,Johnston M,Mueller ND,O'Connell C,Ray DK,West PC,Balzer C,Bennett EM,Carpenter SR,HillJ,Monfreda C,Polasky S,J,Sheehan J,Siebert S,Tilman D,Zaks DP(2011)Solutions for a cultivated planet.Nature 478:337-42.
3、Friebe,B.,Jiang,J.,Knott,D.R.,and Gill,B.S.(1994).Compensationindices of radiation-induced wheat-Agropyron elongatumtranslocationsconferring resistance to leaf rust and stem rust.Crop Sci.34,400-404.
4、Hao,C.,Jiao,C.,Hou,J.,Li,T.,Liu,H.,Wang,Y.,Zheng,J.,Liu,H., Bi,Z.,Xu,F.,et al.(2020).Resequencing of 145Landmark Cultivars Reveals AsymmetricSub-genome Selection and Strong Founder Genotype Effects on Wheat Breeding inChina.Mol Plant.
5、Hickey,L.T.,A,N.H.,Robinson,H.,Jackson,S.A.,Leal-Bertioli,S.C.M.,Tester,M.,Gao,C.,Godwin,I.D.,Hayes,B.J.,and Wulff,B.B.H.(2019).Breeding cropsto feed 10billion.Nat Biotechnol 37,744-754.
6、Huang X,Zhu M,Zhuang L,Zhang S,Wang J,Chen X,Wang D,Chen J,Bao Y,Guo J,Zhang J,Feng Y,Chu C,Du P,Qi Z,Wang H,Chen P(2018)Structural chromosomerearrangements and polymorphisms identified in Chinese wheat cultivars byhigh-resolution multiplex oligonucleotide FISH.Theor Appl Genet 131:1967-1986.
7、Lei J,Zhou JW,Sun HJ,Wan WT,Xiao J,Yuan CX,Karafiatove M,Dolezel J,Wang HY,Wang XE(2020)Development of oligonucleotide probes for FISHkaryotyping in Haynaldia villosa,a wild relative of common wheat.The Crop J8:676-681.
8、Li H,Zheng Q,Pretorius ZA,Li B,Tang D,Li Z(2016)Establishment andcharacterization of new wheat-Thinopyrum ponticum addition and translocationlines with resistance to Ug99 races.J Genet Genomics 43:573-575.
9、Li HW,Boshoff WHP,Pretorius ZA,Zheng Q,Li B,Li ZS(2019)Establishment of wheat-Thinopyrum ponticum translocation lines withresistance to Puccinia graminis f.sp.tritici Ug99.J Genet Genom 46:405-407.
10、Ling HQ,Ma B,Shi X,Liu H,Dong L,Sun H,Cao Y,Gao Q,Zheng S,Li Y, YuY,Du H,Qi M,Li Y,Lu H,Yu H,Cui Y,Wang N,Chen C,Wu H,Zhao Y,Zhang J,Li Y,ZhouW,Zhang B,Hu W,van Eijk MJT,Tang J,Witsenboer HMA,Zhao S,Li Z, Zhang A,WangD,Liang C(2018)Genome sequence of the progenitor of wheat A subgenomeTriticum urartu.Nature 557:424-428.
11、Liu LQ,Luo QL,Teng W,Li B,Li HW,Li YW,Li ZS,Zheng Q(2018)Development of Thinopyrum ponticum-specific molecular markers and FISH probesbased on SLAF-seq technology.Planta 247:1099-1108.
12、IWGSC,Appels R,Eversole K,Feuillet C,Keller B,Rogers J,Stein N,etal.(2018)Shifting the limits in wheat research and breeding using a fullyannotated reference genome.Science 361:eaar7191.
13、Kim NS,Armstrong K,Knott DR(1993)Molecular detection of Lophopyrumchromatin in wheat-Lophopyrum recombinants and their use in the physicalmapping of chromosome 7D.Theor Appl Genet 85:561-567.
14、Mago R,Zhang P,Xia XD,Zhang JP,Hoxha S,Lagudah E,Graner A,Dundas I(2019)Transfer of stem rust resistance gene SrB from Thinopyrum ponticum intowheat and development of a closely linked PCR-based marker.Theor Appl Genet132:371-382.
15、Procunier JD,Townleysmith TF,Fox S,Prashar S,Gray M,Kim WK,Czarnecki E,Dyck PL(1995)PCR-based RAPD/DGGE markers linked to leaf rustresistance genes Lr29 and Lr25 in wheat(Triticum aestivum L.).J Genet Breed49:87-92.
16、Sears ER(1973)Agropyron-wheat transfers induced by homoeologouspairing. In:Proceedings of 4th Intern Wheat Genet Symp pp 53-60.
17、Tilman D,Cassman KG,Matson PA,Naylor R,Polasky S(2002)Agriculturalsustainability and intensive production practices.Nature 418:671-7.
18、Wang HW,Sun SL,Ge WY,Zhao LF,Hou BQ,Wang K,Lyu ZF,Chen LY,Xu SS,Guo J,Li M,Su PS,Li XF,Wang GP,Bo CY,Fang XJ,Zhuang WW,Cheng XX,Wu JW,DongLH,Chen WY,Li W,Xiao GL,Zhao JX,Hao YC,Xu Y,Gao Y,Liu WJ,Liu YH,Yin HY, LiJZ,Li X,Zhao Y,Wang XQ,Ni F,Ma X,Li AF,Xu SS,Bai GH,Nevo E,Gao CX,Ohm H,KongLR(2020)Horizontal gene transfer of Fhb7 from fungus underlies Fusarium headblight resistance in wheat.Science 368:eaba5435.
19、Xi W,Tang Z,Tang S,Yang Z,Luo J,Fu S(2019)New ND-FISH-PositiveOligo Probes for Identifying Thinopyrum Chromosomes in Wheat Backgrounds.IntJ Mol Sci 20.
20、Zhan,H.X.,Li,G.R.,Zhang,X.J.,Li,X.,Guo,H.J.,Gong,W.P.,Jia,J.Q.,Qiao,L.Y.,Ren,Y.K.,Yang,Z.J.,et al.(2014).Chromosomal location andcomparative genomics analysis of powdery mildew resistance gene Pm51in aputative wheat-Thinopyrumponticumintrogression line.PLoS ONE 9,e113455.
21、Zhang J,Hewitt TC,Boshoff WHP,Dundas I,Upadhyaya N,Li J,Patpour M,Chandramohan S,Pretorius ZA,M,Schnippenkoetter W,Park RF,Mago R,Periyannan S,Bhatt D,Hoxha S,Chakraborty S,Luo M,Dodds P,Steuernagel B,WulffBBH,Ayliffe M,McIntosh RA,Zhang P,Lagudah ES(2021)A recombined Sr26and Sr61disease resistance gene stack in wheat encodes unrelated NLR genes.Nat Commun12:3378.
22、Zhang XL,Shen XR,Hao YF,Cai JJ,Ohm HW,Kong LR(2011)A genetic mapof Lophopyrum ponticum chromosome 7E,harboring resistance genes to Fusariumhead blight and leaf rust.Theor Appl Genet 122:263-270.
23、Zhao G,Zou C,Li K,Wang K,Li T,Gao L,Zhang X,Wang H,Yang Z,Liu X,Jiang W,Mao L,Kong X,Jiao Y,Jia J(2017)The Aegilops tauschi i genome revealsmultiple impacts of transposons.Nat Plants 3:946-955.
24、Zheng Q,Lv ZL,Niu ZX,Li B,Li HW,Xu SS,Han FP,Li ZS(2014)Molecularcytogenetic characterization and stem rust resistance of five wheat-Thinopyrum ponticum partial amphiploids.J Genet Genom 41:591-599.
25、Zheng Q,Luo QL,Niu ZX,Li HW,Li B,Xu SS,Li ZS(2015)Variation inchromosome constitution of the Xiaoyan series partialamphiploids and itsrelationship to stripe rust and stem rustresistance.J Genet Genom 42:657-660.
26、郝晨阳,王兰芬,张学勇,游光霞,董玉琛,贾继增,刘旭,尚勋武,刘三才,曹永生(2005),我国育成小麦品种的遗传多样性演变,中国科学35,408-415.
27、董玉琛(2001),小麦远缘杂交育种,21世纪小麦遗传育种展望-小麦遗传育种国际学术讨论会文集(北京:中国农业科技出版社),pp12-22.
28、李振声等(1977),普通小麦与长穗偃麦草杂交育种及其遗传分析,遗传学报4:283-293。
29、姚涵,汤才国,赵静,郑琪,李滨,郝晨阳,李振声,张学勇(2016),偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用,中国农业科学,49:3683-3693.
30、钟冠昌,穆素梅,张正斌(2002),麦类远缘杂交(北京:科学出版社),pp74-75.
31、杨国堂,小偃麦易位系的分子细胞遗传学及抗病性鉴定[D]。中国科学院大学，2018：19-23.
(http://dpaper.las.ac.cn/Dpaper/detail/detailNew？paperID＝20149120&title＝％E5％B0 ％8F％E5％81％83％E9％BA％A6％E6％98％93％E4％BD％8D％E7％B3％BB％E7％9A％84％E5％88％86％E5％AD％90％E7％ BB％86％E8％83％9E％E9％81％97％E4％BC％A0％E5％AD％A6％E5％8F％8A％E6％8A％97％E7％97％85％E6％80％A7％E9％89％B4％E5％AE％9A&author＝％E6％9D％A8％E5％9B％BD％E5％A0％82&highsearch＝teacher_name％253 A345345345％25E6％259D％258E％25E6％258C％25AF％25E5％25A3％25B0345345345&sortField＝scor e％2520desc％252Cid&start＝0&actionType＝Browse&searchText＝％E6％9D％8E％E6％8C％AF％E5％A3 ％B0)。
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 十倍体长穗偃麦草分子标记及其串联重复探针的开发与应用
<160> 7
<170>PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 247
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
gtacggtccggaatttcgtttcccgcccaaagtttcgtctcccgcttgaaatacagtctc 60
gcgcccgttcttcaaatttggatccctccattttgtatttttttggtatattattttttt 120
gtgtcggggagaggccgtggcaatggtgaacaatatatagcacacccaaatttggcatga 180
cggcgaaattttcccgcccaaaatcacgaaaaagtgaccacggccgcgagtgtctcaaat 240
cgctccc 247
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
gtacggtccggaatttcgtt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
gggagcgatttgagacactc 20
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
tcccgcccaaagtttcgtctcccgcttgaaatacagtctcgcgcccgttcttcaaatt 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
gtacggtccggaatttcgtttcccgcccaaagtttcgtctcccgcttgaaatacagtc 58
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
ttcaaatttggatccctccattttgtatttttttggtatattatttttttgtgtcggg 58
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
cccgcttgaaatacagtctcgcgcccgttcttcaaatttggatccctccattttgtat 58

Claims (9)

1.长穗偃麦草分子标记，为序列表中序列1所示的DNA分子。
2.检测权利要求1中所述长穗偃麦草分子标记的物质，包括：能特异识别序列1所示的DNA分子的探针，或，能特异扩增序列表中序列1所示DNA分子或其片段或含有序列1所示的DNA分子的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求2所述的物质，其特征在于：所述探针的序列为序列表中序列1、序列4、序列5、序列6或序列7。
4.根据权利要求2或3所述的物质，其特征在于：所述探针携带有荧光基团或荧光染料。
5.根据权利要求2所述的物质，其特征在于：所述引物对由序列表中序列2和3所示的两条单链DNA组成。
6.权利要求1中所述长穗偃麦草分子标记在检测或辅助检测长穗偃麦草或其后代中的应用；
或，权利要求1中所述长穗偃麦草分子标记在检测或辅助检测长穗偃麦草染色体或其片段中的应用；
或，权利要求1中所述长穗偃麦草分子标记在小麦育种中的应用。
7.权利要求2-5中任一所述检测长穗偃麦草分子标记的物质在检测或辅助检测长穗偃麦草或其后代中的应用；
或，权利要求2-5中任一所述检测长穗偃麦草分子标记的物质在制备检测或辅助检测长穗偃麦草或其后代产品中的应用；
或，权利要求2-5中任一所述检测长穗偃麦草分子标记的物质在检测或辅助检测长穗偃麦草染色体或其片段中的应用；
或，权利要求2-5中任一所述检测长穗偃麦草分子标记的物质在制备检测或辅助检测长穗偃麦草染色体或其片段产品中的应用；
或，权利要求2-5中任一所述检测长穗偃麦草分子标记的物质在小麦育种中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述长穗偃麦草的后代为长穗偃麦草与非长穗偃麦草杂交的后代。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述非长穗偃麦草为小麦。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6407311B1 (en) * 1997-05-15 2002-06-18 Yeda Research & Development Co., Ltd. Methods for production of hybrid wheat
CN107475390A (zh) * 2017-08-23 2017-12-15 中国科学院遗传与发育生物学研究所 十倍体长穗偃麦草串联重复序列特异探针的开发与应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6407311B1 (en) * 1997-05-15 2002-06-18 Yeda Research & Development Co., Ltd. Methods for production of hybrid wheat
CN107475390A (zh) * 2017-08-23 2017-12-15 中国科学院遗传与发育生物学研究所 十倍体长穗偃麦草串联重复序列特异探针的开发与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
抗条锈病、耐盐小麦-十倍体长穗偃麦草5J(E)二体异附加系的分子细胞学鉴定;朱晨;王艳珍;陈春环;王长有;吉万全;;农业生物技术学报(05);689-699 *
朱晨 ; 王艳珍 ; 陈春环 ; 王长有 ; 吉万全 ; .抗条锈病、耐盐小麦-十倍体长穗偃麦草5J(E)二体异附加系的分子细胞学鉴定.农业生物技术学报.(05),689-699. *

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