SK2099A3 - Pollen-sterile hybrid wheat, process for its preparation based on ability of genic maintaining of pollen-sterile parental line which is readily and steady propagated - Google Patents
Pollen-sterile hybrid wheat, process for its preparation based on ability of genic maintaining of pollen-sterile parental line which is readily and steady propagated Download PDFInfo
- Publication number
- SK2099A3 SK2099A3 SK20-99A SK2099A SK2099A3 SK 2099 A3 SK2099 A3 SK 2099A3 SK 2099 A SK2099 A SK 2099A SK 2099 A3 SK2099 A3 SK 2099A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- chromosome
- allele
- plants
- pollen
- seeds
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 163
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 title claims abstract description 155
- 241000209140 Triticum Species 0.000 title claims abstract 21
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 title abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 867
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 736
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims abstract description 286
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims abstract description 153
- 235000007264 Triticum durum Nutrition 0.000 claims abstract description 74
- 230000035558 fertility Effects 0.000 claims abstract description 73
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 33
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 633
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 claims description 136
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 claims description 136
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims description 135
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 100
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 85
- 244000098345 Triticum durum Species 0.000 claims description 74
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 claims description 47
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 claims description 25
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 25
- 230000010152 pollination Effects 0.000 claims description 25
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims description 24
- JXCGFZXSOMJFOA-UHFFFAOYSA-N chlorotoluron Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(C)C(Cl)=C1 JXCGFZXSOMJFOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 23
- 239000005494 Chlorotoluron Substances 0.000 claims description 22
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 21
- 240000000581 Triticum monococcum Species 0.000 claims description 19
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 claims description 18
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims description 16
- 241000209757 Aegilops searsii Species 0.000 claims description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 11
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 claims description 10
- 108010050181 aleurone Proteins 0.000 claims description 10
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 claims description 10
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 10
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 8
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 8
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims 4
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims 1
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 claims 1
- 101150075118 sub1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 abstract description 7
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 4
- 241000209143 Triticum turgidum subsp. durum Species 0.000 abstract 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 50
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 40
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 35
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 27
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 12
- 238000013461 design Methods 0.000 description 10
- 241001677738 Aleuron Species 0.000 description 9
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 241000209756 Aegilops longissima Species 0.000 description 6
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 102100040515 Delta(3,5)-Delta(2,4)-dienoyl-CoA isomerase, mitochondrial Human genes 0.000 description 5
- 101000966982 Homo sapiens Delta(3,5)-Delta(2,4)-dienoyl-CoA isomerase, mitochondrial Proteins 0.000 description 5
- 241000209125 Thinopyrum elongatum Species 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 244000067538 Abutilon indicum Species 0.000 description 3
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000007251 Triticum monococcum Nutrition 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 241000209758 Aegilops Species 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 2
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 241000209126 Thinopyrum ponticum Species 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 2
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 2
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 2
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000024321 chromosome segregation Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000000661 isochromosome Anatomy 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 description 2
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- KGPGQDLTDHGEGT-JCIKCJKQSA-N zeven Chemical compound C=1C([C@@H]2C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C3=CC(O)=C4)C(=O)NCCCN(C)C)=O)[C@H](O)C5=CC=C(C(=C5)Cl)OC=5C=C6C=C(C=5O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O5)C(O)=O)NC(=O)CCCCCCCCC(C)C)OC5=CC=C(C=C5)C[C@@H]5C(=O)N[C@H](C(N[C@H]6C(=O)N2)=O)C=2C(Cl)=C(O)C=C(C=2)OC=2C(O)=CC=C(C=2)[C@H](C(N5)=O)NC)=CC=C(O)C=1C3=C4O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O KGPGQDLTDHGEGT-JCIKCJKQSA-N 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000886178 Aegilops peregrina Species 0.000 description 1
- 241001522110 Aegilops tauschii Species 0.000 description 1
- 240000003944 Arthrocnemum macrostachyum Species 0.000 description 1
- 240000004792 Corchorus capsularis Species 0.000 description 1
- 244000077283 Distichlis palmeri Species 0.000 description 1
- 235000005422 Distichlis palmeri Nutrition 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 235000017335 Hordeum vulgare subsp spontaneum Nutrition 0.000 description 1
- 241001299819 Hordeum vulgare subsp. spontaneum Species 0.000 description 1
- 244000147568 Laurus nobilis Species 0.000 description 1
- 235000017858 Laurus nobilis Nutrition 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 244000110218 Secale montanum Species 0.000 description 1
- 235000012922 Secale montanum Nutrition 0.000 description 1
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 1
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 description 1
- 235000005212 Terminalia tomentosa Nutrition 0.000 description 1
- 241000234640 Thinopyrum junceum Species 0.000 description 1
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 1
- 235000007249 Triticum timopheevi Nutrition 0.000 description 1
- 241000209153 Triticum timopheevii Species 0.000 description 1
- 241000006770 Xenia Species 0.000 description 1
- 230000031016 anaphase Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 230000000646 gametocidal effect Effects 0.000 description 1
- 101150034785 gamma gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 235000019239 indanthrene blue RS Nutrition 0.000 description 1
- UHOKSCJSTAHBSO-UHFFFAOYSA-N indanthrone blue Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=C4NC5=C6C(=O)C7=CC=CC=C7C(=O)C6=CC=C5NC4=C3C(=O)C2=C1 UHOKSCJSTAHBSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 101150117659 rhtA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
- A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
- A01H6/4678—Triticum sp. [wheat]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
- A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Cereal-Derived Products (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Noodles (AREA)
Description
Pelovo sterilná hybridná pšenica, spôsob jej prípravy založený na možnosti génového udržiavania pelovo sterilnej rodičovskej línie, ktorá sa ľahko a stabilne množí
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka prípravy hybridných semien pšenice letnej a hrubozrnovej, z ktorej sa vyrába lepková múka používaná na výrobu cestovín, ktorej výsledkom sú hybridné rastliny, ktoré sú vysoko heterozygotné a fenotypovo jednotné. Ešte konkrétnejšie sa predložený vynález týka nového spôsobu prípravy založeného na chromozómovom inžinierstve, ktorý má udržať pelovo sterilnú samičiu rodičovskú líniu pre potrebu prípravy hybridných rastlín pšenice, ktorých samičia línia je homozygotná pre recesívnu mutantnú alelu peľovej sterility, pre recesívne príznaky tejto alely a pre dominantnú alelu, nesúcu sterilitu peľových zŕn a ďalej novej udržiavacej línie pre množenie samičej rodičovskej línie, ktorá má rovnaké génové
vybavenie ako samičia línia, ale obsahuje ešte jeden dodatočný cudzorodý vložený chromozóm nesúci dominantnú alelu pre peľovú fertilitu, recesívnu alelu pre peľovú sterilitu citlivú na navodenie peľovej sterility prirodzenou dominantnou alelou pre peľovú sterilitu a ďalej dominantnú alelu(y) so selekčnými značkami (markermi). Všetky alely sú v cudzorodom chromozómovom ramene trvalo spojené, pretože nedochádza k párovaniu a rekombinácii medzi cudzorodými vnesenými a vlastnými chromozómami pšenice. Prítomnosť recesívnej alely pre peľovú sterilitu v cudzorodom chromozóme zaisťuje, že všetky namnožené životaschopné samčie gaméty tento chromozóm nebudú mať a následne teda neponesú ani dominantnú alelu pre samčiu
plodnosť a alelu pre selekčný marker. Na druhej strane 20 % až 50 % samičích gamét ponesie cudzorodý rekombinantný chromozóm. Ak selekčný marker v alele ovplyvňuje výšku rastliny (rastliny nesúce rekombinantný chromozóm sú o 8 až 10 cm vyššie, ako tie rastliny, ktoré ho nenesú), je možné zbierať všetky vyššie rastliny oddelene od nízkych rastlín. Zo semien, ktoré sa vyvinú na vyšších rastlinách, 20 až 50 % ich nesie rekombinantný chromozóm, a preto sa z nich vyvinú rastliny s plodným pelom. U 50 až 80 % rastlín chýba tento chromozóm, a tak sa z nich vyvinú pelovo sterilné rastliny. Možnosť zbierať každý rok oddelene semená z rastlín s vyšším vzrastom umožňuje udržovať konštantný podiel peľovo fertilných rastlín v udržiavacej línii.
Ak je selekčným markerom gén pre rezistenciu proti herbicídu (to znamená napríklad rezistenciu proti chlórtolurónu), je možné použiť herbicíd na potomstvo v množení samoopelovaním a tým usmrtiť všetky rastliny, ktoré nemajú rekombinantný chromozóm (pelovo sterilné rastliny), avšak prežívajú len pelovo fertilné namnožené rastliny. To umožňuje pestovať v každej generácii len pelovo fertilné rastliny v potomstve samosprašného množenia. Ak je selekčným markerom modrý aleurón (znak, ktorý spôsobuje sfarbenie endospermu), možno deliť semená vzniknuté v udržiavacej línii na modré, z ktorých odvodíme pelovo fertilné rastliny (udržiavacia línia) a na prirodzene sfarbené (červené/biele) semená, z ktorých sa vyvinú pelovo sterilné rastliny (samičia línia). Možnosť oddeliť semená samičej pelovo sterilnej línie priamo v potomstve vzniknutom samosprášením v udržiavacej línii zjednodušuje systém a výrazne redukuje výrobnú cenu hybridných semien. Vynález ďalej prináša nové spôsoby na prípravu udržiavacej línie, nové spôsoby na premenu daného kultivaru v pelovo sterilnej samičej línii a nové spôsoby udržiavacieho množenia samičej línie, nový spôsob prípravy hybridnej pšenice, v ktorej sú všetky rastliny vzniknutého hybridu heterozygotné pre recesívnu mutantnú alelu peľovej sterility a sú preto pelovo fertilné.
Doterajší stav techniky
Všeobecne je známe, že mnoho hybridných rastlinných línií má vyššie výnosy, ako línie vzniknuté klasickým šlachtením, ďalej tiež vykazujú zlepšenú kvalitu a vyššiu odolnosť proti biotickým stresom a stresom pochádzajúcim z okolitého prostredia. Na rozdiel od kukurice, kde samčie a samičie kvety sú fyzicky oddelené, pšenica letná (chlebová) (Triticum aestivum var. aestivum.) a hrubozrnová-tvrdá (T. turgidum var. durum) (typ pšenice, z ktorej sa vyrába lepková múka používaná na výrobu cestovín) sú prevažne samosprašné druhy a každý kvet obsahuje ako samičie, tak samčie orgány. Na vytvorenie hybridných semien je preto nutné pelovo sterilizovať samičích rodičov. Pretože manuálne navodenie pelovej sterility je u pšenice nepraktické, peľová sterilita sa vnáša aplikáciou chemických hybridizačných činidiel (CHAs) alebo pomocou genetických prostriedkov. Použitie CHAs na vytvorenie rastlín pšenice, pelovo sterilných, je drahé, neúčinné a znečisťuje životné prostredie. V skutočnosti sa použitie CHAs bežne obmedzuje len na vedecké experimenty.
Vytvorenie hybridných semien genetickou cestou vyžaduje nasledujúce podmienky:
1) kompletnú a stabilnú peľovú sterilitu samičieho rodiča,
2) kompletné a stabilné obnovenie fertility u samčieho rodiča,
3) ľahké množenie samičieho (peľovo sterilného) rodiča v udržiavacej línii.
Hoci tieto podmienky boli známe aj pre genetiku pšenice, v oblesti produkcie hybridnej posledných 46 rokoch od opisu prvej pšenice nebol v peľovo sterilnej pšenice (Kihara, H. (1951) Cytologia 16: strana 117 až 193)
urobený žiaden pokrok.
Na prípravu hybridných semien sa využívajú dva hlavné typy geneticky navodenej peľová sterilita (CMS) líniách, kde prebehla peľovej sterility: cytoplazmická v aloplazmických líniách, alebo jadrová substitúcia, spôsobená nekompatibilnou pšenice letnej. (GMS) interakciou cudzej cytoplazmy Ďalším typom je génová peľová v euplazmických líniách, ktorá je recesívnou mutáciou alebo deléciou jadrového génu (ov), sterilitu v cytoplazme pšenice s j adrom sterilita spôsobená
CMS, kde k redukcii sa využíva cudzia výslednej kapacity ktorej sa využíva ktorá bežne spôsobuje peľovú letnej. Poznamenajme, že v cytoplazma, dochádza obvykle výťažkov hybridu, zatiaľ čo GMS, v natívna cytoplazma, umožňuje normálnu expresiu genómu a tým tiež nedochádza k zníženiu kapacity výťažku hybridu.
Kým u mnohých komerčne pestovaných plodín (ako je napríklad kukurica) sa uprednostňuje genetický typ peľovej sterility, v prípade pšenice letnej alebo hrubozrnovej tento typ ešte nebol naplno využitý. Väčšina pokusov s letným typom pšenice bola zameraná práve na prípravu hybridných semien, založenú na cytoplazmatickej peľovej sterilite. S cieľom toto dosiahnuť sa používa cytoplazma z
ďalších druhov pšenice (G cytoplazma), najviac využívaná je Triticum timopheevii. Aloplazmické línie obsahujúce túto cytoplazmu sú peľovo sterilné. Ďalším typom skúmanej cytoplazmy je cytoplazma z Aegilops variabilis (cytoplazma Sv) . Táto cytoplazma spôsobuje peľovú sterilitu v líniách, ktoré sú deficientné pre Sv reštaurátor v časti chromozómu IBS. Ale ako bolo uvedené vyššie, použitie cudzej cytoplazmy ako faktora sterilizácie u pšenice letnej má veľkú nevýhodu v tom, že jej rôzne dôležité vlastnosti sú negatívne ovplyvnené interakciou medzi jadrom pšenice letnej a cudzou cytoplazmou. Naviac, je veľmi ťažké nájsť stabilné gény, ktoré sú schopné obnoviť fertilitu takej aloplazmickej peľovej sterilnej línie, ktoré by boli vysoko účinné v širokom rozsahu genotypov. Okrem toho, systém vyžaduje aj šľachtenie samčieho rodiča (to znamená vloženie génov, ktoré môžu obnoviť peľovú fertilitu v cudzej cytoplazme). To všetko robí produkciu hybridných semien
drahšou a limituje to počet samčích rodičov, ktorí môžu byť testovaní na tieto kombinované vlastnosti (príspevok k významnej hybridnej vitalite).
Na druhej strane genetický typ peľovej sterility prebieha v normálnej cytoplazme pšenice letnej alebo hrubozrnovej. Z tohto dôvodu sa neočakávajú žiadne zhubné vplyvy na chovanie rastlín. Ďalej, použitím samičieho rodiča, homozygotného v recesívnej alele pre peľovú sterilitu, možno všetky kultivary, ktoré sú vo svojej podstate homozygotné pre dominantnú alelu odpovedajúcu peľovej sterilite, využiť ako samčieho rodiča, ktorý je schopný úplne obnoviť peľovú fertilitu vo všetkých F1 hybridoch. Nie je teda potrebné šľachtiť samčiu líniu a neexistuje žiadne obmedzenie počtu samčích rastlín, ktoré môžu byť krížené s pelovo sterilnými samičími rastlinami, a tak sa znásobí ich použitie na kríženie.
U pšenice letnej bolo opísaných niekoľko ramien chromozómov nesúcich gény, ktoré ovplyvňujú pelovú fertilitu, napríklad ramená chromozómu skupiny
4: dlhé rameno chromozómu 4A (4AL) , krátke rameno chromozómu 4B (4BS) a krátke rameno chromozómu 4D (4DS), ktoré nesú v tomto poradí normálne gény pre peľovú fertilitu Ms-Al, MsBI a Ms-Dl. Dlhé ramená 5.
skupiny chromozómov: nesú Ms-A2,
Ms-B2 a Ms-D2 gény v tomto danom poradí.
Avšak doposiaľ len v mieste Ms-Bl, v distálnej časti ramena 4BS (predtým 4AS), boli nájdené alebo indukované tri recesivne alely spôsobujúce pelovú sterilitu. 0 týchto alelách, najmä ms-Bl-a, ms-Bl-b a ms-Bl-c (často tiež tomto poradí nazývané msla, mslb a bolo známe, že okrem peľovej sterility nemajú žiaden iný vplyv na vlastnosti rastlín (opísané v Wilson, P. a
Driscoll, C.J.
(1983) in Frenkel, R. (ed.) Monographs on Theoretical and
Applied Genetics, Vol.6, Heterosis, Springer-Verlag, strana až 123) .
Množenie peľovo sterilných samičích línií zostáva hlavnou prekážkou pre úspešné zavedenie systému produkujúceho hybridy, založeného na GMS. Snaha o množenie pelovo sterilných samičích rastlín sa uberala dvoma smermi. Jedným bolo použitie fertilnej cytoplazmy a druhý využíval na množenie princíp cudzej fertilnej alely, homológnej s recesivnym mutantom alely pre pelovú sterilitu, ktorá sa neprenáša do samičej línie.
Prvý prístup množenia pel’ovo sterilnej samičej rastliny, t.j. použitie fertilnej cytoplazmy, bol už dávno navrhnutý Hermsenom (Hermsen, J.G. Th (1965) Euphytica 14: strana 221 až 224), ale dosial nebol podložený experimentálnymi výsledkami. Autor opisuje možnosť použitia fertilizačnej cytoplazmy, t.j. vlastnej či cudzej cytoplazmy, v ktorej sa peľová sterilita v rastlinách homozygotných pre alelu peľovej sterility neexprimuje a preto sú línie fenotypicky peľovo sterilné. Na nešťastie, takáto cytoplazma nebola dosiaľ nájdená. Systém navrhnutý Hermsenom nemol byť prakticky realizovaný z dôvodu neexistencie dostatočnej vnútrodruhovej variability cytoplazmy u pšenice letnej, ktorá môže obnoviť fertilitu peľovo sterilného genotypu. Ani cytoplazmy blízko príbuzných druhov pšenice nemôžu uľahčiť obnovenie peľovej sterility v peľovo sterilnom genotype. Na druhej strane, cytoplazma vzdialenejších druhov obvykle spôsobuje peľovú sterilitu, výnimkou sú prípady, kedy aloplazmická línia nesie vhodný reštaurátor (ov). Ale z tohto hľadiska ich vplyv na peľovú sterilitu nebol študovaný. Franckowiak a ďalší (Frackowiak, J.D., Maan, S.S. a Williams, N.D. (1976) Crop Sci. 16: strana 725 až 728) opísal gény obnovujúce peľovú fertilitu v D genóme pšenice letnej (genóm AABBDD), v Aegilops squarrosa (D) cytoplazma je peľovo fertilná a aloplazmická pšenica hrubozrnová (genóm AABB) je peľovo sterilná v D cytoplazme. Pomocou cytoplazmy D boli indukované mutácie v aloplazmickej línii pšenice letnej. Bol navrhnutý produkčný hybridný systém, v ktorom sa táto aloplazmická, peľovo sterilná rodičovská línia množila pomocou euplazmického typu rovnakého kultivaru, t. j. samičí, peľovo sterilný rodič ponesie peľovo fertilnú mutovanú alelu a D cytoplazmu, udržovateľ bude tú istú mutovanú alelu a natívnu (B) cytoplazmu a samčí rodič bude mať normálne peľovo fertilnú alelu a B cytoplazmu.
Fertilita hybridu je potom obnovená krížením týchto samčích a samičích rodičov. Všetky takéto hybridy mali D cytoplazmu odvodenú od samičieho rodiča, čo bol neprijateľný fakt z toho hľadiska, že táto cytoplazma by mohla mať negatívne vplyvy na vlastnosti (výťažok, životnosť a tak ďalej) hybridov.
Okrem toho vo vyššie uvedenom, Franckowiakom a ďalšími navrhnutom systéme udržiavacou líniou pre získanie peľovo sterilných samičích rodičov v následných generáciách je línia nesúca mutáciu pre peľovú sterilitu a B cytoplazmu pre zabezpečenie fertility množenej línie. Tento systém sa ukázal ako veľmi nepraktický a to hlavne z dôvodu, že všetky získané mutanty boli sterilné aj v B cytoplazme (Sasakuma, T., Maan, S.S. a Williams, N.D. (1978) Crop Science 18: strana 850 až 853.
Potom teda aj navrhnutá udržiavacia línia bola peľovo sterilná a nemala prakticky žiadnu cenu.
Pretože vhodná udržiavacia línia chýbala, od Franckowiakom a ďalšími navrhnutého systému sa upustilo.
Podobným spôsobom, ako je opísaný vyššie, Feldman a Millet (nepublikované dáta) objavili, že genotypy nesúce alely pre peľovú sterilitu v B genóme chromozómov, t.j. 4B a 5B, sú tiež pelovo sterilné v alopazmických líniách obsahujúcich D a Sv cytoplazmy. Zdá sa teda, že návrh fertilizačnej cytoplazmy (Hermsen, J.G. Th (1965)
Euphytica 14: strana 221 až 224) nemožno u pšenice realizovať.
Príkladom druhého prístupu k množeniu pelovo sterilných samčích rastlín je XYZ systém navrhnutý Driscollom (Driscoll C. J. (1972) Crop Sci. 12: strana 516 až 517. Pred dvoma desaťročiami navrhoval pridať do pelovo sterilnej samčej línie Z (homozygotná pre recesívny mutant alely ms-Bl-c) jeden ďalší (v línii Y) alebo pár (v línii X) cudzích chromozómov nesúcich Ms homológnu alelu, ktorá udeľuje fertilitu líniám X a Y. Cudzorodý chromozóm sa nepáruje s homológnymi chromozómami pšenice a v línii Y (udržovatel) je prenášaný peľom len vo veľmi malom počte prípadov a tak teda opelené peľovo sterilné línie produkujú semená, z ktorých väčšina vyklíči ako pelovo sterilné rastliny.
Hoci udržovatel (Y) netvorí pravú šľachtiteľskú líniu, je produkovaný opelením pelovo sterilnej samičej (Z) pomocou dvojnásobného pridania dizorničkej cudzej línie (X). Tento systém je charakterizovaný dvoma hlavnými problémami: niektoré prenosy cudzieho chromozómu, vyskytujúce sa v peli udržiavacej línie, môžu zaviesť pelovú fertilitu do novej generácie pelovo sterilnej samičej línie a ďalší problém je v zhoršení čistoty línie X. Toto sú pravdepodobne dôvody, prečo nebol tento systém zavedený do komerčnej praxe.
Driscoll (Driscoll C.J., (1985) Crop Sci. 25: strana 1115 až 1116) neskôr navrhol modifikáciu vyššie opísaného XYZ systému, produkujúceho hybridnú pšenicu. V tomto navrhnutom systéme samoopelovacia línia Y nahradí Y líniu a tak sa produkuje pelovo sterilná línia Z. Táto modifikácia
eliminuje použitie línie X, ktorá bola pôvodne potrebná na prípravu veľkého množstva Y línie rastlín. Naviac, novo navrhnutá línia Y nesie cudzí izochromozóm, a tak príkladom druhého prístupu k množeniu pelovo sterilných samičích rastlín je XYZ systém navrhnutý Driscollom (Driscoll C.J. (1972) Crop Sci. 12: strana 516 až 517). Pred dvoma desaťročiami navrhoval pridať do pelovo sterilnej samičej línie Z (homozygotná pre recesívny mutant alely ms-Bl-c) jeden ďalší (v línii Y) alebo pár (v línii X) cudzích chromozómov nesúcich dominantnú Ms homológnu alelu, ktorá udeľuje fertilitu líniám X a Y. Cudzí chromozóm sa nepáruje s homológnymi chromozómami pšenice a v línii Y (udržovatel) je prenášaný pelom vo veľmi malom počte prípadov a tak teda opelené pelovo sterilné línie produkujú semená, z ktorých väčšina vyklíči ako pelovo sterilné rastliny.
Hoci udržovatel (Y) netvorí pravú šľachtiteľskú líniu, je homológna alela, kompenzujúca pelovú fertilitu, v dvoch dávkach. Aj keď modifikovaný systém XYZ vyžaduje menej kríženia medzi rôznymi rodičovskými líniami pre udržanie a namnoženie pelovo sterilných samičích rastlín ako pôvodný systém, nedostatky charakterizujúce pôvodný systém však pretrvávajú aj v modifikovanom systéme a tak limitujú jeho praktické komerčné využitie pri výrobe hybridných semien.
Z vyššie uvedených skutočností je teda zrejmé, Že tradičné spôsoby prípravy hybridných semien nie sú dostatočne účinné a sú preto potrebné nové prístupy. Jeden taký nový spôsob, založený na vylepšení vyššie Driscollom (1972) opísaného systému XYZ, je opísaný v medzinárodných patentových prihláškach PCT č. PCT/AU91/0013 (WO92/01366) a PCT/AU93/00017 (WO 93/13649), ktoré sa týkajú produkcie
hybridných obilnín ako je pšenica letná. V týchto publikáciách sú opísané rastlinné línie používané na prípravu hybridov, ktoré majú cudzí chromozóm alebo jeho časť, nesúci dominantný gén pre peiovú fertilitu, homoalelický k mutantnej alele peľovej sterility a gén pre farebný marker, ktorý umožňuje sfarbenie požadovaných semien v potomstve. Množenie pelovo sterilných (samičích) rodičovských línií je dokonalé vo výbere semien v potomstve na základe farebného triedenia. Takto geneticky pozmenené rastliny pšenice letnej obsahujú modifikovaný chromozóm s dominantnou alelou pre normálnu peľovú fertilitu z diploidnej pšenice Triticum monococcum, ktorý je pridaný alebo nahrádza jeden zo 4B chromozómov pšenice. Modifikovaný chromozóm nesie krátke rameno chromozómu 4Am z T. monococcum (4AmS) nesúcej alelu M-Aml a druhé rameno s proximálnym segmentom z dlhého ramena z vlastného chromozómu 4Am z T. monococcum (4AmL) alebo chromozóm 4E z
Agropyron elongatum (4EL) s alelou (C) nesúcou farebnosť a distálny segment pšeničného chromozómového ramena 4BL. Časť
tohto modifikovaného chromozómu je homológna s časťou pšeničného chromozómu 4B, nesúceho recesívnu alelu pre peľovú sterilitu. Homológna časť, t.j. distálna oblasť 4BL, sa môže párovať s normálnym pšeničným 4BL, čo umožní správne rozdelenie pri meióze. Ďalšou možnosťou je označiť tento chromozóm nesúci normálnu dominantnú alelu pre peľovú fertilitu Ms-Aml použitím génu udeľujúceho rastlinám v potomstve vyšší vzrast.
Avšak aj tento vyššie uvedený systém na prípravu hybridov má rad nevýhod, ktoré sa týkajú účinnosti množenia rodičovských línii. Po prvé, výsledkom opelenia samičích rastlín udržovateľom je veľké množstvo semien s
rekombinantným cudzorodým /4BL chromozómom, ktorý podmieňuje vývoj peľovo fertilných rastlín. Po druhé, množenie pelovo sterilného samičieho rodiča zahŕňa komplex postupov triedenia potomkov, ktorý je založený na základe markerových génov. Po tretie, udržiavacia línia pre samičiu (pelovo sterilnú) rodičovskú líniu je tiež geneticky nestabilná línia, v ktorej je 20 párov chromozómov z normálnej pšenice, jeden 4B chromozóm nesúci mutantnú alelu pre peľovú sterilitu (ms-Bl-b) (známu ako Probus)(Wilson a Driscoll, 1983) a jednu rekombinantnú cudzorodú skupinu 4/4BL chromozómu s normálnou alelou pre peľovú fertilitu Ms-Aml a alelu pre zafarbenie semien. Tak je teda udržiavacia línia pelovo fertilná a podľa opelenia budú vznikať fertilné rastliny buď homozygotné alebo heterozygotné pre modifikovaný chromozóm. Bude teda nemožné rozlíšiť medzi týmito dvoma genotypmi na základe génu farebnosti alebo génu pre výšku rastlín. Tak je teda množenie udržovateľa- a ním poskytnutej pelovo sterilnej samičej línie veľmi pracné a teda nevhodné pre komerčnú aplikáciu vo veľkej miere.
Na prekonanie ťažkostí pri mechanickom výbere alebo použití ďalších nepriamych prostriedkov pri selekcii zameranej proti cudziemu chromozómu, ktorý nesie alelu pre peľovú fertilitu Ms, navrhol T.R. Endo z univerzity v Kyote v Japonsku, citované Tsujimotom a Tsunewakim, (Tsujimoto, H. a Tsunewaki, K. (1983) Proc. 6th Int. Wheat Genet. Symp., Kyoto, Japan, strana 1077 až 1081) použitie gametocídneho génu Gcl a jeho pripojenie k alele, ktorá nesie peľovú sterilitu ms. Gametocídna alela, pôvodom z Ae. speltoides, vyvoláva zničenie gamét, ktoré ju nenesú (nesú natívnu recesívnu alelu gCl). Podľa Endovho návrhu je peľovo sterilná samičia línia homozygotná ako pre ms, tak Gcl, ktoré sú tesne spojené, zatiaľ čo na opelenie samičej línie sa použije peľovo fertilná línia (udržovateľ) izogénna k samičej línii, ale s Ms a gcl alelami, tak vznikne dvojnásobne heterozygotná kombinácia msMsGclgcl. Vďaka zničeniu gamét, ktoré nesú gcl, celé potomstvo takejto samoopelovacej línie bude homozygotné msmsGclGcl a identické so samičou líniou. Avšak podľa ich návrhu by sa tiež mali množiť v systéme produkujúcom hybrid samčej
línie, (R línia), obsahujúci alelu Gcl, inak by došlo k zníženiu plodnosti F1 hybridu.
Naviac, Gcl spôsobuje stratu plodnosti ako u samičích, tak u samčích gamét a preto sa vyžaduje každý rok (medzi samičou líniou a udržovateľom) a ňou kríženie samotnou (dvakrát heterozygot), aby sa obnovila zásoba samičích semien. To nevýhodu v časovej a náročnosti.
prináša
Ďalšia nevýhoda Endovho návrhu pramení peňažnej z faktu, že peľovo sterilný samičí rodič obsahuje cudzorodý chromozómový segment, ktorý nesie Gcl speltoides.
alelu, odvodenú z Ae.
Táto časť môže tiež niesť alely s negatívnym efektom na vlastnosti samičej línie, zvyšuje cenu výroby hybridných semien a dokonca ovplyvňuje aj výťažok hybridu.
Čo sa týka dôležitosti výroby hybridu pšenice letnej, malo by byť poznamenané, že rôzne správy uvádzajú pri zavedení experimentálnych hybridov zvýšenie výnosov, u najlepších hybridov až o 30 % nad výnosmi najlepších kultivarov (Wilson, P. and Driscoll, C.J. (1983) in Frenkel, R. (ed.) Monographs on Theoretical and Applied
Genetics, Vol.6, Heterosis, Springer-Verlag, strana 94 až 123) .
Ďalej je všeobecne známe, že mnoho hybridov vykazuje zlepšenie kvality a väčšiu odolnosť proti biotickým stresom a stresom pochádzajúcim z okolitého prostredia, oproti konvenčným kultivarom.
Všeobecne sa predpokladalo, že relatívne malé výhody hybridnej pšenice oprotipravým
šľachtiteľským líniám pramenia z nepretržitého výberu homozygotnej germplazmy lepších vlastnosti.
Z tohto dôvodu sa tiež predpokladá, že výber heterozygotnej germplazmy za účelom zlepšenia vlastností by mohol za krátky čas vyústiť do značného zvýšenia výnosov.
Aj keď konštrukcia hybridov je založená na bežných kultivaroch, ktoré sa v priebehu času vylepšujú metódami klasického šľachtenia, bude výhodné každý novo vyvinutý alebo novo zavedený kultivar zmeniť na potenciálny samičí. Toto je nevyhnutné nielen pre prehľad kombinačných schopností pre novo zavedené rastlinné materiály, ale čo je dôležitejšie, komerčne vyrábané nové hybridy zaplnia medzeru medzi novo zavedenými čistými líniami.
Definície
V celom opise a uplatňovaní nárokov vynálezu budú používané nasledujúce termíny a skratky:
Pšenica letná = chlebová pšenica, Triticum aestivum var. aestivum, je to hexaploidný druh (2n=42) s tromi genómami ABD
Pšenica hrubozrnová-tvrdá = durum, Triticum turgidum var. durum, je to alotetraploidný druh (2n=28) s dvoma genómami AB
Triticum monococcum = je to diploidný druh (2n=14) zahŕňajúci taxóny: divoký (var. boeoticum) a kultivovaný (var. monococcum), blízko príbuzné diploidnému darcovi A genómu pre pšenicu letnú a hrubozrnovú, majúce genóm Am, ktorého chromozóm 4Am je homológny (čiastočne homológny) s chromozómom 4A a tiež s ďalšou skupinou chromozómov pšenice letnej a hrubozrnovej
Aegilops longissima a Aegilops searsii = diploidné druhy (2n=14) blízko príbuzné donoru B genómu pšenice letnej a hrubozrnovej, majúce genóm S1 a/alebo Ss, ktorého chromozómy sú homológne (čiastočne homológne) s rovnakými chromozómami v pšenici letnej a hrubozrnovej
Agropyron elongatum = komplex druhov zahŕňajúcich taxóny: diploid (2n=14), tetraploid (2n=28) a dekaploid (2n=70), príbuzné pšenici letnej a hrubozrnovej, majúce genóm E (polyploidný a autoploidný), ktorého chromozómy sú homológne s odpovedajúcimi chromozómami v pšenici letnej a hrubozrnovej
4BS = krátke rameno chromozómu 4B (predtým 4A) pšenice letnej a hrubozrnovej
6BL = dlhé rameno chromozómu 6B pšenice letnej a hrubozrnovej
4AmS a 4AmL = krátke a dlhé rameno 4Am z Triticum monococcum
4EL - dlhé rameno chromozómu 4E Agropyron elongatum
4SsS = krátke rameno chromozómu 4Ss z Aegilops searsii
4S’S = krátke rameno chromozómu 4S1 z Aegilops longissima 6SsL = dlhé rameno chromozómu 6Ss z Aegilops searsii = dlhé rameno chromozómu 6S1 z Aegilops longissima
Ms = dominantná alela zodpovedná za peľovú fertilitu pšenice
Ms-Bl = dominantná alela zodpovedná za peľovú fertilitu pšenice jarnej a hrubozrnovej, lokalizovaná na 4BS ms = recesivny mutant alely Ms, ktorý spôsobuje peľovú sterilitu ms-Bl = recesivny mutant alely Ms-Bl, vzťahuje sa na peľovú sterilitu pšenice jarnej a hrubozrnovej, ak je prítomná v homozygotnom stave ms-Bl-a = msla, to je Pugsley mutant ms-Bl alely ms-Bl-b = mslb, to je Probus mutant ms-Bl alely ms-Bl-c = mslc, to je Cornestone mutant ms-Bl alely Ms-Ssl = dominantná alela pre pelovú fertilitu, (homo)alelická k Ms-Bl na 4SsS
Ms-S1! = dominantná alela pre peľovú fertilitu, (homo)alelická k Ms-Bl na 4S1S
Ms-Aml = dominantná alela pre pelovú fertilitu, (homo)alelická k Ms-Bl na 4AmS
Ki-Bl = dominantná alela pre navodenie peľovej sterility (pollen-killer) na 6BL z pšenice letnej, indukuje sterilitu peľu, nesúceho -a alebo ki-S1 1-a
Ki-Bl-a = recesívna alela pre navodenie peľovej sterility na 6BL z pšenice letnej, peľ, ktorý ju nesie je v rastlinách majúcich ki-Bl sterilný
Ki-Bl-a = recesívna alela génu pre navodenie peľovej sterility na 6BL z pšenice letnej, peľ, ktorý ju nesie je v rastlinách majúcich ki-Bl sterilný
Ki-Bl-n = neutrálna alela génu pre navodenie peľovej sterility na 6BL z pšenice letnej, peľ, ktorý ju nesie je buď v rastlinách majúcich ki-Bl sterilný alebo indukuje sterilitu peľu nesúceho ki-Bl-a alebo Ki-S^-a
Ki-s‘l-a = alela pre navodenie peľovej sterility na ÔS1!, z Aegilops longissima, peľ, ktorý ju nesie je v rastlinách majúcich Ki-Bl sterilný
Rhtl a Rht2 = recesivne alebo čiastočne recesivne alely, lokalizované na chromozómových ramenách 4BS a 4DS, ktoré indukujú zníženie vzrastu rastliny rht = dominantná alebo semidominantná alela, určujúca normálnu výšku rastliny (vysoká rastlina) rht-Ssl = dominantná alebo semidominantná alela na 4SsS, určujúca normálnu výšku rastliny (vysoká rastlina) rht-Aml = dominantná alebo semidominantná alela na 4AmS, určujúca normálnu výšku rastliny (vysoká rastlina)
Su-Bl = dominantná alela na 6BL z hexaploidnej alebo tetraploidnej pšenice, vzťahuje sa na rezistenciu proti herbicídu chlórtolurónu (3-(3-chloro-p-tolyl)1,1-dimetylmočovina) su-Bl = recesívna alela z Su-Bl nájdená na 6BL hexaploidnej alebo tetraploidnej pšenice, rastliny, ktoré ju nesú sú vnímavé na pôsobenie chlórtolurónu su-S1! = recesívna alela, homoalela k Su-Bl, nájdená na z Aegilops longissima, rastliny, ktoré ju nesú sú vnímavé na pôsobenie chlórtolurónu
SU-Ssl = dominantná alela, homoalelická k Su-Bl, nájdená na 6S1!, z Aegilops searsii, rastliny, ktoré ju nesú sú rezistentné proti pôsobeniu chlórtolurónu
Ba = dominantná alela, ktorá určuje modrú farbu vrstvy aleurónu v 3n endosperme
Ba/An‘l = dominantná alela pre modrú farbu vrstvy aleurónu na 4AmL
Ba-El = dominantná alela pre modrú farbu aleurónu na 4EL
Phl = dominantná alela na dlhom ramene chromozómu 5B pšenice letnej a hrubozrnovej, ktorá potláča párovanie homológnych chromozómov phlb = recesivna mutantná alela, ktorá umožňuje homológne párovanie cv. = kultivar
EC = vložený chromozóm, ktorý pozostáva z častí odvodených z dvoch alebo viacerých cudzích chromozómov, nesúci Ms alelu, Ki alelu a selektívny marker, pomocou ktorého sú rastliny nesúce tento chromozóm vyberané
EC-H = vložený chromozóm, ktorý nesie ako selekčný marker alelu rht (výška rastliny)
EC-H1 = vložený chromozóm pozostávajúci z 4SsS/6S1L, nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl a ki-S^-a (obrázok 2a)
EC-HR = vložený chromozóm, ktorý nesie ako selekčné markery alelu rht (výška rastliny) a alelu Su (rezistencia proti herbicídu chlórtolurónu)
EC-HR1 = vložený chromozóm pozostávajúci z 4SsS/6S1L, nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl, Su-Ssl a ki-S1l-a (obrázok 2b)
REC = rekombinantný vložený chromozóm pozostávajúci z častí odvodených z dvoch alebo viacerých cudzích chromozómov a distálneho segmentu ramena natívneho chromozómu 6BL, nesúci alelu Ms, ki-S^-a a selekčný marker(y), pomocou ktorých tento chromozóm môže byť v rastline identifikovaný
REC-H = rekombinantný vložený chromozóm, ktorý nesie alelu rht ako selekčný marker
REC-H1 = rekombinantný vložený chromozóm pozostávajúci z 4SsS/6S1L/6BL nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl a ki-^l-a (obrázok 2c)
REC-HR = rekombinantný vložený chromozóm, ktorý nesie alely rht a Su ako selekčné markery
REC-HR1 = rekombinantný vložený chromozóm pozostávajúci z ^S/GS^/ôBL nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl, Su-Ssl a ki-s'l-a (obrázok 2d)
IEC = vylepšený vložený chromozóm pozostávajúci zo segmentov odvodených z dvoch alebo viacerých cudzorodých chromozómov nesúcich naviac alely Ms, ki a alelu pre selekčný marker, pomocou ktorého môžu byť oddelené semená, ktoré majú a nemajú tento chromozóm IEC-HC = vylepšený vložený chromozóm, ktorý nesie ako selekčné markery alely rht (výška rastlín) a Ba (farba semien)
IEC-HC1 = vylepšený vložený chromozóm pozostávajúci z 4SsS/4EL/6S1L nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-El a ki-S^-a (obrázok 3a)
IEC-HC2 = vylepšený vložený chromozóm pozostávajúci z 4SsS/4AmEL/6S1L nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-Aml a kiS2l-a (obrázok 4a)
IEC-HC3 = vylepšený vložený chromozóm pozostávajúci z 4AmS4AmL/6S1L nesúci Ms-Aml, rht-Aml, Ba-Aml a ki-S^-a (obrázok 5a)
IREC = vylepšený vložený chromozóm pozostávajúci z častí odvodených z dvoch alebo viacerých cudzorodých chromozómov a z distálneho segmentu ramena natívneho chromozómu 6BL, nesúci ešte alelu Ms, ki a alely selekčného markera, pomocou ktorého môžu byť oddelené semená, ktoré majú a nemajú tento chromozóm
IREC-HC = vylepšený vložený rekombinantný chromozóm, ktorý nesie ako selekčné markery alely rht a Ba
IREC-HCl = vylepšený vložený rekombinantný chromozóm pozostávajúci z 4SsS/4EL/6S1L/6BL nesúci Ms~Ssl, rhtSsl, Ba-El a ki-S1l-a (obrázok 3b)
IREC-HC2 = vylepšený vložený rekombinantný chromozóm pozostávajúci z 4SsS/4AmL/6S1L/6BL nesúci Ms-Ssl, rhtSsl, Ba-Aml a ki -S11-a (obrázok 4b)
IREC-HC3 = vylepšený vložený rekombinantný chromozóm pozostávajúci z 4AmS-4AmL/6S1L/6BL nesúci Ms-Aml, rhtAml, Ba-Aml a kí-S11-a (obrázok 5b)
Udržiavacia línia = pelovo fertilná línia izogénna k pelovo sterilnej samičej línii, ktorá ale naviac obsahuje vložený chromozóm typu EC
Rekombinantná udržiavacia línia = pelovo fertilná línia izogénna k pelovo sterilnej samičej línii, ktorá je ale monozomická pre chromozóm 6B a obsahuje ako monozomický substituent vložený chromozóm typu REC Vylepšená udržiavacia línia = pelovo fertilná línia génovo zhodná s pelovo sterilnou samičou líniou, ktorá ale naviac obsahuje vložený chromozóm typu IEC
Vylepšená rekombinantná udržiavacia línia = pelovo fertilná línia génovo zhodná s pelovo sterilnou samičou líniou, ktorá je ale monozomická pre chromozóm 6B a obsahuje ako monozomický substituent vložený chromozóm typu IREC
Podstata vynálezu
S prihliadnutím na vyššie uvedené nedostatky, uvedené v prehľade predchádzajúceho stavu výskumu danej problematiky, je podstatou predloženého vynálezu spôsob genetického množenia peľovo sterilnej rodičovskej samičej línie kultivaru pšenice letnej a hrubozrnovej. Tu uvedený spôsob predkladá jednoduché postupy pre stabilné množenie peľovo sterilnej samičej rodičovskej línie.
Vynález ďalej opisuje získanie udržiavacej línie na použitie vo vyššie uvedenom postupe, ktorým sa táto udržiavacia línia ľahko, rýchlo a stabilne množí.
Vynález ďalej opisuje spôsob prípravy vyššie uvedenej udržiavacej línie.
Vynález tiež opisuje uvedenie nových spôsobov premeny akéhokoľvek uvažovaného kultivaru pšenice letnej a hrubozrnovej v peľovo sterilnú samičiu líniu a utvorenie udržiavacej línie.
Predkladaný vynález umožňuje komerčnú výrobu hybridov u pšenice letnej a hrubozrnovej. Z tohto pohľadu vynález uvádza novelizovaný spôsob množenia peľovo sterilnej samičej rodičovskej línie (línia A), ktorá je homozygotná pre recesívnu mutantnú alelu peľovej sterility (ms) a pre dominantnú alelu génu pre navodenie peľovej sterility (Kí) . Udržovateľ (línia B)(obrázok 1) je izogénny k samičej línii a má ďalší cudzorodý vložený chromozóm, ktorý nesie dominantnú alelu pre peľovú fertilitu (Ms) spojenú s recesívnou alelou génu pre navodenie peľovej sterility (k±) a ešte najmenej jednu alelu pre selekčný marker. Peľové zrnká udržovateľa, ktoré obsahujú vložený chromozóm (Ms a k±), sú neaktívne. Niekoľko typov vložených chromozómov nesie ako selekčný marker alelu rht (ovplyvňuje výšku raslín), ďalšie nesú dva selekčné markery, alely rht a Sul (rezistencia proti chlórtolurónu), každý pre každé rameno chromozómu, kým iné typy nesú ako selekčné markery alely rht a Ba (indukuje modré zafarbenie semien) , každý marker pre každé rameno chromozómu.
V rámci predkladaného vynálezu bol vyvinutý jednoduchý systém, pomocou ktorého pelovo sterilná samičia rodičovská línia (línia A) sa množí jednak opelením peľom samčej fertilnej udržiavacej línie (línia B) a celé vzniknuté potomstvo obsahuje len pelovo sterilné samičie rastliny (obrázok la), v ešte výhodnejšom usporiadaní, výberom zo samoopelovacieho potomstva udržovatela, ktorý je uskutočnený na základe rozdielnej farebnosti semien, ktoré sa vyvinuli v pelovo sterilnej samičej línii a semien, ktoré sa vyvinuli v samčej fertilnej udržiavacej línii (obrázok lb). Podobne sa udržiavacia línia sama lahko množí samoopelením a výsledkom je zmes semien, z ktorých asi 20 % nes_ie vložený chromozóm a tým sú teda pelovo fertilné a 80 % semien, ktorým chýba tento chromozóm, je tým pelovo sterilných. V tých udržiavacích líniách, ktoré nesú len rht alelu ako selekčný marker, je možné zberať rastliny vyššieho vzrastu, ktoré obsahujú vložený chromozóm. Možnosť selektívneho zberu ulahčuje zachovanie konštantného množstva pelovo fertilných rastlín (okolo 20 % každý rok) v potomstve samoopelovacieho udržovatela, ktoré samozrejme zahŕňa aj pelovo sterilné rastliny. V tých udržiavacích líniách, ktoré nesú obe alely (rht a Sul) ako selekčné markery, možno rastliny, ktoré nemajú vložený chromozóm odstrániť chlórtolurónom. Takto je zabezpečené, že každý rok budú pestované v pokusoch s vysiatym potomstvom samoopelovacieho udržovatela len pelovo fertilné rastliny udržovatela. Na druhej strane, vo vylepšenej udržiavacej línii nesúcej alelu Ba ako selekčný marker možno oddeliť pomocou triedenia semien modré semená, ktoré sa po výseve vyvinú ako peľovo fertilné rastliny, kým zo semien červených/bielych sa vyvinú peľovo sterilné rastliny. Táto jednoduchá selekcia umožní mať každý rok udržiavaciu líniu so 100 % obsahom peľovo fertilných rastlín.
Podľa ďalšieho aspektu predloženého vynálezu sú
vložené chromozómy EC-H a EC-HR prenesenými (translokovanými) chromozómami, odvodenými z dvoch cudzorodých chromozómov. Jedno ich rameno nesie Ms a rht alelu a ďalšie má alelu kí v EC-H a obe alely Su-1 a ki v EC-HR. Pretože cudzie ramená chromozómu netvoria pár so svojimi homológnymi chromozómami pšenice, tri alely na EC-H a štyri na EC-HR sú pripojené a nie sú navzájom oddelené. EC-H (obrázok 2a) alebo EC-HR (obrázok 2b) udržovateľa v jednej dávke, t. j.
monozomickú líniu. Funkčné peľové sú teda zavedené do udržovateľ vytvára zrnká udržovateľa neobsahujú vložený chromozóm.
Potom teda celé potomstvo
vzniknuté krížením medzi peľovo sterilnou samičou líniou a udržiavacou líniou je peľovo sterilné, kým potomstvo vzniknuté samoopelením udržiavacej línie obsahuje zmes genotypov, z ktorých je asi 20 % peľovo fertilných a približne 80 % peľovo sterilných.
Konštrukcia EC v pšenici letnej je založená na novom zistení vedcov, že recesívna alela génu pre navodenie peľovej sterility ki-S1l-a, ktorá je umiestnená na dlhom ramene chromozómu 6 Ae. longissima (óS^), je prítomná v jednej kópii v rastlinách nesúcich dominantnú alelu Ki-Bl pre gén navodzujúci peľovú sterilitu na chromozóme 6B1 pšenice letnej, tak ako v monozomickej pridanej línii, nie je prenášaná peľovými zrnkami (t.j. samčími gamétami). Je teda rozumné zostaviť EC-H1, nesúci obe alely spojené s peľovou fertilitou, Ms-SJl-a rht-Ssl z Ae. searii a alelu génu navodzujúceho peľovú sterilitu Ki-S^-a z Ae. longissima, čo možno získať ako výsledok súčasných zmien delenia chromozómov 4Ss a 6S1 nasledovaného centrickou
fúziou 4SsS a ôS1!;, ktoré sa potom vyskytujú ako dvojnásobne monozomické pridania 4Ss a 6S1 pšenice letnej (obrázok 7a) .
Tento EC-H1 má krátke rameno 4. chromozómu z Ae. searii (4SsS) nesúce alelu Ms-S1!, o ktorej je známe, že zodpovedá za peľovú fertilitu u hexaploidného genotypu, homozygotného pre ms-Bl-c a rht-Ssl alelu, ktorá spôsobuje vyšší vzrast rastlín. Ďalej EC-H1 obsahuje dlhé rameno 6. chromozómu z Ae. longissima (6S1L) nesúce recesívnu alelu ki-S^-a, ktorá spôsobuje to, že peľové zrnká, ktoré ju obsahujú sú neaktívne v prítomnosti alely Ki-Bl.
Pretože sa zriedka vyskytuje párovanie a rekombinácia medzi cudzorodými vloženými chromozómami a ich homológnymi ramenami v pšenici, sú alely Ms-Ssl, rht-Ssl a ki-Ssl spojené a následne je tak zabránené prenosu alely Ms-Ssl peľovými zrnkami. To umožňuje prípravu udržiavacej línie, ktorá je homozygotná pre Ki-Bl alelu na 6BL a ďalej homozygotná pre jednu zo známych recesívnych mutantných alel spôsobujúcich peľovú sterilitu (napríklad ms-Bl-c), ktoré sú umiestnené na krátkom ramene chromozómu 4B, ale ktorých peľová sterilita sa neexprimuje, t.j., že udržiavacia línia je peľovo fertilná vďaka prítomnosti vloženého chromozómu nesúceho alelu Ms-Ssl. Výsledkom opelenia peľovo sterilnej samičej línie líniou udržovateľa sú len pelovo sterilné rastliny, kým výsledkom samoopelenia udržiavacej línie je populácia, ktorá sa skladá z 20 % pelovo fertilných rastlín a 80 % pelovo sterilných rastlín.
Ďalším bodom predkladaného vynálezu je zvýšenie podielu (z 20 % na 50 %) genotypu udržovateľa v potomstve samoopelovacej udržiavacej línie. Kým 20 % zvýšenie počtu semien je dostatočné pre udržovateľa ako takého, zvyšuje to však cenu produkcie samičích semien, pretože na získanie ekonomicky efektívneho množstva samičích rodičov pre oplodnenie udržovatelom je potrebné osiať väčšiu plochu udržovatelom. Tým sa ako velká výhoda javí zvýšenie podielu udržovateľa v jeho vlastnom potomstve. Tento by mal byť zvýšený až na 50 % a to modifikáciou EC-H, t.j. zostrojením vloženého rekombinantného chromozómu, tu označovaného ako RC-H1 (obrázok 2b), ktorý možno vytvoriť v pšenici letnej nasledujúcim spôsobom (obrázok 7b) : distálny segment chromozómového ramena 6BL je prenesený do ramena tak, že translokačný zlomový bod je distálny k ki-S1l-a alele, čo mu umožňuje párovanie s chromozómom 6BL. Výsledky translokácie z homológneho párovania v dvojnásobných monozomických podmienkach za neprítomnosti Phl, t. j. genotypu phlbphlb, kedy sa môžu spárovať a rekombinovať ECH1 (4SsS/6S1L) a 6B, vyústia do konštruktu REC-H1, t. j. 4SsS/6S1L/6BL. V líniách homozygotných pre Phl a monozomických pre normálne 6B s jednou sadou REC-H1, sa dva chromozómové páry temer v každom meiocyte v homológnej oblasti (distálna oblasť 6BL) oddeľujú k opačným pólom a vedú k zavedeniu REC-H1 do jednej polovice gamét.
Vynález ďalej opisuje ako udržať konštantný pomer 1:4 rastlín pelovo fertilných a pelovo sterilných alebo 1:1 pelovo fertilných k pelovo sterilným v potomstve samoopelovacieho udržovatela, ktoré obsahuje buď EC-H1 alebo REC-H1. Počas množenia udržovatela samoopeľovaním,
časť pelovo sterilných rastlín v samoopelovacom potomstve rastie s počtom generácií, pretože pelovo sterilné rastliny sa získavajú nielen z potomstva pelovo fertilných rastlín, ale aj z celého potomstva pelovo sterilných rastlín, ktoré boli opeľované pelovo fertilnými potomkami z tej istej generácie, ktorí rastú s nimi v zmesi a sú pelovo sterilní. Z toho vyplýva, že časť pelovo fertilných rastlín (udržovatel) v zmesi klesá až na hranicu, kedy je množstvo pelu nedostatočné pre opelenie celej samičej produkovanej populácie, všetkých pelovo sterilných samičích kvetov.
Preto je veľmi dôležité udržať v každej generácii konštantný pomer pelovo sterilných k pelovo fertilným rastlinám.
Toto môže byť dosiahnuté odstraňovaním (vytrhávaním) pelovo sterilných rastlín v potomstve udržovatela. Tento spôsob je však
samoopelovacom veľmi pracný a zvyšuje tiež náklady na pestovanie samičích rodičovských kmeňov. Preto je výhodnejšie využiť prítomnosť alely rht na krátkom ramene 4Ss v EC-H1 alebo REC-H1. Táto alela, ktorá je trvalo pripojená k Ms-Ssl alele, ovplyvňuje svojou prítomnosťou v rastline je výšku (t.j. výšku udržovatela). Rastliny, ktoré jú majú, sú vyššie (priemerne o 6 až 8 cm), ako rastliny ktoré ju neobsahujú (pelovo sterilné samičie rastliny). Rozdiel vo výške uľahčuje selektívny zber udržovatela zo zmesi.
Ďalšou výhodnou cestou, ako udržať konštantný podiel pelovo fertilných rastlín k pelovo sterilným rastlinám v potomstve samoopelovacieho udržovatela, je ďalšie vylepšenie EC alebo REC. Toto vylepšenie spočíva v
začlenení ďalšieho selekčného markera, ako je napríklad rezistencia proti herbicídu, rezistencia proti chorobám alebo modré zafarbenie semien, do každého z týchto dvoch vložených chromozómov udržovateľa. Zavedenie alely pre rezistenciu proti chlórtolurónu Su-Ssl do EC (vznikne RECHR) (obrázok 2b) alebo do REC (vznikne REC-HR) (obrázok 2d) uľahčí pomocou herbicídu selektívne zničenie len pelovo sterilných rastlín vo všetkých generáciách. EC-HR sa zostrojí nasledujúcimi krokmi (obrázok 8) : rastliny udržovateľa kultivaru Chinese Spring (CS), ktoré sú homozygotné pre ms-Bl, su-Bl a Ki-Bl a nesú EC-H, sú opelené líniou Ae. searsii nesúcou Su-Ssl a F1 je spätne skrížená vo funkcii samičieho rodiča s CS. Vo vzniknutom potomstve spätného kríženia sa vyberú rastliny rezistentné proti herbicídu a tie sa potom samoopelia za vzniku B1CiF2 potomstva. Rastliny udržovateľa sa vyberú z B1CiF2 podľa počtu chromozómov (výber pre 2n=43) a pomocou chlórtolurónovej rezistencie. Obdobne umožní vloženie_alely pre rezistenciu proti chorobe do EC alebo REC infikovať pole patogénom. Len pelovo sterilné rastliny sú vnímavé na infekciu a produkujú menej semien, ktoré sú scvrknuté a pri zbere sú odfúknuté kombajnom. Zavedenie alely pre modrý aleurón (Ba), ako súčasti selekčného markera z Agropyron elongatum alebo Tritlcum monococcum, alebo z akéhokoľvek druhu Graminae do EC alebo REC, je súčasťou výhodného uskutočnenia tohto vynálezu, kde ide o zostrojenie vylepšeného vloženého chromozómu (IEC) alebo vylepšeného vloženého rekombinantného chromozómu (IREC), ktoré môžu obsahovať alelu Ms-Aml z chromozómu 4Am z T.
monococcum,
Ba-El alelu z chromozómu 6S1 z Agropyron elongatum a Ki-Bla alelu z chromozómu 6S1 z Ae. longissima, čo umožňuje pestovanie udržovateľa zo 100 % peľovo fertilných rastlín.
Alela Ba určuje farbu (deje sa to syntézou antokyánov) aleurónovej vrstvy v 3n endosperme. Expresia alely Ba
závisí od množstva alely: dve Ba alely vnesené samičou gamétou do 3a endospermu určujú zmenu semien na modrú, na rozdiel od typicky červenej/bielej farby semien pšenice. Marker pre farbu semien je trvalo spojený s alelou Ms a tak možno následne rozlíšiť medzi modrými semenami, ktoré sa po pestovaní objavia v pelovo fertilných rastlinách (udržovatel) a typickými červenými/bielymi semenami, ktoré sa vyvinú v pelovo sterilných rastlinách. Tieto dva druhy semien môžu byť mechanicky oddelené pomocou roztried’ovacieho zariadenia.
Vyššie uvedené modifikácie v EC a REC sú označované
ako IEC-HC (obrázky 3a, 4a a 5a) a IREC-HC (obrázky 3b, 4b a 5b) a sú pripravené nasledujúcim spôsobom: IEC-HC1 nesúci alely MS-Ssl a rht-Ssl z Ae. searsii, alelu Ba-El z A. elongatum a ki-SJl-a alelu z Ae. longissima je pripravený dvoma krokmi (obrázok 9a-d): najprv sa pripraví chromozóm s translokáciou 4SsS/4EL a to ako výsledok súčasných porúch delenia chromozómov 4Ss a 4EL, nasledované centrickou fúziou 4SsS a 4EL, ktoré sa vyskytujú v dvojnásobných monozomických pridaniach 4Ss a 4E do pšenice letnej. Druhý krok zahŕňa ožiarenie semien, v ktorých došlo k dvojnásobnému monozomickému pridaniu 4SsS/4EL a 4SsS/6S1L a selekcii v potomstve vykazujúcom požadovanú translokáciu pripojenia 4SsS/4EL/6S1L.
IEC-HC2 nesúci alely MS-Ssl a rht-Ssl z Ae. searsii, alelu Ba-Aml z T. monococcum a Ki-S1! alelu z Ae. longissima bol pripravený nasledujúcim postupom (obrázok 10): najprv sa pripraví chromozóm s translokáciou 4SsS/4AmL a to ako výsledok súčasných porúch delenia chromozómov 4Ss a 4AmL, nasledované centrickou fúziou 4SsS a 4AmL, ktoré sa vyskytujú v dvojnásobných monozomických pridaniach 4S* a 4A1” (alebo monozomických pridaniach 4Ss a monozomickej translokačnej substitúcie 4BS/4AmL) do pšenice letnej. Druhý krok zahŕňa ožiarenie semien, v ktorých došlo k dvojnásobnému monozomickému pridaniu 4SsS/4AmL a 4SsS/6S1L a selekcii potomstva vykazujúceho požadovanú translokáciu 4SsS/4AmL/6S1L.
IEC-HC3 nesúce alely Ms-Aml a rht-Aml a Ba-Aml z T. monococcum a Ki-S2l-a alelu z Ae. longissima boli pripravené ožiarením semien, v ktorých došlo k dvojnásobnému monozomickému pridaniu 4Am a 6S1 do pšenice letnej a selekcii potomstva vykazujúceho požadovanú translokáciu (obrázok 11). IEC-HC3 má krátke rameno a proximálnu časť dlhého ramena z chromozómu 4 z T. monococcum (4Am) , nesúcu Ms-Aml alelu zodpovedajúcu za pelovú fertilitu v hexaploidnom genotype homozygotnom na ms-Bl-c, rht-Aml alelu, ktorá je zodpovedná za výšku rastliny a Ba-Aml alelu, ktorá určuje modré sfarbenie aleurónu a distálnu časť dlhého ramena chromozómu 6 z Ae. longissima (ÔS1!,), nesúcu recesívnu alelu ki-S2l-a.
Rôzne typy REC a IREC (obrázky 2b, 2d, 3b, 4b a 5b) boli zostrojené za účelom zvýšenia podielu (z 20 % na 50 %) pelovo fertilného genotypu održovatela v samoopelovacom potomstve udržovatela a na zabránenie príležitostného centrického poškodenia vloženého chromozómu, ktoré môže byť spôsobené chybou pri jeho centrickom delení. Vytvorenie týchto vložených rekombinantných chromozómov je dosiahnuté indukciou rekombinácie medzi jedným z nasledujúcich
chromozómov EC-H1, EC-HR1, IEC-HC1, IEC-HC2 alebo IEC-HC3 a chromozómom 6B, cestou homológneho párovania. Pri tomto procese je distálny segment 6BL translokovaný do 6SXL ramena (bod zlomu je distálny k alele ki-S^-a), (obrázky 7b a 12). Táto translokácia umožňuje spáriť REC a IREC a to takmer v každom meiocyte, s 6BL v líniách pšenice letnej, homozygotných pre Phl a monozomických pre 6B a REC alebo pre jeden z IREC. Tieto chromozómy sa oddelujú k opačným pólom a vedú k zavedeniu REC alebo IREC do polovice gamét.
Nežiadúce centrické rozdelenie vloženého chromozómu vedie k centromerickému chybnému oddeleniu Ms-Ssl a rht-Ssl od ki-S^-a v EC-H1 a oddeleniu Ms-Ssl a rht-Ssl od Su-Ssl a ki-S^-a v EC-HR1, čo umožňuje prenos alely Ms-Ssl samčími gamétami. To môže viesť k vzniku peľovo fertilných potomkov po opelení peľovo sterilnej samičej línie udržovateľom. Tieto rastliny, ktoré nesú rht alelu sú vyššie, ako peľovo sterilné rastliny a môžu byť na základe tohto oddelené. Naviac, pretože sa chybné centromerické delenie vyskytuje hlavne u nespárovaných chromozómov (univalentných), použitím REC alebo IREC, ktoré sa párujú s prirodzene sa vyskytujúcim 6B temer v každom meiocyte, dochádza k prevencii tohto nežiadúceho javu.
Vynález ďalej opisuje použitie udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej na množenie peľovo sterilnej samičej rodičovskej línie, ktorá sa používa na vytvorenie hybridnej pšenice, a spôsoby ich prípravy.
Ďalšia časť predloženého vynálezu sa týka selekcie semien peľovo sterilnej samičej rodičovskej línie priamo z potomstva samoopeľovacieho udržovateľa, ktorý nesie buď
IEC-HC (obrázok 15a) alebo IRE-HC (obrázok 15b). Okolo 80 % semien produkovaných udržovatelom so zabudovaným IEC-HC nie je modrých, neobsahujú teda IEC-HC a preto sa po vypestovaní vyvinú do pelovo sterilných rastlín. 20 % semien je modrých, nesú teda IEC-HC a po napestovaní sa v nich vyvinú semená pelovo fertilných rastlín. Roztriedenie samoopeľovacích semien udržovateľa pomocou prístroja na farebné rozlíšenie oddelí semená samičie rodičovské
(červená/biela) od modrých semien udržovateľa. Využitím tohto postupu sú pelovo sterilné samičie línie získané priamo zo samoopelovacej línie udržovateľa, nie je teda potrebné oddelené pestovanie udržovateľa, priamo sa získajú požadované samičie línie a ich výrobná cena je značne nižšia.
Predkladaný vynález ďalej uvádza spôsoby premeny uvažovaného kultivaru pšenice letnej alebo tvrdej v peľovo sterilnú samičiu rodičovskú líniu a peľovo fertilnú udržiavaciu líniu pre uvedenú samičiu líniu.
Ďalej sa predložený vynález vzťahuje na spôsob prípravy hybridnej rastlinnej línie pšenice letnej alebo tvrdej, v ktorom je pelovo sterilná samičia rodičovská línia krížená s kultivarom toho istého druhu (R líniou), ktorá je svojimi prirodzenými vlastnosťami peľovej fertility homozygotná pre Ms-Bl alelu a vytvára Fi hybridné potomstvo, v ktorom sú všetky rastliny fertilné a heterozygotné (Ms-Blms-Bl).
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázky la až lc znázorňujú všeobecné schémy pre množenie peľovo sterilnej samičej rodičovskej línie (línia A) buď :
(la) opelením udržiavacej línie (líniou B), alebo (lb) výberom z potomstva samoopeľovacieho udržovateľa (lc) alebo kombináciou týchto dvoch spôsobov opísaných v la a lb a nakoniec produkciou (Fl) hybridných semien vzniknutých opelením línie A samčou líniou (línia R).
Obrázok 2a až 2d znázorňuje schematické zobrazenia vložených chromozómov EC-H1 (2a), EC-HR1 (2b) a ďalej na obrázku (2c) vložený chromozóm REC-H1 a REC-HR1 na obrázku (2d) .
Obrázky 3a a 3b znázorňujú nákres vylepšeného vloženého chromozómu IEC-HC1 (3a) a IREC-HC1 (3b).
Obrázky 4a a vložených chromozómov
4b znázorňujú nákresy
IEC-HC2 (4a) a IREC-HC2
Obrázky 5a a vložených chromozómov
5b znázorňujú nákres
IEC-HC3 (5a) a vylepšených (4b) .
vylepšených vylepšených rekombinantných vložených chromozómov IREC-HC3 (5b) .
Obrázok 6 znázorňuje schematický proces prenosu recesívnej alely pre peľovú sterilitu ms-Bl-c z Cornestonovho mutantu do 4Ss monozomickej pridanej línie pšenice letnej kultivaru Chinese Spring (CS).
Obrázky 7a a 7b znázorňujú schémy postupu prípravy udržiavacej línie s vloženým chromozómom EC-H1 (7a) a s rekombinantným vloženým chromozómom REC-H1 (7b), nesúcimi
Ms-Ssl a rht-Ssl z 4SsS z Ae. searsii a ki-S^-a z 6S]L z Ae. longissima, rovnako ako je to v peľovo sterilnej samičej línii pšenice letnej kultivaru Chinese Spring. ECH1 sa pripraví ako monozomické pridanie v dizomických 6B rastlinách a preto je tiež homozygotný pre Ki-Bl, REC-H1 je pripravený monozomickou substitúciou v monozomických 6B rastlinách a je preto hemizygotný pre Ki-Bl,
Obrázky 8a a 8b znázorňujú schémy postupu prípravy udržiavacej línie s vloženým chromozómom EC-HR1 (8a) a s rekombinantným vloženým chromozómom REC-HR1 (8b), nesúcimi Ms-Ssl, rht-Ssl z 4SsS z Ae. searsii, Su-Ssl z 6SsL z Ae. searsii a ki-S1l-a z z Ae. longissima. EC-HR1 sa pripraví ako monozomické pridanie v dizomických 6B rastlinách a preto je tiež homozygotný pre Ki-Bl, REC-HR1 je pripravený monozomickou substitúciou v monozomických 6B rastlinách a je preto hemizygotný pre Ki-Bl.
Obrázky 9a až 9d znázorňujú prípravy udržiavacej línie s chromozómom IEC-HC1 nesúcim Ms-Ssl, searsii, Ba-El z 4EL z Ae.elongatum tri schémy postupov vylepšeným vloženým rht-Ssl z 4SsS z Ae. a ki-S^-a z 6S1L z Ae.
longissima rovnako ako v peľovo sterilnej samičej línii v pšenici letnej kultivaru Chinese Spring. Dvojnásobné rozbitie a opätovné zostavenie je indukované dvojnásovným monozomickým pridaním EC-H1 a 4E chromozómu (9a), jednoduché poškodenie a zostavenie je indukované medzi ECH1 a predtým už ožiareným translokovaným chromozómom 4SsS/4EL (9b), jednoduché poškodenie a zostavenie je indukované medzi EC-H1 a translokovaným chromozómom 4SsS/4EL, ktorý sa získal ako výsledok poruchy delenia chromozómu a centrickej fúzie (9c), obrázok (9d) znázorňuje rozdiely medzi 9a, 9b a 9c.
Obrázok 10 znázorňuje schému postupu prípravy udržiavacej línie s vylepšeným vloženým chromozómom IEC-HC2 nesúcim Ms-Ssl a rht-Ssl z 4SsS z Ae. searsii, Ba-A1! z 4ArrL z T.monococcum a ki-S11-a z ÔS1!, z Ae. longissima, rovnako ako je to v peľovo sterilnej samičej línii v pšenici letnej kultivaru Chinese Spring.
Obrázok 11 znázorňuje schému postupu prípravy udržiavacej línie s vylepšeným vloženým chromozómom IEC-HC3 nesúcim Ms-Aml a rht-Aml z 4AmS z T. monococcum a Ba-Aml z 4AmL z T.monococcum a ki-S}l-a z ôS^ z Ae. longissima, rovnako ako je to v peľovo sterilnej samičej línii v pšenici letnej kultivaru Chinese Spring.
Obrázok 12 znázorňuje schému postupu prípravy
udržiavacej línie s vylepšeným vloženým rekombinantným chromozómom IREC-HC1 nesúcim Ms-Ssl a rht-Ssl z 4SsS z Ae. searsii a ki-S1!-a z ÔS1!, z Ae. longissima, rovnako ako je to v pelovo sterilnej samičej línii pšenice letnej kultivaru Chinese Spring.
Obrázky 13a a 13b znázorňujú schémy podlá obrázku (la) pre pšenicu letnú alebo tvrdú, založené na geneticky získanej peľovej sterilite, kde je línia A označovaná cv. One, ktorá je homozygotná pre recesívnu alelu peľovej sterility ms-Bl-c a pre dominantnú alelu génu navodzujúceho peľovú sterilitu Ki-Bl.
Obrázok 13a: Línia B rovnakého kultivaru cv. One je génovo zhodná s líniou A, ale nesie aj vložený chromozóm EC-H1^S^S/ôS^) nesúci dominantnú alelu pre peľovú fertilitu Ms-Ssl a dominantnú alelu rht na 4SsS a recesívnu alelu génu navodzujúceho peľovú sterilitu Ki-S:l na Línia R, tu označená ako cv. Two, je homozygotná pre alelu divokého typu peľovej fertility Ms-Bl a pre recesívne alely génu navodzujúceho peľovú sterilitu ki-Bl-a alebo ki-Bl-n. Obrázok 13b: opis je rovnaký ako pre 13a, ale línia B nesie vložený rekombinantný chromozóm REC-H1 namiesto EC-H1 a len jednu dávku chromozómu 6B nesúceho KiBl.
Obrázky 14a a 14b znázorňujú schémy podľa obrázku (la) pre pšenicu letnú alebo tvrdú, založené na geneticky získanej peľovej sterilite, kde je línia A označovaná cv. One, ktorá je homozygotná pre recesívnu alelu peľovej sterility ms-Bl-c, pre recesívnu alelu citlivosti na
herbicíd su-Bl a pre dominantnú alelu génu navodzujúceho peľovú sterilitu Ki-Bl. Obrázok 14a: Línia B rovnakého kultivaru cv. One je génovo zhodná s líniou A, ale nesie aj vložený chromozóm EC-HR1 (4SsS/6S1L) nesúci dominantnú alelu pre peľovú fertilitu Ms-Ssl a dominantnú alelu rht na 4SsS, dominantnú Su-Ssl alelu a recesívnu alelu génu navodzujúceho peľovú sterilitu ki-S1! na 6SXL. Línia R je tu označená ako cv. Two, je homozygotná pre alelu divokého typu peľovej fertility Ms-Bl a recesívna pre jednu z alel génu navodzujúceho peľovú sterilitu ki-Bl-a alebo ki-Bl-n. Obrázok 14b: opis je rovnaký ako pre 14a, ale línia B nesie vložený rekombinantný chromozóm REC-HR1 namiesto EC-HR1 a len jednu dávku chromozómu 6B nesúceho Ki-Bl.
Obrázky 14a a 14b znázorňujú schémy podlá obrázku (la) pre pšenicu letnú alebo tvrdú, založené na geneticky získanej pelovej sterilite, kde je línia A označovaná cv. One, ktorá je homozygotná pre recesívnu alelu pelovej sterility ms-Bl-c, pre recesívnu alelu citlivosti na herbicíd su-Bl a pre dominantnú alelu génu navodzujúceho peľovú sterilitu Ki-Bl. Obrázok 14a: Línia B rovnakého
kultivaru cv. One je génovo zhodná s líniou A, ale nesie aj vložený chromozóm EC-HR1(4SsS/6S1L) nesúci dominantnú alelu pre peľovú fertilitu Ms-Ssl a dominantnú alelu rht na 4S°S, dominantnú Su-Ssl alelu a recesívnu alelu génu navodzujúceho peľovú sterilitu ki-S1! na ôS^. Línia R je tu označená ako cv. Two, je homozygotná pre alelu divokého typu peľovej fertility Ms-Bl a recesívna pre jednu z alel génu navodzujúceho peľovú sterilitu ki-Bl-a alebo ki -BI -n.
Obrázok 14b: opis je rovnaký ako pre 14a, ale línia B nesie vložený rekombinantný chromozóm
REC-HR1 namiesto EC-HR1 a len jednu dávku chromozómu 6B nesúceho
Ki-BI.
Obrázky 15a a 15b znázorňujú schémy podľa obrázku (la) pre pšenicu letnú alebo tvrdú, založené na geneticky získanej pelovej sterilite, kde je línia A označovaná cv. ”One, ktorá je homozygotná pre recesívnu alelu pelovej sterility ms-Bl-c a dominantnú alelu Ki-Bl. Obrázok 15a: Línia B rovnakého kultivaru cv. One je génovo zhodná s líniou A, ale nesie naviac vylepšený vložený chromozóm IECHC1 majúci 4SsS/4EL/6S1L nesúci alely Ms-Ssl, rht-Ssl, BaE1, ki-S11-a. Línia R je tu označená ako cv. Two. Je homozygotná pre alelu divokého typu pelovej fertility Ms-Bl a recesívna pre jedn^ z alel génu navodzujúceho peľovú sterilitu ki-Bl-a alebo ki-Bl-n. Obrázok 15b: opis je rovnaký ako pre 15a, ale línia B nesie vložený rekombinantný chromozóm IREC-HR1 namiesto EC-HC1 a len jednu dávku chromozómu 6B nesúceho Ki-Bl.
Obrázky 16a a 16b opisujú schematické postupy premeny uvažovaného kultivaru (cv. New) v pelovo sterilnú líniu a udržiavaciu líniu nesúcu EC-H (16a) a premenu uvažovaného kultivaru (cv. New) v pelovo sterilnú líniu a rekombinantnú udržiavaciu líniu nesúcu REC-H (16b).
Obrázky 17a a 17b opisujú schematické postupy premeny uvažovaného kultivaru (cv. New) v pelovo sterilnú líniu a udržiavaciu líniu nesúcu EC-HR (17a) a premenu uvažovaného kultivaru (cv. New) v pelovo sterilnú líniu a rekombinantnú udržiavaciu líniu nesúcu REC-HR (17b).
Obrázky 18a a 18b opisujú schematické postupy premeny uvažovaného kultivaru (cv. New) v pelovo sterilnú líniu a vylepšenú udržiavaciu líniu nesúcu IEC-HC (18a) a premenu uvažovaného kultivaru (cv. New) v pelovo sterilnú líniu a vylepšenú rekombinantnú udržiavaciu líniu nesúcu IREC-HC (18b) .
Podrobný opis vynálezu
V súlade s predloženým vynálezom bol vyvinutý jednoduchý systém pre pšenicu letnú a tvrdú, ktorý je znázornený na obrázkoch la, 13a a 14a, pomocou ktorého sa sterilná samičia línia (línia A) množí opelením líniou udržovatela (línia B) a celé vzniknuté potomstvo sú pelovo sterilné samičie rastliny. Obdobne, udržiavacia línia sa sama ľahko množí samoopelením, výsledkom je zmes semien, z ktorých sa okolo 20 % po výseve vyvinie do pelovo fertilných rastlín, ktoré sú identické s udržiavacou líniou a nesú vložený chromozóm, zvyšných 80 % sa po výseve vyvinie do pelovo sterilných rastlín, pretože im chýba alela Ms-Ssl. Použitím selekčných markerov pre charakterizáciu udržovatela sa zachová v každej generácii potomstva samoopelovacej udržiavacej línie pomer 80 % pelovo sterilných k 20 % pelovo fertilných rastlín.
Ak je selekčným markerom farebný selekčný marker, ako je modrý aleurón alebo ďalšia vlastnosť semena, predložený vynález poskytuje ďalší alternatívny systém na množenie oboch línií a to vylepšený a výhodný ako pelovo sterilnej samičej rodičovskej línie (línia A) , línie udržovatela (línia B), (obrázky tak lb, oboch semien pelovo pelovo fertilnej lc a 14a). Semená línií sa získajú samoopelením udržovatela: 80 % je červených/bielych a keď sa vysejú, poskytnú sterilné rastliny, (línia A) a 20 % semien je modrých a po výseve sa vyvinú do pelovo fertilnej rastliny B) . Roztriedením semien samoopelovacej udržiavacej (línia línie pomocou prístroja semien. V tomto pre farebné triedenie výhodnom uskutočnení získame dva druhy sú semená pelovo sterilnej línie získavané priamo samoopelovaním udržiavacej línie, nemusí sa zvlášť pestovať udržovatel ani samičia línia a tým sa znížia výrobné náklady na získanie samičieho rodiča. Tiež sa neznižuje množstvo životaschopného pelu v udržovatelovi, pretože všetky rastliny vo udržovatela sú pelovo fertilné.
výseve
Pre produkciu samičia rodičovská pšeničných hybridov sa pelovo línia krížila s kultivarom sterilná letnej alebo tvrdej pšenice (línia R), ktorý bol prirodzene pelovo fertilný a homozygotný pre Ms-Bl.
Celé vzniknuté Fi hybridné potomstvo bolo heterozygotné pre Ms-Blms-Bl a preto pelovo fertilné.
V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je opísaný spôsob množenia pelovo sterilnej rodičovskej línie (obrázok 13a, 14a a 15a) pšenice letnej a tvrdej, ktorého cielom je príprava hybridnej pšenice. Tento spôsob zahŕňa:
a) kríženie samičej rodičovskej línie so samčím rodičom, kde samičou líniou býva pelovo sterilná rastlina, homozygotná pre ktorúkolvek recesívnu alelu pre pelovú sterilitu ms-Bl, nachádzajúcu sa na krátkom ramene chromozómu 4B(4BS) a dominantná pre alelu génu
navodzujúceho pelovú sterilitu (pollen-killer) Ki-Bl, ktorá je na dlhom ramene chromozómu 6B(6BL). Samčou rodičovskou líniou je udržiavacia línia, ktorá je génovo zhodná so samičou rodičovskou líniou a homozygotná pre tie isté alely ms-Bl a Ki-Bl samičieho rodiča a ktorá ešte nesie pridaný cudzí chromozóm, vybraný z:
i) vložený chromozóm, tu označovaný EC, pozostávajúci z častí odvodených z dvoch alebo viacerých cudzorodých chromozómov, nesúci dominantnú alelu pre pelovú fertilitu Ms, recesívnu alelu ki, ktorá je citlivá na pôsobenie prirodzenej alely ničiacej pelovú fertilitu. Táto je na 6BL. Ďalej nesie alely pre jeden alebo dva selekčné markery, pomocou ktorých rastliny s týmto chromozómom môžu byť rozpoznané, ii) vylepšený vložený chromozóm, tu označovaný IEC, pozostávajúci z častí odvodených z dvoch alebo viacerých cudzorodých chromozómov, nesúci naviac Ms a ki alely pre selekčné markery, pomocou ktorých rastliny s týmto chromozómom môžu byť rozpoznané a oddelené od tých, čo tento chromozóm nenesú,
b) zber semien potomstva po krížení (a), ktoré sú všetky homozygotné pre uvedené alely peľovej sterility a alelu génu navodzujúceho peľovú sterilitu a nemajú vložený chromozóm EC alebo IEC. Tieto semená sa vyvinú do línie peľovo sterilných samičích rastlín.
V ešte výhodnejšom uskutočnení vynálezu je opísaný alternatívny spôsob množenia peľovo sterilné rodičovskej línie (obrázok 13b, 14b a 15b) pšenice letnej a tvrdej, ktorého cieľom je príprava hybridnej pšenice. Tento spôsob zahŕňa:
a) kríženie samičej rodičovskej línie so samčím rodičom. Samičou líniou býva peľovo sterilná rastlina, homozygotná pre obe alely a to pre recesívnu alelu peľovej sterility
ms-Bl, nachádzajúcu sa na krátkom ramene chromozómu 4B(4BS) a pre dominantnú alelu génu navodzujúceho peľovú sterilitu (pollen-killer) Ki-Bl, ktorá je na dlhom ramene chromozómu 6B(6BL). Samčou rodičovskou líniou je udržiavacia línia, ktorá je génovo zhodná so samičou rodičovskou líniou a homozygotná pre alelu ms-Bl samičieho rodiča, ale monozomická pre obe alely na chromozóme 6B, t.j. pre Ki-Bl a pre vložený rekombinantný chromozóm, vybraný z:
i) vložený rekombinantný chromozóm, tu označovaný REC, pozostávajúci z častí odvodených z dvoch alebo viacerých cudzorodých chromozómov a z distálnej časti prirodzeného chromozómového ramena 6BL, nesúceho alely Ms a ki a alelu pre jeden alebo dva selekčné markery. Pomocou nich rastliny s týmto chromozómom môžu byť rozpoznané a oddelené od tých, čo tento chromozóm nenesú, ii) vylepšený vložený rekombinantný chromozóm, tu označovaný IREC, pozostávajúci z častí odvodených z dvoch alebo viacerých cudzorodých chromozómov a z distálnej časti prirodzeného chromozómového ramena 6BL a nesúci ešte alely Ms a ki pre selekčné markery, pomocou ktorých semená s týmto chromozómom môžu byť rozpoznané a oddelené od tých, čo tento chromozóm nenesú,
b) zber semien potomstva po krížení (a) , ktoré sú všetky homozygotné pre uvedené alely peľovej génu navodzujúceho peľovú sterilitu sterility a alelu a nemajú vložený rekombinantný chromozóm REC alebo IREC; tieto semená sa po vypestovaní vyvinú do línie pelovo sterilných samičích rastlín.
V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je opísaný ešte
ďalší vylepšený spôsob množenia peľovo sterilnej rodičovskej línie (obrázok 15a) pšenice letnej a tvrdej, ktorého cieľom je príprava Fi hybridov pšenice. Tento spôsob zahŕňa:
a) samoopelenie vylepšenej udržiavacej línie, ktorá je génovo zhodná so samičou rodičovskou líniou, t.j., že je homozygotná pre ktorúkoľvek z recesívnych alel pre peľovú sterilitu ms-Bl a pre dominantnú alelu génu navodzujúceho peľovú sterilitu a majúca ešte ďalší vylepšený vložený chromozóm, tu nazývaný IEC-HC (obrázky 3a až 5a) , ktorý nesie okrem toho ešte Ms, rht a ki-S1l-a alely a tiež marker na selekciu semien, t.j. Ba alelu pre modrú farbu semien. z tohto dôvodu tu opísaný vylepšený vložený chromozóm zahŕňa vlastne IEC-HC1 (4SsS/4EL/6S1L) nesúci MsSslf rht~Ssl, Ba-El a ki-S'l-a, IEC-HC2 (4SsS/4AmL/6S:L) nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-Aml a ki-S^-a alebo IEC-HC3 (4AmS/4AmL/6S:L) nesúci Ms-Aml, rht-A'!, Ba-Aml a ki-ďl-a a
b) zber semien zo samoopeľovacieho potomstva rastlín (a),
ktoré sú všetky homozygotné pre uvedené alely peľovej sterility a alely génu navodzujúceho peľovú sterilitu, 80 % z nich chýba IEC-HC a preto sú červeno/bielo sfarbené a môžu byť oddelené deliacim zariadením od modrých semien obsahujúcich vylepšený vložený chromozóm, tieto sa po vysiatí vyvinú do uvedenej peľovo sterilnej samičej línie.
V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je opísaný ešte ďalší vylepšený spôsob množenia peľovo sterilnej rodičovskej línie (obrázok 15b) pšenice letnej a tvrdej, ktorého cieľom je príprava Fi hybridov pšenice. Tento spôsob zahŕňa:
a) samoopelenie vylepšenej udržiavacej línie, ktorá je génovo zhodná so samičou rodičovskou líniou, t.j., že je homozygotná pre ktorúkoľvek z recesívnych alel pre peľovú sterilitu ms-Bl a monozomická pre chromozóm 6B nesúci alelu Ki~Bl a pre vylepšený vložený rekombinantný chromozóm typu IREC-HC (obrázky 3b, 4b, 5b), distálna k ki-S^-a alele.
Distálna oblasť dlhého ramena chromozómu 6B(6BL) sa pravidelne páruje s homológnou oblasťou natívneho chromozómu 6BL. Opísaný IREC-HC1 nesie ešte okrem toho alely Ms, rht a kl-S^-a a tiež marker na selekciu semien, t.j. Ba alelu pre modrú farbu semien. Z tohto dôvodu tu opísaný vylepšený vložený rekombinantný chromozóm zahŕňa vlastne IREC-HC1 (4SsS/4EL/6S1L/6BL) nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl,
Ba-El a ki-S'l-a, IREC-HC2 (4SsS/4AmL/6S1L/6BL) nesúci Ms~
Ssl, rht-Ssl, Ba-Aml a ki-S'l-a alebo IREC-HC3 (4AmS/4AmL/eS^/ôBL) nesúci Ms-A™!, rht-Aml, Ba-A1! a ki-S2l-a a
b) zber semien zo samoopeľovacieho potomstva rastlín (a), ktoré sú všetky homozygotné pre uvedené alely peľovej sterility a alely génu navodzujúceho peľovú sterilitu, 50 % z nich je dizomických pre chromozóm 6B a chýba im IREC-HC a preto sú červeno/bielo sfarbené a po vypestovaní sa z nich vyvinú peľovo sterilné rastliny. Zvyšných 50 % semien je monozomických pre chromozóm 6B a monozomických pre IRECHC a preto sú sfarbené na modro. Po vypestovaní poskytnú pelovo fertilné rastliny a pre ďalšiu generáciu semená potomstva (a), v ktorom budú peľovo fertilné rastliny vznikať samoopelením a budú tiež opeľovať peľovo sterilné rastliny a
c) zber semien z rastlín potomsťva (b) , ktoré sú všetky
homozygotné pre uvedené alely peľovej sterility, 75 % z nich je dizomických pre chromozóm 6B a chýba im IREC-HC, preto sú červeno/bielo sfarbené a môžu byť deliacim zariadením oddelené od modrých semien obsahujúcich IREC-HC. Po výseve sa z nich vyvinie pelovo sterilná samičia línia.
Podľa vynálezu sa môžu používať všetky alely pre peľovú sterilitu Ms-Bl, napríklad alely Ms-Bl-a, Ms-Bl-b a Ms-Bl-c alebo ďalšie alely z tohto lokusu alebo iného lokusu pšenice letnej alebo tvrdej, ktoré vyvolávajú peľovú sterilitu. Podľa vynálezu môžu byť použité všetky alely Ba z akéhokoľvek druhu Graminae, napríklad Ba-A1! z T. monococcum, Ba-El z A. elongatum, Ba-Rl z ryže a Ba-Hl z jačmeňa. Podľa vynálezu môže byť použitá akákoľvek alela,
ktorá ovplyvňuje vlastnosti semien. Podľa vynálezu môže byť použitá akákoľvek alela rht z akéhokoľvek druhu Graminae, napríklad rht-Ssl z Ae. Searsii, rht-Ssl z Ae. longissima a rht-Aml z T. monococcum. Podľa vynálezu môže byť použitá akákoľvek alela z akéhokoľvek druhu Graminae nesúca rezistenciu proti herbicídom, napríklad Su-Ssl z Ae. longissiina. Podľa vynálezu môže byť použitá akákoľvek alela kí z akéhokoľvek druhu Graminae nesúca citlivosť na pôsobenie génov navodzujúcich peľovú sterilitu, ako je napríklad Ki-Bl.
V ďalšom uskutočnení vynálezu je opísaný spôsob získania pelovo sterilnej udržiavacej línie pšenice letnej a- tvrdej, ktorého cieľom samičej rodičovskej línie Uvedená udržiavacia línia je množe’nie pelovo sterilnej na výrobu hybridnej pšenice, je génovo zhodná so samičou rodičovskou líniou a homozygotná pre ktorúkoľvek alelu peľovej sterility ms-Bl a pre alelu Ki-Bl samičej rodičovskej línie a nesie ešte pridaný cudzorodý vložený chromozóm EC-H1 (4SsS/6S1L), nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl a ki-
S^-a alely. Pretože alela pre peľovú fertilitu nie je prenášaná peľovými zrnkami, celé potomstvo vzniknuté krížením medzi peľovo sterilnou samičou líniou a peľovo fertilnou líniou udržovateľa je izogénne k samičím rodičom a peľovo sterilné.
V ďalšom uskutočnení vynálezu je opísaný spôsob získania pelovo sterilnej udržiavacej línie pšenice letnej a tvrdej, ktorého cieľom je množenie pelovo sterilnej samičej rodičovskej línie pre potrebu výroby hybridnej pšenice. Opísaná udržiavacia línia je izogénna k samičej rodičovskej línii a homozygotná pre ktorúkoľvek alelu peľovej sterility ms-Bl, pre alelu citlivosti na pôsobenie chlórtolurónu su-Bl a pre alelu Ki-Bl génu navodzujúceho peľovú sterilitu samičej rodičovskej línie a nesie ešte pridaný cudzorodý vložený rekombinantný chromozóm EC-HR1 ^S^S/ôS^) , nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl, Su-S5l a ki-S^-a alely. Pretože alela pre peľovú fertilitu udržiavacej línie nie je prenášaná peľovými zrnkami, celé potomstvo vzniknuté krížením medzi peľovo sterilnou samičou líniou a peľovo
fertilnou líniou udržovateľa je génovo zhodné so samičími rodičmi a peľovo sterilné.
V ešte výhodnejšom uskutočnení vynálezu je opísaný spôsob získania pelovo fertilnej udržiavacej línie pšenice letnej a tvrdej, ktorého cieľom je množenie peľovo sterilnej samičej rodičovskej línie pre potrebu výroby hybridnej pšenice. Opísaná udržiavacia línia je génovo zhodná so samičou rodičovskou líniou a homozygotná pre ktorúkoľvek alelu peľovej sterility ms-Bl, ale jemonozomická pre chromozóm 6B a preto hernizygotná pre alelu
Ki-Bl a nesie ešte pridaný cudzorodý vložený rekombinantný chromozóm REC-H1 (4SsS/6S1L/6BL) , distálny k alele ki-S^-a.
Vzdialená oblasť 6BL sa pravidelne páruje s homológnou oblasťou natívneho chromozómu 6BL. Následne, REC bude obsiahnutý v 50 % gamét. Pretože alela pre peľovú fertilitu rekombinantnej udržiavacej línie nie je prenášaná peľovými zrnkami, celé potomstvo vzniknuté krížením medzi pelovo sterilnou samičou líniou a rekombinantnou pelovo fertilnou líniou udržovateľa bude génovo zhodné so samičím rodičom a bude pelovo sterilné. Na druhej strane, 50 % potomstva vzniknutého samoopeľovaním rekombinantného udržovateľa bude obsahovať REC a bude preto pelovo fertilné.
V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je opísaný spôsob získania rekombinantnej peľovo fertilnej udržiavacej línie pšenice letnej a tvrdej, ktorého cieľom je množenie peľovo sterilnej samičej rodičovskej línie pre potrebu výroby hybridnej pšenice. Opísaná udržiavacia línia je génovo zhodná so samičou líniou a homozygotná pre ktorúkoľvek alelu ms-Bl a pre alely su-Bl, ale je monozomická pre chromozóm 6B a preto hemizygotná pre alelu
Ki-Bl a nesie ešte pridaný cudzorodý vložený rekombinantný chromozóm REC-HR1 (4SsS/6S1L/6BL), distálny k alele ki-S1].a. Vzdialená oblasť 6BL sa pravidelne páruje s homológnou oblasťou natívneho chromozómu 6BL. Následne, REC-HR1 bude obsiahnutý v 50 % gamét. Pretože alela pre peľovú fertilitu rekombinantnej udržiavacej línie nie je prenášaná peľovými zrnkami, celé potomstvo vzniknuté krížením medzi peľovo sterilnou samičou líniou a rekombinantnou peľovo fertilnou líniou udržovateľa je génovo zhodné so samičím rodičom a je peľovo sterilnéL Na druhej strane, 50 % potomstva vzniknutého samoopelením rekombinantného udržovateľa bude obsahovať REC-HR1 a bude preto peľovo fertilné.
V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je opísaný spôsob získania udržiavacej línie pšenice letnej ktorého cieľom je množenie rodičovskej línie pre potrebu Opísaná udržiavacia línia je tvrdej, peľovo výroby génovo sterilnej hybridnej zhodná so samičej pšenice.
samičou líniou a homozygotná pre ktorúkoľvek alelu peľovej sterility ms-Bl a pre alelu Ki-Bl génu navodzujúceho peľovú sterilitu samičieho rodiča. Ďalej nesie pridaný vylepšený vložený chromozóm IEC-HC a to buď IEC-HC1 (4SsS/4EL/6S1L) , IEC-HC2 (4SsS/4AmL/6S1L) , alebo IEC-HC3 (4AraS/4AmL/6S1L) , nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-El a ki-S^-a, Ms-Ssl, rht-S5!,
Ba-Aml a ki-S^-a a Ms-Anl, rht-A1”!, Ba-Aml a ki-S^-a alely. Akákoľvek alela pre selekčný marker môže nahradiť v IEC-HC Ba alelu. Ak je selekčný marker pre semeno charakteristický, ako je farba semena, semená v potomstve vzniknuté samoopelením udržovatela sa vyvinú do rastlín, ktoré sú génovo zhodné so samičou rodičovskou líniou a sú pelovo sterilné. Tieto semená môžu byť oddelené od tých,
ktoré sa vyvinú do pelovo fertilnej udržiavacej línie. Takto možno množiť pelovo sterilnú samičiu rodičovskú líniu samoopelením vylepšeného udržovatela, ktorý obsahuje selekčný marker pre semená. 80 % semien vzniknutých samoopelením vylepšenej udržiavacej línie je červených/ bielych a keď sa vypestujú, poskytnú pelovo sterilné rastliny. 20 % semien je modrých a po vypestovaní sa vyvinú do pelovo fertilnej rastliny.
V ďalšom výhodnom uskutočnení získania vylepšenej rekombinantnej vynálezu je udržiavacej spôsob línie pšenice letnej a tvrdej, ktorého cieľom je množenie sterilnej hybridnej samičej pšenice.
rodičovskej línie pre potrebu Opísaná udržiavacia línia je pelovo výroby génovo zhodná so samičou líniou a homozygotná pre ktorúkoľvek alelu ms-Bl-Bl, ale je monozomická pre chromozóm 6B a preto hemizygotná pre alelu Ki-Bl a nesie ešte pridaný vylepšený vložený cudzorodý rekombinantný chromozóm IREC-HC a to buď IREC-HC1 (4SsS/4EL/6S1L/6BL) , IREC-HC2 (4SsS/4AmL/6S1L/6BL) , alebo IREC-HC3 (4AmS/4AmL/6S1L/6BL), nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-El a ki-S^-a, Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-Aml a ki-S^-a a MsAml, rht-Aml, Ba-Aml a ki-S^-a alely. Všetky obsahujú 6BL časť pšenice letnej. Ktorákoľvek alela pre selekčný marker môže nahradiť v IREC-HC Ba alelu.
Ďalším výhodným uskutočnením vynálezu je spôsob prípravy pelovo sterilnej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej obsahujúcej vložený chromozóm EC-H1 (obrázok 7a), skladajúci sa z:
a) kríženia peľovo sterilnej samičej rodičovskej línie odvodenej z kultivaru Chinese Spring pšenice letnej. Uvedená samičia rodičovská línia je homozygotná pre obe dominantné alely peľovej sterility Ms-Bl, umiestnené na ramene chromozómu 4BS a pre dominantnú alelu Ki-Bl génu navodzujúceho peľovú sterilitu, umiestnenú na 6BL a majúca ďalší cudzorodý chromozóm 6S1, ktorý nesie na svojom dlhom ramene recesívnu alelu pre peľovú sterilitu ki-S^-a so samčou rodičovskou líniou, ktorá je izogénna k samičej rodičovskej línii, ale je homozygotná pre recesívnu alelu peľovej sterility ms-Bl-c a tiež v nej chýba chromozóm 6S1, ktorý je nahradený cudzorodým chromozómom 4Ss, ktorý na svojom kratšom ramene nesie dominantné alely Ms-Ssl a rhtSsl,
b) zberu semien potomstva z kríženia (a) . Vypestovaním týchto semien sa získajú pelovo fertilné rastliny Fi, z ktorých niektoré sú dvojnásobne monozomické v pridaní cudzorodého chromozómu, t.j. majú dva cudzorodé chromozómy 4Ss, ktoré nesú Ms-Ssl a rht-Ssl a 6S1, ktorý nesie ki-S1!a.
c) samoopelenia uvedeného Fi potomstva (b), zhromaždenie veľkého počtu jeho semien. Ich pestovaním sa vytvorili F2 rastliny, z ktorých niektoré sú po pridaní cudzorodého translokovaného vloženého chromozómu monozomické, 25 % z nich je homozygotných pre alelu peľovej sterility ms-Bl-c. To sú požadované rastliny.
d) výberu požadovaných rastlín z (c) pomocou metódy počítania chromozómov a C-pásikovaním, použitím DNA markerov a ich samoopelením,
e) zberu samoopelených semien potomstva (d) . Ich pestovaním sa vytvárajú F3 rastliny, ktoré sú všetky homozygotné k alele peľovej sterility ms-Bl-c. 20 % z nich je peľovo sterilných, pretože nesú aj pridaný vložený chromozóm EC-H1. Takto sa získa požadovaná udržiavacia
línia rastlín,
f) výberu požadovanej udržiavacej línie rastlín z (e) počítaním chromozómov a použitím DNA markerov.
Ďalším výhodným uskutočnením vynálezu je spôsob prípravy peľovo sterilnej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej obsahujúcej vložený chromozóm EC-HR1 (obrázok 8a), skladajúci sa z:
a) kríženia peľovo fertilnej samičej rodičovskej línie odvodenej zo samčej fertilnej udržiavacej línie kultivaru Chinese Spring pšenice letnej. Uvedená samičia rodičovská línia je homozygotná pre obe recesívne alely peľovej sterility Ms-Bl, pre recesívnu alelu citlivosti na chlórtolurón su-Bl a dominantná pre alelu Ki-Bl génu navodzujúceho peľovú sterilitu a majúca ako monozomické pridanie vložený chromozóm EC-H1, ktorý nesie na svojom krátkom ramene dominantnú alelu pre pelovú fertilitu Ms-S1! a semidominantnú alelu rht-Ssl. Na jeho dlhom ramene je recesivna alela citlivosti na chlórtolurón su-Ssl a recesívna alela Ki-Ssl génu navodzujúceho pelovú sterilitu. Ku kríženiu dochádza s líniou diploidných druhov Aegilops searsii, ktoré majú vlastnú dominantnú alelu rezistencie proti chlórtolurónu Su-Ssl na 6S3L, rovnako tak ako Ms-Ssl a rht-S~'l alely na 4SsS ,
b) zberu semien potomstva z kríženia (a) . Vypestovaním týchto semien sa získajú rastliny F:, z ktorých niektoré majú 2n=29 chromozómov, t.j. že majú jednu sadu chromozómov od CS, vložený chromozóm EC-H1 a sadu chromozómov Aegilops searsii, majú teda genotyp ms-BlMs-SslMs-Ssl, ki-Blki-Ssl-a a su-Blsu-S1 lSu-Ssl,
c) výberu F] potomstva z (b) so vzorcom 2n=29 chromozómov a ich spätným krížením s CS ako samčou líniou. Zberom semien tohto potomstva a ich pestovaním sa vytvárajú BCi rastliny, z ktorých niektoré sú rezistentné proti chlórtolurónu a sú monozomické pre pridaný vložený chromozóm EC-HR1. Všetky rastliny sú heterozygotné k msBlMs-Bl a homozygotné pre su-Bl a Ki-Bl. To sú požadované rastliny,
d) výberu požadovaných rastlín z (c) pomocou počítania chromozómov, metódou C-pásikovania a použitím DNA markerov a ich samoopelenia,
e) zberu samoopelených semien potomstva (d) a ich pestovaním sa vytvárajú BCiF2 rastliny, z ktorých je 20 % rezistentných proti chlórtolurónu, t. j. nesú vložený chromozóm, 25 % rastlín je homozygotných k ms-Bl, ale sú pelovo sterilné, pretože nesú Ms-Ssl z vloženého chromozómu EC-HR1. Takto sa získa požadovaná udržiavacia línia rastlín,
f) výberu požadovanej udržiavacej línie rastlín z (e) pomocou ich rezistencie proti chlórtolurónu a použitím DNA markerov.
Ďalším výhodným uskutočnením vynálezu je spôsob prípravy peľovo sterilnej rekombinantnej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej obsahujúcej vložený chromozóm REC-H1 (obrázok 7b), skladajúci sa z:
a) kríženia peľovo fertilnej samičej rodičovskej línie odvodenej z kultivaru Chinese Spring pšenice letnej.
Uvedená samičia rodičovská línia je homozygotná pre dominantnú alelu peľovej fertility Ms-Bl na ramene chromozómu 4BS a pre dominantnú, homológne sa párujúcu alelu supresora Phl na ramene chromozómu 5BL, nulizomická pre chromozóm 6B a teda deficitná pre dominantnú alelu KiB1 génu navodzujúceho peľovú sterilitu a majúcu pár chromozómov 6S1, ktoré nesú recesívnu alelu pre peľovú sterilitu Ki-S1l-a so samčím rodičom, ktorý je génovo zhodný so samičím rodičom, ale je dizomický pre 6B a teda homozygotný pre Ki-Bl, bez chromozómu 6S1, je homozygotný aj pre mutantnú, homológne sa párujúcu alelu supresora phl b,
b) zberu semien potomstva z kríženia (a) . Výsevom týchto semien sa získajú peľovo fertilné rastliny Fx (Ms-BIMs-Bl), ktoré sú heterozygotné pre homológne sa párujúce alely supresora (Phlphlb). Všetky sú monozomické pre oba chromozómy, t.j. pre 6B,
c) spätného kríženia Fx z (b) so samčím rodičom
d) zberu potomstva z kríženia (c) . Ich pestovaním sa vytvárajú BCi rastliny, z ktorých všetky sú pelovo fertilné (Ms-BIMs-Bl) , 50 % homozygotných pre alelu phlb, z ktorých okolo 50 % je dvojnásobne monozomických pre oba chromozómy 6B a 6S1, (pretože 6B sa páruje s 6S1) . Toto sú požadované rastliny,
e) výberu požadovaných rastlín BCi z (d) použitím DNA
markerov, analýzou párovania chromozómov pri meióze. Ich opelenie ditelozomickou 6BS líniou, (t.j. líniou deficitnou pre 6BL ramená), ktorá je génovo zhodná s BCX rastlinami, ale je homozygotná k PhlPhl,
f) zberu semien potomstva z kríženia (e) . Ich pestovaním sa vytvárajú rastliny, ktoré sú všetky monotelozomické pre rameno chromozómu 6BS, niektoré z nich sú monozomické pre vložený chromozóm, ktorý pozostáva z krátkeho ramena a blízkej oblasti dlhého ramena 6S1 (nesie ki-S1l-a) a vzdialenej oblasti chromozómu 6BL (bod rekombinácie je distálny k ki-S1l-a). Toto sú požadované rastliny,
g) výberu semien požadovaných rastlín z (f) pomocou metódy C-pásikovania, použitím DNA markerov a analýzami párovania chromozómov a ich kríženia v úlohe samčej línie so samičou líniou, ktorá nie je rekombinantnou udržiavacou líniou. To znamená, že je homozygotná pre ktorúkoľvek z oboch recesívnych alel pre peľovú sterilitu ms-Bl a dominantná pre alelu génu navodzujúceho peľovú sterilitu Ki-Bl a má vložený chromozóm EC-H1, ktorý nesie Ms-Ssl, rht-Ssl a ki-Ssl-a alely,
h) zberu semien potomstva z kríženia (g) a ich pestovaním sa vytvárajú Fi rastliny, z ktorých niektoré sú monozomické, t. j. monozomické pre 6B, pre cudzí vložený chromozóm EC-H1 a pre rekombinantný chromozóm (6S1/6BL) a sú heterozygotné pre Ms-Blms-Bl, hemizygotné pre Ki-Bl a homozygotné pre ki-S1!.-akí-S11-a. Toto sú požadované rastliny,
i) výberu požadovaných rastlín z (h) pomocou počítania chromozómov, C-pásikovania, použitím DNA markerov. Ich opelením, zberom semien potomstva a ich výsevom sa vytvoria rastliny F2, z ktorých niektoré sú dvojnásobne monozomické, obsahujú chromozóm 6B a vložený rekombinantný chromozóm REC-H1 (4SsS/6S1L/6BL), ktorý nesie alely Ms-Ssl, rht-Ssl a ki-S^-a. Toto je požadovaná udržiavacia línia rastlín.
Vynález sa ďalej týka spôsobu prípravy peľovo sterilnej rekombinantnej udržiavacej línie pšenice- letnej alebo tvrdej obsahujúcej vložený chromozóm REC-HR1 (obrázok 8b), skladajúci sa z:
a) kríženia pelovo fertilnej samičej rodičovskej línie odvodenej z pelovo fertilnej rekombinantnej udržiavacej línie kultivaru Chinese Spring pšenice letnej. Uvedená samičia rodičovská línia je monozomická pre 6B monozomické pridanie REC-H1. Táto samičia rodičovská línia je homozygotná pre recesívnu alelu peľovej sterility ms-Bl na ramene chromozómu 4BS a hemizygotná pre recesívnu alelu citlivosti na chlórtolurón su-Bl a dominantná pre alelu KiBl génu navodzujúceho peľovú sterilitu a majúca ako monozomické pridanie vložený rekombinantný chromozóm REC-H1 (4SsS/6S1L/6BL), ktorý nesie na svojom krátkom ramene dominantnú alelu pre peľovú fertilitu Ms-S'l a semidominantnú alelu rht-Ssl. Na jeho dlhom ramene je recesívna alela citlivosti na chlórtolurón su-S:l a recesivna alela Ki-S‘l génu navodzujúceho peľovú sterilitu. Kríženie prebieha s líniou diploidných druhov Aegilops searsii, ktoré majú vlastnú dominantnú alelu rezistencie proti chlórtolurónu Su-Säl na 6SsL, rovnako tak ako alely Ms-Ssl a rht-Ssl,
b) zberu semien potomstva z kríženia (a) . Vypestovaním týchto semien sa získajú rastliny Fx, z ktorých 50 % obsahuje vložený rekombinantný chromozóm, ktorý sa páruje s 4Ss a 6Ss a tak tvorí trivalent pri meióze, ktorý má genotyp ms-BlMs-SslMs-Ssl, ki-Ssl-a su-Ssl a Su-Ssl,
c) výberu opísaného Fx potomstva z (b) a jeho spätného kríženia s cv. Chinese Spring ako samčou líniou,
d) zberu semien potomstva kríženia (c) a ich pestovaním sa vytvárajú BCi rastliny, z ktorých sú všetky heterozygotné k ms-BlMs-Bl a preto peľovo fertilné, niektoré rastliny sú monozomické pre 6B a teda aj hemizygotné pre su-Bl a Ki-Bl a majú vložený rekombinantný chromozóm REC-HR1 a ako monozomickú substitúciu nesú Ms-Ssl a rht-Ssl na krátkom ramene a Su-Ssl a ki-Ssl-a na dlhom ramene. Toto sú požadované rastliny,
e) výberu požadovaných rastlín z (d) pomocou ich rezistencie proti chlórtolurónu a pomocou analýzy párovania chromozómov v meióze a ich samoopelenia,
f) zberu semien zo samoopeleného potomstva z (e) a ich pestovaním sa pripravia BC1F2 rastliny, 50 % z nichje monozomických na 6B a monozomických pre vložený rekombinantný chromozóm REC-HR1, pozostávajúci z krátkeho ramena 4S3 (nesúceho Ms-Ssl a rht-Ssl) , z blízkej oblasti dlhého ramena chromozómu 6S1 (nesúceho Su-Ssl a ki-Ssl-a) a z distálnej oblasti chromozómového ramena 6BL (rekombinantný bod je distálny k ki-Ssl-a) . 25 % týchto rastlín je hemizygotných pre su-Bl a Ki-Bl. Toto je požadovaná udržiavacia línia,
g) výberu požadovaných rekombinantných rastlín udržiavacej línie z (f) s využitím ich rezistencie proti chlórtolurónu, použitím DNA markerov a metódou chromozómového párovania.
Vynález sa ďalej týka spôsobu prípravy pelovo fertilnej vylepšenej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej obsahujúcej vylepšený vložený chromozóm IEC-HC1 (obrázok 9a-b), skladajúci sa z:
•
a) kríženia pelovo fertilnej samičej rodičovskej línie odvodenej z kultivaru Chinese Spring pšenice letnej (uvedená samičia rodičovská línia je udržiavacou líniou, t.j., že je homozygotná pre obe recesívne alely pelovej sterility ms-Bl na ramene chromozómu 4BS, dominantná pre alelu Ki-Bl génu pre navodenie pelovej sterility na 6BL a majúca vložený chromozóm EC-H1, ktorý nesie na svojom krátkom ramene dominantne alely Ms-Ssl a rht-Ssl a na dlhom ramene recesívnu alelu ki-S11-a) so samčím rodičom, ktorý je izogénny so samičím rodičom, ale je homozygotný pre dominantnú alelu Ms-Bl a obsahuje ešte ďalší pár cudzorodých chromozómov 4E, ktoré nesú na svojich ramenách alelu pre modrú farbu aleurónu Ba-El, dlhých
b) zberu semien potomstva z kríženia (a), ktoré sú modré, ich ožiarenie pomalými neutrónmi. Výsevom semien sa získajú pelovo fertilné rastliny Fi, všetky sú heterozygotné pre Ms-Blms-Bl a homozygotné pre Ki-Bl. 20 % z nich je dvojnásobne monozomických po pridaní chromozómu
EC-H1 a pre chromozóm 4E. To sú všetky týchto vloženého požadované rastliny.
c) výberu chromozómov
d)
Ich rastlín požadovanej a použitím DNA markerov zberu semien z potomstva (c), počítaním
Fi generácie a ich samoopelenie, výberu modrých semien.
z ktorých niektoré majú výsevom dostaneme F2 rastliny, z týchto obsahujú vylepšený obsahujúci 4SsS/4EL/6S1L a a ki-S11-a. To sú chromozómov a niektoré vložený chromozóm IEC-HC1, nesúci alely Ms-Ssl, rht-Ssl rastliny, kým ďalšie obsahujú translokovaný 4SsS/4EL, požadované chromozóm
e) výberu požadovaných rastlín z (d) pomocou chromozómov a DNA markerov a ich samoopelenia, počítania
f) zberu semien zo samoopeleného potomstva z (e) modrých semien, ich pestovaním sa vyvinú pelovo rastliny, ktoré nesú vylepšený vložený Toto je vylepšená požadovaná udržiavacia chromozóm a výberu fertilné
IEC-HC1.
línia rastlín,
g) ak sa v kroku (d) nezískajú rastliny, potom výberom rastlín z žiadne požadované (d), ktoré majú translokovaný chromozóm 4SsS/4EL (pôvodom z modrých semien a sú peľovo fertilné), použitím metódy počítania chromozómov a DNA markerov a ich spätným krížením vo funkcii samčieho rodiča s udržiavacou líniou, ktorá obsahuje EC-H1 sa získajú semená Fx,
h) výberu semien Fx z (g), ktoré majú modrú farbu, z ich ožiarenia pomalými neutrónmi, ich klíčenia, výsevu a výberu
sadeníc so 44 chromozómami, t.j. s obsahom dvoch pridaných cudzorodých vložených chromozómov 4SsS/4EL a 4SsS/6SlL a
i) opakovania krokov (d) až (f), čim získaná požadovaná vylepšená udržiavacia línia obsahuje vylepšený vložený chromozóm IEC-HC1, ktorý obsahuje 4535/4ΕΕ/65^, nesúci BaE1 a kí -S11-a.
Vynález sa ďalej týka spôsobu prípravy peľovo fertilnej vylepšenej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej obsahujúcej vylepšený vložený chromozóm IEC-HC1 (obrázok 9c), skladajúci sa z:
a) kríženia peľovo fertilnej samičej rodičovskej línie odvodenej z kultivaru Chinese Spring pšenice letnej (uvedená samičia rodičovská línia je homozygotná pre dominantnú alelu peľovej fertility Ms-Bl, pre dominantnú alelu Ki-Bl génu navodzujúceho peľovú sterilitu a obsahujúca ešte ďalší pár cudzorodých chromozómov 4E, ktoré nesú nesú na svojich dlhých ramenách alelu pre modrú farbu aleurónu Ba-El) so samčím rodičom, ktorý je génovo zhodný so samičím rodičom, ale je homozygotný pre recesívnu alelu peľovej sterility ms-Bl-c a nesie pridaný cudzí chromozóm
4S5, ktorý nesie na svojom krátkom ramene dominantné alely Ms-Ssl a rht-Ssl,
b) zberu semien potomstva z kríženia (a) a z výsevu týchto semien sa získajú rastliny Fi, z ktorých všetky sú heterozygotné pre Ms-Blms-Bl a homozygotné pre Ki-BlKi-Bl, % z nich má dvojnásobne monozomické pridanie chromozómov
4E a 4Sb. To sú požadované rastliny,
c) výberu požadovaných rastlín F: z (b) pomocou metódy počítania chromozómov a DNA markerov a ich samoopelenia,
d) výberu modrých semien vzniknutých samoopelením (c), ich výsevom sa pripravia F2 rastliny, z ktorých niektoré obsahujú translokovaný chromozóm 4Ss/4EL. To sú nami požadované rastliny,
e) výberu požadovaných F2 rastlín z (d) pomocou metódy počítania chromozómov a DNA markerov, ich kríženie so samčou udržiavacou líniou obsahujúcou EC-H1 (4SsS/6S1L)a líniou z Fi semien, z ktorých niektoré sú modré,
f) výberu semien z (e), ktoré majú modrú farbu a ich ožiarenia pomalými neutrónmi. Ich klíčením a pestovaním sa získajú Fx rastliny, ktoré sú všetky homozygotné pre obe ms-Blc a Ki-Bl, niekolko z nich obsahuje dvojnásobne monozomické pridanie 4SsS/4EL a 4SsS/6S1L. Toto sú požadované rastliny,
g) výberu požadovaných rastlín z (f) pomocou metódy počítania chromozómov a DNA markerov a ich samoopelenia,
h) zberu semien z potomstva (g), výberu modrých semien a ich pestovaním sa získajú F, rastliny, všetky sú homozygotné pre obe alely ms-Bl-c a Ki-Bl, niektoré majú 43 chromozómov. Z týchto rastlín niektoré obsahujú vylepšený rekombinantný chromozóm IEC-HC1, obsahujúci 4SsS/4EL/6S1L, nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-El a ki-S:l. To sú požadované rastliny,
i) výberu požadovaných rastlín z (h) pomocou metódy počítania chromozómov, C-pásikovania a skúšky peľovej fertility a ich samoopelenia,
j) zberu potomstva semien z (i), výberu modrých semien. Ich pestovaním sa získajú pelovo fertilné rastliny, ktoré nesú IEC-HC1, čo je požadovaná vylepšená udržiavacia línia rastlín.
Vynález sa ďalej týka spôsobu prípravy peľovo fertilnej vylepšenej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej obsahujúcej vylepšený vložený chromozóm IEC-HC2 (obrázok 10), skladajúci sa z:
a) kríženia dizomicky substituovanej samčej rodičovskej línie pšenice letnej cv. Chinese Spring, v ktorej nahrádza chromozóm 4Am z T. monococcum 4B chromozóm pšenice letnej a teda vzniknutý samčí rodič je deficientný pre alelu peľovej fertility Ms-Bl, homozygotný pre alelu Ki-Bl génu vnášajúceho peľovú sterilitu a pre alely Ms-Aml a rht-Am na 4AmS a Ba-Aml na 4AmL. Kríženie prebieha so samičím rodičom, génovo zhodným so samčím rodičom, ale homozygotným pre recesívnu alelu peľovej sterility ms-Bl a majúcim pridaný vložený cudzorodý chromozóm 4Ss, ktorý nesie na svojom krátkom ramene dominantné alely Ms-Ssl a rht-Ssl,
b) zberu semien potomstva z kríženia (a), všetky sú modré. Výsevom týchto semien sa získajú rastliny Fi, z ktorých všetky sú hemizygotné pre ms-Bl-c, niektoré z nich sú trojnásobne monozomické pre 4B, 4Ss a 4Am. To sú požadované rastliny,
c) výberu trikrát monozomických rastlín z (b) počítaním chromozómov, tak sa pripravia Fi rastliny a nechajú sa samoopeliť,
d) zberu potomstva semien F2 z (c) , výberu modrých semiena a pestovania týchto vybraných semien, získajú sa F2 rastliny, ďalším výberom z týchto F2 rastlín tie, ktoré majú 44 chromozómov (ukazujú 21+2'v meióze) , tieto rastliny sú tie, ktoré podľa požiadavky sú dvojnásobne monozomické po pridaní 4Ss a 4Am,
e) samoopelenia vyššie opísaných požadovaných rastlín (d), získajú sa F3 semená, selekcia modrých semien,
f) výberu semien z (e) , ktoré majú modrú farbu a výberu rastlín so 43 chromozómami (21,,+1), ktoré sú pelovo fertilné a produkujú modré semená, tieto rastliny majú translokovaný chromozóm 4SsS/6AmL a sú to požadované rastliny,
g) kríženia požadovaných rastlín z (f) ako samčej línie s udržiavacou líniou, ktorá je homozygotná pre ms-BlmsBlKi61
BlKiBl a má EC-H1 (4SsS/6S‘L) nesúci Ms-Sslrht-Sslki-Ssl-a ako samičiu líniu, tak sa získajú semená Fi,
h) výberu semien z potomstva Fi z (f), ktoré majú modrú farbu, ich ožiarenia pomalými neutrónmi. Ich klíčením a pestovaním a ďalej výberom rastlín so 44 chromozómami (21,,+1,,), t.j., že sú dizomické po pridaní krátkeho ramena a dvojnásobne monozomické pre dlhé rameno cudzieho chromozómu. Ich samoopelením a
i) pestovaním modrých semien z (h) a ďalej výberom pelovo fertilných rastlín so 43 chromozómami, ktoré produkujú modré a červené/biele semená. Tieto rastliny majú IEC-HC2 a sú to požadované rastliny,
j) samoopelenia požadovaných rastlín z (i), zberu potomstva semien z (i), výberu modrých semien. Ich pestovaním sa získajú peľovo fertilné rastliny nesúce IECHC2, to je požadovaná vylepšená udržiavacia línia rastlín.
Vynález sa ďalej týka spôsobu prípravy pelovo fertilnej vylepšenej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej obsahujúcej vylepšený vložený chromozóm IEC-HC3 (obrázok 11), skladajúci sa z:
a) kríženia dizomicky substituovanej samčej rodičovskej línie pšenice letnej cv. Chinese Spring, v ktorej nahrádza chromozóm 4Aln z T. monococcum 4B chromozóm pšenice letnej a
teda vzniknutý samčí rodič je deficientný pre alelu pelovej fertility Ms-Bl, homozygotný pre alelu Ki-Bl génu vnášajúceho pelovú sterilitu a pre alely Ms-Aml a rht-Aml na 4AmS a Ba-Aml na 4AmL, so samičím rodičom izogénnym k samčiemu rodičovi, ale homozygotným pre recesívnu alelu peľovej sterility ms-Bl a majúcim pridaný vložený cudzorodý chromozóm 4S', ktorý nesie na svojom krátkom ramene dominantné alely Ms-Ssl a rht-Ssl,
b) zberu semien Fi potomstva z potomstva (a), ktoré sú všetky modré. Výsevom týchto semien sa získajú rastliny Fi, všetky hernizygotné pre ms-Bl-c, homozygotné pre Ki-Bl, z ktorých je 7 5 % monozomických pre 4B a ďalej monozomických pre substitúciu 4An nesúcu Ms-Aml, sú teda peľovo fertilné. Použitie rastlín s touto monozomicko-monozomickou substitúciou na opelenie samičieho rodiča, heterozygotného pre Ms-Blms-Bl a homozygotného pre Ki-Bl alely, a majúceho ako monozomické pridanie chromozóm 6S1, kým samičí rodič bol získaný z kríženia samčieho rodiča Chinese Spring 4Ss, monozomického pre pridanie ms-Bl-cms-Bl-c a samičieho rodiča, homozygotného pre Ms-Bl a Ki-Bl alely a majúceho _ako monozomické pridanie chromozóm 6S1, 20 % potomstva má potom požadované zloženie,
c) zberu semien potomstva z kríženia (b), ktoré sú všetky modré, ich ožiarenie pomalými neutrónmi. Výsevom týchto semien sa získajú Fi, ktoré majú 43 (21,,+1') a 42 (20,,+2,,) chromozómov. Ďalej dôjde k samoopeleniu týchto rastlín a
d) výberu samoopelených semien z (c), ktoré majú modrú farbu, ich klíčením, pestovaním a výberom sa získajú rastliny, ktoré sú pelovo fertilné, obsahujú však asi 20 % nefunkčného peľu a poskytujú modré a červené/biele semená a
e) pestovaním týchto semien z (d) a výberu modrých semien, ktoré sa po vypestovaní vyvinú do pelovo fertilnej rastliny s IEC-HC3 (so 43 chromozómami) . To je požadovaná vylepšená udržiavacia línia rastlín.
Vynález sa ďalej týka spôsobu prípravy pelovo fertilnej vylepšenej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej obsahujúcej vylepšený vložený rekombinantný chromozóm IREC-HC (obrázok 12), skladajúci sa z:
a) kríženia pelovo fertilnej samičej rodičovskej línie odvodenej z kultivaru Chinese Spring pšenice letnej (uvedená samičia rodičovská línia je homozygotná pre dominantnú alelu peľovej fertility Ms-Bl na ramene chromozómu
4BS a pre dominantnú alelu homológne sa párujúceho nulizomická alelu Ki-Bl supresora Phl na ramene chromozómu 5BL, pre chromozóm 6B a preto tiež deficitná pre génu vnášajúceho peľovú sterilitu. Línia ďalej obsahuje pár chromozómov 6S1, ktoré nesú recesívnu alelu génu pre navodenie peľovej sterility ki-SJl-a so samčou
líniou, ktorá je génovo zhodná so samičou rodičovskou líniou, ale je dizomická pre 6B a preto homozygotná pre KiBl, ďalej jej chýba chromozómu 6S1. Je homozygotná aj pre mutantnú alelu homologického párovania phlb,
b) zberu semien potomstva z kríženia (a), ich pestovaním sa pripravia peľovo fertilné (Ms-BIMs-Bl) rastliny, heterozygotné pre homológne sa párujúce alely (Phlphlb). Všetky rastliny sú monozomické pre oba chromozómy 6B a 6S1,
c) spätného kríženia opísaných Fi rastlín z (b) so samčím rodičom,
d) zberu semien potomstva z kríženia (c). Pestovaním uvedených semien sa vyprodukujú BCi rastliny, ktoré sú všetky peľovo fertilné (Ms-BIMs-Bl}, polovica z nich je homozygotná pre alelu phlb, z ktorých je opäť približne polovica (pretože 6B sa páruje s 6S1) dvojnásobne monozomická pre 6B a 6S1 chromozómy. Toto sú požadované BCX rastliny,
e) výberu BCX rastlín z (d) pomocou párovania chromozómov v meióze a pomocou DNA markerov, ich opelenie líniou, ktorá je ditelozomická 6BS (t.j. deficientná pre rameno 6BL) a génovo zhodná s rastlinami BCX, ale je homozygotná PhlPhl,
f) zberu semien potomstva z (e). Ich pestovaním sa získajú rastliny, ktoré sú monotelozomické pre 6BS, niektoré z nich sú tiež monozomické pre rekombinantný chromozóm, ktorý pozostáva z krátkeho ramena a proximálnej oblasti dlhého ramena 6S1 (nesie ki-S^-a} a distálnej oblasti chromozómového ramena 6BL (bod translokácie je distálny k ki-S^-a} . To sú požadované rastliny,
g) výberu požadovaných rastlín z (f) pomocou metódy Cpásikovania, metódy párovania chromozómov a použitím DNA markerov a ich kríženia vo funkcii samčej línie so samičou, ktorá je vylepšenou udržiavacou líniou, t.j., že je homozygotná pre ktorúkoľvek z nasledujúcich alel a to pre recesívnu alelu peľovej sterility ms-Bl a dominantnú alelu génu navodzujúceho peľovú sterilitu Ki-Bl a má jeden z vylepšených vložených chromozómov IEC-HC1 (4SsS/4EL/6S1L), IEC-HC2 (4SsS/4AmL/6S1L) alebo IEC-HC3 (4AmS/4AraL/6S1L) , ktoré nesú Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-El a ki-S1l-a, Ms-Ssl, rht65
Ssl, Ba-Aml alebo ki-S1l-a a Ms-Aal, rht-Aml, Ba-Aml a kiSll-a,
h) zberu semien potomstva z kríženia (g), z výsevu týchto semien sa získajú rastliny F·., z ktorých niektoré sú trojnásobne monozomické, t.j. monozomické pre 6B, ďalej pre jeden vylepšený vložený chromozóm IEC-HC1, IEC-HC2 alebo IEC-HC3 a pre rekombinantný chromozóm (ôsVôBL) a sú ďalej heterozygotné pre ms-BIMs-Bl a hemizygotné pre Ki-Bl. To sú požadované rastliny,
i) výberu rastlín z (h) počítaním chromozómov, pomocou metódy C-pásikovania a použitím DNA markerov, ich samoopelenia, zberu semien týchto vybraných rastlín a ich pestovania. Niektoré sú dvojnásobne monozomické, majú chromozóm 6B a vylepšený vložený rekombinantný chromozóm IREC-HC a to buď IREC-HC1 (4SsS/4EL/6S1L/6BL) , IREC-HC2 (4SsS/4AmL/6S1L/6BL) .alebo IREC-HC3 (4AmS/4AmL/6S1L/6BLl . Toto je požadovaná udržiavacia línia rastlín s IREC-HC.
Vynález ďalej opisuje spôsob na udržanie konštantného pomeru medzi pelovo fertilnými a sterilnými rastlinami v každej generácii udržiavacej línie alebo rekombinantnej udržiavacej línie pšenice letnej a tvrdej. Spôsob pozostáva z nasledujúcich krokov:
a) samoopelenie pelovo fertilnej udržiavacej línie obsahujúcej vložený chromozóm vybraný zo skupiny vložených chromozómov EC-H1 a vloženého rekombinantného chromozómu REC-H1, ktoré majú okrem alel Ms-Ssl a ki-S^-a ešte alelu rht-Ssl ako selekčný marker, ktorý uľahčuje oddelený zber semien z peľovo fertilného potomstva samoopeľovacej udržiavacej línie. Semená sa po vypestovaní vyvinú do udržiavacej línie,
b) zber semien z potomstva (a), pestovaním týchto semien vznikajú rastliny, v ktorých 20 % (potomstvo udržiavacej línie) má vložený chromozóm EC-H1 a 50 % (potomstvo udržiavacej línie s vloženým rekombinantným chromozómom REC-H1) obsahuje vyššie uvedený chromozóm, tieto rastliny sú identické s udržiavacou líniou a nesú alelu rht-Ssl. Sú vyššie (o 6 až 8 cm) , ako tie, ktoré tento chromozóm nemajú,
c) zber vyšších rastlín z (b), z ktorých všetky sú pelovo fertilné.
Získané potomstvo semien sa skladá zo semien, ktoré z % (EC-H1) a z 50 % (REC-H1) obsahujú dané vložené rekombinantné chromozómy. Takto sa v každej alebo rekombinantnej udržiavacej generácii udržiavacej línie udržuje pomer peľovo fertilných ku pelovo sterilným rastlinám.
Vynález ďalej opisuje spôsob na udržanie konštantného pomeru medzi pelovo fertilnými a sterilnými rastlinami v každej generácii udržiavacej línie alebo rekombinantnej udržiavacej línie pšenice letnej a tvrdej. Spôsob pozostáva z nasledujúcich krokov:
a) samoopelenie peľovo fertilnej udržiavacej línie obsahujúcej rekombinantný chromozóm vybraný zo skupiny vložených chromozómov EC-HR1 a vložených rekombinantných chromozómov REC-HR1, ktoré majú okrem alel Ms-Ssl a ki-S1!.a ešte alelu Su-Ssl ako selekčný marker, ktorý uľahčuje výber rastlín, ktoré si udržali rovnaký genotyp ako peľovo fertilné potomstvo v samoopelovacej udržiavacej línii,
b) zber semien z potomstva (a) , ich klíčenie a pestovanie. Získajú sa sadenice potomstva, z ktorých 20 % (udržiavacia línia s vloženým chromozómom EC-HR1) a 50 % (potomstvo udržiavacej línie s vloženým rekombinantným chromozómom REC-HR1) obsahuje uvedený rekombinantný chromozóm, ich postrek herbicídom chlórtolurónom, ktorý zničí všetky naňho citlivé rasliny, t.j. tie, ktoré nemajú EC-HR1 alebo REC-HR1,
c) zber rastlín z (b), odolných proti pôsobeniu chlórtolurónu, z ktorých všetky sú pelovo fertilné a nesú EC-HR1 a REC-HR1. Získané potomstvo semien sa skladá zo semien, ktoré z 20 % (EC-H1) a z 50 % (REC-H1) obsahujú dané vložené chromozómy. Týmto spôsobom sa v každej generácii udržiavacej alebo rekombinantnej udržiavacej línie udržuje pomer peľovo fertilných ku pelovo sterilným rastlinám.
Vynález opisuje ešte ďalší spôsob na udržanie konštantného pomeru medzi peľovo fertilnými a sterilnými rastlinami v každej generácii udržiavacej línie alebo rekombinantnej udržiavacej línie pšenice letnej a tvrdej. Spôsob pozostáva z nasledujúcich krokov:
a) samoopelenie peľovo fertilnej udržiavacej línie obsahujúcej vylepšený vložený chromozóm vybraný zo skupiny vložených chromozómov IEC-HC1 a vylepšených vložených rekombinantných chromozómov IREC-HC1, ktoré majú okrem alel Ms-Ssl a ki-S1l-a ešte alelu Ba (spôsobuje modrú farbu semien) ako selekčný marker, ktorý uľahčuje výber semien z peľovo fertilného potomstva v samoopeľovacej udržiavacej línii. Tieto semená sa po vysiatí vyvinú do požadovanej udržiavacej línie,
b) zber semien z potomstva (a), oddelenie (pomocou triediaceho zariadenia) modrých semien nesúcich IEC-HC1 alebo IREC-HC1 od červených/bielych semien, ktoré nemajú tieto chromozómy,
c) vypestovanie modrých semien z (b), z ktorých všetky sa vyvinú do peľovo rastlín alebo do fertilnej vylepšenej udržiavacej línie vylepšenej rekombinantnej udržiavacej línie rastlín.
Vynález ďalej opisuje spôsob zamedzenia poškodeniu pri chybnom centrimerickom delení rekombinantného chromozómu v meióze na dva telocentrické chromozómy, (jedno rameno), z ktorých každý nesie na krátkom ramene vloženého chromozómu Ms a rht alebo ki-S1l-a a v prípade EC-HR aj zatiaľ čo v prípade IEC alelu Ba na dlhom ramene, delenia medzi Ms a ki-S1l-a je prenos Ms peľom. Z tohto dôvodu sa vytvára po opelení samičej udržiavacou alebo vylepšenou udržiavacou množstvo peľovo fertilných dvoch prípadoch sa semená buď alely alelu Su,
Výsledkom samičích rastlín.
línie líniou líniou isté posledných vyvinú do semenami.
nesúce Ms po výseve červenými/bielymi nenesú. Ich od do tých, ktoré Ms pelovo sterilnej pelovo fertilnej rastliny Preto nemôžu byť oddelené semená sa po výseve vyvinú prípade EC-HR majú rastliny len krátke rameno chromozómu, nesú Ms-Ssl a rht-Ssl. Sú teda rastliny. V z vloženého pôsobenie chlórtolurónu a môžu byť oddelené citlivé na na základe
aplikácie herbicídu. Použitie rekombinantného udržovatela a vylepšeného rekombinantného udržovatela eliminuje nebezpečie prenosu Ms alely. V týchto rekombinantných líniách a vylepšených rekombinantných líniách sa rekombinantné chromozómom chromozómy
6B a tak pravidelne párujú s natívnym sa následne zabráni chybnému centromerickému deleniu, ktoré sa nevyskytuje u párovaných chromozómov. Tento stav je podporovaný spojením medzi Ms a ki-S'l-a.
Vynález ďalej opisuje spôsob premeny uvažovaného kultivaru pšenice letnej a tvrdej na pelovo sterilnú samičiu rodičovskú líniu obsahujúcu vložený chromozóm EC-H, toto pre samičiu líniu znázorňuje obrázok 16a. Opísaná metóda sa skladá z:
a) kríženia udržiavacej línie homozygotnej pre msBlmsBlKi-BlKiBl, ktorá má cudzorodý vložený chromozóm EC-H1 (4SsS/6S1L) nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl a ki-Ssl-a s požadovaným kultivarom, ktorý je homozygotný pre Ms-BIMs-Blki-BlkiBI,
b) zberu semien potomstva z kríženia (a), ich pestovaním sa pripravia pelovo fertilné Fi rastliny. Všetky sú heterozygotné pre ms-BlMs-BlKi-Blki-Bl-a. 1/4 z nich nesie vložený chromozóm EC-H1. To sú nami požadované rastliny.
c) výberu Fi rastlín z (b) metódou počítania chromozómov a s použitím DNA markerov, ich opelením s uvažovaným kultivarom sa pripraví BCi potomstvo. 1/6 z neho je heterozygotná k ms-BlMs-BlKi-Blki-Bl-a a nesie rekombinantný chromozóm EC-H1. To je požadovaný genotyp.
d) pestovania vyššie opísaných rastlín BC-. z (c) a ich výberu podlá genotypu metódou počítania chromozómov a DNA markerov a ďalším spätným krížením vo funkcii samičieho rodiča s uvažovaným kultivarom po štyri ďalšie generácie s cielom získať piatu generáciu potomstva spätného kríženia (BC5) . Metódou počítania chromozómov a DNA markerov sa v každej generácii vybrali potomkovia heterozygotní pre msBlMs-BlKi-Blki-Bl-a, ktorí nesú rekombinantný chromozóm ECHl.
e) samoopelenia vyššie opísaných rastlín BC5 z (d) , zberu semien potomstva. Pestovaním týchto opísaných semien vzniknú rastliny BC5F2, z ktorých 1/16 je pelovo sterilná a homozygotná pre obe alely pelovej sterility, ms-Bl a pre alelu génu navodzujúceho pelovú sterilitu Ki-Bl a to je požadovaná pelovo sterilná samičia línia. Ďalšie rastliny BC5F2 s podobným genotypom, ale ktoré majú rekombinantný chromozóm EC-H1 nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl a ki-Ssl-a, sú nami požadované rastliny pelovo fertilnej udržiavacej línie rastlín.
Vynález ďalej opisuje spôsob premeny uvažovaného kultivaru pšenice letnej a tvrdej na pelovo sterilnú samičiu rodičovskú líniu a pelovo fertilnú udržiavaciu líniu, obsahujúcu rekombinantný chromozóm EC-HR. Toto pre samičiu líniu znázorňuje obrázok 17a. Opísaná metóda sa skladá z:
a) kríženia udržiavacej línie homozygotnej pre ms-BlmsBlSu-BlSu-BlKi-Bl, ktorá má cudzí rekombinantný chromozóm EC-HR1 nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl, Su-Ssl a ki-Ssl-a s požadovaným kultivarom, ktorý je homozygotný pre Ms-BlMsBlSu-BlSu-BlKi-Blki-BI,
b) zberu semien potomstva z kríženia (a) , ich pestovaním sa pripravia pelovo fertilné F: rastliny. Všetky sú heterozygotné ms-BIMs-BISu-BISu-BlKi-Bl-a. 1/4 z nich nesie rekombinantný chromozóm EC-H1 a to sú nami požadované rastliny,
c) výberu Fi rastlín z (b) metódou počítania chromozómov a s použitím DNA markerov, ich opelením s uvažovaným kultivarom sa pripraví BCi potomstvo. 1/32 z neho je heterozygotné pre ms-BIMs-BISu-BISu-BlKi-BlKi-Bl-a a nesie rekombinantný chromozóm EC-HR1. To je požadovaný genotyp,
d) pestovania vyššie opísaných rastlín BCi z (c) a ich výberu podlá genotypu metódou počítania chromozómov a DNA markerov a ďalším spätným krížením vo funkcii samičieho rodiča s uvažovaným kultivarom po štyri nasledujúce generácie s cielom získať piatu generáciu potomstva spätného kríženia (BC5) . Metódou počítania chromozómov a DNA markerov sa v každej generácii vybrali potomkovia heterozygotní pre ms-BIMs-BISu-BISu-BlKi-Bl-a, ktorí nesú rekombinantný chromozóm EC-HR1,
e) samoopelenia vyššie opísaných rastlín BC5 z (d), zberu semien potomstva. Pestovaním týchto semien vzniknú rastliny BC5F2, z ktorých 1/64 je pelovo sterilná a homozygotná pre obe alely pelovej sterility, ms-Bl a pre alelu génu citlivosti na chlórtolurón su-Bl a génu navodzujúceho pelovú sterilitu Ki-Bl a to je požadovaná pelovo sterilná samičia línia. Ďalšie rastliny BC5F2 s podobným genotypom, ale s rekombinantným chromozómom EC-HR1 nesúcim Ms-Ssl, rht-Ssl, Su-Ssl a ki-S:l-a, sú nami požadované rastliny peľovo fertilnej udržiavacej línie rastlín.
Vynález ďalej opisuje spôsob premeny uvažovaného kultivaru pšenice letnej a tvrdej na pelovo sterilnú samičiu rodičovskú líniu a peľovo fertilnú rekombinantnú udržiavaciu líniu, obsahujúcu rekombinantný chromozóm RECH. Toto pre samičiu líniu znázorňuje obrázok 16b. Opísaná metóda sa skladá z:
a) kríženia udržiavacej línie, obsahujúcej REC-H1 vo funkcii samičieho rodiča, ktorá je homozygotná pre ms-BlmsB1 a monozomická ako pre 6B (hemizygotná pre Ki-Bl), tak aj pre rekombinantný chromozóm REC-H1 (4SsS/6S1L/6BL) , nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl a ki-Ssl-a s požadovaným kultivarom, ktorý je homozygotný Ms-BIMs-Blki-BlkiBI,
b) zberu semien potomstva z kríženia (a), ich pestovaním sa pripravia peľovo fertilné Fi rastliny. Všetky sú heterozygotné ms-BIMs-Bl. Polovica z nich nesie rekombinantný chromozóm REC-H1,
c) výberu dvoch typov Fi rastlín z (b) analýzou párovania chromozómov a DNA markerov, ich opelením s uvažovaným kultivarom sa pripravia dva typy BCi potomstva. Potomstvo odvodené od dizomických F} rastlín, z ktorého 1/4 je heterozygotná k ms-BIMs-BlKi-BlKi-Bl-a. Druhý typ potomstva odvodeného od monozomických Fi, z ktorého 1/4 je dvojnásobne monozomická, heterozygotná pre ms-BIMs-Bl a hemizygotná pre ki-Bl-a. Nesú tiež Ms-Ssl, rht-Ssl a ki-Ssla z rekombinantného chromozómu REC-H1,
d) výberu dvoch skupín rastlín F1 potomstva z (c) metódou párovania chromozómov a použitím DNA markerov a ďalším spätným krížením vq funkcii samičieho rodiča s uvažovaným kultivarom po štyri nasledujúce generácie s cieľom získať piatu generáciu dvoch druhov potomstva spätného kríženia (BC5) . Metódou párovania chromozómov a DNA markerov sa v každej generácii vyberie potomstvo heterozygotné pre ms-
BlMs-BlKi-BlKi-Bl-a v dizomickom type a pre ms-BIMs-Bl v dvojnásobne monozomickom type, ktorý nesie rekombinantný
chromozóm REC-H1,
e) opelenia vyššie opísaných, dvojnásobne monozomických rastlín BC5 z (d) s rastlinami dizomickými z BC5 z (d), vzniknú dve skupiny rastlín BCsF2. Prvou je skupina dizomických rastlín, z ktorých 1/8 je homozygotná pre msBlms-Bl a heterozygotná Ki-Blki-Bl-a. Ďalšou skupinou sú
dvakrát monozomické rastliny, z ktorých 1/8 je homozygotná pre ms-Blms-Bl a hemizygotná Ki-Bl a nesie Ms-Ssl, rht-S3l a ki-S1l-a z rekombinantného chromozómu REC-H1 a preto je pelovo fertilná,
f) pestovania semien vyššie opísaného, dvojnásobne monozomického potomstva BC5F2 z línie (e) a semien dizomickej línie BC5F2 z (e), následného výberu požadovanej, pelovo fertilnej rekombinantnej udržiavacej línie analýzou párovania chromozómov a použitím DNA markerov.
Vynález ďalej opisuje spôsob premeny uvažovaného kultivaru pšenice letnej a tvrdej na pelovo sterilnú samičiu rodičovskú líniu a pelovo fertilnú rekombinantnú udržiavaciu líniu, obsahujúcu rekombinantný chromozóm REC
HR. Toto pre samičiu líniu znázorňuje obrázok 17b. Opísaná metóda sa skladá z:
a) kríženia udržiavacej línie s REC-HR1 ako samičieho rodiča, ktorý je homozygotný pre ms-Blms-Bl a monozomický ako pre 6B (hemizygotný pre su-Bl a Ki-Bl), tak aj pre rekombinantný chromozóm REC-HR1 nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl, SuSsl a ki-Ssl-a s požadovaným kultivarom, ktorý je homozygotný Ms-BIMs-BISu-BISu-Blki-Blki-BI,
b) zberu semien potomstva z kríženia (a) , ich pestovaním sa pripravia peľovo fertilné Fi rastliny, všetky sú heterozygotné ms-BIMs-Bl, z ktorých jedna polovica je dizomická pre chromozóm 6B a preto heterozygotná pre SuBlsu-BlKi-Blki-Bl a druhá polovica je dvojnásobne monozomická, jednak pre chromozóm 6B a jednak pre REC-HR1 a je hemizygotná pre Su-Bl a ki-Bl-a a nesie tiež Ms-Ssl, rht~Ssl, Su-Ssl a ki-Ssl-a z rekombinantného chromozómu RECHR1,
c) výberu dvoch typov Fx rastlín z (b) analýzou párovania chromozómov a použitím DNA markerov, ich opelením uvažovaným kultivarom sa pripravia dva typy BCi potomstva. Potomstvo odvodené od dizomických Fi, z ktorého 1/4 je heterozygotná k ms-BIMs-Bl a druhého typu potomstva odvodeného od monozomických Fi, z ktorého 1/4 je dvojnásobne monozomická, heterozygotná pre ms-BIMs-Bl a hemizygotná pre Su-Bl a ki-Bl-a. Nesú tiež Ms-Ssl, rht-Ssl a ki-Ssl-a z rekombinantného chromozómu REC-HR1,
d) pestovania vyššie opísaných rastlín BCi z (c) a ich výberu metódou párovania chromozómov a použitím DNA
markerov a ďalším spätným krížením vo funkcii samičieho rodiča s uvažovaným kultivarom po štyri nasledujúce generácie s cielom získať dva typy potomstva piatej generácie spätného kríženia (BC5) .
Metódou počítania chromozómov a DNA markerov sa v každej generácii vybralo potomstvo heterozygotné pre ms-BIMs-BIsu-BISu-BlKi-Blki-Bl v dizomickom type a v dvojnásobne monozomickom type, ktorý nesie rekombinantný chromozóm REC-HR1 pre ms-BlMs-Bl,
e) opelenia vyššie opísaných, dvojnásobne monozomických rastlín BC5 z (d) dizomickými rastlinami z BC5 z (d), vzniknú dve skupiny rastlín BC5F2. Prvou je skupina dizomických rastlín, z ktorých 1/16 je homozygotná pre msBlms-Bl a heterozygotná su-BISu-BlKi-BlKi-Bl, a to je skupina požadovaných dizomických rastlín. Ďalšou skupinou sú dvakrát monozomické rastliny, z ktorých 1/16 je homozygotná pre ms-Blms-Bl a hemizygotná su-Bl a Ki-Bl a nesie tiež Ms-Ssl, rht-Ssl,_ Su-Ssl a ki-S^-a z rekombinantného chromozómu REC-HR1 a preto je pelovo fertilná. To sú nami požadované rekombinantné udržiavacie
línie,
f) pestovania semien vyššie opísanej, dvojnásobne monozomickej BC5F2 z (e) línie a semien dizomickej línie BC5F2 z (e) a výberu požadovanej, pelovo fertilnej rekombinantnej udržiavacej línie analýzou párovania chromozómov a odpovedí na pôsobenie chlórtolurónu. Vzniknuté línie sú nami požadovaná pelovo fertilná rekombinantná udržiavacia línia a pelovo sterilná samičia línia,
g) pestovania potomstva dizomických rastlín, ktoré sú všetky homozygotné pre ms-Blms-Bl a preto peľovo sterilné, 1/4 z nich je homozygotná pre su-Blsu-Bl a Ki-BlKi-Bl. To je nami požadovaná peľovo sterilná samičia línia,
h) pestovania vyššie opísaných dizomických rastlín BC5F3 z (g) a výberu pomocou DNA markerov sa vyberie požadovaná peľovo sterilná samičia línia.
Vynález ďalej opisuje spôsob konverzie uvažovaného kultivaru pšenice letnej a tvrdej na peľovo sterilnú samičiu rodičovskú líniu a pelovo fertilnú vylepšenú udržiavaciu líniu pre vyššie opísanú líniu typu IEC-HC (obrázok 18a). Opísaná metóda sa skladá z:
a) kríženia vylepšenej udržiavacej línie, ktorá je homozygotná pre ms-Blms-BlKi-BlKi-Bl a má vylepšený rekombinantný chromozóm buď typu IEC-HC1 (4SsS/4EL/6S1L) nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-El a ki-S^-a, IEC-HC2 (4SsS/4AraL/6S1L) nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-Aml a ki-S^-a alebo IEC-HC3 (4AmS-4AmL/6S1L) nesúci Ms-Aml, rht-Aml, BaAml a ki-S1l-af s požadovaným kultivarom, ktorý je homozygotný pre Ms-BIMs-Blki-Blki-Bl,
b) zberu semien potomstva z kríženia (a), ich pestovaním sa pripravia peľovo fertilné Fi rastliny, všetky sú heterozygotné ms-BIMs-BlKi-BlKi-Bl-a, z ktorých jedna štvrtina tiež nesie vylepšený rekombinantný chromozóm typu IEC-HC a to sú požadované rastliny,
c) výberu Fx rastlín z (b) pomocou farby semien, ich opelením uvažovaným kultivarom sa pripravia dva typy BCi
potomstva, z ktorého 1/16 je heterozygotná k ms-BlMs-BlKiBIKi-Bl-a a tiež nesie vylepšený rekombinantný chromozóm typu IEC-HC. To sú rastliny s požadovaným genotypom,
d) pestovania vyššie opísaných rastlín BCX z (c) a ich výberu farebnosti semien, metódou počítania chromozómov a použitím DNA markerov a ďalším spätným krížením vo funkcii samičieho rodiča s uvažovaným kultivarom po štyri
nasledujúce generácie s cieľom získať dva typy potomstva piatej generácie spätného kríženia (BC5) . Metódou triedenia semien, počítania chromozómov a DNA markerov sa v každej generácii vybrali potomkovia heterozygotní pre ms-BlMsBlKi-BlKi-BlKi-Bl-a a ktorí tiež niesli vylepšený rekombinantný chromozóm IEC-HC,
e) samoopelenia vyššie opísaných rastlín BC5 z (d), zberu semien potomstva, z ktorých niektoré sú modré a niektoré červené/biele. Ich pestovaním vznikne línia BC5F2, z ktorých 1/16, pochádzajúca z červených/bielych semien, je
peľovo sterilná a homozygotná pre alelu peľovej sterility ms-Bl a pre alelu génu navodzujúceho peľovú sterilitu Ki-Bl a to je skupina požadovaných peľovo sterilných samičích rastlín. Ďalšia skupina z BC5F2 rastlín, ktorá má pôvod v rastlinách s modrými semenami a nesie tiež vylepšený rekombinantný chromozóm typu IEC-HC, ktorý obsahuje Ms, rht, Ba a ki-s1af to sú nami požadované rastliny peľovo fertilnej vylepšenej rekombinantnej udržiavacej línie.
Vynález ďalej opisuje spôsob konverzie uvažovaného kultivaru pšenice letnej a tvrdej na peľovo sterilnú samičiu rodičovskú líniu a peľovo fertilnú vylepšenú
udržiavaciu líniu pre vyššie opísanú líniu typu IREC-HC (obrázok 18bs). Opísaná metóda sa skladá z:
a) kríženia udržiavacej línie s IREC-HC vo funkcii samičieho rodiča, ktorá je homozygotná pre ms-Blms-Bl a monozomická ako pre 6B (hemizygotná pre Ki-Bl), tak pre jeden z vylepšených rekombinantných chromozómov IREC-HC1 (4SsS/4EL/6S1L/6BL) , nesúci Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-El a ki-S:la, IREC-HC2 (4SsS/4AmL/6S1L/6BL) , nesúci Ms~Ssl, rht-S3l, Ba-Aml a ki-S^-a alebo IREC-HC3 (4A'nS-4AmL/6S1L/6BL) , nesúci Ms-Aml, rht-Aml, Ba-Aml a ki-S^-a, s požadovaným kultivarom, ktorý je homozygotný pre Ms-BIMs-Blki-Blki-Bl,
b) zberu semien potomstva z kríženia (a), ich pestovaním sa pripravia peľovo fertilné Fi rastliny, všetky sú heterozygotné ms-BIMs-Bl, z ktorých jedna polovica je dizomická pre chromozóm 6B a preto heterozygotná pre KiBlBlki-Bl-a a . druhá polovica je dvojnásobne monozomická jednak pre chromozóm 6B a jednak pre rekombinantný chromozóm IREC-HC a je hemizygotná pre ki-Bl-a a tiež nesie Ms, rht, Ba a ki-Ssl-a alely z rekombinantného chromozómu,
c) výberu dvoch typov Fi rastlín z (b) podlá farby semien, analýzou párovania chromozómov a použitím DNA markerov, ich opelením uvažovaným kultivarom sa pripravia dva typy BCi potomstva. Potomstvo odvodené od dizomickej Fi, z ktorého 1/4 je heterozygotná k ms-BIMs-BlKi-BlKi-Bl-a a a druhého typu potomstva, odvodeného od dvojnásobne monozomickej Fi, z ktorého je 1/4 dvojnásobne monozomická, heterozygotná pre ms-BIMs-Bl a hemizygotná pre ki-Bl-a.
Nesie tiež Ms-Ssl, rht-Ssl a ki-Ssl-a z rekombinantného chromozómu IREC-HC,
d) výberu požadovaných skupín rastlín z dvoch skupín rastlín z (c) pomocou farebnosti semien, metódou párovania chromozómov a použitím DNA markerov a ďalším spätným krížením vo funkcii samičieho rodiča s uvažovaným kultivarom po štyri nasledujúce generácie s cieľom získať dva typy potomstva piatej generácie spätného kríženia (BCS) · Metódou triedenia semien podľa farby, počítania chromozómov a DNA markerov sa v každej generácii vybrali potomkovia heterozygotní pre ms-BIMs-BlKi-BlKi-BlKi-Bl-a v dizomickom type rastlín a pre ms-BIMs-Bl v dvojnásobne monozomickom type, ktorý tiež niesol vylepšený rekombinantný chromozóm typu IREC-HC,
e) opelenia vyššie opísaných, dvojnásobne monozomických rastlín. BC5 z (d) dizomickými rastlinami BCs._ z (d), vzniknú dve skupiny rastlín BC5F2. Skupina dizomických rastlín, z ktorých 1/8 je homozygotná pre ms-Blms-Bl a heterozygotná pre Ki-BlKi-Bl-a, to sú rastliny, ktoré vyrástli z červených/bielych semien. Sú to požadované dizomické rastliny. Ďalšiou skupinou sú dvakrát monzomické rastliny, vypestované z modrých semien, z ktorých 1/8 je homozygotná pre ms-Blms-Bl a hemizygotná Ki-Bl a nesú tiež Ms, rht, Ba a ki-S1l-a alely z rekombinantného chromozómu typu IREC-HC, a preto sú peľovo fertilné. To je nami požadovaná vylepšená rekombinantná udržiavacia línia,
f) pestovania semien vyššie opísanej, dvojnásobne monozomickej BC5F2 z (e) línie a semien dizomickej línie BC5F2 z (e) a výberu požadovanej, pelovo fertilnej vylepšenej rekombinantnej udržiavacej línie a tiež pelovo sterilnej línie analýzou párovania chromozómov a DNA markerov.
Vo vyššie uvedených spôsoboch prípravy udržiavacej línie alebo premeny uvažovaného kultivaru na pelovo sterilnú samičiu rodičovskú líniu a pelovo fertilného udržovateľa, pre výber rastlín, nesúcich uvažovanú alelu ms-Bl v ktorejkoľvek generácii potomstva, sa používali DNA sondy, ktoré boli pripravené pre mapovanie distálneho konca chromozómu 4BS. Slúžili tak na označenie všetkých mutantných alel peľovej sterilty ms-Bl a umožňovali výber rastlín, ktoré túto mutantnú alelu nesú. Na tento cieľ môže byť použitá akákoľvek sonda, ktorá označí subterminálnu oblasť 4BS, napríklad PSR921 (M.D. Gale, Cambridge Lab. oratory, JII, Norwich, U.K.).
Tieto DNA markery sa používajú na-základe skutočnosti, že niektoré zo známych mutantných alel majú zavedené v 4BS terminálne delécie a tieto delécie zahŕňajú aj miesto pre mutantnú alelu ms-Bl-c, a tak možno ľahko identifikovať homozygotné rastliny (ms-Bl-cms-Bl-c) absenciou markera (nulový fenotyp). Potom aj v krížení rastlín homozygotných pre normálnu dominantnú alelu (Ms-BlMs-Bl) ako samičieho rodiča a rastlín heterozygotných pre mutantnú alelu (MsBlMs-Bl-c) ako samčieho rodiča, 50 % Fx rastlín je homozygotných pre (Ms-BlMs-Bl) a 50 % heterozygotných pre (Ms-BIMs-Bl-c) . Ak sa táto Fi generácia podrobí spätnému kríženiu, t.j., že je opelená samčím rodičom (Ms-BlMs-Bl-
c), potom 1/8 z potomstva vzniknutého spätným krížením (BCi) je homozygotná pre ms-Bl-cms-Bl-c. Tieto homozygotné rastliny sa rozpoznávajú a vyberajú použitím DNA markerov.
Výsledkom každého ďalšieho spätného kríženia je 50 % úbytok homozygotného potomstva, ktoré môže byť oddelené pomocou DNA markerov.
Vo vyššie uvedených spôsoboch prípravy rastlín, ktoré nesú požadovanú alelu ki-SJ-a v ktorejkoľvek generácii potomstva, sa používali DNA sondy, ktoré boli pripravené pre mapovanie miesta, pevne spojeného s vyššie uvedenou alelou na 6SlL. Slúžili tak na označenie tejto alely. Príkladom takej sondy môže byť DNA sonda PSR915 (M.D.Gale, Cambridge Laboratory, JII, Norwich, U.K.). Výber rastlín, ktoré nesú požadovanú alelu ki-S2-a, možno uskutočniť aj oddelením peľovo nefunkčných zŕn.
Vynález ďalej opisuje hybridných rastlín pšenice skladá z:
ešte jeden spôsob prípravy letnej a tvrdej. Spôsob sa
a) kríženia samčieho rodiča s peľovo sterilným samičím rodičom rovnakého druhu, kedy vyššie uvedený samčí rodič sa vyberie z akéhokoľvek uvažovaného kultivaru pšenice letnej a tvrdej, ktorý je prirodzene homozygotný pre dominantný divoký typ alely pre peľovú fertilitu (Ms-Bl) a ako uvedený peľovo sterilný samičí rodič vystupuje opísaná línia druhu pšenice, ktorá je homozygotná pre obe alely, ako pre recesívnu alelu peľovej sterility (ms-Bl), tak pre dominantnú alelu génu navodzujúceho pelovú sterilitu (KiBl) . Uvedená pelovo sterilná samičia rodičovská línia sa udržuje ako udržiavacia línia spôsobu prípravy hybridných rastlín opísaných v tomto vynáleze,
b) zberu semien potomstva z kríženia (a), tieto semená po vypestovaní vytvoria potomstvo hybridných rastlín, z ktorých všetky sú pelovo fertilné a heterozygotné pre uvedenú mutantnú alelu pelovej sterility, t.j. ms-BIMs-Bl.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Vo všetkých nasledujúcich príkladoch sú použité línie Aegilops líniami Aegilops searsii Feldman a Kislev ex Hammer, obsahujúce alely Ms-Ssl (peľová fertilita), rht-Ssl (vyšší vzrast rastlín) a Su-Ssl (rezistencia proti chlórtolurónu), v tomto dokumente je označená ako AES-5, semená sa získali z Yattiru, Južná Judea, Izrael. Línia Aegilops longissima Schweinf. A Muschl, obsahujúca alely ki-S3l-a (vnáša citlivosť na efekt navodenia pelovej sterility, pochádzajúci od alely Ki-Bl), v tomto dokumente je označovaná ako AEL-1, semená boli pozberané neďaleko Revivinmu, Centrálny Negev., Izrael.
Semená AES-5 a AEL-1 sú uložené v zmysle pravidiel budapeštianskej dohody o Medzinárodnom uznávaní a ukladaní mikroorganizmov pre účely patentového riadenia v NCIMB Ltd., Aberdeen, Škótsko, Veľká Británia a dňa 13. mája 1998 im boli pridelené čísla 40952 a 40953.
Vynález bude podrobnejšie opísaný v nasledujúcich príkladoch a priložených obrázkoch.
Príklad 1
Systém hybridov
Na obrázku 1 sú znázornené tri schémy prípravy hybridných semien z peľovo sterilného samičieho rodiča a samčieho rodiča. Podmienky požadované pre úspešnú prípravu hybridných semien pomocou genetických prostriedkov sú tieto:
1) úplná a stabilná peľová sterilita samičieho rodiča, ktorý sa nazýva A-línia alebo samičia línia,
2) kompletná a stabilná obnoviteľnosť peľovej fertility u samčieho rodiča, nazývaného R-línia alebo samčia línia,
3) ľahké množenie samičej A-línie pomocou pelovo fertilnej udržiavacej línie, tu nazývané B-línia alebo udržiavacia línia. Všetky vytvorené Fx hybridné semená sú peľovo fertilné. Samičia A-línia sa množí buď opelením udržiavacej línie B, samoopelením udržiavacej línie B alebo oboma opísanými spôsobmi. Udržiavacia línia B sa množí samoopeľovanim a požadované, pelovo fertilné rastliny sa vyberú zo samoopeľovacieho potomstva udržovateľa v každej generácii použitím selekčných markerov, ktoré sú pre charakteristické pre udržovateľa.
Príklad schémy prípravy hybridnej pšenice letnej alebo tvrdej je detailnejšie znázornený na obrázkoch 13, 14 a 15. Ako pelovo sterilná samičia línia A je tu použitý kultivar nazvaný cv. One, vybavený génmi pre peľovú sterilitu, t.j. homozygotný pre jednu z recesívnych mutantných alel pre peľovú sterilitu (ms-Blms-Bl), umiestnenú na krátkom ramene chromozómu 4B a homozygotný aj pre dominantnú alelu génu vnášajúceho peľovú sterilitu (Ki-Bl), ktorá je umiestnená na dlhom ramene 6B. V prehľadnom článku Wilsona a Driscolla (Wilson, P. a Driscoll, C.J. (1983) in Frenkel, R. (ed.) Monographs on Theoretical and Applied Genetics, Vol.6, Heterosis, Springer-Verlag, strana 94 až 123) boli opísané tri alely pre peľovú sterilitu. Tieto alely sú: Pugsley (Pugsley a Oram, 1959 - spontánny výskyt ms-Bl-a) Probus (Fossati a Ingold, 1970 - indukcia X-lúčmi, ms-Blb) Cornestone” (Driscoll 1977 - indukcia gama žiarením, ms-Bl-c). Alely ms-Bl-b a ms-Bl-c sú terminálnymi deléciami. Predtým bolo indukovaných niekoľko ďalších prídavných mutantných alel a to buď gama žiarením alebo pôsobením etylmetánsulfonátom (EMS). Mutanty pripravené pôsobením EMS môžu byť odlíšené od rôznych delécií v lokuse Ms-Bl, a to prítomnosťou koncového C-pásika na 4BS. DNA markery, ako je napríklad Xpsr921, ktoré sú lokalizované v distálnej oblasti 4BS, nie sú prítomné v ms-Bl-c a v niekoľkých našich mutantoch vzniknutých gama žiarením (a možno tiež v ms-Bl-b), t. j., že sú umiestnené na deletovaných segmentoch a ich neprítomnosť je známkou homozygotnosti pre delécie. Alela Ki-Bl, prítomná v kultivare Chinese Spring, je lokalizovaná na dlhom ramene 6B a to asi 50 cM od centroméry (Loegering, W.Q. a Sears, E.R. (1963) Can. J. Genet. Cytol. 5: strana 65 až 72). DNA markery, ako je napríklad Xprs915, sú pevne spojené s alelou ki-Bl. Ak je peľovo sterilná samičia línia udržiavaná pomocou udržovatela, ktorý nesie rekombinantný chromozóm typu EC-HR, samičia línia by mala byť tiež homozygotná pre recesívnu alelu citlivosti na chlórtolurón su-Bl. Táto alela, prítomná v kultivare Chinese Spring pšenice letnej a v niekoľkých ďalších genotypoch tetraploidnej pšenice, je lokalizovaná na dlhom ramene chromozómu 6B, asi 0,5 cM od centroméry (Snape, J.W., Leckie, D., Parker, B.B. and Nevo, E. (1991) v Casely,
J.C., Cussans, G.W. and Atkin, R.K. (eds.) Herbicíde Resistance in Weeds and Crops).
Udržovacia línia je odvodená z toho istého kultivaru ako línia A, t.j. z cv. One, je homozygotná pre tie isté alely ms-Bl a Ki-Bl, ktoré sú prítomné aj v línii A, ale má ešte pridaný cudzí rekombinantný chromozóm typu EC-H (obrázok 2a) . Tento cudzorodý chromozóm pozostáva z 4S'S z Aegylops searsii, ktorý nesie dominantnú alelu pre peľovú fertilitu Ms-Ssl a dominantnú alebo semidominantnú alelu rht~Ssl, ktorá zodpovedá za vyšší vzrast rastlín, ďalej potom z Ae. longissima, ktorý nesie recesívnu alelu pre peľovú sterilitu ki-S^-a, ktorá spôsobuje, že peľové zrnká, ktoré ju obsahujú, sú prístupné deštruktívnemu pôsobeniu alely Ki-Bl, ktorá sa vyskytuje v pšenici letnej alebo tvrdej. Cudzí rekombinantný chromozóm nie je prenášaný peľovými zrnkami z dôvodu prítomnosti ki-S^-a. Preto výsledkom opelenia peľovo sterilnej samičej línie (línia A) líniou udržovateľa (líniou B) je potomstvo, v ktorom všetky jedince sú identické so samičou líniou a sú peľovo sterilné (obrázok 13a). Naopak, - samoopelenie udržiavacej línie vedie k vytvoreniu potomstva, v ktorom je 80 % pelovo sterilných a 20 % peľovo fertilných potomkov (obrázok 13a). V dôsledku prítomnosti alely rht-Ssl v rekombinantnom chromozóme, je peľovo fertilné potomstvo udržovateľa priemerne o 6 až 8 cm vyššie, ako potomstvo peľovo sterilné. Tento výškový rozdiel uľahčuje selektívny zber pelovo fertilného potomstva pomocou kombajnu. Týmto sa v každej generácii udržuje konštantný podiel medzi pelovo fertilnými potomkami v samoopeľovacej udržiavacej línii.
Podobne môže byť udržiavacia línia odvodená z toho istého kultivaru ako línia A, ale je monozomická pre chromozóm 6B, t.j. homozygotná pre ms-Bl a hemizygotná pre Ki-Bl a má ešte pridanú jednu sadu cudzieho rekombinantného chromozómu typu REC-H (obrázok 2c). Tento cudzorodý chromozóm pozostáva z 4SsS z Aegylops searsii, ktorý nesie dominantné alely Ms-Säl a rht-Ssl. Ďalej obsahuje 6S‘L z Ae. longissima, ktorý nesie recesivnu alelu pre peľovú sterilitu ki-S2l-a, ktorá spôsobuje, že peľové zrnká, ktoré ju obsahujú, sú prístupné deštruktívnemu pôsobeniu alely Ki-Bl, ktorá sa vyskytuje v pšenici letnej alebo tvrdej. Ďalšou súčasťou je distálna oblasť chromozómového ramena 6BL. Pravidelné párovanie rekombinantného chromozómu REC-H s 6B umožňuje jeho oddelenie a následne jeho výskyt v 50 % gamét. Z dôvodu prítomnosti ki-S2l-a nie je cudzí rekombinantný chromozóm prenášaný peľovými zrnkami. Preto výsledkom opelenia pelovo sterilnej samičej línie (línie A) líniou udržovatela (líniou B) je potomstvo, v ktorom sú všetky jedince identické so samičou líniou a sú pelovo sterilné. Naopak, samoopelenie udržiavacej línie rekombinantného udržovatela umožňuje vznik potomstva s 50 % pelovo sterilných a 50 % pelovo fertilných potomkov (obrázok 13b).
V dôsledku prítomnosti alely rht-Ssl v rekombinantnom chromozóme, je pelovo fertilné potomstvo udržovatela priemerne o 6 až 8 cm vyššie, ako potomstvo pelovo sterilné. Tento výškový rozdiel udržuje v každej generácii konštantný podiel medzi pelovo fertilnými a sterilnými jedincami.
Obdobne ešte ďalšia línia udržovatela môže byť zhodná s líniou A, ale je monozomická pre chromozóm 6B, t.j. homozygotná pre ms-Bl a hemizygotná pre su-Bl a Ki-Bl a nesie ešte jednu sadu cudzieho rekombinantného chromozómu typu REC-HR (obrázok 2d), skladajúcu sa z 4SsS z Aegylops
searsii, ktorý nesie dominantné alely Ms-Ssl a rht-Ssl. Ďalej sa skladá z z Ae. longissima, ktoré nesie dominantnú alelu rezistencie proti chlórtolurónu Su-Ssl, ktorá je prenesená z 6SsL z Ae. searsii na ÔS1!, z Ae. longissima. Ďalej obsahuje recesívnu alelu peľovej sterility ki-S^-a, ktorá spôsobuje, že peľové zrnká, ktoré ju obsahujú, sú prístupné deštruktívnemu pôsobeniu alely
Ki-Bl, ktorá sa vyskytuje v pšenici letnej alebo tvrdej. Ďalšou súčasťou je distálna oblasť chromozómového ramena 6BL. Pravidelné párovanie rekombinantného chromozómu REC-HR s 6B umožňuje jeho oddelenie a následne jeho výskyt v 50 % gamét.
Z dôvodu prítomnosti ki-S^-a nie je cudzí rekombinantný chromozóm prenášaný peľovými zrnkami. Preto výsledkom opelenia pelovo sterilnej samičej línie (línie A) líniou udržovateľa (líniou B) je potomstvo, v ktorom sú všetky jedince identické so samičou líniou a sú pelovo sterilné. Naopak, samoopelenie udržiavacej línie
rekombinantného udržovateľa vedie k vytvoreniu potomstva, v ktorom je 50 % pelovo sterilných a 50 % peľovo fertilných potomkov (obrázok 14b).
V dôsledku prítomnosti alely Su-Ssl v peľovo fertilnom potomstve, je toto rezistentné proti pôsobeniu herbicídu chlórtolurónu. Aplikáciou tohto herbicídu na výsev udržovateľa budú všetci pelovo sterilní potomkovia, ktorí nenesú rekombinantný chromozóm, zničení. V línii udržovateľa zostanú len peľovo fertilné rastliny.
Ďalší udržovatelia obsahujú vylepšený rekombinantný chromozóm typu IEC-HC (obrázok 3a, 4a a 5a), ktorý ešte okrem alel Ms, rht a ki-S^-a nesie selektívny marker, ktorým je alela pre modrú farbu aleurónu (Ba), spôsobujúca modré sfarbenie semien. Pripravené boli tri typy týchto vylepšených chromozómov: (1) IEC-HC1, pozostávajúci z 4SsS (nesie alely Ms-Ssl a rht-Ssl), 4EL (nesie alelu Ba-El) a 6S:L (nesie ki-S^-a); (2) IEC-HC2, pozostávajúci z 4SsS (nesie alely Ms-Ssl a rht-Ssl), 4AmL (nesie alelu Ba-A^l) a (nesie alelu ki-S^-a) ; (3) IEC-HC3 pozostávajúci z
4AirS (nesie alely Ms-Aml a rht-Aml) , 4AmL (nesie alelu BaAml) a 6SlL (nesie alelu ki-S'l-a) .
Z dôvodu prítomnosti ki-S^-a nie je vylepšený rekombinantný chromozóm prenášaný peľovými zrnkami. Preto výsledkom opelenia peľovo sterilnej samičej línie (línie A) líniou udržovateľa (líniou B) je potomstvo, v ktorom sú všetky jedince identické so samičou líniou a sú peľovo sterilné (obrázok 15a). Naopak, samoopelenie udržiavacej línie vedie k vytvoreniu potomstva, v ktorom je 80 % peľovo sterilných a 20 % pelovo fertilných potomkov (obrázok 15a).
Možnosť oddelenia červených/bielych semien udržovateľa, z ktorých sa vyvinú pelovo sterilné rastliny (línia A), od modrých semien, ktoré sa po vypestovaní vyvinú do pelovo fertilnej línie (línia B) (obrázky lb a 15a), je alternatívnou a výhodnou cestou pre získanie semien pelovo sterilnej samičej línie priamo z potomstva samoopelením vzniknutej línie udržovateľa. Tento spôsob značne znižuje finančné náklady na získanie samičích semien.
Ďalší udržovatelia obsahujú vylepšený rekombinantný chromozóm typu IREC-HC (obrázok 3b, 4b a 5b) , nesúci na dlhom ramene vylepšeného rekombinantného chromozómu terminálny segment chromozómového ramena 6BL, ktorý sa pravidelne páruje s natívnym chromozómom 6B, ktorý existuje ako monozomické pridanie v tejto línii udržovateľa. Toto pravidelné párovanie umožňuje správne oddelenie vylepšených rekombinantných chromozómov počas meiózy a následne ich výskyt v 50 % gamét. Z dôvodu prítomnosti ki-S^-a nie je IREC chromozómy prenášané peľovými zrnkami. Preto výsledkom opelenia peľovo sterilnej samičej línie (línie A) líniou udržovateľa (líniou B) je potomstvo, v ktorom sú všetky jedince identické so samičou líniou a sú peľovo sterilné (obrázok 15b). Naopak, samoopelenie rekombinantnej udržiavacej línie vedie k vzniku 50 % peľovo sterilných a 50 % peľovo fertilných potomkov (obrázok 15b). V dôsledku prítomnosti alely Ba je preto ľahké deliť semená pomocou triediaceho stroja na červené/biele a modré. Tak sa pestovaním len modrých semien v každej generácii zaistí, že všetky rastliny udržovateľa budú peľovo fertilné.
Ako u ďalších tráv, tak aj u pšenice príležitostne dochádza počas meiózy k priečnemu deleniu centroméry univalentného (nespárovaného) chromozómu. Týmto delením, na rozdiel od pozdĺžneho delenia, vzniknú pri delení dva telocentrické chromozómy, čiže izochromozómy. Početnosť tohto typu delenia v monozomických rastlinách alebo v rastlinách s monozomickým pridaním, t.j. s univalentným chromozómom v meióze, je obvykle nízka, len niekoľko percent. Pretože EC v EC-H, EC-HR a IEC-HC typoch chromozómov existuje v udržiavacej línii ako monozomické pridanie a ako taký zostáva počas meiózy nespárovaný, samoopelením vzniknutá udržiavacia línia môže obsahovať rastliny, ktoré majú len jedno rameno z EC. Rastliny, ktoré majú len dlhé rameno, ECL (nesúce Ba a ki-S^-a alely), budú peľovo sterilné. Na druhej strane, rastliny, ktoré majú krátke rameno ECS (nesúce Ms a rht alely), budú peľovo fertilné. Pretože rastliny s ECS nenesú alelu ki-S11-a, samčie gaméty s ECS budú funkčné a buď opelením samičích rastlín alebo samoopelením budú kontaminovať samičiu líniu. V prípade EC-HR, rastliny, ktoré majú krátke rameno a ktorým chýba dlhé rameno z EC sú citlivé na pôsobenie chlórtolurónu a môžu byť oddelené na základe aplikácie tohto herbicídu na potomstvo vzniknuté samoopelením udržovateľa. V prípade IEC-HC, rastliny, ktoré majú krátke rameno a ktorým chýba dlhé rameno z EC produkujú červené/biele semená, ktoré môžu byť oddelené triediacim strojom od modrých semien v potomstve vzniknutom samoopelením udržiavacej línie.
Na druhej strane rekombinantný chromozóm z obidvoch typov REC-H a IREC-HC sa počas meiózy pravidelne páruje s natívnym chromozómom 6B. Následne centroméra prechádza len pozdĺžnym delením v druhej meiotickej anafáze, netvoria sa centroméry a samičia línia nie je kontaminovaná peľovo fertilnými rastlinami.
Pre zvýšenie obsahu semien v potomstve vzniknutom samoopelením vylepšenej rekombinantnej línie, ktoré sa po výseve vyvinú do peľovo sterilnej rastliny, je nutné samoopeliť vylepšenú rekombinantnú udržiavaciu líniu a pestovať semená ďalšiu sezónu. Týmto spôsobom (znázornený na obrázku 15b) sa získa množstvo požadovaných semien, dosahujúce až 70 %. Vo vylepšenej rekombinantnej udržiavacej línii obsahujúcej typ IREC-HC možno uskutočniť výber, ktorý pozostáva z dvoch krokov: v prvom kroku je to zber vyšších rastlín (nesúcich IREC-HC s rht alelou), v
druhom kroku zber nižších rastlín a roztriedenie ich semien podľa farby. Červené/biele semená neobsahujú IREC-HC a po vypestovaní sa z nich vyvinú pelovo sterilné samičie línie.
Samčí rodič (línia R, cv. Two) je normálny kultivar pšenice letnej alebo tvrdej, ktorý je prirodzene homozygotný pre alelu pelovej fertility Ms-Bl, ďalej homozygotný buď pre dominantnú alelu Ki-Bl alebo pre jednu z recesívnych alel ki-Bl (ki-Bl-a alebo ki-Bl-n).
Ako je schemeticky znázornené na obrázkoch 13a-b, 14ab a 15a-b, sú hybridné semená pšenice letnej a tvrdej v F: potomstve produkované rýchlo a účinne, všetky jedince sú heterozygotné pre alely peľovej sterilty (Ms-Blms-Bl) a preto peľovo fertilné. Ďalej, všetky tu používané kultivary boli ako samčí rodičia schopné úplne obnoviť peľovú fertilitu hybridov Fi.
Príklad 2
Testovanie expresie pelovej fertility spôsobenej prítomnosťou jednej sady pelovo fertilnej alely Ms-Ss-1 z Aegilops searsii v genotype ms-Blms-Bl pšenice letnej
Z dôvodu testovania uskutočniteľnosti vyššie uvedeného hybridného produkčného systému a udržania pelovo sterilnej samičej rodičovskej línie (línie A) bolo najprv nutné pripraviť cudzorodú líniu s monozomickým pridaním chromozómu, tak bol chromozóm 4Ss z Aegilops searsii pridaný k plnej genetickej výbave pšenice letnej, ktorá je
homozygotná pre alelu pelovej sterility ms-Bl-c. Toto bolo uskutočnené krížením dizomickej línie 4Ss (odvodenej z kríženia Aegilops searsii acc. TE-10 s vysokou pšenicou letnou, cv. Chinese Spring, ktorú láskavo poskytol Prof. G. Hart, Soil and Crop Science, Texas A a M University, College Station, Texas). Táto línia je homozygotná pre MsBl, rhtl a rht2 a nesie dve sady Ms-Ssl a rht-SJl. Druhá línia obsahuje kombináciu ms-Bl-cms-Bl-c RhtlRhtlrht2rht2, čo je pelovo sterilný genotyp polozakrpatenej pšenice letnej cv. Gamenia (láskavo poskytnutá Dr. M. MacKayom, kurátorom Australian Winter Cereal Collection, RRM 994, Calala Lane, Tamworth, NSW 2340, Austrália). FT potomstvo vzniknuté týmto krížením je celé heterozygotné pre Ms-BlmsBl -c a nesie jeden ďalší pridaný chromozóm 4Ss s Ms-Ssl alelou. Tieto rastliny sa podrobili samoopeleniu a boli vybrané F2 rastliny, ktoré sú homozygotné pre ms-Bl-c (ich fenotyp bol určený pomocou DNA markerov). Ako sa očakávalo, všetky euploidné homozygotné rastliny (ms-Bl-cms-Bl-c) boli pelovo sterilné, ale všetky homozygotné rastliny, ktoré obsahujú pridaný 4Ss chromozóm nesúci Ms-Ssl, boli pelovo fertilné, čo poukazuje na úplnú dominanciu Ms-Ssl nad dvoma sadami ms-Bl-c.
Príklad 3
Testovanie výškových rozdielov medzi rastlinami pšenice letnej, ktoré sú homozygotné pre alelu znižujúcu výšku rastliny Rhtl alebo Rht2 a génovo zhodných rastlín, ktoré majú chromozóm 4Ss z Ae. searsii, nesúci rht-Ssl alelu
Aegilops searsii je rastlina nízkeho vzrastu. Avšak obsahuje alelu rht-Ssl, ktorá podporuje výšku rastliny. Táto alela je homoalelická k alelám rht z pšenice letnej, ktoré sú umiestnené na krátkom ramene 4. skupiny
chromozómov, umiestnených asi 15 cM od centroméry (Mcľntosh, R.A. (1998) Proc. 8th Int. Wheat Genet. Symp., Beijing, China, strana 1333 až 1500) . Alela rht-S'~l je spojená s alelou pre peľovú fertilitu Ms-Ssl, ktorá je umiestnená v terminálnej oblasti. Pretože sa chromozóm 4Ss nepáruje so svojím homológom v pôvodnej pšenici letnej, obe alely rht-Ssl a Ms-Ssl sú v rôznych typoch vložených cudzorodých chromozómov stále spojené. Existencia alely rht~Ssl na vloženom chromozóme môže podporovať vyšší vzrast rastlín a preto môže slúžiť ako alela pre selekčný marker, ktorá uľahčuje oddelený zber pelovo fertilných potomkov udržiavacej línie, t.j. tých, ktorí nesú vložený chromozóm. Takto sa v každej generácii udržuje konštantný podiel pelovo fertilných rastlín v samoopelením vzniknutom potomstve udržovateľa.
Pre zistenie vplyvu rht-Ssl na výšku rastlín pšenice letnej, ktorá je homozygotná pre Rht- alely, bola skrížená línia s dizomickým pridaním 4Ss s polozakrpatenou líniou pčenice letnej cv. Gamenia, obe boli opísané v príklade 2. Všetky vzniknuté Fx rastliny boli heterozygotné pre jednu z alel Rht a niesli jeden pridaný chromozóm z 4Ss, nesúci alelu rht-S5!. Tieto rastliny boli samoopelené a vybrali sa rastliny, ktoré boli buď homozygotné alebo heterozygotné pre Rht (indikovalo sa to ich výškou). Všetky euploidné rastliny boli menšie (priemerne o 6 až 8 cm), v porovnaní s tými, ktoré obsahovali pridaný chromozóm z 4Ss s alelou rht-Ssl. Toto bolo potvrdením toho, že prítomnosť alely rht-Ssl v genotype polozakrpatenej pšenice letnej podporuje vyšší vzrast rastlín, čo možno využiť ako selekčný marker.
Príklad 4
Testovanie vplyvu chlórtolurónu na rastliny pšenice letnej, ktoré sú homozygotné pre alelu Su-Bl a na génovo zhodné rastliny, ktoré majú vložený chromozóm nesúci dominantnú alelu pre rezistenciu Su-Ssl
Rôzne kultivary pšenice letnej vykazujú rôzne reakcie na herbicíd chlórtolurón a ďalšie fenylderiváty močoviny. Niektoré kultivary, ktoré nesú dominantnú alelu Su-Bl (napríklad Capelle Desprez), sú rezistentné, zatiaľ čo ostatné, nesúce recesívnu alelu su-Bl (napríklad Chinese Spring), sú citlivé (Snape a ďalší, 1991). Gén je lokalizovaný na dlhom ramene chromozómu 6B (6BL), asi 0,5 cM od centroméry. Rôzne línie diploidného druhu Aegilops, ktorých genóm je veľmi podobný genómu B pšenice, tiež vykazujú rôzne reakcie na pôsobenie chlórtolurónu: aj keď je väčšina línií citlivých na jeho pôsobenie, jedna línia z Ae. searsii je rezistentná. Pretože sa chromozóm 6SsL z Ae. searsii temer pravidelne páruje s z Ae. longissima, je možné preniesť alelu rezistencie do 6SXL ramena vloženého chromozómu EC-H (obrázok 8a,b). Tak vznikne vložený chromozóm typu EC-HR. Pretože ramená chromozómov 4SsS a 6SsL sa nepárujú so svojimi homológmi z pšenice vo východiskovej normálnej pšenici letnej, alela Su-Ssl je trvalo spojená s ďalšími alelami vloženého chromozómu, t.j. s Ms-Ssl, rht-Ssl a Ki-S11-a. Prítomnosť alely rezistencie proti chlórtolurónu vo vloženom chromozóme uľahčuje v každej generácii samoopelením vzniknutého potomstva selektívne hubenie peľovo sterilných rastlín, ktoré nemajú tento vložený chromozóm. Rastliny, ktoré tento chromozóm majú, t. j. pelovo fertilná udržiavacia línia, zostávajú týmto herbicídom nedotknuté. To je zárukou, že v každej generácii porastie len pelovo fertilné potomstvo.
Pre testovanie vplyvu chlórtolurónu na rôzne genotypy sa rastliny postriekali dávkou, ktorá bola dvojnásobná oproti odporúčanej dávke na komerčné využitie. Aplikácia sa uskutočnila na poli s rastúcou pšenicou letnou, ktorá je homozygotná pre alelu citlivosti na herbicíd su-Bl a na poliach s líniou Ae. searsii, nesúcou alelu rezistencie proti chlórtolurónu Su-Ssl. Všetky rastliny nesúce recesívnu alelu su-Bl boli vyhubené 10 až 14 dní po postreku, zatial čo rastliny s dominantnou alelou Su-Ssl prežili.
Príklad 5
Vplyv modrého aleurónu na farbu semena a oddeľovanie modrých a červených/bielych semien
Farba semien pšenice letnej alebo tvrdej je červená alebo biela, červená je výsledkom prítomnosti pigmentu v osemení. Niekoľko druhov, príbuzných k pšenici letnej a tvrdej, t.j. T. monococcum, A. elongatum, A. glaucum, A. tricophorum, A. junceum, Secale montanum, Secale cereale a Hordeum spontaneum, obsahuje línie s modrými semenami. Modrá farba je výsledkom tvorby antokyánov v triploidnej aleurónovej vrstve endospermu (pozri Zeven, A. C. (1991) Euphytica 56: strana 243-258). Modrá farba indikuje genotyp aleurónu, jav sa nazýva xénia, t. j. rastliny s červenými/bielymi semenami sa opeľujú raslinami so semenami s modrým aleurónom. Modrá farba semien je určená alelou pre modrý aleurón (Ba) (označenie podľa Keppenna a Baezingera,
1990, v súhlase s Dr. R.A. Mclntoshom, koordinátorom génových symbolov pre pšenicu), ktorá je lokalizovaná na dlhom ramene chromozómu 4Am z T. monococcum alebo na 4E z E. pontica (Zeven, A.C. (1991) Euphytica 56: strana 243258) . V jačmeni je miesto pre Ba (tu označované BI) položené na dlhom ramene chromozómu 4H, 29 cM od centroméry (Grain Genes Database, ref. BCN-25-93). Preto sa z dôvodu podobnosti génov, existujúcej medzi druhmi Triticae predpokladá, že aj v T. monococcum a E. pontica je tento gén lokalizovaný v približne rovnakej vzdialenosti od centroméry. Semená z línií, ktoré vznikli monozomickým pridaním 4Am alebo 4E do genómu pšenice letnej, sú modré a indikujú tak prítomnosť kompletnej dominantnosti alely Ba. Výsledná farba semien závisí od množstva pridania tejto alely, ktorá sa prejavuje intenzitou sfarbenia. Tri sady alely Ba poskytnú tmavomodré semená, dve sady (výsledok prenosu alely samičími gamétami) dajú semená stredne modré, jedna sada (výsledok prenosu alely samčou gamétou) umožní vznik bledomodrých semien. Prostredie, v ktorom sú rastliny pestované, t.j. sucho a teplo počas obdobia nalievania zŕn, ďalej aj rastlinný genetický základ, môžu redukovať expresiu Ba alely, čo spôsobuje chybnú klasifikáciu semien s jednou sadou Ba. Semená s dvoma alebo tromi sadami alely Ba sú vždy klasifikované správne. Ba alela, buď s Ba-El alebo Ba-A1]., je translokovaná na cudzorodom rekombinantnom vloženom chromozóme, ktorý sa pravidelne nepáruje so svojím homológom z pšenice. Pretože alela Ba je trvalo spojená s Ms-Ssl a rht-Ssl alebo s Ms-Aml a rht-Aml alelami, ďalej aj s ki-S^-a alelou, môže slúžiť ako vynikajúci selekčný marker. Modré semená môžu byť oddelené od červených/bielych pomocou triediaceho zariadenia (napríklad Sortex 5000).
Tento postup možno využiť na separáciu veľkého množstva semien a teda má komerčné využitie.
Príklad 6
Testovanie ničenia peľu nesúceho alelu ki-S^-a pomocou dominantnej alely génu pre navodenie peľovej sterility KiB1 z pšenice letnej
Loegering a Sears objavili, že chromozómové rameno 6BL z kultivaru Chinese Spring pšenice letnej nesie dominantnú alelu pre gén navodzujúci peľovú sterilitu, ktorá ničí peľové zrnká s recesívnou alelou ki (= ki-Bl-a) z kultivaru Timstein). V krížení niekoľkých kultivarov pšenice letnej s dvomi testovacími líniami a to Chinese Spring a Timstein, objavili v mieste pre alelu génu navodzujúceho peľovú sterilitu najmenej tri alely a to: dominantnú Ki (= Ki-Bl), recesívnu ki(= ki-Bl-a) a neutrálnu (= ki-Bl-n).
Pretože táto dominantná alela zabíja len peľ a nie vajíčka, môže sa využiť na zabránenie prenosu peľu, ktorý nesie cudziu dominantnú alelu pre peľovú sterilitu Ms-Ssl. To si vyžaduje stále spojenie medzi Ms-Ssl a ki-Bl-a alelami. Toto spojenie možno dosiahnuť zostavením cudzorodého chromozómu, ktorý nesie tieto dve alely a ktorý sa pravidelne páruje so svojím homológnym chromozómom v pšenici. Podmienkou, ktorá musí byť splnená pred zostrojením takéhoto vloženého chromozómu, je dostupnosť recesívnej alely génu pre navodenie peľovej sterility v jednom z divokých, pšenici príbuzných druhov rastlín.
Pripravením radu línií, ktoré vznikli pridaním časti z Ae. longissima do základnej línie kultivaru Chinese Spring, autori vynálezu zistili, že chromozóm 6 z Ae. longissima (6S1) sa prenáša peľom len v prípade rastlín deficientných pre chromozóm 6B. Analýzou životaschopnosti peľu a to zafarbením peľu Alexandrovým reagens
44:117) u línie s monozomickým pridaním (Stain
6S1, sa
Technology, ukázalo, že bolo zničených asi 20 % peľových niesli 6S1 chromozóm, zatiaľ zrniek, hlavne tých, ktoré čo v línii s
6S‘S monotelozomickým pridaním bolo zabitých len až peľových zrniek. V potomstve samoopelených rastlín monozomickým pridaním neboli nájdené žiadne rastliny dizomickým pridaním. To naznačuje, že zatiaľ čo prenos 6S' vajíčkami zostáva nedotknutý, prenos 6S1 peľovými zrnkami je v prítomnosti 6B úplne zablokovaný, t.j. v prítomnosti Ki-Bl. Predpokladá sa, že chromozóm 6S1 z niekoľkých odrôd
Ae. longissima nesie recesívnu peľovú alelu, tu označovanú ki-S^-a, ktorej peľové zrnká sú citlivé na ničivé pôsobenie Ki-Bl alely z pšenice letnej.
Príklad 7
Zostrojenie vloženého chromozómu EC-H1, ktorý obsahuje 4SsS, ktorý nesie alely Ms-Ssl a rht-Ssl a ÔS1!., ktorý nesie alelu ki-S^-a
Chromozóm, natívny alebo cudzí, ktorý existuje v pšenici v jednej sade ako monozomicky pridaná línia, môže podstúpiť, aj keď s malou početnosťou výskytu, chybné centromerické delenie v meióze. Dôjde nie k pozdĺžnemu rozdeleniu chromzómu, ale k priečnemu deleniu v centromére, čo sa prejaví vznikom jedného alebo dvoch stabilných telocentrických chromozómov. Ak existujú dva nehomologické chromozómy, každý v jednej sade, súčasne podstúpia priečne
rozdelenie, vzniknú telocentrické chromozómy, ktoré môžu fúzovať za výsledku translokovaného chromozómu (Sears, E.R. (1972) Stadler Symposium 4: strana 23 až 38). Početnosť tejto centrickej fúzie sa pohybuje v rozmedzí od menej ako 1 % (Sears, E.R. (1972) Stadler Symposium 4: strana 23 až 38) do viac ako 23 % (Lukaszewski, A.J. (1993) Genome 36: strana 821 až 824.
Autori vynálezu využili tento jav pri zostrojení vloženého chromozómu 4SsS/6S1L. Opelením línie s monozomickým pridaním 6SlL, ktorá nesie ki-S11-a s líniou s dizomickým 4Ss pridaním, nesúcim Ms-Ssl a rht-Ssl vznikne Fi potomstvo s chromozómom 4Ss, pričom jedna jeho štvrtina obsahuje aj chromozóm 6S1, to znamená, že sa vytvorila dvojnásobne monozomicky pridaná línia. Prítomnosť 4Ss a 6S1 sa v rastlinách určuje pomocou DNA sond PSR921 a PSR915.
Získalo sa asi 2000 rastlín E2, ktoré boli všetky otestované metódou počítania chromozómov. Rastliny obsahujúce monozomické pridania, najmä tie rastliny, ktoré mali 2n=43, boli podrobené ďalšiemu skúmaniu pomocou DNA markerov preto, aby sa vylúčili tie, ktoré majú 4SsL a 6SlL. Metódou C-pásikovania sa potvrdila prítomnosť požadovanej centrickej fúzie.
Ako sa očakávalo, tento chromozóm sa neprenáša peľovými zrnkami a výsledkom všetkých opelení euploidných rastlín rastlinami, ktoré nesú vložený chromozóm ako monozomicky pridanú líniu, sú len euploidné rastliny, kým samoopelením monozomicky pridanej línie vznikne asi 20 % rastlín so 43 chromozómami.
100
Príklad 8
Zostrojenie vloženého chromozómu EC-HR1, ktorý obsahuje 4SaS, nesúci alely Ms-Ssl a rht-Ssl a 6S L, ktorý nesie alely Su-S'l a ki-S^-a
Zostrojenie vloženého chromozómu EC-HR1 spočíva v prenose dominantnej alely pre rezistenciu proti chlórtolurónu Su-SJl z ramena chromozómu 6SsL vybranej línie Ae. searsii do ramena vloženého chromozómu ECH1. Toto sa dosiahne nasledujúcim postupom: krížením pelovo fertilnej samičej rodičovskej línie odvodenej z pelovo fertilnej udržiavacej línie v pšenici letnej cv. Chinese Spring. Tento samičí rodič je homozygotný pre ms-Bl, su-Bl a Ki-Bl alely a má ako monozomické pridanie vložený chromozóm EC-H1 (4SsS/6S1L), nesúci na svojom krátkom ramene alely Ms-Ssl a rht-Ssl a na svojom dlhom ramene alelu Su-S:l ki-S^-a, druhým partnerom v krížení je diploidný druh Ae. searsii, nesúci alelu pre rezistenciu proti chlórtolurónu na dlhom ramene chromozómu 6Ss, t.j. na 6SsL, ďalej potom alely Ms-Ssl a rht-Ssl na 4SsS. Asi 20 % z Fi potomstva má vložený chromozóm EC-H1 a teda obsahuje 2n=29 chromozómov a možno ich odlíšiť od ďalších Fi rastlín, ktoré majú 2n=28. Rastliny z Fi potomstva, nesúce vložený chromozóm, vykazujú 26 univalentných (26') a jeden trivalentný (ľ'') chromozóm v metafáze, čo je spôsobené párovaním vloženého chromozómu (4SsS/6S1L) s chromozómovým ramenom 4SsS a 6SsL z Ae. searsii. Párovanie 4Ss z EC s 4SsS z Ae. searsii nezmení alelické zloženie krátkeho ramena EC, kde sa medzi a 6SsL, po krížení medzi centromérou a miestom Su a po druhom krížení medzi Su a miestom ki, vytvorí uvažovaný chromozóm EC-HR1. Opelením 2n=29 Fj
101 rastlín raz alebo dvakrát s Chinese Spring vzniknú rastliny homozygotné pre su-Bl s 2n=43 (21+ ľ), ktoré obsahujú požadovaný chromozóm EC-HR1 ako monozomické pridanie. Aplikáciou chlórtolurónu na potomstvo samoopelením vzniknutých rastlín s monozomickým pridaním sa vyhubia všetky rastliny s 2n=42 (chýba EC-HR1 a preto aj alela rezistencie proti chlórtolurónu) a zostanú len rastliny s 2n=43, t.j. tie, ktoré obsahujú EC-HR1.
Príklad 9
Zostrojenie cudzorodého chromozómu pomocou centrickej fúzie 4SsS/4EL a 4SsS/4AmL
Na vytvorenie cudzorodého chromozómu pozostávajúceho z 4SsS/4EL a 4SsS/4AmL možno využiť aj jav centrickej fúzie. Opelením línie s monozomickým pridaním 4E v pšenici letnej, ktorá je heterozygotná pre Ms-Blms-BlKi-BlKi-Bl a nesie BaE1 s líniou s 4Ss dizomickým pridaním, ktorá je homozygotná pre ms-Blms-BlKi-BlKi-Bl a nesie Ms-Ssl a rht-Ssl, vznikne potomstvo Fi, ktoré má chromozóm 4Ss a z tohto potomstva má 1/4 aj chromozóm 4E, t. j. má dvojnásobné monozomické pridanie. Prítomnosť 4Ss a 4E v týchto rastlinách bola potvrdená modrou farbou semien a pomocou DNA markerov. Modré semená F2, ktoré sa vyvinuli na Fx, sa oddelia, nechajú vyklíčiť a vypestované rastliny sa delia pomocou počítania chromozómov. Línia, ktorá obsahuje monozomické pridania (2n=43), sa podrobí ďalšiemu skúmaniu pomocou DNA markerov preto, aby sa vylúčili tie, ktoré majú chromozómové ramená buď 4SsL alebo 4ES. Objavených bolo niekoľko rastlín, ktoré majú obe ramená 4SsS a 4EL. Metódou C-pásikovania sa potvrdilo, že tu došlo k centrickej fúzii.
102
V príprave 4SsS/4AmL sa opelila línia s 4Ss monozomickým pridaním líniou dizomicky substituovanou (4B)4Am. Vybrané rastliny Fx potomstva sú samoopelené a tak sa pripraví dvojnásobne monozomicky pridaná línia na 4Ss a 4Am. Prítomnosť týchto chromozómov v rastlinách je potvrdená modrou farbou semien a pomocou DNA markerov.
Modré semená potomstva F2 (na Fx rastlinách) boli predklíčené a po ich vypestovaní boli sadenice skúmané metódou počítania chromozómov. Boli vybraté tie, ktoré mali monozomické pridanie (2n=43) a ďalej sa skúmali pomocou DNA markerov, aby sa vylúčili tie, ktoré majú buď 4SsL alebo 4AmS. Objavených bolo niekoľko rastlín, ktoré majú 4SsS a 4AmL. Prítomnosť centrickej fúzie chromozómov sa potvrdila analýzou pomocou C-pásikovania.
Príklad 10
Zostrojenie rekombinantného vloženého chromozómu REC-H1, ktorý obsahuje 4SsS, nesúci alely Ms-Ssl a rht-S5]., 6SXL, ktorý nesie alely Su-S2l a ki-S1l-a a distálnu oblasť chromozómu 6BL
Homológne chromozómové ramená 6BL a 6SX1 sa nepárujú v prítomnosti génu Phl z pšenice letnej. Táto dominantná alela, umiestnená na dlhom ramene chromozómu 5B, zabraňuje párovaniu homológnych chromozómov, avšak dovoľuje pravidelné párovanie homológov. Recesívna mutácia (phlb) bola indukovaná vo svojom lokuse pomocou ožarovania kultivaru Chinese Spring X-lúčmi. V homozygotnej forme nepotláča homológne párovanie (Sears, E.R. (1977) Can. J. Genet. Cytol. 19: strana 585 až 593) . Táto mutácia bola
103 využitá na homológne párovanie a rekombináciu medzi 6BL a 6S1]..
6S1 (6BL) dizomicky substituovaná línia, v ktorej pár chromozómov 6S1 z Ae. longissima nahrádza pár chromozómov 6B z pšenice letnej cv. Chinese Spring, bola opelená mutantnou líniou phlbphlb. Fx hybrid, ktorý je monozomický pre 6B monozomickú substitúciu 6S1 a heterozygotnú Phlphlb, bol spätne krížený v úlohe samičieho rodiča s mutantnou líniou. Pomocou DNA sondy WPG90 (túto sondu pripravili autori vynálezu a je záujemcom k dispozícii) boli vybrané dvojnásobne monozómne jedince, ktoré boli homozygotné pre phlb. Takto vybrané BCX potomstvo bolo opelené líniou, ditelozomickou pre 6BS. Vzniknuté potomstvo, v ktorom niektoré jedince sú monotelozomické pre 6BS a monozomické pre rekombinantný chromozóm ósVeBL, t.j. chromozóm, ktorý obsahuje krátke rameno 6S1, proximálnu časť dlhého ramena 6S1 a distálnu časť 6BL (translokačný bod zlomu je distálny k miestu ki-S1! na ôS^) . Výber jedincov s týmito translokovanými chromozómami sa uskutočňuje na základe nemožnosti párovania s 6BS a pomocou DNA markerov, ktoré sa určené na označovanie 6SXL, distálne k ki-S11-a a DNA markerov na distálnej oblasti 6BL. Vybraný genotyp, ktorý je monotelozomický 6BS a monozomický 6S1/6BL a homozygotný pre dominantnú alelu peľovej fertility Ms-Bl, deficientný pre Ki-Bl a hernizygotný pre ki-S11-a, bol krížený ako samčí rodič s líniou nesúcou ako monozomické pridanie vložený chromozóm EC-H1 (pozri príklad 6) . Niektoré jedince z potomstva sú trojnásobne monozomické, t.j. monozomické pre 6B, 4SsS/6S1L a 6S1L/6BL. Medzi týmito rastlinami sa pomocou DNA markerov vybrali jedince heterozygotné pre ms-Bl-c MsBl MS-Ssl a Ki-Blki-S^-a. Vo vybraných rastlinách tohto potomstva sa objavuje párovanie v proximálnej oblasti 6S1 z
104 oboch translokovaných chromozómov, čo sa prejaví vznikom rekombinantného vloženého chromozómu REC-H1 (4SsS/6S1L/ 6BL) . Samopelením vybraného potomstva vzniknú okrem iného aj dvojnásobne monozomické rastliny, ktoré majú 6B a RECHl, sú homozygotné pre ms-Bl-c ms-Bl-vc, hernizygotné pre Ki-Bl a ki-S11-a.
Podobne vybrané rastliny, ktoré sú monotelozomické 6BS-monozomické ôS^ôBL, boli krížené ako samčí rodič s líniou nesúcou ako monozomické pridanie vylepšený rekombinantný vložený chromozóm IEC-HC1, IEC-HC2 a IEC-HC3. Niektoré jedince z tohto potomstva sú v každom krížení trikrát monozomické, t.j. monozomické pre 6B, ôS^ôBL a pre vylepšený vložený chromozóm. Medzi týmito rastlinami sa pomocou DNA markerov vybrali jedince heterozygotné pre. U týchto vybraných rastlín existuje párovanie v proximálnej oblasti 6S1 u oboch translokovaných chromozómov, čo sa prejaví vznikom vylepšeného _ rekombinantného vloženého chromozómu IREC-HC1 (4SsS/4EL/6S1L/6BL) , IREC-HC2 (4SsS/4AmL/6S1L/6BL) a IREC-HC3 (4AmS-4AmL/6S1L/6BL) . Samoopelením vybraných rastlín medzi ostatnými vzniknú dvojnásobne monozomické rastliny, ktoré majú 6B a vylepšený rekombinantný vložený chromozóm, ktorý je homozygotný pre ms-Bl-c ms-Bl-c a hemizygotný pre ki-S11-a.
Príklad 11
Zostrojenie rekombinantného vloženého chromozómu REC-HR1, ktorý obsahuje 4SsS, (nesúci alely Ms-S3! a rht-Ssl), ktorý nesie alely Su-S1!, ki-S^-a a distálnu oblasť chromozómu 6BL
105
Príprava REC-HR1 sa uskutočňuje krížením línie s monozomicky pridaným rekombinantným vloženým chromozómom REC-H1 s líniou Ae. searsii nesúcou alelu rezistencie proti chlórtolurónu Su-Ssl, výberom rastlín Fi potomstva s 25' + ľ' a ich opelením Chinese Spring (podobne ako v príklade 8) .
Príklad 12
Príprava vylepšených vložených chromozómov IEC-HC1 (4SsS/4EL/6S1L) , IEC-HC2 (4SsS/4AmL/6S1L) a IEC-HC3 (4AmS4AmL/6S1L)
Príprava týchto vylepšených vložených chromozómov zahŕňa prípravu terminálnej translokácie vzájomnou výmenou distálnych oblastí ôS^ (obsahujúcich alelu ki-S1l-a} s homológnou oblasťou z 4EL alebo 4AmL z centrický fúzovaných chromozómov. Translokovaný- bod zlomu je medzi alelou Ba z 4EL alebo 4AmL (táto je lokalizovaná asi 30 cM od centroméry) a alelou ki-S^-a z ôS^ (tá je lokalizovaná asi 50 cM od centroméry).
Terminálne translokácie sú vyvolané pri rôznych príležitostiach ožiarením semien alebo pelových zrniek Xlúčmi alebo pomalými neutrónmi (kvôli prehľadu pozri Keppene, V.D. a Baenziger, P.S. (1990) Genome 33: strany 525 až 529, Sharma, D. a Knott, D.R. (1966) Can. J. Genet. Cytol. 8: strana 137 až 143. Pomalé neutróny sú pre tieto ciele viac účinné a nespôsobujú žiadne zníženie klíčivosti.
Rastliny monozomicky pridané pre chromozóm vzniknutý centrickou fúziou 4SsS/6SxL (pozri príklad 6), homozygotný
106
| pre alely ms-Bl a Ki-Bl, ktoré nesú aj Ms-Ssl, | rht-Ssl a | ||||
| ki-S^-a, | sú opelené buď | ||||
| (i) | líniou s monozomickým | pridaním | pre | fúzovaný | |
| chromozóm | 4SsS/4EL alebo 4SsS/4AmL, | ktorý je | homozygotný | pre | |
| ms-Bl a Ki-Bl a nesie aj Ms-Ssl, rht-Ssl a | Ba-El | alebo | Ba- | ||
| Aml alebo | |||||
| (ii) | 4Am monozorničky pridanou | líniou, | ktorá | nesie | Ms- |
Aml, rht-Aml a Ba-Aml.
V závislosti od kombinácii rodičov, potomstvo Fx obsahuje aj dizomické pridanie S a dvojnásobne monozomické pridanie L v 4SsS/6S1L + 4SsS/4EL, 4SsS/6SxL + 4SsS/4AmL alebo 4SsS/6S1L + 4Am. Bolo vybrané veľké množstvo semien a tie boli ožiarené 1013 Nth cm2 termálnymi neutrónmi. Takto ošetrené semená boli predklíčené a pomocou metódy počítania chromozómov a DNA sond pre monozomické pridanie boli rozdelené. Vybrané rastliny sa nechali samoopeliť a v ich potomstve sa hľadali potomkovia s modrými semenami. Po výseve sa z týchto semien vyvinuli pelovo fertilné rastliny, z ktorých všetky obsahovali požadovanú translokáciu.
t
Príklad 13
Premena uvažovaného kultivaru pšenice letnej a tvrdej na pelovo sterilnú samičiu líniu a udržiavaciu líniu, ktorá má buď EC-H, EC-HR alebo IEC-HC
Postup premeny uvažovaného kultivaru pšenice letnej na peľovo sterilnú samičiu líniu a udržiavaciu líniu, v ktorej je súbor alel existujúci v samičej a udržiavacej línii nahradený doplnkom alel z uvažovaného kultivaru tak, aby
107 bola vytvorená pelovo sterilná samičia línia a udržiavacia línia alebo vylepšená udržiavacia línia, ktorá má požadovaný doplnok alel z daného kultivaru. Tento postup je vysvetlený na obrázkoch 16a, 17a a 18a.
v tomto postupe udržiavacia línia, ktorá má buď EC-H1, EC-HR1 alebo jeden z typov chromozómov IEC-HC, je homozygotná pre recesivnu alelu pelovej sterility ms-Bl-c a pre dominantnú alelu génu pre navodenie pelovej sterility Ki-Bl. Ďalej má cudzorodý vložený chromozóm 4SsS/6SxL, ktorý nesie dominantné alely Ms-Ssl a rht-Ssl a recesivnu alelu génu pre navodenie pelovej sterility ki-S1l-a a v prípade EC-HR1 aj Su-Ssl, alebo v prípade vylepšených vložených chromozómov 4SsS/4EL/6S1L, 4SsS/4AmL/6S1L alebo 4AmS-4AmL/6S1L, nesúcich ako monozomické pridanie dominantné alely Ms-Ssl a rht-Ssl, dominantnú alelu pre modrý aleurón Ba-El a recesivnu alelu pre gén navodzujúci peľovú sterilitu ki-S2l-a, ďalej alely Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-Aml a ki-SIl-a, alebo alely Ms-Amlf rht-Aml, Ba-Aml a ki-S^-a. Táto udržiavacia línia je opelená uvažovaným kultivarom, ktorý je homozygotný pre Ms-BIMs-Bl a ki-Bl-aki-Bl-a. Všetky Fi hybridy sú heterozygotné pre alely peľovej sterility, Ms-Blms-Bl-c a pre alely génu navodzujúceho peľovú sterilitu Ki-Blki-Bl-a, niektoré z nich nesú aj vložený chromozóm. Tieto rastliny sú vybrané a znovu opelené požadovanou líniou kultivaru, tak vznikne BCX potomstvo, z ktorého je 1/4 heterozygotná pre Ms-Blms-BlcKi-Blki-Bl-a, niektorí potomkovia nesú aj vložený chromozóm. Sadenice s monozomickým pridaním sa vyberú pomocou metódy počítania chromozómov (to je výber rastlín s 2n=43). Heterozygotný charakter oboch miest je určený použitím metódy DNA markerov a testom potomstva. Ďalej sú
108 vybrané rastliny potomstva vo funkcii samičieho rodiča spätne krížené s požadovaným kultivarom po štyri ďalšie generácie, až sa v piatej generácii spätného kríženie získa potomstvo BC5. V každej generácii je potomstvo skúmané postupmi opísanými pre BC; a vyberú sa rastliny, ktoré sú heterozygotné pre Ms-Blms-Bl-cKi-Blki-Bl-a a majú vložený chromozóm ako monozomické pridanie. Samoopelením BC5 vznikne potomstvo, z ktorého 3/64 sú homozygotné pre ms-Blcms-Bl-cKi-BlKi-Bl. To je nami požadovaná pelovo sterilná samičia línia. Ďalšia skupina (1/80) tohto potomstva má podobný genotyp a má tiež vložený chromozóm. To je požadovaná udržiavacia línia.
Príklad 14
Premena uvažovaného kultivaru pšenice letnej a tvrdej na pelovo sterilnú samičiu líniu a udržiavaciu líniu, ktorá má buď REC-H, REC-HR alebo IREC-HC
Postup premeny uvažovaného kultivaru pšenice letnej na pelovo sterilnú samičiu rodičovskú líniu a rekombinantnú udržiavaciu líniu, v ktorej je súbor alel existujúci v samičej a udržiavacej línii nahradený doplnkom alel z uvažovaného kultivaru tak, aby bola vytvorená pelovo sterilná samičia línia a rekombinantná udržiavacia línia alebo vylepšená udržiavacia línia, ktorá má požadovaný doplnok alel z kultivaru. Tento postup je vysvetlený na obrázkoch 16b, 17b a 18b.
V tomto postupe rekombinantná udržiavacia línia je monozomicky substituovaná pre 6B v 4SsS/6S1L/6BL, je homozygotná pre recesívnu alelu pelovej sterility ms-Bl-c,
109 má dominantnú alelu pelovej fertility Ms-Ssl a je hemizygotná pre recesívnu alelu génu navodzujúceho pelovú sterilitu Ki-Bl a pre recesívnu alelu pelovej sterility kiS^-a a v prípade REC-HR1 aj pre alelu Su-S1!. Alebo možno použiť jednu z vylepšených rekombinantných udržiavacích línií, ktorá je monozomicky substituovaná pre vylepšené rekombinantné vložené chromozómy 4SsS/4EL/6S1L/6BL, 4SsS/4AmL/6S1L/6BL alebo 4AmS-4AmL/6S1L/6BL, nesúce buď alely Ms-Ssl a rht-Ssl, Ba-El a ki-S1l-a, alebo alely Ms-Ssl, rhtSsl, Ba-Aml a ki-S^-a alebo alely Ms-Aml, rht-Aml, Ba-Aml a ki-S^-a a tá je opelená uvažovaným kultivarom, ktorý je homozygotný pre Ms-BIMs-Bl a ki-Bl-aki-Bl-a. Všetky Fx hybridy sú heterozygotné pre alely navodzujúce pelovú sterility (Ms-Blms-Bl-c), 1/2 z nich je dvojnásobne monozomické pre 6B (obdržali tento chromozóm od svojho samčieho rodiča a preto sú hemizygotné pre Ki-Blki-a) a pre REC alebo IREC, ďalšia polovica je dizomická pre 6B a heterozygotná pre Ki-Slki-Bl-a. Dizomické a dvojnásobnemonozomické rastliny sú vybrané a opelené uvažovaným kultivarom. Tak vznikne potomstvo BCX, z ktorého je 1/2 heterozygotná pre Ms-Blms-Bl-c. Toto BCX potomstvo vykazuje dva typy jedincov: typ prvý, odvodený z opelenia dvojnásobne monozomických Fx rastlín, z ktorého je 1/2 dvojnásobne monozomická pre 6B a preto hemizygotná pre kiBl-a, ďalej pre REC a IREC, druhý typ, odvodený z opelenia dizomických Fx rastlín, z ktorých 1/2 je heterozygotných Ki-Blki-Bl-a. Rastliny z BCX, ktoré sú heterozygotné pre Ms-Blms-Bl-c, ktoré boli monozomické pre 6B a ktoré majú monozomickú substitúciu pre 6B v každom chromozóme 4SsS/6S1L/6BL, 4SsS/4EL/6S1L/6BL, 4SsS/4AmL/6S1L/6BL alebo 4AmS-4AmL/6S1L/6BL a ďalej rastliny, ktoré sú pre 6B dizomické a sú heterozygotné pre Ki-Blki-Bl-a, možno vybrať
110 pomocou DNA markerov a cytologickou analýzou a ďalej spätne krížiť vo funkcii samičích rodičov s uvažovaným kultivarom po štyri ďalšie generácie tak, aby sa získalav piata generácia spätného kríženie (BC5) . Potomstvo z každej generácie je analyzované postupom opísaným pre BCi· Vybrané
| sú rastliny | heterozygotné | pre | Ms-Blms-Bl- | •c a | buď |
| hemizygotné | ki-Bl-a, ktoré | majú | REC alebo | IREC | ako |
| monozomickú | substitúciu, | alebo | dizomické | pre | 6B, |
| heterozygotné | pre Ki-Blki-Bl-a. | Vybrané | rastliny, |
dvojnásobne monozomické pre 6B-REC alebo IRECBC5, sú potom opelené dizomickými rastlinami z potomstva BC5. Tak vznikne BC2F2 potomstvo, z ktorého je 1/8 dvojnásobne monozomická pre 6B-REC alebo IREC (nesie ms-Bl-cms-Bl-c Ms-Ssl Ki-Bl a ki-S^-a) . To je buď požadovaná rekombinantná udržiavacia línia alebo vylepšená rekombinantná udržiavacia línia. Ďalšia 1/8 je dizomická a má ms-Bl-cms-Bl-c a Ki-Blki-Bl-a. To je požadovaná peľovo sterilná samičia línia.
Claims (59)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Spôsob udržiavania pelovo sterilnej samičej rodičovskej línie pšenice tvrdej alebo letnej na použitie v produkcii hybridnej pšenice, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) kríženie samičej rodičovskej rastliny so samčou rodičovskou rastlinou, pričom uvedená samičia rodičovská rastlina je pelovo sterilná rastlina homozygotná ako v ľubovoľnej z recesívych alel peľovej sterility ms-Bl na krátkom ramene chromozómu 4B(4BS), tak aj v dominantnej alele génu spôsobujúceho peľovú sterilitu Kí-Bl na dlhom ramene chromozómu 6B(6BL), a pričom uvedená samčia rodičovská rastlina je udržiavacou líniou a je génovo zhodná so samičou rodičovskou rastlinou a homozygotná v tých istých alelách ms-Bl a Ki-Bl samičej rodičovskej rastliny, a zároveň nesie dodatočný cudzí vložený chromozóm vybraný z: i) vloženého chromozómu opisovaného ako-EC, skladajúceho sa zo segmentov pochádzajúcich z dvoch alebo viacerých rozdielnych cudzích chromozómov, ktoré nesú dominantnú alelu pre peľovú fertilitu Ms, recesívnu alelu ki, ktorá je citlivá voči aktivite natívnej alely génu pre peľovú sterilitu na chromozóme 6BL a jeden alebo dva selekčné markery, pomocou ktorých možno odlíšiť rastliny nesúce tento chromozóm; a z ii) vylepšeného vloženého chromozómu opisovaného ako IEC, sa skladá zo segmentov pochádzajúcich z dvoch alebo viacerých rozdielnych cudzích chromozómov, ktoré okrem alel Ms a ki a selekčných markerov nesú ešte marker semena, ktorý umožňuje odlíšiť semeno s týmto chromozómom a bez neho; ab) zber semien krížencov podľa (a), pričom všetky tieto semená sú homozygotné v uvedenej alele pre peľovú sterilitu112 a v géne spôsobujúcom pelovú sterilitu a nenesú vložený chromozóm EC alebo IEC, a pričom možno z týchto semien vypestovať rastliny uvedenej pelovo sterilnej samičej línie.
- 2. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený vložený cudzorodý chromozóm nesie ako selekčný marker alelu rht určujúcu normálny vzrast rastliny a je označovaný ako EC-H.
- 3. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený vylepšený vložený cudzorodý chromozóm nesie ako selekčný marker alelu rht a ako marker semena alelu Ba, určujúcu modrú farbu semien, pričom tento chromozóm je označovaný ako IEC-HC.
- 4. Spôsob podlá nároku 2, vyznačujúci sa tým, že uvedený vložený cudzorodý chromozóm ECcH je rekombinantný chromozóm EC-H1 skladajúci sa zo segmentov 4SsS/6SLl, ktorý nesie alely Ms-Ssl a rht-íŕl na krátkom ramene a ki-S11-a na dlhom ramene.
- 5. Spôsob podlá nároku 3, vyznačujúci sa tým, že uvedený vylepšený vložený cudzorodý chromozóm IEC-HC je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z chromozómu IEC-HC1, ktorý sa skladá zo segmentov chromozómov 4SsS/4EL/6S1L, nesúcich Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-El a ki-S1l-a, chromozómu IEC-HC2, ktorý sa skladá zo segmentov 4SsS/4AmL/6S1L, nesúcich Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-Aml a ki-S^-a a chromozómu IEC-HC3 skladajúceho sa zo segmentov 4AmS4AmL/6S1L, nesúcich Ms-Aml, rht-Aml, Ba-Aml a ki-S^-a.113
- 6. Spôsob udržiavania pelovo sterilnej samičej rodičovskej línie pšenice letnej alebo tvrdej na použitie v produkcii hybridnej pšenice, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) skríženie samičej rodičovskej rastliny so samčou rodičovskou rastlinou, pričom uvedená samičia rodičovská rastlina je pelovo sterilný homozygot ako pre ľubovoľnú z recesivych ms-Bl alel pre peľovú sterilitu na krátkom ramene chromozómu 4B(4BS), tak aj pre dominantnú alelu génu spôsobujúceho peľovú sterilitu Ki-Bl na dlhom ramene chromozómu 6B(6BL), a pričom uvedená samčia rodičovská rastlina je udržiavacia línia, ktorá je génovo zhodná so samičou rodičovskou rastlinou a homozygotná v rovnakej msBl alele akú má aj samičia rodičovská rastlina, ale je monozomická ako v chromozóme 6B nesúcom Ki-Bl alelu, tak aj vo vloženom rekombinantnom chromozóme vybranom z: i) vloženého rekombinantného chromozómu, označovaného ako REC, ktorý sa skladá zo segmentov pochádzajúcich od dvoch _alebo viacerých rozdielnych cudzorodých chromozómov a z distálneho segmentu natívneho chromozómového ramena 6BL, nesúceho alelu Ms, alebo alelu ki a jeden alebo dva selekčné markery pre výber rastlín s týmto chromozómom; a z ii) vylepšeného vloženého rekombinantného chromozómu, opisovaného ako IREC, ktorý sa skladá zo segmentov pochádzajúcich od dvoch alebo viacerých rozdielnych cudzorodých chromozómov a z distálneho segmentu natívneho chromozómového ramena 6BL, nesúceho okrem alel Ms a ki a selekčného markera ešte marker semena, ktorý umožňuje rozlíšiť semeno s týmto chromozómom a bez neho; ab) zber semena krížencov podľa (a), pričom všetko toto semeno je homozygotné v uvedených alelách peľovej sterility a v géne spôsobujúcom peľovú sterilitu a nenesie114
rekombinantný chromozóm REC alebo IREC, pričom sa sterilnej z tohto samičej semena vyvinú línie. rastliny uvedenej peľovo 7. Spôsob podľa nároku 6, v y z n a č u j ú c i sa tým, že uvedený vložený rekombinantný chromozóm, označovaný ako REC-H, nesie ako selekčný marker alelu rht, určujúcu normálny vzrast rastliny. - 8. Spôsob podlá nároku 6, vyznačujúci sa tým, že vylepšený vložený rekombinantný chromozóm, označovaný ako IREC-HC, nesie ako selekčný marker alelu rht a ako marker semena alelu Ba, určujúcu modrú farbu semien.
- 9. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že uvedený vložený rekombinantný chromozóm REC-H je vložený rekombinantný chromozóm REC-H1, ktorý obsahuje segmenty_4SsS/6S1L/6BL, nesúce alely Ms-Ssl _a rht-Ssl na krátkom ramene a ki-S^-a na dlhom ramene.
- 10. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že uvedený vylepšený vložený rekombinantný chromozóm IREC je vybraný zo skupiny skladajúcej sa z chromozómu IREC-HC1, ktorý obsahuje segmenty 4SsS/4EL/6S1L/6BL, nesúce alely Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-El a ki-S^-a; chromozómu IRECHC2, ktorý obsahuje segmenty 4SsS/4AmL/6S1L/6BL, nesúce MsSsl, rht-Ssl, Ba-Aml a ki-S1l-a; a chromozómu IREC-HC3, ktorý obsahuje segmenty 4AmS-4AmL/6S1L/6BL, nesúce Ms-Aml, rht-Aml, Ba-Aml a ki-S^-a.
- 11. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že uvedený vložený cudzorodý chromozóm EC-H nesie115 alelu Su pre rezistenciu proti chlórtolurónu ako ďalší selekčný marker, pričom taký vložený cudzorodý chromozóm je označovaný ako EC-HR.
- 12. Spôsob podlá nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedený vložený cudzorodý chromozóm EC-HR nesie alely Ms-Ssl, rht-Ssl, Su-Ssl a ki-S^-a, pričom taký vložený cudzorodý chromozóm je označovaný ako EC-HR.
- 13. Spôsob podlá nároku 7, vyznačujúci sa tým, že uvedený vložený rekombinantný chromozóm REC-H nesie alelu Su pre rezistenciu proti chlórtolurónu ako ďalší selekčný marker, pričom taký vložený rekombinantný chromozóm je označovaný ako REC-HR.
- 14. Spôsob podlá nároku 13, vyznačujúci sa tým, že uvedený vložený rekombinantný chromozóm REC-HR sa skladá zo segmentov 4SsS/6S1L/6BL, nesúcich alely Ms-Ssl, rht-S5!., Su-Ssl a ki-S1l-a, pričom taký vložený rekombinantný chromozóm je označovaný ako REC-HR1.
- 15. Spôsob udržiavania pelovo sterilnej samičej rodičovskej línie pšenice letnej alebo tvrdej na použitie v produkcii hybridnej pšenice, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) samoopelenie udržiavacej línie, ktorá je génovo zhodná so samičou rodičovskou rastlinou, t.j., že homozygotná ako v ľubovoľnej z recesívnych alel ms-Bl pre peľovú sterilitu, tak aj v alele dominantného génu spôsobujúceho peľovú sterilitu Ki-Bl; a ktorá má naviac dodatočný vylepšený vložený cudzorodý chromozóm, označovaný ako IEC, nesúci okrem naviac alel Ms, ki a selekčného markera ešte marker116 semena, ktorý umožňuje rozlíšiť semeno s týmto chromozómom a bez neho; ab) zber semena rastlín vzniknutých samoopelovaním podlá (a), ktoré je celé homozygotné v uvedenej pelovej sterilite a v alele génu spôsobujúceho pelovú sterilitu; ac) oddelenie semien obsahujúcich chromozóm IEC a teda aj marker semena (20 %) od semien neobsahujúcich chromozóm IEC a teda ani marker semena (80 %), pričom uvedené semená bez markera semena sa po vysiatí vyvinú do uvedenej pelovo sterilnej samičej línie.
- 16. Spôsob podlá nároku 15, vyznačujúci sa tým, že uvedenou alelou markera semena je alela Ba, určujúca modrú farbu semena a modré semená sú oddelené pomocou triediaceho zariadenia od červených alebo bielych semien bez alely Ba.
- 17. _Spôsob podlá nároku 15 alebo 16, v y_z načuj úci sa t ý m, že uvedený vylepšený vložený cudzorodý chromozóm IEC je vybraný zo skupiny tvorenej chromozómom IEC-HC1, ktorý obsahuje 4SsS/4EL/6S1L, nesúce Ms-S3]., rhtSsl, Ba-El a ki-S1l-a; chromozómom IEC-HC2, ktorý obsahuje 4SsS/4AmL/6S1L, nesúce Ms-Ssl, rht-S5!., Ba-Aml a ki-S^-a; a chromozómom IEC-HC3, ktorý obsahuje 4AmS-4AmL/6S1L, nesúce Ms-Aml, rht~Aml, Ba-Aml a ki -S11-a.
- 18. Spôsob udržiavania pelovo sterilnej samičej rodičovskej línie pšenice letnej alebo tvrdej na použitie v produkcii hybridnej pšenice, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) samoopelenie vylepšenej rekombinantnej udržiavacej línie, ktorá je génovo zhodná so samičou rodičovskou117 rastlinou, t.j., je homozygotná v ľubovoľnej z recesivnych alel peľovej sterility ms-Bl na chromozóme 4BS, ale je monozomická ako v chromozóme 6B, nesúcom alelu Ki-Bl, tak aj vo vylepšenom vloženom rekombinantnom chromozóme, označovanom ako IREC, ktorý nesie, okrem alel Ms, ki a alely selekčného markera, ešte marker semena, pomocou ktorého možno odlíšiť semená s týmto chromozómom IREC a bez neho ;b) zber semena rastlín vzniknutých samoopeľovaním podľa (a), ktoré je celé homozygotné v uvedenej alele peľovej sterility a z ktorého 50 % je dizomických vzhľadom na chromozóm 6B a nemá chromozóm IREC a marker semena a 50 % obsahuje ako IREC, tak aj marker semena;c) pestovanie semena druhej generácie podľa (b) v zmesi tak, aby bolo umožnené opelenie pelovo sterilných rastlín pelovo fertilnými, ako aj samoopelenie pelovo fertilných rastlín za vzniku zmiešaného semena ďalšej generácie; ad) oddelenie asi 75 % semien dizomických vzhľadom na chromozóm 6B a zároveň bez chromozómu IREC a markera semena a vypestovanie uvedenej pelovo sterilnej samičej línie zo zvyšujúcich 25 % semien obsahujúcich IREC a marker semena.
- 19. Spôsob podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že alela markera samčieho semena je Ba alela určujúca modrú farbu semena a modré semená sú oddelené pomocou triediaceho zariadenia od červených alebo bielych semien bez Ba alely.
- 20. Spôsob podľa nároku 18 alebo 19, vyznačuj úci sa t ý m, že uvedený vylepšený vložený rekombinantný chromozóm IREC je vybraný zo skupiny tvorenej: chromozómom IREC-HC1, ktorý obsahuje segmenty 4SsS/4EL/6S1L/6BL, nesúce118 alely Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-El a ki-S^-a; chromozómom IRECHC2, ktorý obsahuje segmenty 4SsS/4AmL/6S1L/6BL, nesúce alely Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-Aml a ki-S^-a; a chromozómom IREC-HC3, ktorý obsahuje segmenty 4AmS-4AmL/6S1L/6BL, nesúce Ms-Aml, rht-Aml, Ba-Aml a ki-S'l-a.
- 21. Udržiavacia línia vybraná z pelovo fertilnej udržiavacej línie a vylepšená pelovo fertilná udržiavacia línia pšenice tvrdej alebo letnej na údržbu peľovo sterilnej ženskej rodičovskej línie na použitie v produkcii hybridnej pšenice, ktorá je génovo zhodná so samičou rodičovskou rastlinou a homozygotná ako v ľubovoľnej z alel ms-Bl pre peľovej sterilitu, tak aj v alele nesúcej gén pre peľovú sterilitu Ki-Bl samičej rodičovskej rastliny, a ktorá má vložený dodatočný cudzorodý chromozóm, vybraný zo skupiny tvorenej: i) chromozómom EC, ktorý sa skladá zo segmentov odvodených od dvoch alebo viacerých rôznych cudzích chromozómov, a ktorý nesie dominantnú alelu peľovej fertility Ms, recesívnu alelu ki, ktorá je citlivá voči sterilizačnej aktivite prirodzenej alely génu pre sterilitu peľu na chromozóme 6BL a selekčný marker, pomocou ktorého možno selektovať rastliny' s týmto chromozómom; a ii) chromozómom IEC, ktorý sa skladá zo segmentov odvodených od dvoch alebo viacerých rôznych cudzích chromozómov, a ktorý okrem alel Ms, ki a selekčného markera nesie marker semena, ktorý umožňuje rozlíšiť semeno s týmto chromozómom a bez neho.
- 22. Udržiavacia línia vybraná z rekombinantnej pelovo fertilnej udržiavacej línie a z vylepšenej rekombinantnej pelovo fertilnej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej na udržiavanie pelovo sterilnej samičej rodičovskej119 línie na použitie pri produkcii hybridnej pšenice, pričom uvedená udržiavacia línia alebo vylepšená udržiavacia línia je génovo zhodná so samičou rodičovskou rastlinou, t.j. je homozygotná v ľubovoľnej z alel peľovej sterility ms-Bl, ale je monozomická ako vzhľadom na chromozóm 6B nesúci alelu Ki-Bl, tak vzhľadom na rekombinantný alebo vylepšený vložený rekombinantný chromozóm, vybraný zo skupiny tvorenej: i) chromozómom REC, skladajúcim sa zo segmentov odvodených od dvoch alebo viacerých rôznych cudzích chromozómov a z distálneho segmentu prirodzeného chromozómového ramena 6BL, nesúceho alelu Ms a ki a selekčný marker, pomocou ktorého možno selektovať rastliny s týmto chromozómom; a ii) chromozómom IREC, ktorý sa skladá zo segmentov odvodených od dvoch alebo viacerých rôznych cudzích chromozómov a z distálneho segmentu prirodzeného chromozómového ramena 6BL, nesúceho okrem alel Ms, ki a selekčného markera ešte marker semena, ktorý umožňuje rozlíšiť semeno, s týmto chromozómom a bez neho.
- 23. Udržiavacia línia podľa nároku 21 alebo 22, v ktorej uvedený vložený cudzorodý chromozóm EC-H, IEC-HC, REC-H alebo IREC-HC obsahuje ako selekčný marker alelu rht, určujúcu normálny vzrast rastlín.
- 24. Udržiavacia línia podľa nárokov 21 až 23, v ktorej uvedený vložený cudzorodý chromozóm IEC-HC alebo IREC-HC nesie ako selekčný marker semena Ba alelu pre modrú aleurónovú farbu semena.
- 25. Udržiavacia línia podľa nároku 23 alebo 24, v ktorej je uvedený vložený cudzorodý chromozóm vybraný zo skupiny tvorenej: (i) chromozómom REC-H1, ktorý nesie alely Ms-Ssl,120 rht-Ssl a ki-S11-a, a (ii) jedným z chromozómov IREC-HC, ktoré nesú alely Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-El a ki-S11-a alebo MsSsl, rht-Ssl, Ba-A^l a ki-S11-a alebo Ms-Aml, rht-Aml, Ba-A~‘l a ki-S^-a.
- 26. Udržiavacia línia vybraná z pelovo fertilnej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej pre údržbu pelovo sterilnej ženskej rodičovskej línie na použitie v produkcii hybridnej pšenice, pričom uvedená udržiavacia línia je génovo zhodná so samičou rodičovskou rastlinou a homozygotná ako v lubovolnej z alel ms-Bl pre pelovú sterilitu, tak v alele su-Bl pre citlivosť na herbicíd chlórtolurón a tak aj v alele génu pre sterilitu pelu Ki-Bl samičej rodičovskej rastliny, a ďalej má vložený dodatočný cudzorodý chromozóm, vybraný zo skupiny tvorenej chromozómami typu EC-HR, ktoré sa skladajú zo segmentov odvodených od dvoch alebo viacerých rôznych cudzích chromozómov, a_ ktorý nesie dominantnú alelu pelovej fertility Ms, recesívnu alelu ki, ktorá nesie citlivosť na sterilizačnú aktivitu prirodzenej alely génu pre sterilitu pelu na chromozóme 6BL a dva selekčné markery: alelu rht určujúcu normálny vzrast rastlín a alelu Su určujúcu rezistenciu proti chlórtolurónu, pomocou ktorého možno selektovať rastliny s týmto chromozómom.
- 27. Udržiavacia línia podlá nároku 26, v ktorej uvedený vložený cudzorodý chromozóm typu EC-HR1 nesie ako selekčné markery rht-Ssl a Su-Ssl.
- 28. Udržiavacia línia vybraná z pelovo fertilnej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej pre údržbu pelovo sterilnej ženskej rodičovskej línie na použitie v121 produkcii hybridnej pšenice, pričom uvedená udržiavacia línia je génovo zhodná so samičou rodičovskou rastlinou, t. j. je homozygotná v ľubovoľnej z alel ms-Bl, ale je monozomická ako v chromozóme 6B nesúcom alely su-Bl a KiBl, tak aj vo vloženom rekombinantnom chromozóme, vybranom zo skupiny tvorenej chromozómami typu REC-HR, ktoré sa skladajú zo segmentov odvodených od dvoch alebo viacerých rôznych cudzích chromozómov a z distálneho segmentu prirodzeného chromozómového ramena 6BL, ktoré nesie alely Ms, ki a selekčné markery, ktoré umožňujú rozlíšiť semeno s chromozómom REC-HR a bez neho.
- 29. Udržiavacia línia podľa nároku 28, v ktorej je uvedený vložený cudzorodý chromozóm typu REC-HR1 a nesie ako selekčné markery alelu rht-Ssl, ktorá určuje normálny vzrast rastlín a alelu Su-Ssl, ktorá udeľuje rastlinám rezistenciu proti chlórtolurónu.
- 30. Spôsob udržiavania stáleho pomeru medzi peľovo fertilnými a peľovo sterilnými rastlinami vo všetkých generáciách udržiavacej línie alebo rekombinantnej udržiavacej línie pšenice letnej a tvrdej, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) samoopelenie pelovo fertilnej udržiavacej línie obsahujúcej vložený cudzorodý chromozóm vybraný zo skupiny tvorenej vloženým cudzorodým chromozómom EC-H a vloženým rekombinantným chromozómom REC-H, ktorý okrem alel Ms a ki nesie aspoň jednu alelu pre selekčný marker, ktorý uľahčuje selekciu semien peľovo fertilného, samoopelením vzniknutého potomstva, pričom uvedená udržiavacia línia vzniká pestovaním uvedených semien;122b) zber semien podľa bodu (a) a ich pestovanie za vzniku rastlín, z ktorých 20 % (to sa týka potomstva udržiavacej línie s vloženým cudzorodým chromozómom EC-H) a 50 % (to sa týka potomstva udržiavacej línie s vloženým rekombinantným chromozómom REC-H) obsahuje uvedený vložený chromozóm a sú identické s uvedenou udržiavacou líniou a nesú teda alelu so selekčným markerom, ktorá umožňujú rozlíšiť semeno s vloženým chromozómom a bez neho;c) zber rastlín vykazujúcich prejavy selekčného markeru podľa bodu (b) , z ktorých všetky sú peľovo fertilné, a získavanie semien ďalšej generácie, z ktorých 20 % (to sa týka potomstva udržiavacej línie s vloženým cudzorodým chromozómom EC-H) alebo 50 % (to sa týka potomstva udržiavacej línie s vloženým rekombinantným chromozómom REC-H) nesie uvedený vložený chromozóm, čím sa udržiava stály pomer peľovo fertilných a peľovo sterilných rastlín v jednotlivých generáciách udržiavacej línie alebo rekombinantnej udržiavacej línie.
- 31. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že selekčným markerom je alela rht, ktorá podporuje rast rastlín do výšky, čím uľahčuje selektívny zber semien peľovo fertilnej udržiavacej línie, pričom uvedená udržiavacia línia vzniká pestovaním uvedených semien.
- 32. Spôsob udržiavania stáleho pomeru medzi peľovo fertilnými a peľovo sterilnými rastlinami v jednotlivých generáciách udržiavacej línie alebo rekombinantnej udržiavacej línie pšenice letnej a tvrdej, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) samoopelenie peľovo fertilnej udržiavacej línie obsahujúcej vložený chromozóm vybraný zo skupiny tvorenej:123 vloženým chromozómom typu EC-HR a vloženým rekombinantným chromozómom typu REC-HR, ktorý okrem alel Ms-S^l a ki-S^-a nesie ako selekčný marker alelu rezistencie proti herbicídu, ktorá z pelovo fertilného, samoopelením udržiavacej línie vzniknutého potomstva, uľahčuje výber rastlín s rovnakým genotypom ako uvedená udržiavacia línia;b) zber semien ďalšej generácie podľa bodu (a), klíčenie uvedených semien a ich pestovanie do štádia sadeníc, z ktorých 20 % (týka sa EC-HR) a 50 % (týka sa REC-HR) obsahuje uvedený vložený cudzorodý chromozóm a postrekovanie sadeníc herbicídom tak, aby boli eliminované všetky citlivé sadenice, t.j. tie, ktoré nenesú vložený cudzorodý chromozómom; ac) zber rastlín odolných proti herbicídom (b), ktoré všetky nesú uvedený vložený cudzorodý chromozómom a sú teda peľovo fertilné, a získavanie semien ďalšej generácie, z ktorej 20 % (to sa týka potomstva s vloženým chromozómom EC-H) alebo 50 % (to sa týka potomstva s vloženým chromozómom REC-H) nesie uvedený vložený chromozóm, čím sa udržiava stály pomer pelovo fertilných a pelovo sterilných rastlín v jednotlivých generáciách udržiavacej línie alebo rekombinantnej udržiavacej línie.
- 33. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že alelou rezistencie proti selekčnému je alela Su~Ssl, ktorá nesie rezistenciu proti chlórtolurónu.
- 34. Spôsob pestovania len peľovo fertilných udržiavacích rastlín v jednotlivých generáciách vylepšenej udržiavacej línie alebo vylepšenej rekombinantnej udržiavacej línie pšenice letnej a tvrdej, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:124a) samoopelenie pelovo fertilnej udržiavacej línie obsahujúcej vložený chromozóm vybraný zo skupiny tvorenej: vylepšeným vloženým chromozómom typu IEC-HC a vloženým vylepšeným rekombinantným chromozómom typu IREC-HC, ktorý okrem alel Ms-Ssl a ki-S'l-a nesie ako selekčný marker alelu rezistencie proti herbicídu, ktorá z pelovo fertilného, samoopelením udržiavacej línie vzniknutého potomstva, uľahčuje výber rastlín s rovnakým genotypom ako uvedená udržiavacia línia;b) zber semien ďalšej generácie podľa bodu (a) a oddelenie semien, ktoré vykazujú uvedený marker, od semien, ktoré ho nevykazujú pomocou triediaceho zariadenia;c) pestovanie semien vykazujúcich marker semena podľa bodu (b) , z ktorých sa vyvinú len pelovo fertilné rastliny vylepšenej udržiavacej línie alebo rastliny vylepšenej rekombinantnej udržiavacej línie.
35. Spôsob podľa nároku 34, vyzná čujúci -s a t ý m, že markerom semena je alela Ba, ktorá určuje modrú farbu semena. 36. Spôsob produkcie peľovo fertilnej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej s vloženým cudzorodým chromozómom typu EC-H1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) kríženie pelovo fertilnej samičej rodičovskej rastliny odvodenej od pšenice letnej kultivaru Chinese Spring, pričom uvedená samičia rodičovská rastlina je homozygotná ako v dominantnej alele peľovej fertility Ms-Bl na chromozómovom ramene 4BS, tak aj v dominantnej alele Ki-Bl na chromozóme 6BL, pričom táto rastlina má dodatočný cudzorodý chromozóm 6S1, na ktorého dlhom ramene sa125 nachádza recesívna alela génu pre peľovú sterilitu ki-S:l-a so samčou rodičovskou líniou, ktorá je vzhľadom na samičiu rodičovskú rastlinu génovo zhodná a homozygotná v recesívnej alele peľovej sterility ms-Bl-c, a ktorá má namiesto chromozómu 6S1 dodatočný cudzí chromozómom 4S', na ktorého krátkom ramene sa nachádzajú dominantné alely MsSsl a rht-Ssl;b) zber semena vzniknutého krížením podľa bodu (a) a pestovanie uvedených semien za vzniku pelovo fertilných Fi rastlín, z ktorých niektoré nesú dvojitý monozomický prídavok, t.j. majú dva cudzie chromozómy a to chromozóm 4Ss nesúci alely Ms-Ssl a rht-Ssl a chromozóm 6S1, ktorý nesie alelu ki-S^-a;c) samoopelenie uvedeného Fi potomstva podľa bodu (b), zberanie veľkého množstva semien týchto rastlín a ich pestovanie za vzniku F2 rastlín, z ktorých niektoré sú monozomické vzhľadom na vložený cudzorodý chromozóm EC-H1, z ktorých 25 % tvorí požadované rastliny, -ktoré sú homozygotné v alele ms-Bl-c pre peľovú sterilitu;d) selekcia uvedených požadovaných rastlín (c) pomocou počítania chromozómov, C-pásikovania a použitím DNA markerov a ich samoopelenie;e) zber semien vzniknutých samoopelením bodu (d) a pestovanie uvedených semien za vzniku F3 rastlín, ktoré sú všetky homozygotné v alele ms-Bl-c pre peľovú sterilitu, a 25 % z nich je peľovo fertilných požadovaných rastlín udržiavacej línie, pretože majú uvedený dodatočný vložený cudzorodý chromozóm EC-HE1; af) selekciu požadovaných rastlín udržiavacej línie podľa bodu (e) pomocou metódy počítania chromozómov a použitia DNA markerov.126 - 37. Spôsob produkcie peľovo fertilnej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej s vloženým rekombinantým chromozómom typu REC-H1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) kríženie peľovo fertilnej samičej rodičovskej rastliny odvodenej od pšenice letnej kultivaru Chinese Spring, pričom uvedená samičia rodičovská raslina je homozygotná ako v dominantnej alele peľovej fertility Ms-Bl na chromozómovom ramene 4BS, tak aj v dominantnej alele supresora homológneho párovania Phl na chromozómovom ramene 5BL, nulizomická v chromozóme 6B, vďaka čomu je deficitná v dominantnej alele Ki-Bl pre peľovú sterilitu, a ďalej má táto rastlina pár dodatočných cudzorodých chromozómov 6S:, na ktorého dlhom ramene sa nachádza recesívna alela génu pre sterilitu peľu ki-S^-a, so samčou rodičovskou rastlinou, ktorá je vzhľadom na samičiu rodičovskú líniu génovo zhodná, ale je dizomická v chromozóme 6B a teda homozygotná v alele Ki-Bl, chýba jej chromozóm 6S a je takisto homozygotná v mutantnej alele pre homológne párovanie phlb;b) zber semena vzniknutého krížením podľa bodu (a) a pestovanie uvedených semien za vzniku peľovo fertilných F; rastlín (Ms-BIMs-Bl), ktoré sú heterozygotné v alelách pre homológne párovanie (Phlphlb) a všetky monozomické ako pre chromozóm 6B, tak 6S1 ;c) spätné kríženie uvedených Fx rastlín podľa bodu (b) so samčou rodičovskou rastlinou;d) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (c) a pestovanie uvedených semien za vzniku BCX rastlín, ktoré sú všetky peľovo fertilné (Ms-BIMs-Bl), pričom 50 % z nich je homozygotných v alele phlb, a z ktorých 50 % je dvojnásobne127 mono zorníc kých vzhľadom na chromozómy 6B a 6S1, čo sú požadované rastliny BC:;e) selekciu požadovaných rastlín BCi podľa bodu (d) pomocou DNA markerov a sledovania párovania chromozómov v priebehu meiózy, opelenie týchto rastlín ditelozomickou 6BS líniou, ktorá je génovo zhodná s BCi rastlinami, ale je homozygotná v PhlPhl;f) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (e) a pestovanie uvedených semien za vzniku rastlín, ktoré sú všetky monotelozomické v chromozómovom ramene 6BS a niektoré z nich sú požadované rastliny, ktoré sú monozomické vzhľadom na rekombinantný chromozóm, ktorý pozostáva z krátkeho ramena a proximálnej oblasti dlhého ramena chromozómu 6S1, (ktoré nesie ki-S1l-a) a distálnej oblasti chromozómového ramena 6BL, pričom bod rekombinácie je distálny k alele ki-S^-a;g) selekciu požadovaných rastlín podľa bodu (f) pomocou C-pásikovania, použitia DNA markerov -a analýzy párovania chromozómov a ich kríženie ako samčích rastlín so samičou líniou, čo je nerekombinantná udržiavacia línia, t.j. homozygotná ako v ľubovoľnej z recesívnych alel peľovej sterility ms-Bl, tak v dominantnej alele génu pre sterilitu peľu Ki-Bl a má vložený cudzorodý chromozóm EC-H1;h) zber semien vzniknutých kríženín podľa bodu (g) a pestovanie uvedených semien za vzniku Fi rastlín, z ktorých niektoré sú požadované rastliny, ktoré sú trikrát monozomické a to v chromozóme 6B, vo vloženom cudzorodom chromozóme EC-H1 a v rekombinantnom chromozóme (ósVóBL) a ktoré sú heterozygotné v alele Ms-BIMs-Bl, hemizygotné v alele Ki-Bl a homozygotné v alele ki-S1l-aki-S11-a;i) selekciu uvedených požadovaných rastlín podľa bodu (h) pomocou počítania chromozómov, C-pásikovania a použitia DNA128 markerov a ich samoopelenie, zber ich semien a vypestovanie rastlín F2 generácie, z ktorých niektoré sú požadované rastliny, ktoré dvojnásobne monozomické, v chromozóme 6B a vloženom rekombinantnom chromozóme REC-H1, nesú alely MsSsl, rht-Ssl a ki-^l-a.
- 38. Spôsob prípravy pelovo fertilnej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej s vloženým cudzorodým chromozómom typu EC-HR1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) kríženie pelovo fertilnej samičej rodičovskej rastliny odvodenej od peľovo fertilnej udržiavacej línie pšenice letnej cv. Chinese Spring, pričom uvedená samičia rodičovská rastlina je homozygotná v recesívnej alele ms-Bl pre peľovú sterilitu, recesívna v alele su-Bl pre citlivosť na chlórtolurón a v dominantnej alele Ki-Bl nesúcej gén pre sterilitu peľu a ktorá má vo forme monozomického pridania vložený cudzorodý chromozóm EC-ΉΙ, ktorý nesie na svojom krátkom ramene dominantnú alelu Ms-Ssl pre peľovú fertilitu a semidominantná alelu rht-Ssl a na svojom dlhom ramene recesívnu alelu su-S;l pre citlivosť na chlórtolurón a recesívnu alelu ki-S^-a pre sterilitu peľu, s líniou diploidného druhu Aegilops searsii, ktorá obsahuje dominantnú alelu génu pre rezistencie proti chlórtolurónu Su-Ssl na chromozóme 6SsL, ako aj alely Ms-Ssl a rht-Ssl na chromozóme 4SsS;b) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (a) a pestovanie týchto semien za vzniku Fi rastlín, z ktorých niektoré majú 2n=29 chromozómov, t.j. že majú jednu sadu chromozómov z kultivaru Chinese Spring, vložený chromozóm EC-H1 a sadu chromozómov Aegilops searsii, pričom majú genotyp ms-BlMs-SslMs-Ssl, ki-Blki-S11-a su-Blsu-S1 lSu-Ssl;129c) selekciu uvedených rastlín F: generácie podlá bodu (b) s 2n=29 chromozómami a použitie ich peľu na spätné kríženie s rastlinami cv. Chinese Spring, zber semena vzniknutého týmto krížením a pestovanie rastlín z tohto semena za vzniku BCi. rastlín, z ktorých niektoré, ktoré sú odolné proti chlórtolurónu, sú požadované rastliny, ktoré sú monozomické vo vloženom cudzorodom chromozóme EC-HR1, sú všetky heterozygotné v alele ms-BIMs-Bl a homozygotné v alele su-Bl a Ki-Bl;d) selekciu uvedených požadovaných rastlín podľa bodu (c) pomocou počítania chromozómov, použitia DNA markerov a potom ich samoopelenie,e) zber samoopelením vzniknutých semien podľa bodu (d) a pestovanie uvedených semien za vzniku BCiF2 rastlín, z ktorých je 20 % odolných proti chlórtolurónu, t.j. nesú vložený cudzorodý chromozóm, 25 % z týchto odolných rastlín sú rastliny požadovanej udržiavacej línie, ktoré sú homozygotné v alele ms-Bl,. ale sú pelovo fertilné, pretože nesú alelu Ms-Ssl z vloženého cudzorodého chromozómu ECHR1;f) selekciu rastlín požadovanej udržiavacej línie podľa bodu (e) na základe ich chlórtolurónovej rezistencie a použitia DNA markerov.
- 39. Spôsob prípravy pelovo fertilnej rekombinantnej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej s vloženým rekombinantným chromozómom typu REC-HR1, vyznačuj úc i sa t ý m, že zahŕňa:a) kríženie pelovo fertilnej samičej rodičovskej rastliny odvodenej od pelovo fertilnej rekombinantnej udržiavacej línie pšenice letnej kultivaru Chinese Spring, ktorá je monozomická v chromozómoch 6B a REC-H1, pričom uvedená130 samičia rodičovská línia je homozygotná v recesívnej alele ms-Bl pre peľovú sterilitu a hemizygotná v recesívnej alele su-Bl pre citlivosť na chlórtolurón a v dominantnej alele Ki-Bl nesúcej gén pre sterilitu peľu, a má monozomickú substitúciu tvorenú vloženým cudzorodým chromozómom REC-H1, ktorý nesie na svojom krátkom ramene dominantnú alelu pre peľovú fertilitu Ms-S‘l a semidominantnú alelu rht-S~l a na svojom dlhom ramene recesivnu alelu su-S‘l pre citlivosť na chlórtolurón a recesivnu alelu ki-S'l-a génu pre sterilitu peľu, s líniou diploidného speciesxxdruhu Aegilops searsii, ktorá má dominantnú alelu Su-S^l pre rezistenciu proti chlórtolurónu, ako aj alely Ms-S3l a rht-Ssl;b) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (a) a pestovanie uvedených semien za vzniku Fi rastlín, z ktorých 50 % obsahuje rekombinantný vložený chromozóm, ktorý sa páruje s chromozómom 4SsS a 6SsS, takže pri meióze dochádza k vzniku trivalentnej formy s genotypom ms-BlMs-SslMs-S;'lf ki-S1l-a su-S2l a Su-Ssl;c) selekciu uvedeného F: potomstva podľa bodu (b) a použitie jeho peľu na spätné kríženie s rastlinami cv. Chinese Spring;d) zber semien vzniknutých týmto spätným krížením a ich pestovanie za vzniku BCi rastlín, ktoré sú všetky heterozygotné v alele ms-BIMs-Bl a preto teda pelovo fertilné, niektoré z nich sú požadované rastliny, ktoré sú monozomické v alele 6B a preto teda hemizygotné v alelách su-Bl a Ki-Bl a majú ako monozomickú substitúciu vložený rekombinantný chromozóm REC-HR1, ktorý nesie alely Ms-Ssl a rht-S5! na krátkom ramene a alely Su-Ssl a ki-Ssl-a na dlhom ramene;131e) selekciu uvedených požadovaných rastlín podľa bodu (d) na základe ich rezistencie proti chlórtolurónu a analýzou párovania chromozómov v meióze a ich samoopelenie;f) zber samoopelením vzniknutých semien podľa bodu (e) a pestovanie uvedených semien za vzniku BCiF2 rastlín, z ktorých 50 % je monozomických v chromozóme 6B a monozomických v rekombinantnom chromozóme REC-HR1, ktorý sa skladá z krátkeho ramena 4Ss (nesie alely Ms-Ssl a rht-Ssl), proximálnej oblasti dlhého ramena chromozómu 6S1 (nesie alely Su-Ssl a kí-S2l-a) a z distálnej oblasti chromozómového ramena 6BL (bod rekombinácie je distálny vzhľadom na alelu ki-S^-a) , pričom 25 % týchto rastlín sú rastliny existencie požadovanej udržiavacej línie, ktoré sú homozygotné v alele ms-Bl a hemizygotné v alelách su-Bl a Ki-BI; ag) selekcie rastlín požadovanej udržiavacej línie z (f) na základe ich rezistencie proti chlórtolurónu a použitia DNA markerov.
- 40. Spôsob prípravy pelovo fertilnej vylepšenej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej nesúcej vylepšený vložený cudzorodý chromozóm IEC-HC1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) kríženie peľovo fertilnej samičej rodičovskej rastliny odvodenej od pšenice letnej kultivaru Chinese Spring, pričom uvedená samičia rodičovská rastlina je udržiavacou líniou, t.j., je homozygotná ako v recesívnej alele ms-Bl pre peľovú sterilitu na chromozómovom ramene 4BS, tak v dominantnej alele Ki-Bl pre peľovú sterilitu na chromozóme 6BL a nesie dodatočný yložený cudzorodý chromozóm typu ECHl, ktorý má na svojom krátkom ramene dominantné alely MsSsl a rht-Ssl a na svojom dlhom ramene recesívnu alelu ki132S11-a, so samčou rodičovskou rastlinou, ktorá je génovo zhodná so samičou rodičovskou rastlinou, ale je homozygotná v dominantnej alele peľovej fertility Ms-Bl a má dodatočný pár cudzích chromozómov 4E, ktoré nesú na svojom dlhom ramene dominantné alely Ba-El xx pre xx aleurónovú modrú farbu;b) zber semien vzniknutých podľa bodu (a), ktoré sú všetky modré, ich ožiarenie termálnymi neutrónmi a pestovanie týchto semien za vzniku peľovo fertilných F; rastlín, ktoré sú všetky heterozygotné v alele MsBlms-Bl a homozygotné v alele Ki-Bl, z ktorých je 20 % požadovaných rastlín s dvojíto monozomickým vloženým cudzorodým chromozómom EC-H1 a chromozómom 4E;c) selekciu uvedených požadovaných Fi rastlín podľa bodu (b) pomocou počítania chromozómov a použitím DNA markerov a ich samoopelenie;d) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (c), selekcia modrých semien a ich pestovanie za vzniku F2 rastlín, z ktorých niektoré majú 43 chromozómov a niektoré nich sú požadované rastliny, ktoré majú vylepšený vložený cudzorodý chromozóm IEC-HC1, obsahujúci 4SsS/4EL/6S1L a nesúci alely Ms-Ssl, rht-Ssl, Ba-El a ki-S1!, kým niektoré z ostatných rastlín obsahujú translokovaný chromozóm 4SsS/4EL;e) selekciu požadovaných rastlín podľa bodu (d) pomocou počítania chromozómov a použitia DNA markerov a ich samoopelenie;f) zber semien vzniknutých podľa bodu (e) a výber modrých semien, z ktorých sa vyvinú rastliny požadovanej vylepšenej udržiavacej línie, ktoré sú pelovo fertilné a nesú vylepšený vložený cudzorodý chromozóm IEC-HC1;133g) ak sa v kroku (d) nezískala žiadne požadovaná rastlina, potom sa pristúpi k selekcii podľa bodu (d), ktoré majú translokovaný chromozóm 4SsS/4EL (a ktoré pochádzajú z modrých semien a sú peľovo fertilné) pomocou počítania chromozómov a použitia DNA markerov a použitie ich peľu pre spätné kríženie s udržiavacou líniou s chromozómom EC-H1 za vzniku Fx semien;h) selekciu modrých semien z uvedených Fx semien podľa bodu (g), ich naklíčenie a ožiarenie pomocou selekciu sadeníc sadeníc, ktoré majú 4SsS/6S1L;i) opakovania krokov termálnych neutrónoví, ich44 chromozómami, t. j.chromozómy 4SsS/4EL a so dva cudzie (d) až (f), za vzniku požadovaných rastlín vylepšenej udržiavacej vložený chromozóm IEC-HC1, nesúci alely Ms-Ssl, rht-Ssl, línie, ktoré majú vylepšený obsahujúci 4SsS/4EL/6SxL a Ba-El a ki-S1!.
- 41. Spôsob prípravy pelovo fertilnej vylepšenej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej s vylepšeným vloženým cudzorodým chromozómom IEC-HC1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) kríženie peľovo fertilnej samičej rodičovskej rastliny odvodenej od pšenice letnej kultivaru Chinese Spring, pričom uvedená samičia rodičovská rastlina je homozygotná ako v dominantnej alele Ms-Bl pre peľovú fertilitu, tak aj v dominantnej alele Ki-Bl pre sterilitu peľu a má dodatočný pár cudzorodých chromozómov 4E, ktoré nesú na svojom dlhom ramene dominantnú alelu Ba-El pre aleurónovú modrú farbu, so samčou rodičovskou rastlinou, ktorá je génovo zhodná so samičou rodičovskou rastlinou, ale je homozygotná v recesívnej alele ms-Bl-c pre peľovú sterilitu a má1.34 dodatočný cudzorodý chromozóm 4Ss, ktorý nesie na svojom krátkom ramene dominantné alely Ms-Ssl a rht-Ssl;b) zber semien vzniknutých krížením podlá bodu (a) a pestovanie uvedených semien za vzniku F; rastlín, ktoré sú všetky heterozygotné v alele Ms-Blms-Bl a homozygotné v alele Ki-BlKi-Bl, z ktorých je 25 % požadovaných rastlín, ktoré sú dvojito monozomické v oridaných chromozómoch 4E a 4Ss;c) selekciu uvedenej požadovanej F; rastliny podľa bodu (b) pomocou počítania chromozómov a DNA markerov a ich samoopelenie;d) selekciu modrých semien zo semien vzniknutých samoopelením podľa bodu (c) a pestovanie uvedených semien za vzniku F2 rastlín, z ktorých niektoré sú požadované rastliny, ktoré majú translokovaný chromozóm 4SsS/4EL;e) selekciu uvedených požadovaných F2 rastlín (d) pomocou počítania chromozómov a DNA markerov a použitie ich peľu na kríženie s udržiavacou- líniou s chromozómom EC-H1 (4SsS/6S1L) a získanie Fi semien, z ktorých niektoré sú modré;f) selekciu modrých. semien podľa bodu (e), ich ožiarenie termálnymi neutrónmi a pestovanie do Fj rastlín, ktoré sú všetky homozygotné a to ako v alele ms-Bl-c, tak aj v alele Ki-Bl, a niektoré z nich majú dokonca dvojité monozomické pridanie 4SsS/4EL a EC-H1 (4SsS/6SlL), čo sú požadované rastliny;g) selekciu uvedených požadovaných rastlín podľa bodu (f) pomocou počítania chromozómov a DNA markerov a ich samoopelenie;h) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (g), selekciu modrých semien a ich vypestovanie do F2 rastlín, ktoré sú všetky homozygotné ako v alele ms-Bl-c, tak aj v135 alele Ki-Bl, z ktorých niektoré majú 43 chromozómov a z nich niektoré sú požadované rastliny, ktoré majú vylepšený vložený chromozóm IEC-HC1, obsahujúci 4SbS/4EL/6S1L, nesúci alely Ms-S^l, rht-Ssl, Ba-El a ki-S1!;i) selekciu požadovaných rastlín podlá bodu (h) pomocou počítania chromozómov, C-pásikovania a na základe peľovej fertility a ich samoopelenie;j) zber semien krížením podľa bodu (i) a selekciu modrých semien, z ktorých sa nechajú vypestovať peľovo fertilné rastliny, ktoré nesú IEC-HC1, pričom také rastliny sú rastliny požadovanej vylepšenej udržiavacej línie.
- 42. Spôsob prípravy peľovo fertilnej vylepšenej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej s vylepšeným vloženým cudzorodým chromozómom IEC-HC2, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) kríženie samčej rodičovskej línie pšenice letnej cv. Chinese Spring, v ktorej .chromozóm 4Am T. monococcum nahrádza chromozóm 4B pšenice letnej a preto teda uvedená samčia rodičovská rastlina nemá alelu peľovej fertility MsBlt je homozygotná v alele nesúcej gén pre sterilitu peľu Ki-Bl a Ms-A1! a rht-Am na chromozóme 4AmS a v alelách BaAml na ramene 4AmL, so samičou rodičovskou rastlinou, ktorá je génovo zhodná so samčou rodičovskou rastlinou, ale je homozygotná v recesívnej alele ms-Bl pre peľovú sterilitu a má dodatočný cudzorodý chromozóm 4Ss, na ktorého krátkom ramene sa nachádzajú dominantné alely Ms-Ssl a rht-Ssl;b) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (a), ktoré sú všetky modré a pestovanie týchto semien za vzniku Fx rastlín, ktoré sú všetky hemizygotné v alele ms-Bl-c a homozygotné v alele Ki-Bl a z ktorých niektoré sú136 požadované rastliny, ktoré sú trojito monozomické v chromozómoch 4B, 4Ss a 4Am;c) selekciu uvedených trojito monozomických rastlín podlá bodu (b) pomocou počítania chromozómov, a samoopelenie týchto pelovo fertilných Fi rastlín;d) zber F2 semien podlá bodu (c) , selekciu modrých semiena a pestovania uvedených vybraných semien za vzniku F; rastlín, a ďalší výber tých F2 rastlín, ktoré majú 44 chromozómov (s usporiadaním 21+2'v meióze) , čo sú požadované rastliny s dvojitým monozomickým pridaním 4Ss a 4Am;e) samoopelenie uvedených požadovaných rastlín podlá bodu (d) za vzniku F3 semien a selekciu modrých;f) pestovanie modrých semien podlá bodu (e) a selekciu rastlín so 43 chromozómami (21 + 1); tieto rastliny sú požadované pelovo fertilné rastliny, tvoria modré semená a majú translokovaný chromozóm 4SsS/6AmL;g) použitie peľu požadovaných rastlín podľa bodu (f) ako pre kríženie s udržiavacou líniou, ktorú tvoria rastliny homozygotné v alelách ms-BlmsBlKi-BlKiBl a majúce chromozóm EC-H1 (4SsS/6SxL), nesúci Ms-Ssl rht-SslKi-Ssl-a a získavanie Fi semien;h) selekciu modrých semien zo semien Fi vzniknutých krížením podľa bodu (f), ich ožiarenia termálnymi neutrónmi a ich pestovanie, a ďalšiu selekciu rastlín so 44 chromozómami (2ľ'+l), t.j. tých, ktoré sú dizomické v krátkom ramene a dvojíto monozomické v dlhom ramene cudzorodého pridaného chromozómu, a ich samoopelenie;i) pestovanie modrých semien podlá bodu (h) a selekciu požadovaných, pelovo fertilných rastlín so 43 chromozómami, vytvárajúcich modré a červeno-biele semená a ktoré majú chromozóm IEC-HC2;137j) samoopelenie požadovaných rastlín podľa bodu (i), zber vzniknutých semien a výber modrých semien, z ktorých možno vypestovať požadované vylepšené udržiavacie línie, ktoré sú peľovo fertilné rastliny a majú chromozóm IEC-HC2.
- 43. Spôsob prípravy peľovo fertilných rastlín vylepšenej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej s vloženým vylepšeným chromozómom IEC-HC3, vyznačuj úci sa t ý m, že zahŕňa:a) kríženie samčej rodičovskej rastliny z línie pšenice letnej cv. Chinese Spring s dizomickou substitúciou, v ktorej je chromozóm 4B pšenice letnej nahradený chromozómom 4Am T. monococcum a preto uvedená samčia rodičovská rastlina neobsahuje alelu pre peľovú fertilitu Ms-Bl, je homozygotnýá v alele pre sterilitu peľu Ki-Bl a v alelách Ms-Aml a rht-Aml na chromozómoch 4AmS a v alele Ba-Aml na 4AmL, so samičou rodičovskou rastlinou, ktorá je so samčou rodičovskou rastlinou génovo zhodná, ale je homozygotná v recesívnej alele ms-Bl pre peľovú sterilitu a má dodatočný cudzí chromozóm 4Ss, ktorý nesie na svojom krátkom ramene dominantné alely Ms-Ssl a rht-Ssl;b) zber Fi semien vzniknutých krížením podľa bodu (a), ktoré sú všetky modré a pestovanie uvedených semien, ktoré sú všetky hemizygotné v alelách ms-Bl-c a homozygotné v alelách Ki-Bl, a z ktorých je 75 % monozomických v chromozóme 4B a majú monozomickú substitúciu 4Am, na ktorom sa nachádza alela Ms-Aml a sú preto pelovo fertilné, a použitie uvedeného peľu s monozomicko-monozomickou substitúciou pre opelenie samičej rodičovskej rastliny, heterozygotnej v alelách Ms-Blms-Bl a homozygotnej v alele Ki-Bl a nesúcej chromozóm 6S1 ako monozomické pridanie, pričom uvedená samičia rodičovská rastlina je získaná138 krížením peľu rastliny cv. Chinese Spring s monozomickým pridaním 4Ss ms-Bl-c ms-Bl-c so samičou rodičovskou rastlinou, homozygotnou v alelách Ms-Bl a Ki-Bl a nesúcou chromozóm 6Sl ako monozomické pridanie, pričom sa získa 20 % požadovaného potomstva;c) zber modrých Fi semien vzniknutých krížením podľa bodu (b), ich ožiarenie termálnymi neutrónmi, ich pestovanie a selekcia takých Fi rastlín, ktoré majú 43 (21''+1') a 42 (20''+2'') chromozómov a samoopelenie týchto rastlín;d) selekciu modrých semien vzniknutých samoopelením podľa bodu (c), ich pestovanie a selekciu peľovo fertilných rastlín, ktoré majú asi 20 % neživotaschopného peľu a tvoria modré a červeno-biele semená; ae) pestovanie semien podľa bodu (d) a oddelenie modrých semien, z ktorých možno vypestovať požadované rastliny vylepšenej udržiavacej línie, ktoré sú pelovo fertilné a majú chromozóm IEC-HC3 (majú 43 chromozómov).
- 44. Spôsob prípravy pelovo fertilnej vylepšenej udržiavacej línie pšenice letnej alebo tvrdej s vylepšeným vloženým rekombinantným chromozómom IREC-HC, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) kríženie pelovo fertilnej samičej rodičovskej rastliny odvodenej od pšenice letnej kultivaru Chinese Spring, pričom uvedená samičia rodičovská rastlina je homozygotná v dominantnej alele Ms-Bl pre peľovú fertilitu na chromo zómovom ramene 4BS a v dominantnej alele Phl suprimujúcej homológne párovanie na chromozómovom ramene5BL, nulizomická pre chromozóm 6B a teda nemá alelu Ki-Bl pre sterilitu peľu a má pár 6S1 chromozómov, ktoré nesú recesívnu alelu ki-S^-a pre sterilitu peľu, so samčou rodičovskou rastlinou, ktorá je génovo zhodná so samičou139 rodičovskou rastlinou, ale je dizomická v chromozóme 6B a teda homozygotná v alele Ki-Bl, nemá chromozóm 6S1 a je aj homozygotná v mutantnej alele phlb pre homologické párovanie;b) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (a), pestovanie uvedeného semena za vzniku peľovo fertilných (Ms-Bl Ms-Bl) Fx rastlín, heterozygotných v alele Phlphlb pre homológne párovanie, ktoré sú všetky monozomické ako v chromozóme 6B, tak aj v 6S1;c) spätné kríženie uvedených Fx rastlín (b) so samčou rodičovskou rastlinou;d) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (c) a pestovanie uvedených semien za vzniku BCi rastlín, ktoré sú všetky peľovo fertilné (Ms-BIMs-Bl), a polovica z nich je homozygotná v alele phlb, z ktorých je ďalej približne polovica (pretože 6B sa páruje s 6S1) požadovaných BC1 rastlín, ktoré sú dvojito monozomické ako v chromozóme 6B, tak v chromozóme 6S1;e) selekciu požadovaných BCx rastlín podľa bodu (d) pomocou párovania chromozómov v meióze a pomocou DNA markerov, ich opelenie ditelozomickou 6BS líniou (t.j. líniou bez 6BL ramien), ktorá je génovo zhodná s BCx rastlinami, ale je homozygotná v alele PhlPhl; af) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (e) a pestovanie uvedeného semena za vzniku rastlín, ktoré sú monotelozomické v 6BS, z ktorých niektoré sú požadované rastliny, ktoré sú tiež monozomické v rekombinantnom chromozóme skladajúcom sa z krátkeho ramena a proximálnej oblasti dlhého ramena 6S1 (nesie alelu ki-S^-a) a z distálnej oblasti chromozómového ramena 6BL (bod translokácie je distálny k alele ki-S^-a);140g) selekciu uvedených požadovaných rastlín podľa bodu (f) pomocou C-pásikovania, pomocou analýzy párovania chromozómov a DNA markerov a použitie ich peľu na kríženie so samičou líniou, ktorá je vylepšenou udržiavacou líniou, t.j., že je homozygotná ako v ľubovoľnej z recesivnych alel pre peľovú sterilitu ms-Bl, tak aj v dominantnej alele KiB1 pre peľovú sterilitu a má jeden z vylepšených vložených chromozómov typu IEC-HC1 (4SsS/4EL/6S1L) , typu IEC-HC2 (4SsS/4AmL/6SlL) alebo IEC-HC3 (4AmS-4AmL/6S1L) ;h) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (g) a pestovanie uvedených semien za vzniku Fi rastlín, z ktorých niektoré sú požadované rastliny, ktoré sú trojito monozomické v chromozóme 6B, v jednom z vylepšených vložených cudzorodých chromozómov typu IEC-HC1, IEC-HC2 alebo IEC-HC3 a v rekombinantnom chromozóme ôsVeBL a sú heterozygotné v alele ms-BIMs-Bl a hemizygotné v alele KiBl; ai) selekciu uvedených požadovaných rastlín podľa bodu (h) pomocou počítania chromozómov, C-pásikovania a DNA markerov a ich samoopelenie, zber semien vzniknutých týmto samoopelením a pestovanie uvedených semien, z ktorých niektoré sú dvojíto monozomické v chromozóme 6B a vo vylepšenom vloženom rekombinantnom chromozóme typu IREC-HC t.j. majú buď IREC-HC1 (4SsS/4EL/6S1L/6BL) , IREC-HC2 (4SsS/4AmL/6S1L/6BL) alebo IREC-HC3 (4AmS-4AmL/6S1L/6BL) , čo sú rastliny požadovanej udržiavacej línie s chromozómom IREC-HC.
- 45. Spôsob konverzie požadovaného kultivaru pšenice letnej alebo tvrdej na peľovo sterilnú ženskú rodičovskú líniu a pelovo fertilnú udržiavaciu líniu pre uvedenú ženskú líniu141 podlá nároku 21, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) kríženie udržiavacej línie horaozygotnej v alelách msBlms-BlKi-BlKi-Bl, ktorá má cudzorodý chromozóm EC-H1, ktorý nesie alely Ms-Ssl a ki-S^-a ako samičie rastliny s peľom požadovaného kultivaru, homozygotného v alelách MsBlMs-Blki-Blki-BI;b) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (a) a pestovanie uvedených semien za vzniku peľovo fertilných Fi rastlín, ktoré sú všetky heterozygotné v alelách ms-BlMsBlKi-Blki-Bl-a a z ktorých 20 % tvorí požadované rastliny, ktoré takisto nesú vložený cudzorodý chromozóm typu EC-H1 ac) selekciu uvedených požadovaných Fi rastlín podľa bodu (b) pomocou počítania chromozómov a DNA markerov a ich opelenie požadovaným kultivarom za vzniku potomstva BCi, z ktorého je 1/16 rastlín požadovaného genotypu, t. j. sú heterozygotné v alelách MS-Blms-BlKi-Blki-Bl-a a nesú vložený cudzorodý chromozóm EC-H1;d) pestovanie BCi rastlín podľa bodu (c) a selekciu rastlín s požadovaným genotypom pomocou počítania chromozómov a použitím DNA markerov a ich ďalšie spätné kríženie ako samičích rastlín s požadovaným kultivarom po štyri nasledujúce generácie za vzniku potomstva piatej generácie BC5, pričom v každej generácii boli pomocou počítania chromozómov a použitím DNA markerov vyberané rastliny heterozygotné v alelách Ms-Blms-BlKi-Blki-Bl-a a s vloženým cudzorodým chromozóm EC-H1; ae) samoopelenie požadovaných BC5 rastlín podľa bodu (d), zber ich semien a pestovanie uvedených semien za vzniku BC5F2 rastlín, z ktorých 1/20 tvoria pelovo sterilné rastliny homozygotné ako v alele ms-Bl pre peľovú sterilitu142 a v alele Ki-Bl nesúcej gén pre sterilitu peľu, čo sú rastliny požadovanej peľovo sterilnej samičej línie, a ďalšie sú rastliny požadovanej peľovo fertilnej udržiavacej línie BC5F2 s podobným genotypom, ale majú takisto vložený chromozóm EC-H1; to je požadovaná, peľovo fertilná udržiavacia línia.
- 46. Spôsob podľa nároku 45, vyznačujúci sa tým, že rastliny udržiavacej línie sú rastliny vylepšenej udržiavacej línie s chromozómom IEC-HC, uvedená samičia línia odpovedá nároku 21 a selekcia podľa bodu (d) na prítomnosť IEC-HC v jednotlivých generáciách (Fx, BC1-BC5, BC5F5) sa uskutočňuje pomocou modrej farby semena.
- 47. Spôsob konverzie požadovaného kultivaru pšenice letnej alebo tvrdej na peľovo sterilnú samičiu rodičovskú líniu a na peľovo fertilnú rekombinantnú udržiavaciu líniu pre uvedenú samičiu líniu podľa nároku 22, vyznačujúci sa t ý m, že zahŕňa:a) kríženia vajíčok rastlín udržiavacej línie s cudzorodým vloženým rekombinantným chromozómom REC-H1, pričom sú rastliny tejto línie homozygotné v alele ms-BliasB1 a monozomické ako v chromozóme 6B, tak aj vo vloženom rekombľnantnom chromozóme REC-H1 (4SsS/6S1L/6BL) , nesúcom alely Ms-Ssl a ki-S1l-a s požadovaným kultivarom, ktorý je homozygotný v alelách Ms-BIMs-Blki-Blki-Bl;b) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (a) a pestovanie uvedených semien za vzniku pelovo fertilnéých Fi rastlín, ktoré sú všetky heterozygotné v alelách ms-BlMsBl, jedna polovica z nich je dizomická v chromozóme 6B a je teda heterozygotná v alelách Ki-Blki-Bl-a a z nich je polovica dvojito monozomická v chromozóme 6B a vo vloženom143 rekombinantnom chromozóme REC-H1 a hemizygotná v alele kiBl-a, ale takisto nesie alely Ms-Ssl a ki-S^l-a na vloženom rekombinantnom chromozóme;c) selekciu uvedených dvoch druhov potomstva Fi podlá bodu (b) pomocou analýzy párovania chromozómov a použitím DNA markerov, ich opelenie rastlinami požadovaného kultivaru za vzniku dvoch druhov BCi rastlín, z ktorých jedny sú odvodené od dizomických Fi rastlín a 1/4 z nich je heterozygotná v alelách ms-BIMs-BlKi-Blki-Bl-a a druhé sú odvodene od dvojito monozomických Fi rastlín a 1/4 z nich sú dvojito monozomické, heterozygotné v alele ms-BIMs-Bl a hemizygotné v alele ki-Bl-a a takisto nesú alely Ms-Ssl a ki-S11-a na vloženom rekombinantnom chromozóme REC-H1;d) selekciu uvedených požadovaných rastlín oboch skupín podlá bodu (c) pomocou analýzy párovania chromozómov a použitím DNA markerov a ich ďalšie spätné kríženie ako samičích rastlín s pelom požadovaného kultivaru po štyri nasledujúce generácie z_a vzniku dvovh druhov piatej generácie potomstva BC5, pričom sa uskutočňuje selekcia v jednotlivých generáciách na heterozygotnosť v alelách msBlMs-BlKi-BlKi-Bl-a u dizomického typu a v alelách ms-BlMsB1 v dvojito monozomickom type s vloženým rekombinantný chromozóm REC-HR1 a to pomocou párovania chromozómov a použitím DNA markerov;e) opelenie požadovaných, dvojito monozomických BC5 rastlín podlá bodu (d) požadovanými dizomickými BC5 rastlinami podlá bodu (d) za vzniku dvoch skupín BC5F2 dizomických rastlín, z ktorých 1/8 je homozygotná v alele ms-Blms-Bl a heterozygotná v alele Ki-Blki-Bl-a, čo sú požadované dizomické rastliny a ďalšia skupina je dvojito monozomická, z ktorej 1/8 tvoria rastliny požadovanej udržiavacej línie, ktoré sú homozygotné v alele ms-Blms-Bl144 a hemizygotné v alele Ki-Bl a nesú aj alely Ms-Ssl a kiS'l-a z vloženého rekombinantného chromozómu REC-HR1 a sú teda pelovo fertilné; af) pestovanie uvedených, dvojito monozomických BCôF2 semien podlá bodu (e) a dizomických BC5F2 semien podlá bodu (e) a selekciu požadovanej, peľovo fertilnej udržiavacej línie resp. pelovo sterilnej samičej línie pomocou párovania chromozómov a použitím DNA markerov.
- 48. Spôsob podľa nároku 47, vyznačujúci sa tým, že rastliny udržiavacej línie sú rastliny rekombinantnej udržiavacej línie s vylepšeným vloženým rekombinantným chromozómom IREC-HC, uvedená samičia línia odpovedá nároku 24 a selekcia podľa bodu (d) na prítomnosť IREC-HC v jednotlivých generáciách (Fx, BCX-BC5, BC5F5) sa uskutočňuje pomocou modrej farby semena.
- 49. Spôsob konverzie požadovaného kultivaru pšenice letnej alebo tvrdej na pelovo sterilnú samičiu rodičovskú líniu a peľovo fertilnú rekombinantnú udržiavaciu líniu pre uvedenú samičiu líniu podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) kríženie rastlín udržiavacej línie homozygotnej v alelách ms-Blms-Blsu-Blsu-BlKi-BlKi-Bl s vloženým cudzorodým chromozóm EC-HR1, ktorý nesie alely Ms-Ssl, rht-Ssl, Su-Ssl a ki-S11-a s požadovaným kultivarom, ktorý je homozygotný v alelách Ms-BIMs-BISu-BISu-Blki-Blki-Bl;b) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (a) a pestovanie uvedených semien za vzniku pelovo fertilných Fx rastlín, ktoré sú všetky heterozygotné v alelách ms-Bl MsBlSu-BlSu-BlKi-Blki-Bl, 20 % z nich sú požadované rastliny, ktoré takisto nesú vložený cudzorodý chromozóm; a145c) selekciu uvedených požadovaných Fi rastlín podľa bodu (b) počítaním chromozómov a použitím DNA markerov a ich opelenie požadovaným kultivarom za vzniku potomstva BCi, z ktorého 1/32 tvoria rastliny požadovaného genotypu, ktoré sú heterozygotné v alelách ms-BIMs-BISu-BIsu-BlKi-Blki-Bl a nesú vložený cudzorodý chromozóm EC-HR1;d) pestovanie uvedených BCj rastlín podľa bodu (c) a selekciu rastlín s uvedeným požadovaným genotypom pomocou počítania chromozómov a použitím DNA markerov a ich ďalšie spätné kríženie ako samičích rastlín s požadovaným kultivarom po štyri nasledujúce generácie za vzniku piatej generácie potomstva spätného kríženia BCs, pričom sa uskutočňuje v jednotlivých generáciách selekcia potomstva heterozygotného v alelách ms-BIMs-BISu-BIsu-Ki-BlKi-Bl s vloženým chromozómom EC-HR1 a to počítaním chromozómov a použitím DNA markerov;e) samoopelenie požadovaných BC5 rastlín podľa bodu (d), zber semien vyniknutých týmto samoopelením a pestovanie uvedených semien za vzniku BC5F2 rastlín, z ktorých 1/64 tvoria rastliny požadovanej peľovo sterilnej samičej línie, ktoré sú homozygotné ako v alele pre peľovú sterilitu msBl, tak aj v alele pre citlivosť na chlórtolurón su-Bl a v alele nesúcej gén pre sterilitu peľu Ki-Bl, a ďalšie sú BC5F2 rastliny požadovanej peľovo fertilnej udržiavacej línie s podobným genotypom, ale majúce aj vložený chromozóm EC-HR1 nesúci alely Ms-Ssl, rht-Ssl, Su-Ssl a ki-S'l-a.
- 50. Spôsob konverzie požadovaného kultivaru pšenice letnej alebo tvrdej na peľovo sterilnú samičiu rodičovskú líniu a peľovo fertilnú rekombinantnú udržiavaciu líniu s vloženým rekombinantným chromozómom REC-HR pre uvedenú samičiu líniu146 podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) kríženie samičích rastlín udržiavacej línie s chromozómom REC-HR1, ktoré sú homozygotné v alele ms-BlMsB1 a monozomické ako v chromozóme 6B (hernizygotné v alelách su-Bl a Ki-Bl), tak aj vo vloženom rekombinantnom chromozóme REC-HR1, ktorý nesie alely Ms-Ssl, rht-Ssl, SuSsl a ki-S1l-a, s požadovaným kultivarom, ktorý je homozygotný v alelách Ms-BIMs-Bl Su-BISu-Bl ki-Blki-Bl;b) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (a) a pestovanie uvedených semien za vzniku pelovo fertilných Fx rastlín, ktoré sú všetky heterozygotné v alelách ms-BIMs-Bl a polovica z nich je dizomická v chromozóme 6B a sú teda heterozygotné v alelách Su-Blsu-BlKi-Blki-Bl a polovica z nich je dvoj ito monozomická v chromozóme 6B a vo vloženom rekombinantnom chromozóme REC-HR1 a sú hernizygotné v alelách Su-Bl a ki-Bl-a, ale takisto nesú alely Ms-Ssl, rht-Ssl, _ Su-Ssl a ki-S11-a z vloženého rekombinantného chromozómu REC-HR1;c) selekciu uvedených dvoch typov Fx potomstva podľa bodu (b) pomocou analýzy párovania chromozómov a použitím DNA markerov, jeho opelenie požadovaným kultivarom za vzniku dvoch typov BCX potomstva, pričom jeden je odvodený od dizomických Fx rastlín, 1/4 rastlín tohto typu je heterozygotné v alele ms-BIMs-Bl a druhý typ je odvodený od dvojito monozomických rastlín Fx, 1/4 rastlín tohto typu je dvoj ito monozomická, heterozygotná v alele ms-BIMs-Bl a hemizygotná v alelách Su-Bl a ki-Bl a nesie takisto alely Ms-Ssl, rht-Ssl, Su-Ssl a ki-S11-a z vloženého rekombinantného chromozómu REC-HR1;d) pestovanie uvedených BCX rastlín podľa bodu (c) a selekciu uvedených požadovaných rastlín podľa bodu (c)147 pomocou analýzy párovania chromozómov a pomocou DNA markerov, a ich ďalšie spätné kríženie ako samičích rastlín s uvažovaným kultivarom po štyri nasledujúce generácie za vzniku dvoch druhov potomstva piatej generácie spätného kríženia (BC5) , pričom sa v jednotlivých generáciách uskutočňuje pomocou analýzy párovania chromozómov a použitím DNA markerov selekcia rastlín heterozygotných v alelách ms-BIMs-BIsu-BISu-BlKi-Blki-Bl u dizomického typu a v alelách ms-BlMs-Bl u dvojitého monozomického typu, ktorý má vložený rekombinantný chromozóm REC-HR1;e) opelenie požadovaných, dvojito monozomických BC5 rastlín podľa bodu (d) požadovanými dizomickými BC5 rastlinami podľa bodu (d) za vzniku dvoch skupín BC5F2 rastlín, pričom v prvej skupine sú dizomické rastliny, z ktorých 1/16 je homozygotná v alele ms-Blms-Bl a heterozygotné v alelách su-BISu-BlKi-Blki-Bl, čo sú požadované dizomické rastliny a v druhej skupine sú dvojito monozomické rastliny, z ktorých 1/16 tvoria rastliny požadovanej rekombinantnej udržiavacej línie, ktoré sú homozygotné v alele ms-Bl ms-Bl a hemizygotné v alelách suB1 a Ki-Bl a tiež nesú alely Ms-Ssl, rht-Ssl, Su-Ssl a kiSll-a na vloženom rekombinantnom chromozóme REC-HR1 a preto sú teda pelovo fertilné;f) pestovanie semien uvedenej, dvojito monozomickéj BC5F2 línie podľa bodu (e) a dizomických BC5F2 semien podľa bodu (e) a selekciu požadovanej, peľovo fertilnej rekombinantnej udržiavacej línie a peľovo sterilnej samičej línie pomocou analýzy párovania chromozómov a odpovedí na pôsobenie chlórtolurónom;g) pestovania potomstva dizomických rastlín, ktoré sú všetky homozygotné v alele ms-B lms-Bl a teda pelovo sterilné, 1/4 z nich je homozygotná v alelách su-Blsu-Bl a148Ki-BlKi-Bl, čo sú rastliny požadovanej pelovo sterilnej samičej línie;h) pestovanie uvedených dizomických BC5F3 rastlín podľa bodu (g) a selekciu požadovanej, pelovo sterilnej samičej línie pomocou DNA markerov.
- 51. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20 a 30 až 50, vyznačujúci sa tým, že alela pre peľovú sterilitu ms-Bl je vybraná zo skupiny tvorenej alelami msBl-a, ms-Bl-b a ms-Bl-c alebo ľubovoľnými ďalšími alelami MS-BI.
- 52. Udržiavacia línia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 29, v ktorej je alela pre peľovú sterilitu ms-Bl vybraná zo skupiny tvorenej alelami ms-Bl-a, ms-Bl-b a ms-Bl-c alebo ľubovoľnými ďalšími alelami MS-B1.
- 53. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z-nárokov 1 až 20 a 30 až 50, vyznačujúci sa tým, že alela ki, citlivá na aktivitu Ki-Bl alebo ľubovoľného iného génu spôsobujúceho sterilitu peľu, je vybraná z alel ľubovoľného druhu Gramineae.
- 54. Udržiavacia línia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 29 a 52, v ktorej je alela ki, citlivá na aktivitu Ki-Bl alebo ľubovoľného iného génu spôsobujúceho sterilitu peľu, vybraná z alel ľubovoľného druhu Gramineae.
- 55. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20 a 30 až 51 a 53, vyznačujúci sa tým, že alela rht alebo ľubovoľná iná alela génu podporujúceho vzrast, je149 vybraná zo skupiny tvorenej alelami ľubovoľného druhu Gramineae.
- 56. Udržiavacia línia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 29, 52 a 54, v ktorej je alela rht alebo ľubovoľná iná alela génu podporujúceho vzrast, vybraná zo skupiny tvorenej alelami ľubovoľného druhu Gramineae.
- 57. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20 a 30 až51 a 53, vyznačujúci sa t ý m, že alela Su je vybraná z alel ľubovoľného druhu Gramineae.
- 58. Udržiavacia línia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až29, 52 a 54, v ktorej je alela Su alebo ľubovoľná iná alela pre rezistenciu proti herbicídom, vybraná zo skupiny tvorenej alelami ľubovoľného druhu Gramineae.
- 59. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20 a 30 až 51 a 53, vyznačujúci sa tým, že alela Ba je vybraná z alel ľubovoľného druhu Gramineae.
- 60. Udržiavacia línia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 29, 52 a 54, v ktorej je alela Ba vybraná z alel ľubovoľného druhu Gramineae.
- 61. Spôsob prípravy hybridnej línie pšenice letnej alebo tvrdej, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:a) kríženie samčej rodičovskej rastliny s peľovo sterilnou samičou rodičovskou rastlinou rovnakých druhov, pričom uvedená samčia rodičovská rastlina je vyberaná zo skupiny tvorenej ľubovoľným požadovaným kultivarom pšenice letnej alebo tvrdej, ktorý je prirodzene homozygotný v150 dominantnej alele pre prirodzene sa vyskytujúcu peľovú fertilitu (Ms-Bl) a uvedená peľovo sterilná samičia rodičovská rastlina je línia uvedenej pšenice, ktorá je homozygotná v alelách ako pre ľubovoľnú z recesívnych mutantných alel pre peľovú sterilitu (ms-Bl), tak pre dominantnú alelu génu spôsobujúceho sterilitu peľu (Ki-Bl), pričom uvedená peľovo sterilná samičia rodičovská rastlina sa udržuje pomocou udržiavacej línie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 29 až 29; ab) zber semien vzniknutých krížením podľa bodu (a) , z ktorých možno vypestovať hybridné potomstvo, ktoré je celé peľovo fertilné a je heterozygotné v alele ms-BIMs-Bl.
- 62. Hybridné línie pšenice letnej alebo tvrdej, ktoré sa získali spôsobom podľa nároku 61.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL12083597A IL120835A0 (en) | 1997-05-15 | 1997-05-15 | Method for production of hybrid wheat |
| PCT/IL1998/000220 WO1998051142A1 (en) | 1997-05-15 | 1998-05-14 | Methods for production of hybrid wheat |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK2099A3 true SK2099A3 (en) | 2000-03-13 |
Family
ID=11070131
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK20-99A SK2099A3 (en) | 1997-05-15 | 1998-05-14 | Pollen-sterile hybrid wheat, process for its preparation based on ability of genic maintaining of pollen-sterile parental line which is readily and steady propagated |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6407311B1 (sk) |
| EP (1) | EP0923283B1 (sk) |
| JP (1) | JP2000514664A (sk) |
| CN (1) | CN1234722A (sk) |
| AT (1) | ATE221308T1 (sk) |
| AU (1) | AU743525B2 (sk) |
| BG (1) | BG103090A (sk) |
| BR (1) | BR9804915A (sk) |
| CA (1) | CA2259949A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ1599A3 (sk) |
| DE (1) | DE69806890T2 (sk) |
| EA (1) | EA199900103A1 (sk) |
| ES (1) | ES2182302T3 (sk) |
| HU (1) | HUP0001941A3 (sk) |
| IL (1) | IL120835A0 (sk) |
| NZ (1) | NZ333633A (sk) |
| PL (1) | PL331258A1 (sk) |
| SK (1) | SK2099A3 (sk) |
| TR (1) | TR199900125T1 (sk) |
| WO (1) | WO1998051142A1 (sk) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1347678A4 (en) * | 2001-01-04 | 2004-08-18 | Yeda Res & Dev | PROCESS FOR MAINTAINING A STERILE MALE-FEMALE GENE PARENTAL LINE FOR THE PRODUCTION OF HYBRID WHEAT |
| AU2002246937A1 (en) * | 2001-01-04 | 2002-08-06 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Maintenance of genic male-sterile female parental lines using a maintainer line with a stable engineered chromosome |
| WO2003057848A2 (en) * | 2001-12-31 | 2003-07-17 | Yeda Research And Development Co., Ltd | A method to maintain a genic male-sterile female parental line of wheat through selfing of the maintainer line |
| CN102883595A (zh) * | 2010-01-06 | 2013-01-16 | Sg生物燃料有限公司 | 通过仅有雌性特征产生麻风树杂种 |
| CN102334415A (zh) * | 2010-07-23 | 2012-02-01 | 沈天民 | 一种高产小麦品种的设计方法 |
| CA2867139A1 (en) | 2011-04-11 | 2012-10-18 | Targeted Growth, Inc. | Identification and the use of krp mutants in plants |
| US9516824B2 (en) * | 2012-02-14 | 2016-12-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method for modulating the number of archesporial cells in a developing anther |
| BR112015009001A2 (pt) | 2012-10-23 | 2017-12-05 | Univ Montana State | processos de produção de plantas de trigo duro |
| EP3197270A1 (en) | 2014-09-26 | 2017-08-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Wheat ms1 polynucleotides, polypeptides, and methods of use |
| CN107267527B (zh) * | 2016-07-25 | 2021-03-19 | 未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司 | 雄性育性的保持方法及其应用 |
| GB2552657A (en) * | 2016-07-29 | 2018-02-07 | Elsoms Dev Ltd | Wheat |
| WO2018067977A1 (en) | 2016-10-07 | 2018-04-12 | Kansas State University Research Foundation | Genetic system for promoting recombination and gene transfer in wheat |
| WO2019043082A1 (en) * | 2017-08-29 | 2019-03-07 | Kws Saat Se | BLUE ALEURONE ENHANCED AND OTHER SEGREGATION SYSTEMS |
| CN108342502A (zh) * | 2018-02-05 | 2018-07-31 | 西南大学 | 鉴定小麦ms1b隐性不育基因的PCR引物对和引物对组合及其检测方法 |
| US20210105962A1 (en) * | 2018-02-22 | 2021-04-15 | Elsoms Developments Ltd | Methods and compositions relating to maintainer lines |
| BR112021004851A2 (pt) * | 2018-09-14 | 2021-06-08 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | restauração da fertilidade em plantas |
| CN111557237A (zh) * | 2020-06-02 | 2020-08-21 | 西藏自治区农牧科学院农业研究所 | 一种小麦育种的亲本选配方法 |
| CA3226793A1 (en) * | 2021-07-26 | 2023-02-02 | Matthew John MILNER | Methods and compositions relating to maintainer lines for male-sterility |
| CN113557957B (zh) | 2021-07-28 | 2023-03-14 | 西南大学 | 一种蓝标型两系法杂交小麦系统的选育方法及应用 |
| CN114369679B (zh) * | 2022-01-19 | 2024-04-02 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 十倍体长穗偃麦草分子标记及其串联重复探针的开发与应用 |
| EP4311430A1 (en) | 2022-07-28 | 2024-01-31 | Limagrain Europe | Chlorotoluron tolerance gene and methods of use thereof |
| CN117044616A (zh) * | 2023-05-23 | 2023-11-14 | 贵州师范大学 | 一种用尾状山羊草高分子谷蛋白提高小麦品质的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4143486A (en) * | 1977-09-15 | 1979-03-13 | Research Corporation | Hybrid wheat |
| JPS6174526A (ja) * | 1984-09-18 | 1986-04-16 | 住友化学工業株式会社 | 条件的細胞質雄性不稔による一代雑種小麦品種の育種法 |
| GB9015671D0 (en) | 1990-07-17 | 1990-09-05 | Pacific Seeds Pty Limited | Production of hybrid cereal crops |
| CA2108666A1 (en) | 1992-01-16 | 1993-07-17 | Geoffrey Frank Smart | Genetically modified wheat plants and progeny and method for production of hybrid wheat |
-
1997
- 1997-05-15 IL IL12083597A patent/IL120835A0/xx unknown
-
1998
- 1998-05-14 US US09/214,914 patent/US6407311B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-14 HU HU0001941A patent/HUP0001941A3/hu unknown
- 1998-05-14 CZ CZ9915A patent/CZ1599A3/cs unknown
- 1998-05-14 BR BR9804915-1A patent/BR9804915A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-05-14 AT AT98920720T patent/ATE221308T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-05-14 AU AU73495/98A patent/AU743525B2/en not_active Ceased
- 1998-05-14 EP EP98920720A patent/EP0923283B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-14 TR TR1999/00125T patent/TR199900125T1/xx unknown
- 1998-05-14 SK SK20-99A patent/SK2099A3/sk unknown
- 1998-05-14 WO PCT/IL1998/000220 patent/WO1998051142A1/en not_active Application Discontinuation
- 1998-05-14 DE DE69806890T patent/DE69806890T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-14 CA CA002259949A patent/CA2259949A1/en not_active Abandoned
- 1998-05-14 JP JP10548999A patent/JP2000514664A/ja active Pending
- 1998-05-14 EA EA199900103A patent/EA199900103A1/ru unknown
- 1998-05-14 ES ES98920720T patent/ES2182302T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-14 NZ NZ333633A patent/NZ333633A/xx unknown
- 1998-05-14 PL PL98331258A patent/PL331258A1/xx unknown
- 1998-05-14 CN CN98800970A patent/CN1234722A/zh active Pending
-
1999
- 1999-01-15 BG BG103090A patent/BG103090A/bg unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6407311B1 (en) | 2002-06-18 |
| IL120835A0 (en) | 1997-09-30 |
| PL331258A1 (en) | 1999-07-05 |
| AU743525B2 (en) | 2002-01-31 |
| CN1234722A (zh) | 1999-11-10 |
| ATE221308T1 (de) | 2002-08-15 |
| EP0923283A1 (en) | 1999-06-23 |
| NZ333633A (en) | 2000-09-29 |
| CA2259949A1 (en) | 1998-11-19 |
| BR9804915A (pt) | 1999-09-14 |
| TR199900125T1 (xx) | 1999-10-21 |
| EP0923283B1 (en) | 2002-07-31 |
| CZ1599A3 (cs) | 1999-07-14 |
| BG103090A (bg) | 2000-06-30 |
| DE69806890T2 (de) | 2003-03-27 |
| HUP0001941A3 (en) | 2002-04-29 |
| HUP0001941A2 (hu) | 2000-09-28 |
| DE69806890D1 (de) | 2002-09-05 |
| JP2000514664A (ja) | 2000-11-07 |
| AU7349598A (en) | 1998-12-08 |
| ES2182302T3 (es) | 2003-03-01 |
| WO1998051142A1 (en) | 1998-11-19 |
| EA199900103A1 (ru) | 1999-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK2099A3 (en) | Pollen-sterile hybrid wheat, process for its preparation based on ability of genic maintaining of pollen-sterile parental line which is readily and steady propagated | |
| Laurie et al. | The production of haploid wheat plants from wheat x maize crosses | |
| Multani et al. | Development of monosomic alien addition lines and introgression of genes from Oryza australiensis Domin. to cultivated rice O. sativa L. | |
| US4727219A (en) | Genic male-sterile maize using a linked marker gene | |
| Rao et al. | Applications of genie male sterility in plant breeding | |
| Leggett et al. | Oat evolution and cytogenetics | |
| CN106455510A (zh) | 杂种谷物种子生产 | |
| EP4342289A1 (en) | Breeding method of blue marked two-line hybrid wheat system and use | |
| Daunay et al. | Crossability and diversity of eggplants and their wild relatives | |
| Daskalov | Mutation breeding in pepper | |
| US20030014773A1 (en) | Cytoplasmic male sterility-based system for hybrid wheat plant and seed production | |
| Link et al. | Detection and characterization of two new CMS systems in faba bean (Vicia faba) | |
| EA006658B1 (ru) | Способ получения апомиктичного растения | |
| US20060080748A1 (en) | Cross-incompatibility traits from teosinte and their use in corn | |
| US20210137041A1 (en) | Processes for production of large quantities of uniform potato tubers from true seeds | |
| Reddy et al. | Registration of five chickpea germplasm lines resistant to ascochyta blight | |
| Rey et al. | A successful strategy to obtain artichoke hybrids | |
| WO2002059269A2 (en) | Maintenance of genic male-sterile female parental lines using a maintainer line with a stable engineered chromosome | |
| Bailey et al. | Transfer to bread wheat of resistance to common root rot [Cochliobolus sativus] identified in Triticum timopheevii and Aegilops ovata | |
| Namazova | INTERSPECIFIC HYBRIDIZATION BETWEEN BREAD WHEAT AND AEGILOPS TRIUNCIALIS L. | |
| JPH06343359A (ja) | ナタネ一代雑種品種の作成方法 | |
| EP0872173A1 (en) | Hybrid seeds of globe artichoke for seed planting and method of producing same | |
| Verma et al. | Trends in hybrid cucumber development | |
| Daunay et al. | and Xavier Aubriot | |
| Nzuve | Mating Systems in Seed Production (SEMIs) |