EA006658B1 - Способ получения апомиктичного растения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к индукции, стабилизации и контролю апомиксиса (образования семян бесполым путем) у покрытосемянных с целью производства, улучшения и хозяйственного применения высокоурожайных агамных культур (обработка культур, способных как к половому, так и к апомиктичному образованию семян). «Стабилизация» апомиксиса относится к процессам, которые, или преобразовывают факультативный апомикт в сторону облигатного апомиксиса, или наделяют факультативный апомикт механизмами, которые во время факультативного полового образования семян предохраняют рекомбинацию генов, которые вызывают апомиксис, таким образом, что потомство, произведенное половым путем от указанного факультативного апомикта, наследует аллельные комбинации необходимые для апомиксиса. Более конкретно настоящее изобретение относится к (i) производству двух или более наборов генетически дивергентных половых линий, или инбредных, или ауткроссинговых, наборы родительских линий которых остаются гомозиготными для генов, которые вызывают апомиксис при производстве гибридов посредством скрещивания члена одного из таких наборов линий с членом другого набора, (ii) гибридизации половых инбредных или ауткроссинговых родительских линий для производства апомикитов, (iii) стабилизации таких апомиктов посредством цитогенетических или молекулярных модификаций, (iv) улучшению апомиктов путем селекции или генетической инженерии родительских линий или апомиктов, (v) модификации факультативных апомиктов в сторону прерывания женского мейоза, приводящего к облигатному апомиксису, за исключением ингибирования рекомбинантной ДНК, которая прерывает мейоз, и (vi) модификации факультативных апомиктов для сохранения факультативности, кроме как во время индуцибельной экспрессии рекомбинантной ДНК, которая вызывает облигатный апомиксис путем прерывания мейоза. Различные грани этой биологической операционной системы могут быть выборочно скомбинированы для эффективного производства, улучшения и применения агамных культур.

Description

Предпосылки изобретения

Настоящее изобретение относится к закреплению гибридной силы (гетерозиса) и других признаков посредством апомиксиса (образования семян, не связанного с половым процессом) у цветковых растений (покрытосемянных). Более конкретно, изобретение предоставляет способы стабилизации апомиксиса у встречающихся в природе или искусственных факультативных апомиктов (растений, способных к половому и апомиктичному размножению) так, что потомство, полученное половым путем, которое иногда производится факультативно из таких апомиктичных растений, стремится стать апомиктичным, как материнское растение, несмотря на то, что иначе генетически рекомбинировано, вместо того чтобы быть половыми ревертантами. Настоящее изобретение также предоставляет способы «контроля» апомиксиса у встречающихся в природе или искусственных апомиктов таким образом, что такие апомикты проявляют облигатный апомиксис (неспособность к образованию семян половым путем), облигатный апомиксис, кроме индуцированных быть факультативно апомиктичными, или факультативный апомиксис, кроме индуцированных быть облигатно апомиктичными. Данное изобретение использует генетические, цитогенетические и молекулярные модификации чтобы предотвращать генетическую рекомбинацию между локусами опасную для экспрессии апомиксиса (стабилизация апомиксиса), и контролирует процент семян, которые получают апомиктически, посредством контролирования частоты семян, полученных половым путем, у встречающихся в природе или искусственных факультативных апомиктов (контроль апомиксиса).

Типы апомиксиса, относящиеся к настоящей заявке на патент, вызывают образование семян бесполым путем. Таким образом, семена апомиктичных растений содержат зародыши, которые являются генетическими клонами материнского растения. Такие формы апомиксиса включают адвентициальную (добавочную) эмбрионию и гаметофитный апомиксис (называемый ниже как апомиксис), который обычно разделяют на апоспорию и диплоспорию. 8.Е. Аккег & Ь. Дсг11пд. Лрош1х1к ίη Р1ап1к (СКС Ргекк 1992) (далее, Анкет & 1ег1шд).

Связанные с развитием сигналы, ответственные за апомиксис, предшествуют мегаспорогенезу при индуцировании образования скороспелого зародышевого мешка или из материнской клетки мегаспоры (ММС) (диплоспория), или из соматических клеток нуцеллуса (апоспория). Фертилизация является также предшествующей при оплодотворении, которое часто случается до того, как рыльце становится восприимчивым к пыльце. Колебание в интенсивности сигналов ответственных за апомиксис учитывает факультативную экспрессию полового размножения среди апомиктичных растений. Следовательно, у большинства апомиктов определенный процент семян, произведенных отдельным апомиктичным растением, будет образовываться половым путем и этот процент часто находится под влиянием факторов внешней среды. Аккег & 1ег1шд. При диплоспории по типу Айеппапа, сигналы образования скороспелого зародышевого мешка происходят очень рано, полностью предотвращая мейоз. У диплоспории по типу Тагахасит, сигналы образования зародышевого мешка менее ранние и влияют на ММС после того как начался мейоз. При апоспории по типу Н1егасшт, клетки нуцеллуса затронуты ранними и эктопическими (неспецифическими) сигналами, индуцирующими зародышевый мешок, и, затронутые соматические клетки нуцеллуса, подвергаются трем циклам эндомитоза, для образования 8-ядерного зародышевого мешка. При апоспории по типу Рашсит происходит только два цикла эндомитоза, приводящих к образованию зрелых 4-ядерных зародышевых мешков. При адвентиционной эмбрионии зародыши образуются из клеток, а не из яйцеклетки, включая клетки нуцеллуса, интегумента (интегументов), синергидов и антиподные клетки. Аккег & 1ег1шд.

Технологии, которые индуцируют, стабилизируют и контролируют экспрессию апомиксиса у культур, обладают потенциалом революционизирующей селекции растений и становятся существенными для конкурирующего всемирного сельскохозяйственного бизнеса. Такими методами селекционеры будут «клонировать» весьма желательные растения (демонстрирующие гетерозис, трансгенные черты и тому подобное) через собственное растительное семя - поколение за поколением. Увеличение урожая, происходящее в результате закрепления гетерозиса инбредных культур, таких как, пшеница (15%) и рис (35%), будет впервые экономически использовано в большом масштабе, что придаст апомиксису огромное всемирное коммерческое значение. Поскольку клонирование происходит через семя, то апомиксис может стать наиболее ценным эффективным растительным механизмом для передачи биотехнологических и продуктивных достижений маргинальным (небольшим) фермерским землям в развитом мире и плохообеспеченным природными ресурсами хозяйствам в развивающихся странах. В 21-м веке апомиксис может стать среди наиболее ценных для селекционеров растений генетических инструментов. На недавней конференции по апомиксису было достигнуто следующее заключение: «Перспектива введения апомиксиса в культуры, размножающиеся половым путем, предоставляет такие революционные возможности с тем, чтобы оправдать постоянное международное научное усилие. Если бы апомиксис образовывался с достаточно высокой степенью гибкости, то его влияние на сельское хозяйство могло бы быть глубоким по характеру и чрезвычайно широким по масштабу». Тйе Ве11адю Арот1х1к СопГегепсе. \νΐιν ίκ Арот1х1к 1трог1ап1 1о Адпси11иге(1998) (Ы1р://Ь1Ше, йагуагф еби/арот1х1к/аро1есй.Ыт1).

В течение последних 100 лет было предложено четыре способа наследования апомиксиса: хромосомных негомологий (широкой гибридизации), количественного наследования, простого наследования и

-1006658 сложного наследования. Гипотеза хромосомной негомологии, выдвинутая А. Эрнстом, Вак1агб1египд а1к Иткасйе бет Ародаш1е 1т ΡΠζαηΐΌίοΙι (Р1кйег, 1епа 1918), утверждает, что апомиксис является функцией хромосомной негомологии и является одной из нескольких цитогенетических аномалий, вызванной широкой гибридизацией. Согласно этой теории, апомиксис не контролируется непосредственно генами, но является результатом дивергенции в структуре хромосомы. Эта гипотеза больше не считается справедливой главным образом потому, что апомиксис встречается у растений, чьи хромосомы выглядят гомологичными. ЕС. Сагтап, Акупсйгопоик Ехртеккюп οί ЭирНса1е Сепек ίη Апдюкреттк Мау Сайке Арот1х1к, В1крогу, Тейакроту, апб Ро1уетйтуопу, 61 Вю1. 1. Ьшпеап 8ос. 51-94 (1997).

Гипотеза количественного способа наследования также считается недействительной. В середине 20го века это было подтверждено Мюнтцингом, который полагал, что апомиксис происходит в результате точного равновесия от нескольких до многих рецессивных генов, и Пауэрсом, который полагал, что рецессивные гены приводят к трем главным составляющим апомиксиса: нарушению мейоза, образованию апомиктичного зародышевого мешка и партеногенезу. Аккег & 1егйпд.

В течение последних 40 лет большинство ученых по апомиксису, включая Вакйага, НоДег. 8ау1бап, 8йетгаооб и Наг1ап (Бэшеу, Ноглера, Савидана, Шервуда и Харлана) подтвердили гипотезу простого наследования, а именно, что один или два доминантных гена приводят к апомиксису. Аккег & 1егйпд. Исходно это заключение выглядит убедительно в том, что менделевские анализы многократно производят простое соотношение расщепления наследования, например, соотношение 1:1 апомиктичного потомства к потомству, полученному половым путем, является часто продуцированным при скрещиваниях, проведенных между растениями, размножающимися половым путем и апомиктичными растениями. Υ. 8ау1бап, Арот1х1к: Сепейск апб Втеебшд, 18 Р1ап1 Вгееб. Веу. 13-86 (2000). Однако, несмотря на продолжительные усилия, ни один ген, отвечающий за апомиксис, не был идентифицирован или выделен.

В конце 1990-х для эволюции апомиксиса была предложена гипотеза асинхронии двойных генов или теория цветковой асинхронии, произошедшей в результате гибридизации, (в дальнейшем, НРАтеория). РС.Саттап, 61 Вю1. 1. Ьшпеап 8ос, 51-94 (1997). Она подразумевает сложное наследование и основывается на синтезе концепций из различных областей биологии. Согласно этой гипотезе, способ наследования апомиксиса не является простым; и не является просто количественным, по крайней мере, не при стандартном способе наблюдения количественного наследования. Наоборот, он является сложным и является наиболее объяснимым посредством серий из пяти принципов, которые построены друг на друге. Первые три принципа опубликованы, ЕС. Сагтап, 61 Вю1. 1. Ыппеап 8ос. 51-94 (1997), и суммированы ниже. Последние два принципа содержат неопубликованные концепции новые для настоящего изобретения и их представляют здесь.

Первый принцип, апомиксис является оторванным в ходе индивидуального развития гибридным фенотипом. Апомиксис является оторванным, не промежуточным, от его родительских женских репродуктивных фенотипов, которые для удобства обозначают родительскими фенотипами А и В. Растения, демонстрирующие фенотипы А или В, подвергаются нормальной репродукции половым путем. Фенотипические различия между А и В обнаруживали цитоэмбриологически посредством известных в этой области микроскопических методов. Они (фенотипические признаки) просто так (легко) не наблюдаются и по этой причине не были описаны ранее.

Второй принцип, родительские фенотипы А и В отчетливо отличаются друг от друга в отношении периодов времени, в течение которых происходят мейоз, образование зародышевого мешка и эмбриония, относительно всего периода развития семяпочки.

Третий принцип, родительские фенотипы А и В являются сами по себе количественно наследуемыми. Следовательно, почти облигатный апомиксис, в тех случаях, когда большинство семяпочек данного растения производят функциональные апомиктичные зародышевые мешки, выражен вследствие полигенной гетерозиготности. В популяциях агамных комплексов (популяциях интербридинга половых и апомиктичных видов) существуют множественные аллели для многих из критических локусов, то есть критические локусы являются полиморфными. Полигенная гетерозиготность, ответственная за почти облигатный апомиксис, вовлекает, в частности, дивергентные аллели, которые сохраняются в природных популяциях вследствие естественной селекции. Наоборот, факультативный апомиксис, при котором семена, образованные половым путем и апомиктичные семена, обычно развиваются на том же самом растении, происходит, когда некоторые из более критических локусов, требуемых для облигатного апомиксиса, становятся гомозиготными (или приобретают аллели, которые кодируют сходные программы развития семяпочки) посредством генетической сегрегации.

Описаны основанные на НРА-теории эффективные процедуры создания факультативно апомиктичных растений из растений, размножающихся половым путем. ЕС. Сагтап, МеШобк Рот Ртобисшд Аро1шсйс Р1а—к, \νϋ 98/33374 (1998) (здесь приведено в виде ссылки). Эти методы применяют для создания высоко апомиктичных растений, которые могут или не могут быть генетически стабильными как определено выше. Предложенным в νθ 98/33374 решением является производство высоко апомиктичных растений, то есть снижение, насколько это возможно, случая образования семени половым путем у апомиктичных гибридов, путем идентификации или производства (посредством селекции) пар родительских линий, которые являются подходяще дивергентными в их женских репродуктивных программах, при

-2006658 условии, что факультативное половое развитие в факультативно апомиктичном гибридном потомстве сведено до минимума. Искусственные апомикты, произведенные таким образом, могут быть использованы в качестве апомиктичных гибридных линий от нескольких до многих поколений прежде, чем выращенное семя станет непригодным для пересева вследствие опасного загрязнения семенами половых ревертантов. Зараженные ревертантами семена являются продуктами генетической сегрегации и их наличие ухудшает агрономическую ценность. Эта ситуация может быть сходной со смешиванием худшего Е₂ и семян более поздних генераций с элитными Ε₁ гибридными семенами в общепринятой программе по производству семян. Результатом был бы агрономически худший продукт. νΟ 98/33374 не представила предмет стабилизации и контроля апомиксиса. Следовательно, способы модификации апомикта, если уж он создан, не были предоставлены.

Ввиду вышесказанного, было бы выгодно предоставить способы, которые позволяют усовершенствование апомиктичных линий, которые являются облигатными, облигатными если не индуцированы быть факультативными, или факультативными, если не индуцированы быть облигатными. Апомиктичная линия может быть улучшена индуцированием факультативного апомиксиса, традиционными стратегиями селекции и затем возвращена к облигатному апомиктичному состоянию за многие годы полеводства. Должно быть оценено, что эти и другие преимущества настоящей заявки на изобретение (рассмотренные ниже) представляют главные успехи в данной области.

Краткое изложение изобретения

Задачей настоящего изобретения является предоставление нового селекционного способа, который предлагает, стабилизирует и контролирует апомиксис с целью упрощения производства гибридных семян, так что все культуры покрытосемянных могут быть использованы в качестве гибридов.

Другой задачей настоящего изобретения является предоставление специализированных способов селекции растений для успешного улучшения таких апомиктов.

Другой задачей настоящего изобретения является предоставление способов, которые контролируют апомиксис путем превращения факультативного апомикта, который ранее был или не был улучшен методами селекции растений или генетической инженерии, в облигатного апомикта, таким образом, сохраняя, как можно дольше, его генотипические и фенотипические свойства. Эти и другие задачи могут быть решены обеспечением способа получения апомиктичного растения, проявляющего повышенную генетическую стабильность апомиксиса, от покрытосеменного апомиктичного родительского растения, которое проявляет генетическую нестабильность апомиксиса, предусматривающий измерение степени генетической нестабильности апомиксиса родительского растения;

если родительское растение проявляет генетическую нестабильность апомиксиса, получение одного или нескольких растений-потомков от родительского растения, где каждое из растений-потомков содержит двойной хромосомный набор родительского растения;

измерение степени генетической нестабильности апомиксиса одного или нескольких растенийпотомков;

сравнение степени генетической нестабильности апомиксиса одного или нескольких растенийпотомков со степенью генетической нестабильности апомиксиса родительского растения; и селекцию, по меньшей мере, одного из одного или нескольких растений-потомков, проявляющих повышенную генетическую стабильность апомиксиса по сравнению с родительским растением, где одно или несколько растений-потомков получают обработкой родительского растения ингибитором веретена, где ингибитор веретена представляет собой колхицин, где одно или несколько растений-потомков получают культивированием родительского растения или его части в тканевой культуре, где одно или несколько растений-потомков получают самоопылением родительского растения или скрещиванием родительского растения с другим растением того же вида, рода или семейства и получением первого потомства; и подсчет хромосом в первом потомстве и выбор амфиплоида или частичного амфиплоида, имеющего все хромосомы от родительского растения в случае самоопыления такого родительского растения, или все хромосомы от родительского растения и один или несколько наборов хромосом от другого растения того же вида, рода или семейства, или все хромосомы от другого растения того же вида, рода или семейства, и один или несколько наборов хромосом от родительского растения в случае скрещивания родительского растения с другим растением того же вида, рода или семейства.

Способ дополнительно предусматривает обратное скрещивание частичного амфиплоида с родительским растением или с другим растением того же самого вида, рода или семейства и получение от них второго потомства и селекцию амфиплоида, имеющего равный (четный) уровень плоидности, где частичный амфиплоид является эуплоидом или анэуплоидом, где амфиплоид является эуплоидом или анэуплоидом.

-3006658

Способ дополнительно предусматривает повышение фертильности выбранных растений-потомков путем самоопыления или гибридизации с другим растением, получение от них семян, высевание указанных семян, и селекцию полученных половым путем апомиктичных гибридных растений, которые обнаруживают повышенную частоту не сниженной фертильности яйцеклеток или партеногенез.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения апомиктичного сегментного аллополиплоидного растения, проявляющего повышенную генетическую стабильность апомиксиса, от покрытосеменного межсортового гибридного растения, которое проявляет генетическую нестабильность апомиксиса, предусматривающий измерение степени генетической нестабильности апомиксиса межсортового гибридного растения;

если межсортовое гибридное растение проявляет генетическую нестабильность апомиксиса, получение одного или нескольких растений-потомков от межпородного гибридного растения, где каждое из растений-потомков содержит двойной хромосомный набор межсортовое гибридного растения, приводя к появлению одного или нескольких апомиктичных сегментных аллополиплоидных растений;

измерение степени генетической нестабильности апомиксиса одного или нескольких апомиктичных сегментных аллополиплоидных растений; и сравнение степени генетической нестабильности апомиксиса одного или нескольких апомиктичных сегментных аллополиплоидных растений со степенью генетической нестабильности апомиксиса межсортового гибридного растения для проверки того, увеличена ли генетическая стабильность апомиксиса одного или нескольких апомиктичных сегментных аллополиплоидных растений по сравнению с межсортовым гибридным растением.

Способ дополнительно предусматривает повышение фертильности одного или нескольких апомиктичных сегментных аллополиплоидных растений путем их самоопыления или гибридизации с другим растением, получение от них семян, высевание указанных семян и селекцию полученных половым путем апомиктичных сегментных аллополиплоидных растений, которые обнаруживают повышенную частоту не сниженной фертильности яйцеклеток или партеногенез.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ получения апомиктичного аллополиплоидного растения, проявляющего повышенную генетическую стабильность апомиксиса, от покрытосеменного межвидового гибридного растения, проявляющего генетическую нестабильность апомиксиса, предусматривающий измерение степени генетической нестабильности апомиксиса межвидового гибридного растения; и получение одного или нескольких апомиктичных аллополиплоидных растений-потомков от указанного межвидового гибридного растения и селекцию апомиктичного аллополиплоидного растенияпотомка, проявляющего повышенную генетическую стабильность апомиксиса.

Способ дополнительно предусматривает повышение фертильности выбранного апомиктичного аллополиплоидного растения-потомка путем самоопыления или гибридизации с другим растением, получение семян, высевание указанных семян и селекцию полученных половым путем апомиктичных аллополиплоидных растений, которые обнаруживают повышенную частоту не сниженной фертильности яйцеклеток или партеногенез. Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения апомиктичного растения, проявляющего повышенную генетическую стабильность апомиксиса, от покрытосеменного, внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения, проявляющего генетическую нестабильность апомиксиса, предусматривающий измерение степени генетической нестабильности апомиксиса внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения; и получение апомиктичных аутополиплоидных, сегментных аллополиплоидных или аллополиплоидных растений-потомков внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения и селекцию апомиктичного растения, проявляющего повышенную генетическую стабильность апомиксиса.

Способ дополнительно предусматривает повышение фертильности отобранного апомиктичного растения путем самоопыления или гибридизации с другим растением, получение семян, высевание указанных семян и селекцию полученных половым путем апомиктичных растений-потомков, которые обнаруживают повышенную частоту не сниженной фертильности яйцеклеток или партеногенез. Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ генетической стабилизации апомиксиса покрытосеменного, апомиктичного, внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения, проявляющего генетическую нестабильность апомиксиса, предусматривающий измерение степени генетической нестабильности апомиксиса внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения и получение растения-потомка от указанного апомиктичного внутривидового, межсортового или характеризуется нечетным увеличением плоидности, причем женский мейоз обычно прерывается, приводя к практически 100% образованию апомиктичных семян.

Способ дополнительно предусматривает повышение фертильности растения-потомка путем самоопыления или гибридизации с другим растением, получение от них семян, высевание семян и селекцию полученных половым путем апомиктичных растений, которые обнаруживают повышенную частоту не сниженной фертильности яйцеклеток или партеногенез. Другим аспектом настоящего изобретения явля

-4006658 ется способ генетической стабилизации апомиксиса покрытосеменного, апомиктичного, внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения, проявляющего генетическую нестабильность апомиксиса, предусматривающий измерение степени генетической нестабильности апомиксиса внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения и скрещивание этого внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения с мейотическим мутантным растением того же самого вида, рода или семейства и селекцию потомства, где женский мейоз обычно прерывается, приводя к практически 100% образованию апомиктичных семян.

Способ дополнительно предусматривает повышение фертильности отобранного потомства путем самоопыления или гибридизации с другим растением, получение от них семян, высевание указанных семян и селекцию полученных половым путем апомиктичных растений-потомков, которые обнаруживают повышенную частоту не сниженной фертильности яйцеклеток или партеногенез.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ получения апомиктичного растения, проявляющего повышенную генетическую стабильность апомиксиса от покрытосеменного апомиктичного родительского растения, которое проявляет генетическую нестабильность апомиксиса, предусматривающий измерение степени генетической нестабильности апомиксиса родительского растения;

получение растения-потомка от родительского растения путем удвоения числа хромосом указанного родительского растения или введения хромосомной аберрации, в котором рекомбинация подавляется, так что тормозится сегрегация аллелей во время мейоза; и измерение степени генетической нестабильности апомиксиса растения-потомка для проверки того, что такое растение проявляет повышенную генетическую стабильность апомиксиса по сравнению с родительским растением, где указанная хромосомная аберрация предусматривает транслокацию, где указанная хромосомная аберрация предусматривает инверсию.

Способ дополнительно предусматривает повышение фертильности растения-потомка путем самоопыления или гибридизации с другим растением, получение от них семян, высевание указанных семян и селекцию полученных половым путем апомиктичных растений-потомков, которые обнаруживают повышенную частоту не сниженной фертильности яйцеклеток или партеногенез.

Краткое описание нескольких видов графических материалов

Фиг. 1 демонстрирует стадии в эволюции агамных комплексов. Стадии включают экотипичную дифференцировку до образования апомиктов, образование I стадии апомиктов посредством гибридизации, произошедшей в результате вторичных контактов, образование стадии II апомиктов посредством структурной (кариотипической) стабилизации (обычно вовлекающей полиплоидизацию) и образование зрелых, экологически разнообразных агамных комплексов (стадия III) посредством факультативного ауткроссинга, первоначально с половыми родственными формами и вторично с другими родственными апомиктами.

Фиг. 2 демонстрирует стадии мегаспороцита (ММС) и диады в пестиках полового диплоида Ап1еппапа гасешо/а и А. итЫшейа. Отмечают различия между видами в длине интегумента на стадиях ММС и диады. Стрелки = элемены ММС или диады. Линии = величина роста интегумента (сравнивают с фиг. 3).

Фиг. 3 демонстрирует средние значения длин интегумента и семяпочки (фактические измерения, нижние левая и правая фигуры, и в процентах относительное удлинение зрелого интегумента и семяпочки, верхние левая и правая фигуры) на стадиях диады, 2-ядерного зародышевого мешка и зрелого зародышевого мешка для девяти диплоидных клеток-предшественников апомиктичной Аи1еииапа гокеа. Данные на фиг. с 8 по 11 изображают изменчивость в программах развития семяпочки среди растительных экотипов. Это естественное экотипически вызванная изменчивость никогда не была прежде охарактеризована, и она является предпосылкой для возникновения апомиксиса у встречающихся в природе и искусственных гибридов.

Фиг. 4 демонстрирует одно из нескольких измерений продолжительности мейоза среди 17 экологически различных районированных рас и сортов 8огдйит. Продолжительность мейоза является только одним из нескольких типов экотипично выведенной межрасовой/межвидовой изменчивости, обнаруженной в программах развития семяпочки, сохраненной различными экотипами цветковых растений. Столбцы изображают продолжительность времени между стадией диады и время, при котором инициировалось образование зародышевого мешка (как функция роста внутреннего итегумента), т. е. низкие и высокие столбцы изображают линии с очень небольшой и очень большой задержкой, соответственно, между мейозом и образованием зародышевого мешка.

Фиг. 5 демонстрирует созревание цветочной почки во время мегаспорогенеза (женского мейоза) в виде измеренных средних длин внутреннего интегумента (изображенного как относительное удлинение зрелого интегумента в процентах) на стадии диады мейоза для родительских линий трех гибридов 8огдйит. Наблюдали апоспоровые зачатки и/или увеличение многоядерных апомиктичных (апоспоровых) зародышевых мешков приблизительно у 5% пестиков гибридов 5 и 18, чьи родители показывали небольшое различие в уровнях созревания почки во время мегаспорогенеза. Наоборот, многоядерные апо

-5006658 миктичные (диплоспровые) зародышевые мешки плюс апоспоровые зачатки и зародышевые мешки образуют приблизительно 10% пестиков гибрида 15, родители которых показывают гораздо большее различие в уровнях созревания почки во время мегаспорогенеза. Апомиктичное формирование зародышевого мешка в родительских линиях происходит только изредка (<0,1%). Родительскими линиями гибридов 5, 18 и 15 являются Еаг1у Каг1о/Кагаб Ьоеа1, Уй-5049/А|5рип (трансформированные) и \Уе511апб/АДга соответственно.

Фиг. 6 демонстрирует мегаспорогенез и развитие зародышевого мешка у полового Ап1епиапа плюс апомиктичное (диплоспоровое) развитие зародышевого мешка у искусственного Ап1епиапа еогутЬока (2п=2х, половой) X Аи1епиапа гаеетока (2п=2х, половой) межвидового апомиктичного гибрида. Приблизительно 7% пестиков в гибриде обнаруживают образование диплоспорового зародышевого мешка. Диплоспорию не наблюдали в родительских линиях. Примечание к фиг. 3 такое, что две родительские линии не являются сильно дивергентными в отношении сроков мейоза.

Фиг. 7 демонстрирует мегаспорогенез и развитие зародышевого мешка у полового 8ог§йиш плюс апомиктичное (апоспоровое) развитие зародышевого мешка у искусственного гибрида 8ог§1шт. произведенного от половых линий. Приблизительно 5% пестиков в гибриде демонстрируют апоспоровые зачатки и/или апоспоровое образование зародышевого мешка. Диплоспорию не обнаружили в родительских линиях. Примечание к фиг. 3, гибриды, продуцирующие низкую частоту формирования апоспорового зародышевого мешка, выведены из родительских линий, которые не являются сильно дивергентными в отношении сроков мейоза относительно общего развития почки.

Фиг. 8 демонстрирует половой мегаспорогенез и половое и диплоспоровое развитие зародышевого мешка у искусственного факультативно апомиктичного амфиплоида Тпр^аент (2п=4х), произведенного от гибрида Т.1ахит (2п=2х, половой) Х Т.рйокит (2п=2х, половой). Приблизительно 50% пестиков в гибриде демонстрируют диплоспоровое образование зародышевого мешка. Партеногенное образование зародыша из редуцированной яйцеклетки наблюдали цитоэмбриологически (наличие глобулярной стадии эмбриона без фертилизации уже образовавшейся центральной клетки).

Фиг. 9 демонстрирует половой мегаспорогенез и половое и диплоспоровое развитие зародышевого мешка у искусственно стабилизированного облигатно апомиктичного трехспецифичного триплоидного гибрида Тпркаеит, произведенного от половых диплоидов (Т.1ахит /Т.рПо5ит//Т.хорПо1еп5е). Приблизительно 80% пестиков у гибрида демонстрируют диплоспоровое формирование зародышевого мешка. Оставшиеся пестики являются абортивными.

Подробное описание

До раскрытия и описания настоящих способов стабилизации и контроля апомиксиса следует понять, что данное изобретение не ограничивается частными формами, стадиями процессов и материалами, раскрытыми здесь, так как такие формы, стадии процессов и материалы, могут несколько варьироваться. Также должно быть понятно, что терминология, применяемая здесь, используется единственно с целью описания частных воплощений, и она не предназначена для ограничения, поскольку область настоящего изобретения ограничена только прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

Публикации и другие справочные материалы, относящиеся к этому изобретению, для описания предпосылки создания изобретения и предоставления дополнительных подробностей относительно его применения, здесь включены в качестве ссылки. Ссылки, рассмотренные здесь, предусмотрены исключительно для раскрытия уровня до даты подачи данной заявки. Ничто здесь не может быть истолковано как допущение того, что изобретатель не имеет право датировать более ранним числом такое раскрытие посредством более раннего изобретения.

Должно быть отмечено, что, как применяют в данном описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа а, ап и 1йе включают множественные объекты ссылок, если контекст ясно не диктует обратное.

В описании и пунктах формулы настоящего изобретения будет использована следующая терминология в соответствии с определениями, приведенными ниже.

Используемые здесь, «содержащий», «включающий в себя», «содержащий», «характеризующийся» и их грамматические эквиваленты являются включающими в себя, или незавершенными терминами, которые не исключают дополнительных, не перечисленных элементов или стадий способа. «Содержащий» - должен быть интерпретирован как включающий более ограниченные термины «состоящий из» и «состоящий по существу из».

Используемые здесь «состоящий из» и его грамматические эквиваленты исключают любой элемент, стадию или ингредиент, не оговоренный в формуле изобретения.

Используемые здесь «состоящий по существу из» и его грамматические эквиваленты ограничивают объем пункта формулы изобретения описанными материалами или стадиями и теми, которые существенно не влияют на основные и новые признак или признаки заявленного изобретения.

Используемое здесь «генетическая нестабильность» апомиктичного растения означает, что средняя частота образования семени половым путем среди полученного половым путем потомства такого растения превышает среднюю частоту образования семени половым путем такого апомиктичного растения.

-6006658

Используемое здесь «стабилизация» факультативно апомиктичного растения означает гарантированно, что средняя частота формирования семени половым путем среди полученного половым путем потомства такого растения не превосходит среднюю частоту образования семени половым путем такого апомиктичного растения.

Используемое здесь, «полный апомиксис» означает (1) предшествование мегаспорогенеза при образовании раннего зародышевого мешка, (2) предшествование фертилизации при ранней эмбрионии, и (3) образование эндосперма или псевдогамно (посредством фертилизации центральной клетки, но не яйцеклетки), или автономно (без фертилизации центральной клетки).

Принципы 4 и 5 НЕА-теории апомиксиса являются следующими.

Принцип 4 гласит, что в отсутствие структурной или кариотипической гетерозиготности, потомство почти облигатного или факультативного апомикта, полученное половым путем, обычно воспроизводится половым путем, это означает, что оно является половыми ревертантами. В отсутствие структурной гетерозиготности дивергентные аллели, ответственные за родительские фенотипы, расщепляются во время образования половой гаметы, которое у апомиктов происходит то изредка, то часто во время мегаспорогенеза (женский мейоз) и обычно часто во время микроспорогенеза (мужской мейоз). В этом отношении, потеря апомиксиса в половом Е₂ поколении является аналогичным потере гибридной силы в Е₂ поколении стандартных гибридных сортов культур. Оба являются сложными полигенными гибридными фенотипами.

Принцип 5 гласит, что при наличии структурной гетерозиготности, потомство, произведенное половым путем, почти облигатного или факультативного апомикта обычно воспроизводит или апомиктично, имитируя гомозиготное доминантное состояние, или обоими половым путем и апомиктичным (при коэффициенте расщепления почти 1:1), имитируя гетерозиготное доминантное состояние. У настоящих, репродуктивно стабилизированных, апомиктов высокая частота расщепления к половому типу предотвращается структурной (кариотипической) гетерозиготностью, которая включает, но не ограничивается этим, аллополиплоидию, сегментную аллополиплоидию, половую стерильность или палеополиплоидию. Структурная гетерозиготность является ответственной за апомиксис, имитируя простое наследование.

Внутривидовые апомиктичные диплоидные гибриды, половое потомство которых является обычно слабо апомиктичным или полностью половым вследствие рекомбинации полигенной гетерозиготности, необходимой для апомиксиса, стабилизируют путем индуцирующей триплоидии, или другим нечетным полиплоидным уровнем. Это имеет своим результатом почти облигатный апомиксис. При неспаренном уровне плоидности генетически редуцированные и рекомбинированные функциональные яйцеклетки образуются редко и редко оплодотворяются генетически редуцированным и рекомбинированным спермием, выработка которого весьма снижена. Следовательно, внутригеномная полигенная гетерозиготность, ответственная за апомиксис, редко нарушена у полиплоидных апомиктов с неспаренным уровнем плоидности.

Аллополиплоидия (полиплоидия, вовлекающая различные виды) представляет собой вообще наиболее удобный механизм для ограничивающей рекомбинации. У аллополиплоида рекомбинация в основном происходит только внутри геномов, не между геномами. Следовательно, гены, ответственные за апомиксис, поддерживаются посредством факультативных половых поколений в гомозиготном состоянии внутри генома, но в гетерозиготном состоянии между геномами.

Другие цитогенетические механизмы могут быть использованы для предотвращения рекомбинации внутри или между целыми геномами, или частями геномов. Настоящая заявка распространяется на все такие механизмы, включая гетерозиготную инверсию или транслокационную гетерозиготность и механизмы генетически контролируемого мейотического пуска.

Уровни фертильности межвидовых апомиктичных диплоидов, демонстрирующие низкую фертильность, увеличивают полиплоидизацией или четных (например, тетраплоидных, гексаплоидных и тому подобных), или нечетных (например, триплоидных, пентаплоидных и тому подобных) уровней. Апомиктные полиплоиды, созданные таким образом, могут производить некоторое количество потомства, полученного половым путем, то есть они в основном являются факультативными апомиктами. Такое потомство, полученное половым путем, также является факультативными апомиктами поскольку полигенная гетерозиготность, необходимая для апомиксиса, существует между геномами, а не внутри геномов. Аллополиплоиды фиксируют надежную интергеномную гетерозиготность так, что случайная межгеномная рекомбинация не затрагивает аллельный состав дивергентного межгеномного локуса. Сегментообразную аллополиплоидизацию поощряют посредством способов настоящего изобретения, чтобы усилить пыльцевую фертильность, образование нередуцированного зародышевого мешка и яйцеклетки, жизнеспособность и нередуцированный партеногенез яйцеклетки.

Развитие НЕА-теории

Объединением НЕА-теории (всех пяти принципов) с принципами эволюционной генетики, настоящий изобретатель развил новую теорию о происхождении, стабилизации и дифференциации природных «агамных комплексов» (групп интербридинга половых и апомиктичных растений). Теория представлена здесь и формирует основу для производства «агамных культур».

-7006658

В течение фазы пре-апомиксиса теории (фиг. 1), естественная селекция происходит вдоль по широтному и другим экологическим градиентам и половые экотипы эволюционируют с дивергентными широкими временными характеристиками развития яйцеклетки. Это является тем, за чем следует гибридизация, произошедшая в результате вторичных контактов. В этом контексте плейстоцен был единственным в истории покрытосемянных, в котором произошли обширные растительные миграции, В. Нип!1еу & Т. \УсЬЬ III, Уеде!а!юп Н1к!огу (К1и^ег Асабеиис РиЬНкйетк 1988), и гибридизации, произошедшие в результате вторичных контактов, в частности, в средне-широтной гетерогенной заповедной флоре. 1.С. Сагтап, 61 Бю1. I. Ьшпеап 8ос. 51-94 (1997).

Новые гибриды, пытающиеся экспрессировать две и более конкретно дивергентные широковременные характеристики развития цветковых, воспроизводили в виде факультативных апомиктов стадии I (фиг. 1). Большинство из этих исчезающих апомиктов были диплоидами, и апомиксис у большинства из них был факультативным и кратковременным, то есть их потомство, произведенное половым путем, было облигатно половым, поскольку сбалансированная многолокусная гетерозиготность, необходимая для апомиксиса, была нарушена рекомбинацией. Следовательно, последующие поколения этих недолговечных линий содержали несколько апомиктов до тех пор, пока все апомикты не были замещены половым потомством. Такое замещение не происходило у апомиктов, или с имеющимися ко времени их образования, или с быстро приобретенными стабилизирующими механизмами, такими как, аллополиплоидия. Большинство механизмов, которые стабилизируют апомиксис, вовлекают полиполидию и все из них весьма ингибируют и иногда элиминируют рекомбинацию различных гетерозиготных генов, критических для апомиксиса и родственных репродуктивных аномалий.

Стабилизированные апомикты стадии II могут периодически включаться в Вц и В_ш гибридизацию с родственными апомиктами и с экологически дивергентными половыми родственниками, чтобы произвести гетерогенные агамные комплексы стадии III (фиг. 1). Многие апомикты стадии III в настоящее время продолжают ассимилировать, посредством факультативного ауткроссинга с половыми и апомиктичными родственниками, генетическая емкость продолжает мигрировать в новые и экологически различные ареалы. КД. Вауег, Еуо1ийоп ок Ро1ур1о1б Адат1с Сотр1ехек \νί11ι Ехатр1ек кгот Атеппапа (Ак!егасеае),132 Орега Во!. 53-65 (1996).

Механизмы стабилизации генетических систем наследования, ответственных за апомиксис, завершают НЕА-модель происхождения, стабилизации и наследования апомиксиса. Что касается апомиксиса, то составляющие механизмы (определенные ниже) не описаны в уровне техники.

Согласно НЕА-теории, родительские половые фенотипы апомиктов являются полигенными коадаптантами, А.К. Тетр1е!оп, Соабар!а!юп апб Ои!Ьгеебш§ Эергеккюп, ίη М.Е. 8ои1е, Сопуеткюп Вю1оду: Тйе 8с1епсе ок 8сатсйу апб Эгуеткйу 105-116 (8таиет Аккоск. Шс., 8ипбет1апб, МА 1986); В. Зайасе, Соабар!айоп Р.еу1К1!еб, 82 I. Негеб. 89-95 (1991), кодирующимися уникальными группами аллелей, которые действуют кооперативно для подтверждения соответствия специфическим экотипам, адаптированным к специфическим окружающим средам. Любая важная рекомбинация между родительскими геномами, т.е. между этой критической мультилокусной гетерозиготностью у факультативных апомиктов стадии I, имеет следствием потомство, которое демонстрирует раздельнополость или, в лучшем случае, весьма сниженную частоту апомиксиса, т. е. потомство, полученное половым путем, является половым или большей частью половым (высоко факультативным). Следовательно, без стабилизации, апомикты стадии I в конечном счете вытесняются половыми сегрегантами, которые генетически вносят только половое потомство в популяцию.

Подавляющее большинство диплоидных апомиктов стадии I, которые успешно продвигаются к стадии II (фиг. 1), стабилизируют аллополиплоидией или сегментной аллополиплоидией. Скорость, при которой происходит стабилизация, зависит от взаимосвязанности родительских линий и от определенных условий в зоне гибридизации, произошедшей в результате вторичных контактов. Одна родительская линия в таких зонах является более многочисленной, чем другая. В таких случаях пыльца от доминирующего родителя, скорее всего, будет вовлечена в В_ш гибридизацию (фертилизация нередуцированных яйцеклеток), чтобы образовать триплоиды с соотношением генома 2:1. Наоборот, гибрид В_ш может быть образован из нередуцированной пыльцы апомикта стадии I, что сказывается на фертильности доминирующего родителя, образующего такое же соотношение генома 2:1. Полагая, что триплоиды также образуют нередуцированные яйцеклетки (демонстрируют тенденции к апомиксису) или пыльцу, второй раунд обратного скрещивания, вовлекающий того же самого доминирующего диплоидного полового родителя, дает в результате соотношение генома 3:1. Такие соотношения, вероятно, являются частыми среди апомиктов, и они (соотношения) объясняют простое отношение расщепления наследования и присущие апомиксису, гемизиготные группы сцепления. Наоборот, триплоид может быть вовлечен в В_ш гибридизацию с другим родителем, в этом случае имеет место соотношение генома 2:2. Другие формы полиплоидизации, вовлекающие нередуцированную пыльцу и яйцеклетки, или соматическое удвоение, могут давать сходные результаты.

Большинство апомиктов являются ауткроссинговыми многолетниками, т.е. инбридинг апомиктов с однолетними апомиктами является чрезвычайно редким (Аккег & 1егйп§). Гипотезы, основанные на мутации, не объясняют это наблюдение. Наоборот, схема гибридизации и ауткроссинга, описанная выше,

-8006658 (фиг. 1) зависит от ауткроссинга и наличия многолетников. При диплоидном уровне гибрида, ВС1 - триплоидном и ВС₂ - тетраплоидных уровнях, наличие многолетников позволяет проанализировать многочисленные генетические рекомбинации (в пыльце). Каждый может предоставить генетическую предпосылку, которая обсуждает различную степень жизнеспособности и факультативности, и генетические предпосылки, обсуждающие поддержание более высокой жизнеспособности.

Ауткроссинг и наличие многолетников являются особенностью семейств с высокой степенью естественной гибридизации, а Л51сгассас. Роасеае и Кокасеае часто располагаются близко к верху. N.0. Е11кйапб е! а1., ΌίδΙπόιιΙίοη о£ 8роп!апеоик Р1ап! НуЬпбк, 93 Ргос. ΝηΙ'Ι Асаб. 8с1. И8А 5090-5093 (1996). Эти три семейства содержат 75% всего апомиктичного рода. ЕС. Сагтап, 61 Бю1. 1. Ьшпеап 8ос. 51-94 (1997). Напротив, апомиксис редко наблюдается в семействах, которые располагаются низко в гибридизационной оценке, например, Вгаккюасеае, 8о1опасеае и Ар1асеае. Опять-таки, хотя гипотеза, основанная на мутагенезе, не объясняет эти ассоциации, они полностью совпадают с происхождением гибридизации и обратного скрещивания, описанными выше (фиг. 1).

Поскольку большинство апомиктов являются аллополиплоидами, Аккег & 1ег1шд, аллополиплоидия, вероятно, является наиболее частой формой стабилизации апомиксиса. Рекомбинация у истинных аллополиплоидов происходит только внутри геномов. Следовательно, локусы, критичные для высокой частоты (почти облигатного) апомиксиса, изолируются из интергеномной сегрегации и независимого ассортимента, т. е. они сохраняют гомозиготность внутри геномов, но гетерозиготность между геномами. Потомство, образованное половым путем от факультативно апомиктичных ТТ Т'Т' геномных аллополиплоидов, где Т и Т' являются дивергентными и кодируют дивергентные черты развития яйцеклетки, остается апомиктичным, но является фенотипически вариабельным вследствие внутригеномной рекомбинации, вовлекающей гетерозиготные локусы не критичные для апомиксиса.

Если ТТТ Т' апомикты размножают половым путем, то полигенная емкость апомиксиса (от предельно полового до почти облигатного) часто сегрегирует по простому Менделевскому способу. Это происходит из-за того, что косегрегация с нерекомбинантым Т' унивалентом (или большой группой сцепления), который содержат большинство из многих критических дивергентных аллелей, обязательна для экспрессии от низкой до высокой частоты апомиксиса. Похоже, что многие гены, существенные для почти облигатного апомиксиса, встречаются в нескольких хромосомах. Следовательно, в скрещиваниях между ТТТТ половыми линиями и ТТТ Т' апомиктичными линиями, факультативность будет варьировать от <10% до >90% среди сегрегантов, обычно классифицированных в виде апомиктичных. Υ. 8ау1бап, Оепейск апб ИйЕ/айоп о£ Арот1х1к £ог 1Пе 1тргоуетеп! о£ Ошпеадгакк (Рашсит тахтит Шсц), Ргос XIV 1п1. Огакк1. Сопдг., Еехшд!оп, ΚΥ, 1981, 182-184 (1983); 8. Ьийк е! а1., Ма1е апб Еета1е 8рогодепек1к апб Сате1о§епек1к ш Ароткйс ВгасЫапа Ьп/апЫа, ВгасЫапа беситЬек апб Е1 НуЬпбк \νί11ι 8ехиа1 Со1сЫсше 1пбисеб Те!гар1о1б ВгасЫапа ги/1/1епк1К. 78 Еирйуйса 19-25 (1994). Такие апомикты часто приближаются к 50% сегрегированной популяции, т.е. отношение сегрегации 1:1 является часто приблизительным, которое является ошибочным в качестве доказательства простого наследования. Если хромосома, что содержит больше всего локусов, критических для апомиксиса, классифицируется как унивалентная, как ожидается в ТТТ Т' геномной совокупности, то частота передачи не достигнет 50% вследствие образования микросателлита. Это объясняет многие коэффициенты расщепления, которые описывают <50% передачи апомиксиса. Такие наслоения на гипотезу простого наследования объясняют это отклонение тетрасомным наследованием с произвольным хроматидным набором. Υ. 8ау1бап, Арот1х1к: Оепейск апб Вгеебшд, 18 Р1ап! Вгееб. Кеу. 13-86 (2000).

Хромосомный ассортимент в присущем для апомиксиса гомеологичном ТТТ Т' наборе имеет место, если все четыре хромосомы являются гомологичными. Во время мейоза каждая из трех гомологичных Т хромосом имеет равный шанс ассоциирования с соответствующей ей гомеологичной Т' хромосомой. Следовательно, если общий для всех четырех хромосом локус содержит аллели, которые отличаются друг от друга, тогда все шесть парных комбинаций четырех различных аллелей произойдут случайным образом, т.е. хромосомный набор имитирует аутополиплоид.

У многих апомиктов большинство полиплоидных наборов хромосом работают геномно в виде аутополиплоидных наборов, но по меньшей мере один работает в качестве аллополиплоидного набора. Такое хромосомное поведение является типичным для сегментной аллополиплоидии. О.Ь. 81еЬЬшк, ν;·ιπ;·ιйоп апб ЕуоЫбоп ш Р1ап!к (Со1итЬ1а Ишуегкйу Ргекк, №\ν Уогк 1950); I. 8уЬепда, СЫотокоте Ратпд АЕйпйу апб Оиабг|уа1еп1 Рогтайоп ш Ро1ур1о1бк: Эо 8едтеп!а1 А11оро1ур1о1бк ЕхШ?, 39 Оепоте 1176-1184 (1996). Аллополиплодный набор (наборы) поддерживает между геномами пропорциональную мультилокусную гетерозиготность, обязательную для апомиксиса.

Согласно НЕА теории сегментные аллополиплоидные апомикты эволюционируют от ранней стадии межрасовых аутополиплоидных апомиктов или слабо полиплоидных ТТТ Т' или ТТ Т'Т' апомиктов. Критичная для апомиксиса рекомбинация внутри гомеологичного набора (наборов) хромосом является часто неадаптивной, поскольку она обычно приводит к стерильным половым сегрегантам. Следовательно, аллельные рекомбинации, хромосомные аберрации или даже мутации, которые ингибируют рекомбинацию внутри присущего апомиксису гомеологичного набора, вызывают дальнейшую аллоплоидизацию, О.Ь. 81еЬЬшк, Vаπаΐ^οη апб ЕуоЫйоп ш Р1ап!к (Со1итЬ1а ИЫуегкйу Ргекк, №\ν Уогк 1950) этого набора, кото

-9006658 рая может быть сильно адаптивной, приводящей к накоплению таких модификаций. Также рекомбинации внутри гомеологичных наборов, которые не сильно вовлечены в обсуждаемый апомиксис, могут быть высоко адаптивными. Такие рекомбинации первоначально являются редкими, но с каждой дополнительной рекомбинацией сходство между хромосомами внутри гомеологичных наборов возрастает, т.е. эти цитогенетические события аутополиплоидизируют хромосомные наборы путем комбинирования сегментов из дивергентных гомеологичных хромосом в одну хромосому. I. ЗуЬспда. 39 Се по те 11761184 (1996). Поскольку такая рекомбинация не приводит к половым сегрегантам, жизнеспособность апомикта возрастающе увеличивается путем элиминации дисадаптивных аллельных комбинаций, существующих в исходном гибриде и путем образования новых и адаптивных аллельных комбинаций. Этот механизм может объяснить, почему апомикты у Тпркасит, Э.Сптапе11у е! а1., Марртд Э|р1окрогопк Λροιηίχίδ ίη Те1гар1о1б Тпркасит: Опе Сепе ог 8сусга1 Сепек?, 80 Негебйу 33-39 (1998), Ό. Сптапе11у е! а1., №п-МепбеЫт Тгапкппккюп оГ Арот1х1к ш Ма1/е-Тпр5асит НуЬпбк Саикеб Ьу а Тгапкппккюп Кабо ЭЩойюп, 80 Негебйу 40-47 (1998), РепЫкеЫт, Р. О/1а8-Лкт8 е! а1., 95 Ргос. Νπ1'1 Асаб. 8ск И8А 51275132 (1998), у Сепскгик, Ό. Коске, Ап Арокрогу-кресШс Сепопис Кещоп ίκ Сопкегуеб Ве1\уееп ВпГГе1дгакк (Сепскгик Ыкапк Ь.) у РепЫке!ит 8С.|иати1а1ит Егекеп, 19 Р1ап1 1. 203-208 (1999), и у ВгасЫапа, 8.С.Реккшо е! а1,. 130 Негебкак 1-11 (1999), ведут себя геномно как аутополиплоиды, даже не подвергаются рекомбинации в присущем апомиксису гомеологичном хромосомном наборе или группе сцепления.

1. 8уЬепда, 39 Сепоте 1176-1184 (1996), убедительно доказывал, что сегментная аллополиплоидия элиминируется посредством аутополиплоидизации в начале эволюции полиплоидов, которые появляются в виде слабых аллополиплоидов или в виде межрасовых аутополиплоидов. Сегментный аллополиплоидный апомикт появляется, чтобы быть исключением. При этом факультативный апомиксис, связанный с сегментной аллополиплоидией является взаимосвязанной и высоко адаптивной особенностью, т. е. они действуют синергично в эволюции и стабилизации зрелых крайне удачных агамных комплексов (фиг. 1).

В природе существует несколько, кажущихся стабильными, диплоидных апомиктов и некоторые из них, вероятно, стабилизированы посредством почти облигатной половой стерильности, которая предотвращает сегрегацию. Эти апомикты могут образовываться или посредством внутриспецифичной гибридизации половых диплоидов, или из аллополиплоидных апомиктов путем партеногенеза редуцированных яйцеклеток. Примеры включают диплоидные апомикты у Ро1еп1111а, МиЫхщд & МипЫтд, Тке Мобе оГ КергобисЬоп оГ НуЬпбк Ве1\уееп 8ехиа1 апб Аротюйс Ро!еп!111а агдеп!еа, 1945 Во!. №1. 49-71 (1945), у Н1егоск1ое, С. ^е1тагск, Арот1х18 апб 8ехиа1ку ш Н1егоск1ое аикйакк апб ш 3\уеб1кк Н. обога!а оп ЭШегеп! Ро1ур1о1б Ьеуе1к, 120 Вок №1. 209-235 (1967), у 8огЬик, А. 1апкип & М. Коуапба, Арот1х18 а! !ке Э1р1о1б Ьеуе1 т 8огЬик ех1т1а (Еткпо1ощса1 8!иб1ек т 8огЬик 3), 60 Ргекка, Ргака 193-213 (1988), и у АгаЫк, В.А. Коу, Тке Вгеебшд 8ук!етк оГ 81х 8рес1ек оГ АгаЫк (Вгакккасеае), 82 Атег. 1. Во!. 869-877 (1995). В каждом случае геномы диплоидов являются дивергентными, и половые гаметы образуются редко.

Наоборот, полная реверсия к раздельнополости внутри одной до нескольких половых генераций происходит у раздельнополых фертильных диплоидных (или слабых дигаплоидных) апомиктов. Такие нестабильные апомикты образуются или путем межрасовой гибридизации половых диплоидов, или из сегментных аллополиплоидных апомиктов путем партеногенеза редуцированных яйцеклеток. Замечание к последнему случаю, такие стабилизированные полиплоидные апомикты стадии I и III могут быть родительскими для нестабильных неодиплоидных апомиктов стадии I (фиг. 1). Нестабильные апомиктичные диплоиды обнаружены у РайкеЫит, Ό.υ. Сегк!е1 & XV. М. М1ккапес, Оп !ке [пкегкапсе оГ Арот1х1к т РайкеЫит агдеп1а!ит, 115 Во!. Саζ. 96-106 (1950), у Капипси1ик, С.А. №дег, 94 Во!. Не1. 411-422 (1984) и возможно, у Ткетеба, Ь.Т. Еуапк & К.В. Кпох, Епуйотеп1а1 Соп!го1 оГ Кергобисйоп т Ткетеба аикйакк, 17 Айк!. I. Во!. 375-89 (1969), у ВгасЫапа, Т.К К-штоуа е! а1., Арот1х1к апб 8ехиа1ку ш Э1р1о1б апб Те!гар1о1б Ассеккюпк оГ ВгасЫапа беситЬепк, 12 8ех. Р1ап! Кергоб. 43-52 (1999), и у 8огдкит, С.У. Тапд е! а1., Арот1х1к т 8огдкит Ьшек апб Ткей Е1 РгодеЫек, 141 Во!. Саζ. 294-299 (1980); и.К. Мийу, Аррга1ка1 оп !ке Ргекеп! 8!а!ик оГ Кекеагск оп Арот1х1к т 8огдкит, 64 Сиг. 8ск 315-316 (1993), последний из которых появляется, чтобы возникнуть посредством гибридизации половых диплоидов.

Если апомиксис контролировали простым доминантным геном, то приблизительно 75% (если гетерозиготные) или 100% (если гомозиготные) всего потомства, полученного половым путем, факультативных диплоидных апомиктов, должно быть апомиктичным. Однако такого коэффициента сегрегации никогда не наблюдали. Вместо этого, полученное половым путем потомство факультативных диплоидных апомиктов является полностью половым, или только слегка апомиктичным. Эти наблюдения являются несовместимыми с простым наследованием, но они полностью согласуются с НЕА-теорией, то есть рекомбинация сбалансированной мультилокусной гетерозиготности, критичная для апомиксиса, обычно дает в результате половое потомство. Вкратце, на диплоидном уровне при факультативной рекомбинации слабо гомеологичных геномов апомиксис теряется. На полиплоидном уровне гомеология является достаточной, чтобы ограничить факультативную рекомбинацию до одинаковых геномов. Этот механизм гомеологии поддерживает кросс-геномную гетерозиготность, которая часто вызывает апомиксис, чтобы выглядеть как простое наследование при использовании апомиктов в качестве мужских родительских особей в скрещиваниях между половыми особями и апомиктами.

-10006658

Как рассмотрено выше, эти гипотезы, индорсирующие простое наследование, объясняют 100%-ную реверсию к раздельнополости у потомства, произведенного половым путем, факультативно апомиктичных диплоидов путем утверждения, что доминантная апомиксисная аллель ведет себя как рецессивная летальная в гаплоидных гаметах. Следовательно, согласно этому объяснению, апомиксис не может быть наследован от гаплоидных гамет диплоидных апомиктов.

В дополнение к стабилизации определенных диплоидных апомиктов половая стерильность предоставляет добавочную стабилизацию полиплоидным и анеуплоидным апомиктам. Несколько примеров включают (ί) триплоидные апомикты у Тагахасит, Аккег & ДсгНпд. Епдегои, Ό.Ά. 8!га!!ои, ЬгГе Н1к!огу Уапайои \νί!1ιίπ Рори1а!юик оГ Акехиа1 Р1аи1, у Ейдегои аиииик (Ак!егасеае), 78 Атег. 1. Во!. 723-728 (1991), у Еира!огшт, М.8. Вег!акко-Вогдек & 1.К. Со1етаи, ЕтЬгуо1оду аий Су!одеие!юк оГ Еира!огшт рапйПогпт аий Е. 1и!егтейшт (Сотрокйае), 21 Сеие!. Мо1. Вю1. 507-514 (1998), у Тпркасит, В1акеу е! а1., Со-кедгеда!юи оГ ΌΝΑ Магкегк \νί!1ι Тпркасит ЕегШйу, 42 Мауйюа 363-369 (1997), у Ракра1ит, В.Ь. Вигкои & М.А. Никкеу, Су!о1оду оГ Ракра1ит та1асорйу11пт аий йк Ке1а!юикЫр !о Р. щегдеики аий Р. Й11а!а!ит, 159 1и!. 1. Р1аи! 8ск 153-159 (1998), и у С1к!аисйе, В. Раху, П1р1о1й1/а!юи Еайиге аий Арот1х1к ш ОгоЬаисйасеае, 128 Во!. 1. Ыии. 8ос. 99-103 (1998), (и) у анеуплоидных апомиктов Е1утик, ЕВ. Наш, 8иЬкехиа1 Кергойисйои ш Адгоругои, 10 Негеййу 129-160 (1956), у Ытошит, 1.А. Кокке11о е! а1., Ытошит сагуа11ю1 (Р1итЬадшасеае), а №\ν Еийетю 8реаек Ггот !1е Ва1еапс 1к1аийк, 56 Аиа1ек Эе1 1агйш Во!ашсо Эе Майпй 23-31 (1998), у Тпркасит и Аи!еииаиа, 1.С. Сагтаи, неопубликовано, и (ίίί) у неравных тетраплоидных (три гомологичных х=5 геномов плюс один гомеологичный х=4 геном) апомиктов (нуцеллярная эмбриония) у №!йоксогйит, К. 1оиек, КоЬейкошаи Еикюи аий Сеи!пс Е1ккюи ш Кагуо!уре Еуо1и!юи оГ Н1дйег Р1аи!к, 64 Во!. Кет. 273-289 (1998).

Согласно НЕА-теории биспория, тетраспория и полиэмбриония являются также полигенно определенными, аномальными и эволюционно промежуточными (гибридными) фенотипами. 1.С. Сагтаи, 61 Вю1. 1. Ешиеаи 8ос. 51-94 (1997). Подобно апомиксису они происходят из-за внутригеномной гетерозиготности генов, вовлеченных в синхронизацию мегаспорогенеза, развития зародышевого мешка и/или эмбрионии. Однако, в отличие от апомиктов, многие биспоровые, тетраспоровые и полиэмбрионные виды являются диплоидными и почти все биспоровые и тетраспоровые виды являются полностью раздельнополыми. 1.С. Сагтаи, 61 Вю1. 1. Етпеаи 8ос. 51-94 (1997). Следовательно, мультилокусная гетерозиготность, критичная для этих аномалий, не стабилизируется нормальной полиплоидией или половой стерильностью в случае биспоровых, тетраспоровых или факультативно полиэмбиональных диплоидов. Это поднимает вопросы, как такая гетерозиготность возникает и как она стабилизируется.

Биспоровые и тетраспоровые виды и многие полиэмбриональные виды являются палеополиплоидами, которые, по-видимому, должны были образоваться из эволюционно асинхронных половых или апомиктичных полиплоидов. 1.С. Сагтаи, 61 Вю1. 1. Ешиеаи 8ос. 51-94 (1997). Возможные механизмы образования включают возрастающую или убывающую анеуплоидию и структурные реорганизации родительских геномов. Э.Е. 8о1!1к & Р.8. 8о1!1к, Ро1ур1о1йу: Кесштеи! Еогтайои аий Сеиоте Еуо1и!юи, 14 Тгеийк Есо. Еуо1. 348-352 (1999), оба из которых могут быть стабилизированы посредством диплоидизации. Без диплоидизации должна произойти сегрегация к образованию нормального моноспорового зародышевого мешка типа Ро1удоиит. Диплоидизация превращает полиплоидные наборы гомеологичных хромосом, в которых рекомбинация происходит случайно, в рекомбинационно отличные (диплоидные) хромосомы, в которых рекомбинация между вновь отмеченными и потенциально реорганизованными диплоидными парами никогда не происходит. Следовательно, наследственная мультилокусная внутригеномная гетерозиготность, критичная для биспории, тетраспории и полиэмбрионии, постоянно стабилизируется посредством диплоидизации. Апомиксис у несомненных диплоидных апомиктов АгаЫк и, возможно, у нескольких других апомиктов (диплоидных или полиплоидных), также может постоянно стабилизироваться путем диплоидизации.

Наличие экстенсивной анеуплоидии или больших несбалансированных хромосомных перегруппировок перед диплоидизацией могло бы сделать моноспорию (норму) невозможной для некоторых биспоровых и тетраспоровых видов и сделать невозможным половое развитие зародышевого мешка у некоторых апомиктов. Однако, случаи полной облигатной биспории, тетраспории и апомиксиса у растений, вероятно, являются редкими, если они вовсе случаются. Н. Н)е1тду1к!, Уапа!юик ш ЕтЬпо 8ас Эеуе1ортеи!, 14 Р11у!отогр1ю1оду 186-196 (1964); Аккег & 1ег1шд; В.М. 1ойи е! а1., Сотрагайуе ЕтЬпо1оду оГ Аидюкрегтк, Уо1. 1 аий 2 (Νον Уогк: 8ргшдег-Уег1ад 1992). Наоборот многие необычные раздельнополые и бесполые репродуктивные системы насекомых, амфибий и рептилий являются облигатными. В случае с растениями, большинство из аномальных репродуктивных путей отчетливо ассоциировано с гибридизацией, полиплоидией, диплоидизацией и другими цитогенетическими механизмами. Е. 8иота1ашеи е! а1., Су!о1оду аий Еуо1и!юи ш Раг!йеиодеиек1к (СКС Ргекк, Васа Ка!ои, ЕЬ 1987). Следовательно, такие механизмы могут также возникать в виде полигенных гибридных фенотипов, которые стабилизируют путем нормальной или сегментной аллополиплоидии, половой стерильности, диплоидизации или других цитогенетических механизмов, которые предотвращают рекомбинацию мультилокусной гетерозиготности, критичную для их поддержания.

-11006658

Типичный механизм стабилизации дифференциально воздействует на гетерозис и на дрейф генов. Например, аллополиплоидия типа ТТ Т'Т' мгновенно стабилизирует апомиксис, но существует несколько механизмов, закрепляющих мутации и редкий ауткроссинг, для улучшения фертильности таких апомиктов путем модификации исходных коадаптационных программ развития яйцеклетки. Наоборот, среди сегментных аллополиплоидных апомиктов существуют потенциально эффективные механизмы для геномной модификации. У таких апомиктов рекомбинационное смешение происходит внутри таких наборов гомеологичных хромосом, которые не непосредственно вовлечены в обсуждаемый апомиксис, который, вероятно, содержит в себе большинство. Рекомбинации внутри этих наборов могут усиливать половое развитие пыльцы, бесполое развитие яйцеклетки, партеногенез нередуцированных яйцеклеток и гетерозис. В этом смысле апомикты, возникающие как внутривидовые аутополиплоиды или слабо внутривидовые гибриды, могут быстро приобретать, путем естественной селекции и аутополиплоидизации неапомиксисных хромосомных наборов, рекомбинации, которые дают большие партии семян и высокую фертильность пыльцы. Внутригеномные рекомбинации, вредные для проявления пола женских особей, усиливают селекцию против половых ревертантов. Некоторые внутригеномные рекомбинации могут вызывать дупликацию или делецию определенных стадий развития яйцеклетки, как видно при биспории и тетраспории. В этом отношении апомиксис может служить в качестве эволюционного пускового механизма в эволюции репродуктивно новых половых видов и родов, включающих тех, которые являются биспоровыми, тетраспоровыми или полиэмбрионными. ТС. Сагтап, 61 ΒίοΙ. 1. Ьшпеап 8ос. 51-94 (1997). Наоборот, апомикты, возникающие строго в виде геномных аллополиплоидов, или ТТ Т'Т' или ТТТ Т', могут сохранять неограниченно много внутригеномных гетерозиготностей, не вполне адаптированных к апомиксису.

Способы настоящего изобретения

Настоящее изобретение направлено на способы создания генетически стабилизированных апомиктичных растений и генетически стабилизированных встречающихся в природе или искусственно созданных апомиктичных растений, которые демонстрируют генетическую нестабильность. Настоящее изобретение также направлено к способам контроля экспрессии апомиксиса (факультативности) с целью усовершенствования растения, производства семян и производства культур.

Удобно разделить способы настоящего изобретения на 4 категории: а) определение (оценка) геномной гомеологии, факультативности и апомиксисной стабильности, Ь) селекция растений, амфиплоидизация и процессы мутангенеза, с) способы генного картирования и клонирования и й) способы генетической инженерии.

Оценка геномной гомеологии, факультативности и стабильности апомиксиса

Особенностью данного изобретения является стабилизация апомиксиса у встречающихся в природе или искусственных апомиктов путем создания кариотипической (структурной) гетерозиготности. Это легко выполнимо, если апомикты получены из растений, размножающихся половым путем, путем отбора внутривидовых или межрасовых родительских линий, которые также соответствуют требованиям дивергенции в репродуктивных программах развития яйцеклетки, как указано в XVО 98/33374. Предпочитаемый метод оценки степени кариотипической гомеологии двух половых линий (рассматриваемых в качестве гибридизационных пар) включают в себя общепринятый геномный анализ, где произведенные гибриды и степень хромосомного спаривания оценивают в метафазе I в материнских клетках пыльцы (РМС). Ό.Κ.. Эе\уеу. Сепот1с апй Р1у1одепейс Ре1а1юп51пр5 атопд ΝοΠίι Ашепсап Регепша1 ТтФсеае, ίη ТЕ. Е51е5 е1 а1., Сгаккек апй СтакНапйк: 8у51ета11С5 апй Есо1оду (Ишуегайу οί Ок1а1юта Ргекк 1982). На диплоидном гибридном уровне гомеологичное хромосомное спаривание в РМСк часто сильно превышает то, что наблюдали при амфиплоидизации диплоидного гибрида. Р.Р-С. ‘№апд, Ап аккекктеШ оГ депоте апа1у§18 Ьакей оп скготоюте ратпд ш НуЬпйк оГ регепша1 ТтШсеае, 32 Сепоте 179-189 (1989). Следовательно, диплоидные гибриды даже с ограниченной степенью редуцированной хромосомной конъюгации в РМСк могут подходить для создания кариотипической гетерозиготности путем производства амфиплоида.

Факультативность измеряют в виде процента жизнеспособных семян, которые образуются половым путем из апомиктичного растения. Предпочитаемым способом для определения этого процента является проведение анализирования потомства, в котором потомство сравнивают с материнским растением. Современные методы молекулярного фингерпринтинга являются предпочтительными вследствие их надежности и простоты применения, когда системы оптимизированы. О. ЕеЬ1апс & А^ах/исаЮ, 8стеешпд Ргосейигек 1о 1йеп(Ну апй ОнапиГу Арот1хщ, т Υ. 8ау1йап & 1. Сагтап, Айуапсек ш Ароппхй Кекеатсй (РАО, ΟΜΜΥΤ, ОК.8ТОМ, в печати).

Степень стабильности оценивают путем проведения анализирования потомства в выбранных образцах, идентифицированных в первом поколении потомства. Совокупность потомства, члены которого являются апомиктичными как материнское растение, получают из генетически стабильного (кариотипически гетерогенного) апомиктичного материнского растения. Совокупность потомства, члены которого представлены высоким процентом половых ревертантов, поступает из генетически нестабильных апомиктов. Типично, искусственные, или встречающиеся в природе диплоидные апомикты, или встречаю

-12006658 щиеся в природе дигаплоидные апомикты, являются нестабильными. Искусственные или встречающиеся в природе полиплоидные апомикты могут или не могут быть стабильными.

Селекция растений, амфиплоидизация и мутагенез

Для нескольких целей настоящего изобретения применяли общепринятые методы размножения растений, как учили в стандартных текстах по селекции растений, например, РоеЫтаи, Втеейшд Г1е1й Сгорк (Уап №к1гапй Веш1ю1й 1987). Предпочтительным способом является увеличения генетического разнообразия и комбинирующей способности половых родительских линий, для производства апомиктичных диплоидов, или полиплоидов. Селекцию растений, или генетическую инженерию применяли, чтобы генетически модифицировать два набора трансдифференцированных родительских линий видов растений, или близкородственной группы видов растений, которые дифференцированы по их репродуктивному фенотипу, таким образом, что гибридизация любого растения одного из двух наборов трансдифференцированных линий с любым из растений из другого набора трансдифференцированных линий производит апомиктичное растение или растение, которое становится апомиктичным посредством амфиплоидизации или дальнейшей гибридизации. Комбинирующую способность родительских линий улучшали методами стандартного скрещивания и селекции, или методами простого скрещивания, двойного скрещивания или мультискрещивания (ауткроссинга), которые сопровождают внутри каждого набора трансдифференцированных линий.

Особенностью настоящего изобретения является трансдифференцировка новой гибридной селекционной системы, путем которой получают искусственно выведенные гибридные апомикты. Система (способ) вовлекает не только идентификацию половых инбредных родительских линий, которые выражают хорошую комбинационную способность, но и идентификацию гибридных или размноженных ауткроссингом родительских линий внутри двух наборов трансдифференцированных линий, таким образом, что эта хорошая комбинационная способность экспрессируется при гибридизации растения из одного из двух наборов трансдифференцированных линий с растением из другого набора трансдифференцированных линий. Таким образом, эта новая операционная система производит гибриды от скрещивания двух инбредных линий или множественного скрещивания, которые являются или апомиктичными, или становятся апомиктичными посредством амфиплоидизации или дальнейшей гибридизации. Таким образом, многие апомиктичные гибридные генотипы могут быть произведены (из каждого скрещивания). Кроме того, каждый индивидуальный генотип может быть наработан посредством апомиктичного образования семени для полевого испытания и/или выпуска культурного сорта растений. Следовательно, неограниченное число новых апомиктичных генотипов производят быстро. Этот метод сильно увеличивает генетическое разнообразие растений, применяемых в сельском хозяйстве, и сильно увеличивает возможность селекционеров для обеспечения разновидностями апомиктичных гибридов, которые специфически адаптированы к высоко- средне- или слабопродуктивным сельскохозяйственным регионам.

Особенность настоящего изобретения простирается на определение комбинационной способности для включения развития дивергентных, но высоко гетерозиготных половых родительских линий, которые при гибридизации (или гибридизации и амфиплоидизации) дают в результате апомиктичные растения с высшей гибридной силой. Генетически гетерогенное апомиктичное потомство, полученное от скрещиваний, в которые вовлекали гетерогенные родительские линии (половые или апомиктичные) (ауткроссинг), является индивидуально оцененным за агрономически желаемые качества и отобрано для размножения в виде культурного сорта растения. Также, преимуществом способа является скрещивание факультативно апомиктичного растения с генетически дивергентными половыми или апомиктичными линиями для производства производных линий с усиленными агрономическими признаками.

Для амфиплоидизации хромосомные наборы гибридов удваивали с использованием стандартных колхициновых методов, например, 1. ТогаЬше)ай е1 а1., Могр1о1оду апй Сепоте Апа1укек о! 1п!егкресйю НуЬпйк о! Е1утик ксагЬик, 29 Сепоте 150-55 (1987). Альтернативно, могут быть использованы недавно разработанные методы культуры тканей. О. ЬеЫапс е1 а1., Сйтотокоте ЭоиЬйпд ίη Тпркасит: Не РгойисЙоп о! АйШс1а1, 8ехиа1 Те(гар1о1й Р1аи1к, 114 Р1аи1 Вгеей, 226-30 (1995); Сойеи & Уао, 1и Уйго Сйтотокоте ЭоиЬйпд о! №пе 2ап1ейексЫа СиШуагк, 47 Р1ап1 се11 Т1кк. Огд. СиЙ. 43-49 (1996); С1а1ак & Ьедауе, Огухайп СотЬшей \νίΐ1ι АйуепШюнк ВедепегаПюп !ог ап ЕШаеп! С’йготокоте ИоиЫтд о! ТпйарЫй Κίмтйий, 16 Р1ап1 Се11 Вер, 97-100 (1996).

Частично амфиплоидные 2п+п (В_ш) гибриды часто образуются с низкой частотой (0,5 до 3%) при межвидовом возвратном скрещивании Г₁8, например, Ζ.\ν. Ьш е! а1., 89 Тйеог. Арр1. Сепе!. 599-605 (1994), и эта частота может быть намного выше, если у гибридов существует тенденция к апомиксису (образование нередуцированной яйцеклетки), как преподано в О. ЬеЫапс е! а1., Вергойисйуе Вейауют ш Ма1/е- Тпркасит Ро1уйар1о1й Р1ап!к: 1шр1юайопк !ог 1Ие ТгапкГег о! Арот1х1к 1п1о Мш/е, 87 1. Негей. 108111 (1996). Таким образом, предпочитаемым способом для удвоения хромосом внутривидовых и межвидовых гибридов является использование одного или многих методов обработки колхицином (или другим известным химическим ингибитором веретена), перечисленных выше. Также предпочитаемый метод удвоения хромосом внутривидовых гибридов включает возвратное скрещивание с одним из половых родителей и подсчет хромосом в кончиках корня, чтобы определить частичную амфиплоидию (обычно триплоидию). Это является тем, за которым следует возвратное скрещивание с другим родителем для

-13006658 получения полного амфиплоида, или с тем же самым родителем для получения частичного амфиплоида (три генома от одного родителя и один геном от другого). Амфиплоидизация может предшествовать гибридизации, или следовать за гибридизацией.

Традиционные методы мутационной селекции, как преподано в открытой печати, например, РоеН1тап, Втеейшд Пе1й Сторк (Уап №к!гапй РешНо1й 1987), применяют для индукции хромосомных инверсий или транслокаций, которые изолируют от рекомбинации участки хромосом, которые содержат гены, требуемые для апомиксиса. Предпочтительные методы включают регенерацию растений с хромосомной перестройкой из культур растительных тканей, 8. 1аш е! а1., 8отае1оиа1 Уапайоп апй 1пйисей Ми1айопк ίη Сгор 1троуетеп1, Сиггеп! Р1ап! 8с1епсе апй Вю!есНпо1оду ίη АдпсиНиге 32, (К1и\\'ег Асайетю РиЬНкйетк 1998), полученные растения с перестроенными хромосомами далее обрабатывают ионизирующей радиацией, Р.К. Сир!а, Ми1айоп Втеейшд ш Сегеа1к апй Ьедитек, ш 8.М. .Таш е! а1., Ситтеп! Р1ап! 8сшсе апй Вю!есНпо1оду ш АдпсиЙите 32 (К1и\уег Асайетю РиЬНкйетк 1998).

Использование мужских стерильных линий или процедур кастрации желательно, если растения не являются двудомными или самонесовместимыми. Гибриды производят между половыми видами или линиями, которые демонстрируют соответствующие степени дивергенции в фотопериодических ответах и в программах развития женских органов. Внутривидовые гибриды создают с использованием стандартных приемов, как преподано в текстах по растительной селекции, например, РоеЫтап, Втеейшд Г1е1й Сторк (1987). Успешное производство межвидовых или межродовых гибридов может нуждаться в спасительных процедурах обработки гормонами цветков соцветий и зародышей, как преподано в недавних ссылках, относящихся к широкой гибридизации, например, ΖΑΥ. Ьш е! а1., НуЬпйк апй Васксгокк Ртодешек ЬеАтееп УНеа! (Тпйсит аекйуит Ь.) апй АротюНс АикИаПап \УНеа!дгакк [Е1утик гес11ке1ык (№кк 1п Ьейт.) А. Ьоуе & Соппог]: КапоАрю апй Сепотю Апа1укек, 89 ТНеог. Арр1. Сепе!. 599-605 (1994). Гибриды проверяют путем проверки их промежуточного фенотипа.

Генное картирование и клонирование

Особенностью данного изобретения является вовлечение контроля факультативности путем модификации экспрессии локусов количественного признака (фТЬк), необходимых для факультативной экспрессии с использованием антисенсовой технологии. Предпочтительный метод начинается с картирования фТЬк дивергентных половых родительских репродуктивных фенотипов, ответственных за апомиксис, встречающихся у гибридов, произведенных путем скрещивания указанных фенотипов. Метод включает производство Г₂ картированной популяции, состоящей из Г₂ потомства, полученного половым путем, факультативного искусственного Е₁ апомикта, произведенного путем гибридизации исходных репродуктивно дивергентных родительских линий, и идентификации молекулярных маркеров, которые ассоциированы с каждым фенотипом, например, А.У. Неикйеп е! а1., Т1гее фТЬк Ггот Ьусореткюоп региУ1апит СопГег а Н|дН Ьеуе1 оГ Рек1к!апсе !о С1ау1Ьас1ет ткЫдапекщ ккр. МкЫдапекщ, 99 ТНеог. Арр1. Сепе!. 1068-1074 (1999). Важные фТЬк затем точно картировали для данной хромосомы при помощи большой сегрегированной популяции и искусственных хромосом дрожжей (УАСк), окружающий участок хромосомы изолировали с использованием фланкирующих маркеров. Затем производили космидный клон, содержащий фТЬ, комплементные космиды идентифицировали путем трансформации в мутант. фТЬ транскрипт идентифицировали путем выделения кДНК с использованием комплементных космид, например, Н.ф. Ьшд е! а1., Мар-Ьакей С1ошпд оГ СЫотопетуа, а депе 1пуо1уей ш 1гоп Ир!аке оГ Н|дНег Р1ап!к Епсойшд Мсойапатше 8уп1йаке, 96 Ргос. №Г1 Асай. 8сГ И8А 7098-7103 (1999); Е.8. ЬадийаН е! а1., Мар-Ьакей С1ошпд оГ а Сепе 8ес.|иепсе Епсойшд а №с1еоййе-Ьшйшд Поташ апй а Ьеисте-псН Ведюп а! !Не СгеЗ №та!ойе Рек1к!апсе Ьосик оГ ХУНеаН 40 Сепоте 659-665 (1997). Альтернативно могут быть использованы бактериальные искусственные хромосомы (ВАСк), с которыми гораздо легче работать, для клонирования основанного на картировании. ВАС библиотеки получены для многих видов зерновых, например, 8.8АУоо е! а1., Сопкйисйоп апй СНагас!епха!юп оГ а Ьас!епа1 АгиПс1а1 СНготокоте Ь1Ьгагу оГ 8огдНит Ь1со1ог, 22 №с1ек Ас1йк. Век. 4922-4931 (1994).

Генетическая инженерия

Особенностью настоящего изобретения является контроль степени факультативности путем контролирования экспрессии фТЬ, важной для факультативной экспрессии. Другой особенностью данного изобретения является преобразование навсегда (или обратимо) факультативных апомиктов в облигатных апомиктов путем контроля экспрессии мейоз-специфичных генов.

Предпочтительным методом для совершенного облигатного апомиксиса явлется выведение или преобразование факультативно апомиктичного растения таким образом, чтобы оно содержало генетический материал, который вызывает прерывание женского мейоза, приводящее по существу к 100% образованию апомиктичных семян. Генетический материал может быть мейотическим мутантом, введенным посредством селекции, или трансгенной конструкцией промотор/ген, экспрессиия которой прерывает женский мейоз. Индуцибельная даун-регуляция трансгенной, конструкции промотор/ген, генная конструкция которой при экспрессии вызывает мейотическое абортирование, который позволяет существовать факультативному апомиксису. Альтернативно, факультативный апомиксис может возникнуть кроме как в течение индуцибельной ап-регуляции трансгенной конструкции промотор/ген, вызывая таким образом, мейотическое абортирование и по существу 100% апомиктичное образование семян.

-14006658

Конструкция промотор/ген может содержать промотор из группы промоторов, которые экспрессируются непосредственно перед или во время женского мейоза и генную конструкцию, экспрессия которой фатально прерывает мейоз, например, ν.Ι. КНтуик & 6.Ό.Ο. бопех, АЮМС1. Р1е ЛгаЬ1бор818 1юто1одие о£ Не уеазР ЭМС1 депе: сйагасРепхаиоп, Ргапзрозоп-тбисеб а11е11с уапаРюп апб тею818-а88ос1аРеб ехргеззюп, 11 Р1апР б. 1-14 (1997); РСТ/ОВ97/03546. Трансгенный материал, который в норме является цитотоксичным для развития женского мейоцита может быть проконтролирован посредством суппрессорной молекулы, кодируемой геном, который контролируется химически индуцибельным промотором, который может быть специфическим промотором к женскому мейоциту, таким образом, что женская фертильность (факультативность) является индуцибельной в таком апомикте. Трансгенный материал может содержать ген из группы смысловых или антисмысловых генов, экспрессия которых во время мейоза фатально нарушает мейоз или является иным образом цитоксичной для женского мейоцита. Кроме того, метод для восстановления низкого уровня женской раздельнополости у трансгенно-полученного облигатного апомикта может вовлечь экспрессию суппрессора путем индукции индуцибельного промотора. Для введения трансгенного материала в растение-хозяина можно применить любой доступный метод хорошо известный в данной области.

Примеры

Некоторые из особенностей данного изобретения могут быть лучше оценены посредством ссылки на конкретные примеры. Должно быть понятным, что следующие примеры являются по характеру скорее иллюстративными, чем ограничивающими, и они предназначены, чтобы продемонстрировать основные учения и концепции данного изобретения, а не ограничивать изобретение. Ожидается, что специалист в данной области сумеет использовать информацию, содержащуюся в примерах и в другом месте здесь, чтобы применить настоящее изобретение к ситуациям, конкретно здесь не описанным.

Пример 1. Селекция линий, подходящих для синтезирования стабильных апомиктичных растений.

Особенность настоящего изобретения состоит в предоставлении процедур для отбора половых линий внутри первичных, вторичных или третичных пулов зародышевой плазмы данной сельскохозяйственной культуры с целью синтезирования стабильных факультативно апомиктичных растений (тех, которые непросто образуют половые сегреганты) из растений с половыми признаками или нестабильных факультативно апомиктичных растений. В этом примере иллюстрируют предпочтительные процедуры для использования на растениях из подкласса О1соРу1ебопае, а именно, половых видов из рода ЛпРеппапа и из подкласса Мопосо1у1ебопае, а именно, половых видов из родов Тпрзасит и Зогдкит. Ожидается, что специалист в данной области сможет успешно применить эти процедуры ко многим другим сельскохозяйственным культурам, например, рису, сахарной свекле, яблоне, вишне, томатам, сое и салату.

Сейчас предпочтительной процедурой отбора подходящих половых родительских линий является (а) идентификация, из литературы, или из областей изучения, природных экотипов и немелиорированной земли, расе данных видов сельскохозяйственных культур и их близкородственных видов, которые различаются в отношении к тенеустойчивости, широте, фотопериодическим требованиям для цветения, высоте над уровнем моря и предпочитаемым увлажненностям, (Ь) цитоэмбриологическая характеристика физиологически и экологически дивергентных линий путем соотношения стадий мегаспорогенеза и развития зародышевого мешка со стадиями развития интегумента и массы завязи, (с) характеристика и статистический анализ цитоэмбриологических различий между линиями и (б) отбор линий, которые являются дивергентными физиологически (например, фотопериодизм), цитоэмбриологически и таксономически. В общем, растения, классифицированные как различные виды, например, пары растений, чьи гибриды являются стерильными, должны обладать достаточной геномной гомеологией, чтобы обеспечить кариотипичную гетерозиготность, если гибрид, произведенный между ними, является амфиплоидизированным.

Половые диплоиды и полиплоиды у ЛпРЪепапа, Тпрзасит и Зогдкит соответствуют географическим, физиологическим, экологическим, цитоэмбриологическим и таксономическим критериям, перечисленным здесь, для создания генетически стабильных факультативно апомиктичных растений из растений с половыми признаками. В пределах всей горы Роки в Кордильерах, от полярного круга северозападной территории Канады до границы США с Мексикой есть многочисленные разновидности половых ЛпРеппапа, которые коллективно оккупируют широкий диапазон ареалов, но часто индивидуально сужены до специфичных ареалов. Вауег, 132 Орега ВоРашса 53-65 (1996). Значительные различия в синхронизации мейоза относительно развития интегумента наблюдали среди этих видов (фиг. 2 и 3). В пределах Америки от 42° северной до 24° южной широты находятся многочисленные разновидности половых Тпрзасит, которые также коллективно оккупируют широкий диапазон ареалов, но часто индивидуально сужены до специфических ареалов. Эе VеР еР а1., ЗузРетайсз о£ Тпрзасит басРу1о1без (Огаттеае), 69 Лтег. б. ВоР. 1251-57 (1982). Существенные различия в синхронизации мейоза относительно развития интегумента, сходные с теми, которые наблюдали среди подвидов ЛпРеппапа, наблюдали также среди этих видов (данные не представлены). Систематизация в пределах большей части Африканского континента, Австралии и Южной Азии показывает, что многочисленными являются половые диплоидные и полиплоидные экотипы, расы и виды 8огд1шт. Существенные различия в синхронизации мейоза относительно развития интегумента также наблюдали среди этих видов (фиг. 4 и 5). Отбор подходящих половых линий для создания факультативно апомиктичных растений может быть сделан из этих данных.

-15006658

Предполагают, что процедуры сбора, характеризации и отбора для частичного изменения всяких однодольных и двудольных будут оценены по достоинству.

Пример 2. Создание генетически стабильных факультативных и облигатных апомиктов.

В качестве инструкций использовали приемы примера 1 для получения трех и более половых линий с ранним мейозом и ранним развитием гаметофита относительно развития интегумента(-ов). Те же приемы использовали в качестве инструкций для получения трех и более половых линий близкородственных видов с поздним мейозом и поздним развитием гаметофита относительно развития интегумента(-ов). Отбирали несколько линий из каждой категории, так чтобы образование зародышевого мешка в одном наборе линий происходило приблизительно в то же время как и профаза в раннем мейозе в другом наборе линий относительно развития интегумента(-ов). Пары родительских линий (по одному растению из каждой из двух групп) гибридизировали и амфиплоиды производили, применяя стандартные процедуры, описанные выше. Будет оценено то, что генетический фон, из которого получали линии, может влиять на экспрессию апомиксиса. Таким образом, может быть необходим отбор или создание дополнительных линий, объединяющих различные генетические фоны и большее или меньшее расхождение в сроках мейоза.

Факультативные апомикты, которые являются нестабильными, означающие, что они производят половых сегрегантов в результате факультативной половой репродукции, синтезировали в результате цветковой асинхронии, полученной в результате гибридизации, посредством создания искусственных диплоидных гибридов разновидностей Лп1сппапа согутЬоза (2х половой) х А.гасетоза (2х половой) (фиг. 6) и искусственных диплоидных гибридов разновидностей 8огдНит (2х половой) (фиг. 7). Апоспоровые зародышевые-мешки образуются у гибридов 8ог§йит 5-1 X 4-1 и 9-1 X 1-2 с частотой около 5% и диплоспоровые зародышевые мешки, сходные с таковыми у Тпрзасит (фиг. 8), образуются у гибридов 8огдНит 5-2 X 9-2 с частотой около 10%. Отмечают, что дивергенция в сроках мейоза относительно развития интегумента является существенной (фиг. 5) у родительских пар, чье потомство образует диплоспоровые зародышевые мешки.

Структурно гетерозиготные (стабильные) факультативные апомикты могут быть произведены от внутривидовых гибридов Лп1еппапа и 8огд1шт путем удвоения их наборов хромосом с использованием способов, описанных выше. Стабилизация внутривидовых гибридов 8огд1шш (указанных выше) требует генетической модификации, которая вызывает абортирование женского мейоза, или образование мейотической клетки, которая не только стабилизирует апомикты, но и делает их облигатными. Это достигается внедрением мейотического мутанта в линию посредством стандартных методов гибридизации, индуцированием триплоидии посредством В_ш гибридизации, или амфиплоидизацией с последующей гибридизацией с диплоидом, или трансформацией диплоида конструкцией промотор/ген, которая является цитотоксичной для женского мейоцита, применяя способы, рассмотренные выше. С использованием индуцибельных промоторов, как рассмотрено выше, могут быть произведены генетически стабильные апомикты с индуцированной облигатной или факультативной экспрессией.

Искусственный амфиплоид диплоида Тпрзасит 1ахит (2х половой) Х Т.рйозит (2х половой) является стабильным факультативным апомиктом с 50% образованием диплоспорового зародышевого мешка (фиг. 8). Скрещивание этого растения с Т. хорПоЮпке (2х половой) или с Т. Ьгауит (2х половой) производит стабильные облигатные апомикты с приблизительно 80% образованием диплоспорового зародышевого мешка и с 20% образованием абортивного мейоцита или образованием зародышевого мешка половым путем (фиг. 9).

Пример 3. Картирование и клонирование генов, ответственных за факультативность.

Генетические анализы апомиксиса проводили путем опыления половых растений пыльцой из апомиктичных растений и подсчетом яйцеклеток в потомстве при половом или апомиктичном развитии. Обычно в этих исследованиях, если обнаруживали любые апомиктично развивающиеся яйцеклетки, потомство считали апомиктичным. Например, Υ. 8ау|йап, Ыа!иге е! Негеййе йе 1=арот1х1е скех Рапюит тахипит 1асс.|., РЮ (Нему Ишуегзйе Рапз XI, Бгаисе (1982); 8. Ьийз е! а1., Ма1е апй £ета1е 8рого§епе818 апй §ате1о§епе818 т аротюйс ВгасЫапа Ьп/апШа, ВгасЫапа йеситЬез апй Б₁ НуЬгййк χνίΐΐι зехиа1 со1сЫсте тйисей 1е!гар1о1й ВгасЫапа ги7171еп818, 78 Еирйуйса 19-25 (1994); С.В. Ио Уа11е & Т\¥. Мйез, Вгеейтд о£ аротюйс зреЫез, т Υ. 8ау1йап е! а1., Айуапсез ш Арот1х18 Везеагсй (2000); Р. О/1а5-Лкт8 е! а1., 95 Ргос. МаГ1 Асай. 8ск И8А 5127-5132 (1998), собрали растения в апомиксисную категорию, в которой проценты яйцеклеток, развивающихся апомиктично, были ниже чем 12, 28, 17 и 7%, соответственно. Что же произошло в этих исследованиях (было это намеренно или нет), была идентификация минимального числа сцепленных групп, требуемых для кодирования, по меньшей мере, некоторой степени функционального апомиксиса. В некоторых случаях наблюдали пробелы среди потомства в процентном отношении яйцеклеток, экспрессирующих апомиксис, М. Ии)агйт & Наппа, Аротюйс апй зехиа1 реаг1 тй1е! X РепЫзеЫт 8циати1а1ит НуЬг1й8, 74 I. Негей. 277-279 (1983), но в других случаях диапазон экспрессии был кое-где продолжительным, 8. Ьийз е! а1., 78 Еирйуйса 19-25 (1994). Следовательно полагают, что несколько мажорных и, возможно, минорных генов с количественными эффектами (Υ. 8ау1йап, ЫаЫге е! йегеййе йе 1=арот1х1е скех РаЫсит тахипит 1асс.|., РЮ 1йе818, ИЫуегзйе Рапз XI, Бгапсе (1982); 8. Ьийз е! а1., 78 ЕрНуйса 19-25 (1994)) затрагивают факультативность (степень экспрессии) апомиксиса.

-16006658

Особенность данного изобретения состоит в ап-регуляции или даун-регуляции факультативности посредством модификации экспрессии ОТБб с применением антисмысловой технологии. С применением способов, описанных выше, проводят ОТБ картирование для дивергентных половых родительских репродуктивных фенотипов, ответственных за апомиксис, который происходит в гибридах (фиг. 2-5). Важные ОТЬъ затем тонко картировали для данной хромосомы и идентифицировали, как описано выше.

Пример 4. Создание генетически стабильных высокофакультативных апомиктов с идуцибельной облигатной экспрессией или генетически стабильных облигатных апомиктов с индуцибельной высокофакультативной экспрессией.

Приемы примеров с 1 по 3 применяли как руководства для создания генетически стабильных высокофакультативных апомиктов с индуцибельной облигатной экспрессией или генетически стабильных облигатных апомиктов с высокофакультативной экспрессией.

В настоящем изобретении апомиксис является аналогичным компьютерной операционной системе. Особенности этой «биологической операционной системы» включают следующее: (1) на фермерских полях четкое клонирование гибридов из собственно гибридных семян - поколение за поколением, (и) в растительных селекционных питомниках, частичная раздельнополость для улучшения растения с последующей реверсией к строгому апомиксису, (ш) большое количество быстро производимых и генетически разнообразных культурных сортов растений, специально приспособленных к разнообразным сельскохозяйственным нишам, (ίν) увеличение в целом генетического разнообразия для защиты против обложного опустошения вредителями, и (ν) выигрышное снижение расходов, а именно, фермеры платят меньше за семена и семеноводческие компании платят меньше на развитие превосходных разновидностей сельскохозяйственных культур.

Следует отметить, что настоящее изобретение может быть воплощено в других специфических формах без отклонения от его духа или существенных характеристик, которые находятся в раскрытии пяти принципов ΗΡΑ теории. Описанные стадии и материалы должны быть рассмотрены во всех отношениях только как иллюстративные, а не ограничительные, а объем изобретения указан в прилагаемой формуле изобретения, а не в приведенном описании. Все изменения, в пределах значения и эквивалентности формулы изобретения должны входить в ее объем.

Claims (23)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения апомиктичного растения, проявляющего повышенную генетическую стабильность апомиксиса, от покрытосеменного апомиктичного родительского растения, которое проявляет генетическую нестабильность апомиксиса, предусматривающий:

   (a) измерение степени генетической нестабильности апомиксиса родительского растения;

   (b) если родительское растение проявляет генетическую нестабильность апомиксиса, получение одного или нескольких растений-потомков от родительского растения, где каждое из растений-потомков содержит двойной хромосомный набор родительского растения;

   (c) измерение степени генетической нестабильности апомиксиса одного или нескольких растенийпотомков;

   (й) сравнение степени генетической нестабильности апомиксиса одного или нескольких растенийпотомков со степенью генетической нестабильности апомиксиса родительского растения и (е) селекцию по меньшей мере одного из одного или нескольких растений-потомков, проявляющих повышенную генетическую стабильность апомиксиса по сравнению с родительским растением.
2. 2. Способ по п.1, где одно или несколько растений-потомков получают обработкой родительского растения ингибитором веретена.
3. 3. Способ по п.2, где ингибитор веретена представляет собой колхицин.
4. 4. Способ по п.1, где одно или несколько растений-потомков получают культивированием родительского растения или его части в тканевой культуре.
5. 5. Способ по п.1, где одно или несколько растений-потомков получают:

   (a) самоопылением родительского растения или скрещиванием родительского растения с другим растением того же вида, рода или семейства и получением первого потомства и (b) подсчет хромосом в первом потомстве и выбор амфиплоида или частичного амфиплоида, имеющего все хромосомы от родительского растения в случае самоопыления такого родительского растения или все хромосомы от родительского растения и один или несколько наборов хромосом от другого растения того же вида, рода или семейства, или все хромосомы от другого растения того же вида, рода или семейства и один или несколько наборов хромосом от родительского растения в случае скрещивания родительского растения с другим растением того же вида, рода или семейства.
6. 6. Способ по п.5, дополнительно предусматривающий обратное скрещивание частичного амфиплоида с родительским растением или с другим растением того же самого вида, рода или семейства и получение от них второго потомства и селекцию амфиплоида, имеющего равный (четный) уровень плоидности.
7. 7. Способ по п.5, где частичный амфиплоид является эуплоидом или анэуплоидом.

   -17006658
8. 8. Способ по п.5 или 6, где амфиплоид является эуплоидом или анэуплоидом.
9. 9. Способ по любому из пп.1-8, дополнительно предусматривающий повышение фертильности выбранных растений-потомков путем самоопыления или гибридизации с другим растением, получение от них семян, высевание указанных семян, и селекцию полученных половым путем апомиктичных гибридных растений, которые обнаруживают повышенную частоту не сниженной фертильности яйцеклеток или партеногенез.
10. 10. Способ получения апомиктичного сегментного аллополиплоидного растения, проявляющего повышенную генетическую стабильность апомиксиса, от покрытосеменного межсортового гибридного растения, которое проявляет генетическую нестабильность апомиксиса, предусматривающий:

    (a) измерение степени генетической нестабильности апомиксиса межсортового гибридного растения;

    (b) если межсортовое гибридное растение проявляет генетическую нестабильность апомиксиса, получение одного или нескольких растений-потомков от межсортового гибридного растения, где каждое из растений-потомков содержит двойной хромосомный набор межсортового гибридного растения, приводя к появлению одного или нескольких апомиктичных сегментных аллополиплоидных растений;

    (c) измерение степени генетической нестабильности апомиксиса одного или нескольких апомиктичных сегментных аллополиплоидных растений и (ά) сравнение степени генетической нестабильности апомиксиса одного или нескольких апомиктичных сегментных аллополиплоидных растений со степенью генетической нестабильности апомиксиса межсортового гибридного растения для проверки того, увеличена ли генетическая стабильность апомиксиса одного или нескольких апомиктичных сегментных аллополиплоидных растений по сравнению с межсортовым гибридным растением.
11. 11. Способ по п.10, дополнительно предусматривающий повышение фертильности одного или нескольких апомиктичных сегментных аллополиплоидных растений путем их самоопыления или гибридизации с другим растением, получение от них семян, высевание указанных семян и селекцию полученных половым путем апомиктичных сегментных аллополиплоидных растений, которые обнаруживают повышенную частоту не сниженной фертильности яйцеклеток или партеногенез.
12. 12. Способ получения апомиктичного аллополиплоидного растения, проявляющего повышенную генетическую стабильность апомиксиса, от покрытосеменного межвидового гибридного растения, проявляющего генетическую нестабильность апомиксиса, предусматривающий:

    (a) измерение степени генетической нестабильности апомиксиса межвидового гибридного растения и (b) получение одного или нескольких апомиктичных аллополиплоидных растений-потомков от указанного межвидового гибридного растения и селекцию апомиктичного аллополиплоидного растенияпотомка, проявляющего повышенную генетическую стабильность апомиксиса.
13. 13. Способ по п.12, дополнительно предусматривающий повышение фертильности выбранного апомиктичного аллополиплоидного растения-потомка путем самоопыления или гибридизации с другим растением, получение семян, высевание указанных семян и селекцию полученных половым путем апомиктичных аллополиплоидных растений, которые обнаруживают повышенную частоту не сниженной фертильности яйцеклеток или партеногенез.
14. 14. Способ получения апомиктичного растения, проявляющего повышенную генетическую стабильность апомиксиса, от покрытосеменного, внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения, проявляющего генетическую нестабильность апомиксиса, предусматривающий:

    (a) измерение степени генетической нестабильности апомиксиса внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения и (b) получение апомиктичных аутополиплоидных, сегментных аллополиплоидных или аллополиплоидных растений-потомков внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения и селекцию апомиктичного растения, проявляющего повышенную генетическую стабильность апомиксиса.
15. 15. Способ по п.14, дополнительно предусматривающий повышение фертильности отобранного апомиктичного растения путем самоопыления или гибридизации с другим растением, получение семян, высевание указанных семян и селекцию полученных половым путем апомиктичных растений-потомков, которые обнаруживают повышенную частоту не сниженной фертильности яйцеклеток или партеногенез.
16. 16. Способ генетической стабилизации апомиксиса покрытосеменного, апомиктичного, внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения, проявляющего генетическую нестабильность апомиксиса, предусматривающий измерение степени генетической нестабильности апомиксиса внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения и получение растения-потомка от указанного апомиктичного внутривидового, межсортового или характеризуется нечетным увеличением плоидности, причем женский мейоз обычно прерывается, приводя к практически 100% образованию апомиктичных семян.
17. 17. Способ по п.16, дополнительно предусматривающий повышение фертильности растенияпотомка путем самоопыления или гибридизации с другим растением, получение от них семян, высевание

    -18006658 семян и селекцию полученных половым путем апомиктичных растений, которые обнаруживают повышенную частоту не сниженной фертильности яйцеклеток или партеногенез.
18. 18. Способ генетической стабилизации апомиксиса покрытосеменного, апомиктичного, внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения, проявляющего генетическую нестабильность апомиксиса, предусматривающий измерение степени генетической нестабильности апомиксиса внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения и скрещивание этого внутривидового, межсортового или межвидового гибридного растения с мейотическим мутантным растением того же самого вида, рода или семейства и селекцию потомства, где женский мейоз обычно прерывается, приводя к практически 100% образованию апомиктичных семян.
19. 19. Способ по п.18, дополнительно предусматривающий повышение фертильности отобранного потомства путем самоопыления или гибридизации с другим растением, получение от них семян, высевание указанных семян и селекцию полученных половым путем апомиктичных растений-потомков, которые обнаруживают повышенную частоту не сниженной фертильности яйцеклеток или партеногенез.
20. 20. Способ получения апомиктичного растения, проявляющего повышенную генетическую стабильность апомиксиса от покрытосеменного апомиктичного родительского растения, которое проявляет генетическую нестабильность апомиксиса, предусматривающий:

    (a) измерение степени генетической нестабильности апомиксиса родительского растения;

    (b) получение растения-потомка от родительского растения путем удвоения числа хромосом указанного родительского растения или введения хромосомной аберрации, в котором рекомбинация подавляется, так что тормозится сегрегация аллелей во время мейоза; и (c) измерение степени генетической нестабильности апомиксиса растения-потомка для проверки того, что такое растение проявляет повышенную генетическую стабильность апомиксиса по сравнению с родительским растением.
21. 21. Способ по п.20, где указанная хромосомная аберрация предусматривает транслокацию.
22. 22. Способ по п.20, где указанная хромосомная аберрация предусматривает инверсию.
23. 23. Способ по любому из пп.18-22, дополнительно предусматривающий повышение фертильности растения-потомка путем самоопыления или гибридизации с другим растением, получение от них семян, высевание указанных семян и селекцию полученных половым путем апомиктичных растений-потомков, которые обнаруживают повышенную частоту не сниженной фертильности яйцеклеток или партеногенез.

    Свободно вые растения

    Преапомиксис Дифференцировка половых экотипов и видов по экологическим градиентам

    Стадия I Стадия II

    a. Ухудшение климата а. Стабилизация

    b. Гибридизация, происход- апомиксиса ящая в результате вторичных Ь. Улучшение контактов, выражающаяся в климата цветковой асинхронии (апомиксис)

    Стадия III

    a. Периодический ауткроссинг апомиктов с половыми формами

    b. Дифференцировка агамного комплекса

    Стабилизированный агамный комплекс (в основном полиплоидный)

    Генетически стабилизированные апомикты (обычно полиплоиды)