CN1913773A - Ogura胞质雄性不育芸苔属植物的改良的育性恢复及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含独特重组事件的芸苔属植物，该重组事件源于来自Ogura萝卜(Raphanus sativus)的核酸片段在育性恢复基因座和芥子油苷基因座之间的位置断裂并随后重新连接以产生新的重组事件BLR1。BLR1重组事件表达由源于萝卜的育性恢复基因的表达所致的育性恢复以及不高于正常双低开放传粉品种的GSL含量。芸苔属植物自交系BLR－038，保藏号NCIMB－41193，是含有BLR1重组事件的植物的一个例子。使用本领域技术人员已知的育种技术，可以将BLR1重组事件渐渗入不同的芸苔属植物遗传背景中。例如，芸苔属植物自交系BLR－038或含有BLR1重组事件的其它芸苔属植物可以与雄性不育自交系杂交，以产生表达低GSL含量和优良农艺性状的杂种。

Description

Ogura胞质雄性不育芸苔属植物的 改良的育性恢复及方法
                        技术领域
本发明涉及用于Ogura胞质雄性不育芸苔属植物的新育性恢复基因座。
                        背景技术
油籽油菜(欧洲油菜，Brassica napus)，也称作canola(每年一季春季型)或冬油籽油菜(每年两季型)，源于甘蓝(B.oleracea)和芸苔(B.campestris)的种间杂交。芸苔属植物的种间育种是普遍的。一般地，冬季型油籽油菜生长在欧洲西北部，而春季型主要生长在加拿大、中国、印度、澳大利亚和南美。
油籽油菜正在成为日益重要的作物，其因食用油和工业油用途以及其富含蛋白质的籽粉而得到重视。因种子中存在称作芥子油苷类(GSL)的含硫化合物，妨碍了人们对油菜籽粉在动物营养方面的应用的广泛接受性。由于芥子油苷类在油的提取和消化过程中会在酶切割作用下导致产生反营养的(antinutritional)分解产物，故芥子油苷类在芸苔属植物种子中是不希望有的。尽管在20世纪70年代早期通过引入具有占总脂肪酸谱百分比不足2％的芥子酸(单零品质，single zeroquality)的油籽油菜品种开发了优良的食用油，但高蛋白粉中芥子油苷类的持续存在仍然是进一步扩大市场的主要限制因素。
目前，欧洲法律设定的无GSL油籽油菜品种的最大阈值是在9％湿度下每克(g)种子25μmol总芥子油苷(GSL)(EU法令2294/92)。加拿大种植的双低春canola品种需要具有每克空气干燥的无油粉小于30μmol芥子油苷类的GLS水平。欧洲和加拿大普遍种植的双零油籽油菜品种的GSL水平不同，显著低于阈值水平，处在官方阈值水平的60％或甚至更低。目前，种子具有低GSL含量的、基于Ogura杂种系统的杂种芸苔属植物表达较差的农艺性状，例如较低的种子产量、不良的疾病抗性和倒伏易感性。
细胞质雄性不育(CMS)或细胞核雄性不育(NMS)芸苔属植物作为雌性亲本。SI植物由于遗传组成而不能自花传粉，CMS和NMS雌性植物不能产生花粉。因此，所有这些植物均必须由雄性亲本异花传粉。许多CMS系统用于芸苔属植物的杂种种子生产：Polima(pol)，nap，tournefortii，Kosena，和Ogura(ogu)。(见例如Ogura(1968)Mem.Fac.Agric.Kagoshima Univ.6：39-78；Makaroff(1989 Journalof Biol.Chem.264：11706-11713；美国专利号5,254,802)。被认为是最有用的ogu系统所基于的是：使用来源于萝卜(Raphanussativus)细胞质的雄性不育决定子(malesterility determinant)。由Ogura CMS雌性芸苔属植物与正常雄性芸苔属植物杂交产生的F1种子将是雄性不育的。换言之，从F1种子长成的植物将不产生花粉。为了产生雄性能育的F1代植物，在F1杂种的雄性亲本中必须存在恢复基因。
法国Rennes的Institut National de la Recherche Agronomique(INRA)将育性恢复基因座由萝卜转移到芸苔属CMS植物中(Pelletier等，1987，Proc 7th.Int.Rapessed Conf.Poznan，Poland：113-119)。WO92/05251以及Delourme等((1991)Proc.8th.Int.Rapeseed Conf.Saskatoon，加拿大：1506-1510)描述了来源于萝卜的恢复基因(Rf)。携带此Rf基因的最初恢复近交系和杂种表达升高水平的芥子油苷并且结籽减少(Pellan-Delourme和Renard，1988 Genome 30：234-238，Delourme等，1994 Theor.Appl.Genet.88：741-748)。在Ogu Rf杂种植物的种子中，甚至当雌性亲本已经降低了芥子油苷含量时，芥子油苷水平仍升高。在围绕Rf基因的萝卜染色体区域的重组在芸苔属植物中被抑制，因此在该区域中难于获得不同的重组事件。Rf基因和芥子油苷基因座之间的连锁已经被打破(WO 98/27806)。然而，打破芥子油苷基因和恢复基因之间的连锁并且仍保持品系的稳定性和生产高价值商业杂种种子的优良配合力(combining ability)是困难的。因此，需要开发解开恢复基因与芥子油苷基因间的连锁并保持芸苔属植物产生高价值商业杂种种子的能力的重组事件。
                        发明内容
本发明提供包含如下重组事件的芸苔属植物，所述重组事件由沿着核酸区段在来源于Ogura萝卜(Raphanus sativus)的Ogura胞质雄性不育的育性恢复基因座与芥子油苷基因座之间发生断裂和随后重连接产生新核酸区段所导致，在本文中称作BLR1重组事件。
在一个实施方案中，本发明涉及包含包括Ogura胞质雄性不育的育性恢复基因座的DNA片段的芸苔属植物，其中所述DNA片段能够通过至少一个第2仓(bin)标记鉴定，但不能被至少一个第3仓标记检测到。
在一个实施方案中，本发明涉及包含包括Ogura胞质雄性不育的育性恢复基因座的DNA片段的芸苔属植物，其中所述DNA片段能够通过至少一个第2仓标记鉴定，但不能通过任何第3仓标记鉴定。
在一个实施方案中，本发明涉及包含包括Ogura胞质雄性不育的育性恢复基因座的DNA片段的芸苔属植物，其中所述DNA片段能够通过所有的第2仓标记但不能通过任何第3仓标记鉴定。
在另一实施方案中，本发明涉及根据本发明的包含包括Ogura胞质雄性不育的育性恢复基因座的DNA片段的芸苔属植物，其中第2仓由选自下组的标记组成：E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2，第3仓由选自OPY17、OPN20和E8M1-2的标记组成。
在再一实施方案中，本发明涉及根据本发明的芸苔属植物，其中上述标记在聚合酶链式反应中可以分别使用1159和1160；E 2和M14；E3和M1；E4和M14；E5和M1；E5和M4；E8和M14所代表的引物对进行扩增。上述引物分别地基本上由SEQ ID NO：13(1159)、SEQ IDNO：14(1160)、SEQ ID NO：25(E2)、SEQ ID NO：26(M4)、SEQ IDNO：29(E3)、SEQ ID NO：30(M1)、SEQ ID NO：32(E4)、SEQ ID NO：28(M14)、SEQ ID NO：33(E5)和SEQ ID NO：37(E8)中的核苷酸序列表征。
在一个特定实施方案中，本发明涉及根据本发明的芸苔属植物，其中所述标记在聚合酶链式反应中可以分别使用PR0004F和PR0004R；1135和1136；及E8和M1所代表的引物对进行扩增。以上引物分别地基本上由SEQ ID NO：19(PR0004F)、SEQ ID NO：20(PR0004R)、SEQID NO：3(1135)、SEQ ID NO：4(1136)、SEQ ID NO：37(E8)和SEQID NO：30(M1)中给出的核苷酸序列表征。
另一实施方案中，本发明涉及包含包括恢复基因的DNA片段的本发明芸苔属植物，其中所述DNA片段是BLR1重组事件。
在一个特定实施方案中，本发明芸苔属植物是自交(inbred)植物。
在再一特定实施方案中，本发明芸苔属植物是杂种植物。
另一实施方案中，本发明涉及本发明芸苔属植物，所述植物包含包括Ogura胞质雄性不育的育性恢复基因座的DNA片段，其中所述DNA片段是BLR1事件并且所述BLR1重组事件可以从芸苔属自交系BRL-038获得，所述自交系BLR-038的种子样品已经保藏在NCIMB，保藏号NCIMB 41193。
在再一实施方案中，本发明涉及检测包含Ogura胞质雄性不育的育性恢复基因座的芸苔属植物的方法，包括步骤：
a)从芸苔属植物获得样品；
b)在所述样品中检测能够使用第2仓标记但不能被第3仓标记鉴定的DNA片段。
一个实施方案中，本发明涉及检测包含恢复基因的芸苔属植物的方法，包括步骤：
a)从芸苔属植物获得样品；
b)在所述样品中
i)通过使用至少一个第2仓标记，但不能通过至少一个第3仓标记；
ii)通过使用至少一个第2仓标记，但不能通过任何第3仓标记；
iii)通过使用所有第2仓标记，但不能通过任何第3仓标记检测到DNA片段。
另一实施方案中，根据本发明检测芸苔属植物的方法还包括步骤c)：选择含有所述DNA片段的所述芸苔属植物或其部分。
另一实施方案中，根据本发明检测芸苔属植物的方法还包括步骤d)：使包含所述DNA片段的所述芸苔属植物自交。
再一实施方案中，根据本发明检测芸苔属植物的方法还包括步骤e)：使所述芸苔属植物与另一芸苔属植物杂交。
一个实施方案中，本发明涉及根据本发明检测芸苔属植物的方法，其中所述DNA片段包含BLR1重组事件。
另一实施方案中，本发明涉及根据本发明检测芸苔属植物的方法，其中步骤b)中所述第2仓标记包含选自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的标记。
一个特定实施方案中，本发明涉及根据本发明检测芸苔属植物的方法，其中步骤b)中所述第2仓标记与选自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的标记部分同源。
另一实施方案中，本发明涉及根据本发明检测芸苔属植物的方法，还包括步骤f)：在所述样品中检测能够使用引物1159和1160通过PCR扩增获得但不能通过引物PR0004F和PR0004R扩增的DNA片段，并且其中所述标记分别地基本上由SEQ ID NO：13(1159)、SEQ ID NO：14(1160)和SEQ ID NO：19(PR0004F)、SEQ ID NO：20(PR0004R)中给出的核苷酸序列表征。
一个实施方案中，本发明涉及用于检测BLR1重组事件的存在的标记组合，所述组合包含至少一个第2仓标记和至少一个第3仓标记。
另一实施方案中，本发明涉及根据本发明的用于检测BLR1重组事件的存在的标记组合，其中所述标记组合包含至少一个选自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的第2仓标记和至少一个选自OPY17、OPN20和E8M1的第3仓标记，或者包含一个或多个与这些标记中的任何一个部分同源的标记的标记组合。
一个实施方案中，本发明涉及筛选芸苔属植物以确定该植物是否包含BLR1重组事件的方法，所述方法包括从所述芸苔属植物提取DNA，在引物1159、1160、PR0004F和PR0004R表示的DNA片段存在下将提取物进行聚合酶链式扩增反应，并确定通过引物1159和1160从提取的DNA扩增了DNA片段以及缺乏从提取的DNA扩增对应于引物PR0004F和PR0004R的DNA片段。
一个实施方案中，本发明涉及用于产生能育F1杂种芸苔属植物的方法，包括步骤：使包含BLR1重组事件的芸苔属雄性能育植物与芸苔属CMS雄性不育植物杂交以产生F1杂种种子。
另一实施方案中，本发明涉及用于产生能育F1杂种芸苔属植物的方法，包括步骤：
a)确定包含BLR1重组事件的雄性能育恢复系亲本中以及任选地雌性的雄性不育CMS亲本中的总芥子油苷含量，
b)使雌性和雄性亲本杂交以产生F1杂种种子。
在再一实施方案中，本发明涉及产生能育F1杂种芸苔属植物的方法，包括步骤：
a)在雄性能育恢复系亲本的种子或植物中通过标记分析，检测BLR1重组事件；
b)使雌性和雄性亲本杂交以产生F1杂种种子。
在一个本发明特定实施方案中，通过确定雄性能育恢复系亲本中的总芥子油苷和通过标记分析，在恢复系亲本的种子或植物中检测雄性恢复基因的存在。
另一实施方案中，根据本发明用于产生能育F1杂种芸苔属植物的方法包括种植所述F1杂种种子的额外步骤。
另一实施方案中，根据本发明用于产生能育F1杂种芸苔属植物的方法包括收获从来自所述F1种子的植物生长的F2种子。
在另一实施方案中，根据本发明用于产生能育F1杂种芸苔属植物的方法包括在来自F1杂种植物的F2种子中确定总芥子油苷含量的额外步骤。
一个实施方案中，本发明涉及通过本发明方法产生的杂种F1芸苔属植物。
在再一实施方案中，本发明涉及包含BLR1重组事件的芸苔属植物，其中所述事件能够从芸苔属自交系BLR-038获得，所述自交系BLR-038的种子的样品保藏在NCIMB，保藏号NCIMB 41193。
再一实施方案中，本发明涉及用于产生包含BLR1重组事件的芸苔属植物的方法，包括步骤：获得含有BLR1重组事件的芸苔属植物，使该植物与另一芸苔属植物杂交，获得通过该杂交产生的杂种种子，和种植所述杂种种子以产生含有BLR1重组事件的芸苔属植物。
一个实施方案中，本发明涉及用于检测BLR1重组事件的试剂盒，其包含：
a)扩增第2仓标记的第一对引物；和
b)不扩增第3仓标记的第二对引物。
一个实施方案中，本发明涉及包含BLR1重组事件的芸苔属植物。
再一实施方案中，本发明涉及根据本发明的芸苔属植物，其中BLR1重组事件能够从芸苔属自交系BLR-038获得。
另一实施方案中，本发明涉及根据本发明的芸苔属植物，其中所述植物是欧洲油菜(Brassica napus)、芸苔(Brassica campestris)、甘蓝(Brassica oleracea)、Brassica nigra、Brassica carinata或属于十字花科(Brassicacea)的任何其它物种。
另一实施方案中，本发明涉及根据本发明的芸苔属植物，其中所述植物是所述物种的有性或无性重组(recombination)或克隆。
再一实施方案中，本发明涉及根据本发明的芸苔属植物，所述植物包含等于或低于双低芸苔属植物品种的芥子油苷水平的总芥子油苷水平。
本发明提供包含本文中称作BLR1重组事件的独特重组事件(该重组事件由沿着核酸区段(nucleic acid segment)在恢复基因座和芥子油苷基因座间的断裂导致)的芸苔属植物。本发明芸苔属植物表达由于萝卜恢复基因表达所致的育性恢复以及不高于双低自由传粉品种中正常GSL含量的GSL含量。芸苔属自交系BLR-038(保藏号NCIMB-41193)是含有BLR1重组事件的植物的一个例子。使用本领域技术人员已知的以及本文简要描述的育种技术，使自交系BLR-038和含有BLR1重组事件的其它自交系与雄性不育自交系杂交，产生表达低GSL含量和优良农艺性状的杂种。更一般地，本发明还包括将本发明BLR1重组事件从一种芸苔属植物转移至相同或不同亚种的另一种芸苔属植物。本发明的再一方面是试剂盒和方法，其包括标记和使用规定仓(bin)的标记来选择含有BLR1重组事件的芸苔属植物。
含有以BLR1重组事件为例的重组事件(该重组事件由来源于Ogura萝卜的恢复基因座和芥子油苷基因座之间沿核酸区段的断裂和随后的重连接产生新核酸区段所导致)并表达因萝卜恢复基因的表达所致的育性恢复和不高于双低自由传粉品种中正常GSL含量的GSL含量的本发明植物，可以通过使用下述育种策略而获得(关于BLR1重组事件——Ogura萝卜恢复基因座的重组——的育种史的详情，见表1)。CMS自交系例如R30195系可以和含有恢复基因的雄性自交系如R40自交系(Delournme等，1999； http://www.regional.org.au/au/gcirc /4/383.htm)杂交而产生F1杂种，其中所述自交系R40含有通过法国Rennes的Institut National de la Recherche Agronomique(INRA)从萝卜转移至芸苔属CMS植物的恢复基因(Pelletier等，1987，Proc7th.Int.Rapeseed Conf.，Poznan，Poland：113-119)。R40是从原始杂交(Fu 58.Darmor B1F1×Rest.Darmor B1F1)×Bienvenu开始通过自交产生的F6代子代。由CMS自交系和含有恢复基因的雄性自交系杂交(例如，杂交R30195×含有CMS恢复基因的R40)产生的F1杂种，基于雄性能育性(在开花时确定)进行选择。F1杂种植物(例如F1杂种92HR013)与非CMS非恢复系双零品质繁殖系如繁殖系93B-1-3杂交。种植通过与非CMS非恢复系双零品质繁殖系(例如93B-1-3)的杂交产生的能育植物的种子，所得CMS恢复系植物可以再次与相同的或另外的双低品质繁殖系如繁殖系92/19047杂交。由此杂交产生的品系进行几次自交(从1995至2002年进行的自交显示在表1中)。
在所有地块(plot)中，均可以观察到雄性可育性的分离，意味着所有的地块均含有杂合和纯合的保持系和恢复系植物。因为所有杂交均最初在Ogura CMS细胞质中进行而该细胞质在所有的后代中均得以保持，故证明保持系基因型是雄性不育的。可以使用塑料袋在开花前罩住花序，从而使植物自交。袋子优选在整个开花期都罩在植物上以避免异花传粉。
在整个育种程序中监测芸苔属植物种子的芥子油苷(GSL)含量。芥子油苷含量以9％湿度下μmol/g种子表示。可以使用本领域现有技术，例如HPLC或近红外反射光谱(NIRS)，进行芥子油苷分析。使用NIRS方法，可以分析未被破坏的芸苔属植物种子样品的品质组分(qualitycomponent)油、蛋白质和芥子油苷。
本发明含有因核酸区段中位于恢复基因座和芥子油苷基因座之间的位点的断裂所导致的独特重组事件(例如本文中称作BLR1重组事件的重组事件)的芸苔属植物，在来源于该植物的种子中的芥子油苷(GSL)含量等于或低于在双低自由传粉品种中正常发现的芥子油苷水平，优选地低于9％湿度下18μmol总芥子油苷(GSL)每克(g)种子、直至接近9％湿度下0μmol总芥子油苷(GSL)每克(g)种子的水平。
在本发明的一个特定实施方案中，GSL含量为9％湿度下0.5至18μmol总芥子油苷(GSL)每克(g)种子，尤其是9％湿度下2至15μmol总芥子油苷(GSL)每克(g)种子，更尤其是9％湿度下3至14μmol总芥子油苷(GSL)每克(g)种子，特别是9％湿度下3.5至10μmol总芥子油苷(GSL)每克(g)种子的GSL含量。在本发明一个特定实施方案中，GSL含量为9％湿度下3.6至6.0μmol，特别是3.6至4.2μmol总芥子油苷(GSL)每克(g)种子。
本发明芸苔属植物表现出因萝卜恢复基因的表达所致的育性恢复和不高于正常双低自由传粉品种(在油中具有低芥子酸以及在油提取后剩余的固体粉中具有低GSL的品种)的GSL含量。芸苔属自交系BLR-038(保藏号NCIMB-41193)是含有本发明BLR1重组事件的植物的一个例子。使用本领域技术人员已知的和本文中简要描述的育种技术，可以使BLR1重组事件渐渗入能够和自交系BLR-038杂交的任何芸苔属植物中。自交系BLR-038和含有本发明BLR1重组事件的其它植物可以与雄性不育自交系，尤其是表达低GSL含量和/或有利的农艺性质例如对植物病原体的高抗性、良好的站立性(standability)、高油含量、高产量等的自交系杂交，以产生具有低GSL含量和优良农艺性状的杂种。更一般地，本发明还包括将本发明的BLR1重组事件由一个芸苔属植物转移至另一个芸苔属植物。本发明还包括使用标记辅助的选择方法选择含有BLR1重组事件的芸苔属植物。
在一个实施方案中，本发明公开了揭示携带Ogura Rf易位(translocation)和纯合隐性(rfrf)块(bulk)的植物间多态性的标记。这些标记允许比较含有独特重组事件——由核酸区段中位于来源于Ogura萝卜的恢复基因座和芥子油苷基因座之间的位点的断裂和随后的重连接产生新重组事件所致——的芸苔属植物例如芸苔属自交系BLR-038和已公开的恢复自交系例如Pioneer杂种(ATCC 209002，97839，97838，209001)，以及含有I NRA发布的恢复基因座的SERASEM的商业杂种Lutin。这些标记根据其在各种植物材料上的扩增谱分仓，导致4个不同种类的标记。在本申请中，仓(bin)指侧翼为断裂点的核酸或染色体区段，其中所述仓能够通过在包围该仓的断裂点之间作图并且根据它们沿着核酸区段的定位进行分组的一组标记进行鉴定和由该组标记代表。含有第4仓(bin 4)标记的品系含有最长的片段。片段长度随着仓编号的减小而减小。
第1仓(bin 1)含有选自E5M16-1、E5M4-3、E6M 3-2和E8M14-1的AFLP标记或与这些标记之任一具有部分同源性的标记。
第2仓(bin 2)含有选自E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的AFLP标记或与这些标记之任一具有部分同源性的标记。
第3仓(bin 3)含有AFLP标记E8M1-2，或与这些标记之任一具有部分同源性的标记。
第4仓(bin 4)含有选自E2M13-1、E2M14-1、E3M12-1和E6M3-1的AFLP标记或与这些标记之任一具有部分同源性的标记。
在一个实施方案中，本发明涉及含有包括恢复基因的萝卜DNA片段的芸苔属植物，其中所述DNA片段能够使用至少一个第2仓标记而不能使用第3仓标记进行鉴定。
在再一实施方案中，本发明涉及含有包括恢复基因的萝卜DNA片段的芸苔属植物，其中所述DNA片段能够使用所有的第2仓标记而不能使用第3仓标记进行鉴定。
尤其是，本发明涉及含有包括Ogura胞质雄性不育的育性恢复基因座的萝卜DNA片段的芸苔属植物，其中所述DNA片段能够通过至少一个第2仓标记的存在加以鉴定，但不能被至少一个第3仓标记鉴定，并且其中所述DNA片段是本发明的BLR1重组事件。
“至少一个第2仓标记”可以是选自由E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2组成的组的一个、两个、三个、四个、五个、六个或所有标记，包括该组中不同个数标记的所有可能排列组合。
“至少一个第3仓标记”可以是选自由OPY17、OPN20和E8M1-2组成的组的一个、两个或所有标记，包括该组中不同个数标记的所有可能排列组合。
本发明范围内还包括至少一个第2仓组标记和至少一个第3仓组标记的所有可能组合。
在再一实施方案中，本发明涉及选自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的第2仓标记，和/或选自OPY17、OPN20和E8M1-2的第3仓标记，包括各组(仓)内和/或两组(仓)间的一个或多个标记的所有可能组合。
尤其是，本发明涉及选自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的标记，该标记可以在聚合酶链式反应中使用分别由1159(SEQ ID NO：13)和1160(SEQ ID NO：14)；E2(SEQID NO：25)和M4(SEQ ID NO：26)；E3(SEQ ID NO：29)和M1(SEQID NO：30)；E4(SEQ ID NO：32)和M14(SEQ ID NO：28)；E5(SEQID NO：33)和M1(SEQ ID NO：30)；E5(SEQ ID NO：33)和M4(SEQID NO：26)和E8(SEQ ID NO：37)和M14(SEQ ID NO：28)所代表的引物对扩增。上述引物以及在此提供的特定引物组合也是本发明的一部分。
本发明还包括选自OPY17、OPN20和E8M1-2的标记，该标记在聚合酶链式反应中可以使用分别由PR0004F(SEQ ID NO：19)和PR0004R(SEQ ID NO：20)；1135(SEQ ID NO：3)和1136(SEQ ID NO：4)；E8(SEQ ID NO：37)和M1(SEQ ID NO：30)所代表的引物对扩增。上述引物以及在此提供的特定引物组合也是本发明的一部分。
在再一实施方案中，本发明涉及检测含有来自萝卜的恢复基因的芸苔属植物的方法，包括步骤：从芸苔属植物获得植物样品，在样品中检测能够使用至少一个第2仓标记鉴定但不能被至少一个第3仓标记检测的DNA片段。
在再一实施方案中，本发明涉及检测含有来自萝卜的恢复基因的芸苔属植物的方法，包括步骤：从芸苔属植物获得植物样品，在样品中检测能够被第2仓标记检测但不能被第3仓标记检测的DNA片段。该方法还包括选择含有该DNA片段的芸苔属植物或其部分，以及使含有该DNA片段的芸苔属植物自交。在本发明一个特定实施方案中，该DNA片段含有BLR1重组事件。
尤其是，本发明涉及检测含有包含来自萝卜的恢复基因的DNA片段，尤其是包含BLR1重组事件的DNA片段的芸苔属植物的方法，其中所述第2仓标记包含选自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的至少一个标记。
本发明包括检测芸苔属植物的方法，其中所述第2仓标记与选自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的标记部分同源。
本发明方法包括步骤：在植物样品中检测能够通过PCR扩增使用引物1159(SEQ ID NO：13)和1160(SEQ ID NO：14)获得的DNA片段，其中该DNA片段不能被引物PR0004F(SEQ ID NO：19)和PR0004R(SEQ ID NO：20)扩增。
本发明还包括用于检测BLR1重组事件的存在的标记组合，该组合包含至少一个第2仓标记和至少一个第3仓标记。
本发明还包括选自E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2的一个或多个第2仓标记或者与这些标记之任一部分同源的标记和选自OPY17、OPN20和E8M1的一个或多个第3仓标记或者与这些标记之任一部分同源的标记的组合。
本文还提供能够使育种者确定包含Ogura Rf基因的芸苔属植物的基因型的标记。由此育种者可以通过使用两个标记对，尤其是两个SCAR标记对(其一与恢复基因(“Rf”)连锁，另一与恢复基因的缺乏(“rf”)连锁，见例如CA 2,206,673中的描述)的组合，在分离群体的各株植物中区分纯合和杂合Ogura恢复系。
这些标记可以通过实施两个PCR反应鉴定，一个PCR反应涉及能够与“Rf”标记杂交的引物对，例如引物对1137(SEQ ID NO：5)和1138(SEQ ID NO：6)；一个PCR反应涉及能够与“rf”标记杂交的标记，例如引物对PR0001F1(SEQ ID NO：40)和PR0001R1(SEQ ID NO：41)。在“Rf”基因纯合的植物中，所述PCR反应仅仅鉴定出与“Rf”基因连锁的标记。在“rf”基因纯合的植物中，所述PCR反应仅仅鉴定出与“rf”基因连锁的标记。在同时存在“Rf”基因和“rf”基因的杂合植物中，所述PCR反应将给出代表“Rf”和“rf”标记的条带。
所述PCR反应可以是单元PCR反应，其中各DNA样品分开处理；或者是多元PCR反应，其中两组引物对在单一一个PCR反应中一起使用。
本发明还包括筛选芸苔属植物群体以确定是否其含有包含BLR1重组事件的植物的方法，包括：从芸苔属植物提取DNA，在引物1159、1160、PR0004F、PR0004R存在下将芸苔属植物提取物进行聚合酶链式扩增反应，和确定通过引物1159和1160从提取的DNA进行的DNA片段扩增以及缺乏通过引物PR0004F和PR0004R从提取的DNA进行的DNA片段扩增，由此说明存在BLR1重组事件。
本发明包括试剂盒和方法，其涉及第2仓中的一个或多个标记以及第3仓中的一个或多个标记用于在植物或植物部分中检测BLR1重组事件的存在。根据本发明，含有BLR1重组事件的植物材料能够使用至少一个第2仓标记而不能使用至少一个第3仓标记进行鉴定。
本发明还包括使BLR1重组事件渐渗的方法，包括步骤：获得包含BLR1重组事件的芸苔属植物，例如芸苔属自交系BLR-038(保藏号NCIMB 41193，保藏日2003年8月28日)，使该植物与另一芸苔属植物杂交，产生杂种种子和选择含有BLR1重组事件的杂种种子。
特别是，包含BLR1重组事件的芸苔属植物，例如2003年8月28日以保藏号NCIMB 41193保藏的芸苔属自交系BLR-038，与优质冬油籽油菜繁殖系(用作回归亲本)杂交。在这些杂交中，芸苔属自交系用作雌性以维持CMS细胞质。
所得F1植物与回归亲本杂交以置换更多的芸苔属自交系基因组，尤其是80％至99.5％的基因组，更尤其是90％至99％的基因组，特别是95％至98％的基因组。在每一代中，必须确定恢复基因是否存在。由于每一代中的CMS细胞质，可以容易地例如通过育性评分来检测恢复基因存在与否。
在最后一代回交后，需要自交步骤。在以后后代中，使用本发明描述的分子标记选择具有纯合恢复基因的植物。这些植物是恢复系，可以用于产生杂种种子。
获得恢复系的一种不同方式是例如使含有BLR1重组事件的繁殖系，例如芸苔属自交系BLR-038杂交。使能育F1植物自交。在F2代中，在温室中通过使用标记分析诸如之前本文中描述的标记分析，检测纯合恢复系植物，并使纯合植物自交。
将纯合F2植物的F3后代种植在大田中以仅仅在期望的纯合恢复系植物中进行选择。然后将F3植物自交。重复此自交过程，直到对于用作杂种组分(hybrid component)而言，该品系具有足够的同质性。
使用几种CMS Ogura雄性不育系作为雌性亲本，以及使用一组包含本发明BLR1重组事件的遗传上不同的F3代或其后世代的自交植物作为雄性亲本，进行测交。在温室中播种后代，并在开花期计数能育和不育植物。含有BLR1重组事件的植物也可以使用本文所述试剂盒和方法进行选择。
在再一实施方案中，本发明还涉及包含BLR1重组事件的芸苔属植物，其中所述事件能够从芸苔属自交系BLR-038获得，所述近交系BLR-038的种子样品以保藏号NCIMB 41193保藏在NCIMB。
一个实施方案中，本发明涉及产生能育F1杂种芸苔属植物的方法，包括步骤：使包含BLR1重组事件的芸苔属雄性能育植物与芸苔属CMS雄性不育植物杂交以产生F1能育种子，还包括步骤：种植所述F1杂种种子，还包括步骤：收获从来自所述F1种子的植物生长的F2种子；本发明包括通过此方法产生的F1杂种芸苔属植物。
由于雄性不育的雌性CMS A系不能自花授粉，故其必须通过所述A系与保持系B系的杂交来维持，其中所述B系是雄性能育的并且与A系在遗传上一致。该杂交的结果是雄性不育的CMS A系。恢复系R系可以通过自交维持。
恢复系R系与雄性不育CMS A系杂交，产生在A系上生成的F1种子。可以商业销售F1种子用于产生F2种子。本发明F2种子具有低芥子油苷水平，尤其是9％湿度下低于18μmol总芥子油苷(GSL)每克(g)种子、直至9％湿度下接近0μmol总芥子油苷(GSL)每克(g)种子的GSL水平。
保藏
芸苔属自交系BLR-038的种子样品于2003年8月28日保藏在NCIMB，Ltd(23 St Machar Drive，Aberdeen AB24 3RY，Scotland，UK)，保藏号为NCIMB 41193。
实施例
以下实施例旨在举例说明本发明的应用。以下实施例不旨在完全地定义或以其它方式限制本发明的范围。
实施例1：芸苔属自交系BLR038的育种史和GSL表征
表1描述本发明含有BLR1重组事件的植物的育种史，其中所述BLR1重组事件是Ogura萝卜(Raphanus sativus)恢复基因座的重组。在1992年，CMS自交系R30195与含有INRA的恢复基因的雄性自交系R40杂交，产生F1杂种。R40是从原始杂交(Fu 58.Darmor B1F1×Rest.Darmor B1F1)×Bienvenu开始通过自交产生的F6代后代。基于雄性能育性(这在开花时确定)选择由R30195×R40杂交产生的含有CMS-恢复基因的F1杂种。F1杂种植物(92HR013)与非CMS、非恢复系双零品质繁殖系93B-1-3杂交。1994年，栽培通过与93B-1-3杂交产生的能育植物的种子，所得CMS恢复系植物与双低品质繁殖系92/19047杂交。由此杂交产生的品系从1995至2002年进行几次自交，这显示在表1中。在所有地块(plot)中，均观察到了雄性育性的分离，意味着所有的地块均含有杂合和纯合的保持系和恢复系植物。因为所有杂交均最初在Ogura CMS细胞质中进行而该细胞质在所有的后代中均得以保持，故证明保持系基因型是雄性不育的。使用塑料袋在开花前罩住花序，从而使植物自交。袋子在整个开花期都罩在植物上以避免异花传粉。
在自交系BLR-038的整个开发过程中，监测芸苔属植物种子的GSL含量。芥子油苷含量以9％湿度下μmol/g种子表示。使用近红外反射光谱，进行了芥子油苷分析。使用此方法，可以分析未被破坏的芸苔属植物种子样品的品质组分(quality component)油、蛋白质和芥子油苷。在FOSS NIR系统5000-c型上进行此分析。芥子油苷分析描述在P.Williams和D.Sobering，(1992)：Hildrum K.，Isaksson T.，NaesT.和Tandberg A.(编)Near Infra-red Spectroscopy.Bridging thegap between Data Analysis and NIR Applications.HorwoodChichester，UK：41-46。
1999年，F6代的一株植物22044-3具有17.3μmol/g种子的GSL含量，而其姐妹植物的种子具有22.5-23.8μmol/g的GSL含量。植物22044-3自交产生F7代植物。6797-2植物的种子具有11.4μmol/g的GSL含量，而其姐妹植物具有24.6-25.7μmol/g的GSL含量。将从种植6797-2种子得到的植物进行自交。在2001年，在F8代，从此自交得到的植物没有一株的种子具有高于14.3μmol/g的GSL含量。植物21615-7的种子具有仅7.0μmol/g的GSL含量。来自21615地块中的植物的种子的平均表现为10.7μmol/g，这比同时生长在德国的同一实验大田试验中的最低其它参照恢复系低至少7μmol，并比非恢复系品种Express和Laser的标准地块低了5μmol以上。在F9代，通过21615-5的纯合后代的自交，产生BLR-038。
                                         表1
  传粉   年   代   地块   杂交   地块μmol/g种子   植物株数(GSL μmol/g种子，在9％H2O)
  杂交   1992   92HR013   R30195(CMS B6 021)×R40   n.d.*
  杂交   1993   93HR141   92HR013×93B-1-3   n.d.*
  杂交   1994   F1   94HR233   93HR141×92/19047   n.d.*
  自交   1995   F2   21614   9(n.d.*)
  自交   1996   F3   21969   3(n.d.*)
  自交   1997   F4   22446   8(n.d.*)
  自交   1998   F5   22590   1(n.d.*)
  自交   1999   F6   22044   姐妹植物的GSL含量是22.5-23.8   3(17.3)
  自交   2000   F7   6797   姐妹植物的GSL含量是24.6-25.7   2(11.4)
  自交   2001   F8   21615   没有观察到一株植物的GSL含量高于14.3μmol。   10.7   1(10.3)，2(9.4)，4(14.1)，5(8.6)，6(9.4)，7(7.0)，8(14.3)
  自交   2002   F9 21615-5 BLR-038 3(4.5)；6(5.5)；7(10.1)；8(4.9)；10(6.0)；11(8.7).；12(4.2)；13(5.2)；14(12.5)；15(6.4)；17(3.6)；18(7.7)；19(9.5)**
·*n.d.＝未测定的
·**温室数据
表2显示地块01-21615的几个单株植物的分离比例。Rf传粉者植物(21615-01，21615-05，21615-06，21615-08)是Rf基因纯合的(RfRf)。从纯合Rf传粉者和CMS雌性品系的杂交产生F1杂种。这些杂交显示大约100％的雄性育性传递。
                                        表2
  纯合的传粉者
  传粉者   F1杂种   传粉者的自交
  原始2001(F8)   植物   雄性不育   雄性能育   能育植物比例；预期100％   植物   雄性不育   雄性能育   能育植物比例；预期100％
  0121615-01   12   0   12   100.0％   9   0   9   100.0％
  0121615-05   39   1   38   97.4％   14   1   13   92.9％
  0121615-06   16   0   16   100.0％   12   0   12   100.0％
  0121615-08   11   1   10   90.9％   9   0   9   100.0％
  总和   78   2   76   97.4％   44   2   43   97.7％
实施例2：通过AFLP分析表征芸苔属自交系BLR-038
对由原始Ogura恢复基因易位(translocation)发生分离的25株个体组成的群体，使用由来源于RAPD标记OPY17的两个专有SCAR标记组成的共显性PCR试验，进行基因型分型，其中所述SCAR标记与恢复基因座处于互引相或互斥相。纯合隐性(rf/rf)植物和恢复系(RfRf和Rfrf)植物分别混合在一起，并用于鉴定推测与Rf基因连锁的AFLP标记。这些标记允许将BLR-038与Pioneer杂种209002、97839、97838、209001以及与含有法国Rennes的Institut National de laRecherche Agronomique(INRA)发布的恢复基因座(Pelletier等，1987，Proc 7th.Int.Rapeseed Conf.，Poznan，Poland：113-119)的SERASEM杂种Lutin进行比较。AFLP分析基本上如Vos等(1995)Nucleic Acids Research 23(21)：4407-4414所描述的进行。
首先，样品BLR-038、209002、97839、97838、209001和杂种Lutin各500ng DNA在40μl 1×TA缓冲液(10mM Tris-乙酸、10mM MgAc、50mM KAc、1mM DTT、2μg BSA和EcoRI和Trul I(MBI Fermentas，Lithuania)各5u)中消化。EcoRI在以下称作E，而TrulI——MseI的同切口限制内切酶——称作M。以下序列为E和M的衔接子：
EcoRI-衔接子：5’-CTCGTAGACTGCGTACC          SEQ ID NO：21
                     CATCTGACGCATGGTTAA-5’  SEQ ID NO：22
MseI-衔接子：5’-GACGATGAGTCCTGAG            SEQ ID NO：23
                     TACTCAGGACTCAT-5’      SEQ ID NO：24
消化后，将含有1×连接缓冲液(40mM Tris-HCl(pH 7.8)、10mMMgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP、1u T4 DNA连接酶、0.1μM E衔接子和1.0μM M衔接子，Vos等(1995)描述的序列)的10μl连接溶液直接加入该DNA消化物中，温育，随后在1×TE缓冲液中稀释10倍。为了增加模板DNA的量，预先用各具有1个额外的选择性核苷酸的引物，即，E+1和M+1，扩增稀释的连接反应物。用于此预先扩增反应的引物由与衔接子相同的序列组成，除了在其3’末端有1个核苷酸延伸。引物E+A与EcoRI衔接子杂交并带有一个额外的A，引物M+C与MseI衔接子杂交并带有一个额外的C。20μl的反应溶液含有5μl模板DNA(10倍稀释的连接反应物)、1×PCR缓冲液II(10mM Tris-HCl，pH 8.3)、50mM KCl、0.2mM dNTP、1.5mM MgCl2、0.4u Taq聚合酶和(E+A)-引物及(M+C)-引物各0.3μM。此预先扩增反应在Perkin-Elmer/Cetus 9600或MJ Research PTC-100热循环仪中使用以下温度曲线进行：20个循环——94℃ 30s、56℃ 30s和72℃ 60s。
在选择性扩增前，在含有1×激酶缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.6)、10mM MgCl2、5mM DTT、0.1mM亚精胺、0.1mM EDTA、1.7μM(E+3)引物(DNA Technologies)、0.2u/μl T4多核苷酸激酶和2μCi/μl μ-33P[ATP]的溶液中末端标记(E+3)-引物。使用以下温度曲线进行选择性扩增：12个循环——94℃ 30s、65℃(以每循环0.7℃降低至56℃)30s、72℃ 60s；之后23个循环——94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 60s。20μl反应溶液含有5μl预先扩增的模板DNA、0.5μl标记的(E+3)-引物、1×PCR缓冲液II(Advanced Biotechnologies)、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTP、0.25μM(M+3)-引物(DNA Technologies)和0.4u Taq聚合酶。扩增后，将20μl甲酰胺上样缓冲液(98％甲酰胺、10mM EDTA、二甲苯腈蓝和溴酚蓝各0.1％)加入，样品在95℃变性3min。扩增的片段在由19∶1丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(Bis)溶液、1×TBE缓冲液、0.10％TEMED和0.03％APS组成的5％聚丙烯酰胺胶上分离。用于35cm凝胶的定制凝胶装置(CBS Scientific Co.，USA)用于所有分析中。凝胶在110W预先运行30分钟，之后上样3μl样品，在110W运行3小时。电泳后，凝胶转移至3MM纸上，在凝胶干燥器上80℃过夜干燥，对胶片进行曝光1-2天。
表3(SEQ ID NO：25至37)及序列表中显示的所有E+3引物(长度24nt)均在22位带有A，而所有M+3引物(长度21nt)均在19位带有C，这对应于所述预先扩增引物上的延伸。在预先扩增引物上的延伸是随机的，其添加的目的是降低模板的复杂性。并非扩增全基因组，而是仅仅扩增随后在使用E+3和M+3引物的最终扩增中用作模板的部分。E+A和M+C预扩增引物分别与E+3和M+3引物相比，除了短两个核苷酸外，是相同的。可以理解，本领域技术人员能够通过在衔接子M和E上产生其它的随机生成的延伸而开发出其它引物。这些新引物中的一些将扩增位于所述来源于Ogura萝卜的核酸区段上的其它核酸区段或标记，并将被归类于所述四个仓之一中。本领域技术人员将意识到，这些其它的引物和标记属于本发明的范围内。
总共筛选了48种引物组合，包括在专利申请WO98/56948中被证实给出多态性条带的7个引物对。仅仅存在于Ogura Rf块(bulk)而不存在于纯合隐性块(rf/rf)中的条带才被考虑用于比较芸苔属自交系BLR-038和Pioneer和INRA发布的杂种。
表3显示了所有揭示了Ogura Rf易位块和纯合隐性(rfrf)块之间的多态性的AFLP标记。根据标记在各种植物材料上的扩增谱，将这些标记分仓。结果在表4中示意性给出，揭示出4类不同标记。条带的存在表示为‘1’，缺乏则表示为‘0’。仓(bin)指根据标记沿着核酸区段的定位而集合在一起的一组标记。AFLP标记E5M16-1、E5M4-3、E6M3-2和E8M14-1属于笫1仓(bin 1)，其中这些标记在所有样品Lutin、P209001、P97838、P97839、BLR-038和P209002中均得到扩增。ALFP标记E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2、E8M14-2属于第2仓(bin 2)，其中第2仓标记扩增Lutin、P209001、P97838、P97839、BLR-038，但不扩增P209002。AFLP标记E8M1-2属于第3仓(bin 3)，其中第3仓标记扩增Lutin、P209001、P97838和P97839，但不扩增BLR-038和P209002。AFLP标记E2M13-1、E2M14-1、E3M12-1和E6M3-1属于第4仓(bin 4)标记，其中第4仓标记扩增Lutin和P209001，但不扩增P97838、P97839、BLR-038和P209002。
实施例3：使用SCAR标记表征芸苔属自交系BLR-038
对与Ogura恢复基因处于互引相的RAPD、AFLP和SCAR标记(公开在专利申请CA2,206,673)的扩增产物的核苷酸序列，设计引物对：OPC2(SEQ ID NO：2和7)、OPN20(SEQ ID NO：3和8)、OPF10(SEQID NO：4和10)、OPH3(SEQ ID NO：9)、OPH15(SEQ ID NO：11)、E36×M48AIII((SEQ ID NO：12)、E35×M62A V(SEQ ID NO：13)、E33×M47A 1(SEQ ID NO：14)和E38×M60A 1(SEQ ID NO：15)。除了这些标记外，还对RAPD标记OPH11的核苷酸序列设计引物，该RAPD标记OPH11被证实与Ogura基因座所起源的萝卜属中的育性恢复有关(登录号AB051636)。所分析的所有引物的序列以及预期的扩增产物的大小都列在表3中。使用标准PCR方案，采用引物组合，包括来源于RAPD标记OPY17的专有SCAR标记，分析了原始Ogura易位、BLR038、Pioneer杂种209002、97839、97838、209001和杂种Lutin。PCR后，通过琼脂糖凝胶电泳，观察扩增产物。参见表4，SCAR标记OPF10、OPC2和E35M62是第1仓的标记。属于第1仓的标记在上面作了讨论，其特征在于扩增样品Lutin、P209001、P97838、P97839、BLR-038和P209002。SCAR标记E33M47属于第2仓。第2仓标记的特征在于扩增样品Lutin、P209001、P97838、P97839和BLR-038，但不扩增P209002。两个SCAR标记OPY17和OPN20属于第3仓，特征在于扩增样品Lutin、P209001、P97838和P97839，但不扩增BLR-038和P209002。第4仓SCAR标记例如OPH15和E36M48扩增Lutin和P209001，但不扩增P97838、P97839、BLR-038和P209002。
                                               表3
  标记基因座 引物对 序列   产物大小   序列来源
  SCAR标记和引物
  OPC2  1127(SEQ ID NO：1)1128(SEQ ID NO：2)   ggggaaggaaggaaggactctcaggttcacacagcagcata   677bp   CA 2,206,673
  OPN20  1135(SEQ ID NO：3)1136(SEQ ID NO：4)   ataggttcctggcagagatgatagcagtcagaaaccgctc   630bp   CA 2,206,673
  OPF10  1137(SEQ ID NO：5)1138(SEQ ID NO：6)   ctgatgaatctcggtgagacccgtatgccttggttatctc   760bp   CA 2,206,673
  OPH15  1218(SEQ ID NO：7)1219(SEQ ID NO：8)   tctgtaaatcctttccacccaaaaaagcacccgagaatct   601bp   CA 2,206,673
  E36M48  1222(SEQ ID NO：9)1223(SEQ ID NO：10)   gcgtgatgatctgttgagaaggatttgtgggattggaaa   251bp   CA 2,206,673
  E35M62  1224(SEQ ID NO：11)1225(SEQ ID NO：12)   gaggttcaggaatgctgtttgctcctgttagtgactcttca   201bp   CA 2,206,673
  E33M47  1159(SEQ ID NO：13)1160(SEQ ID NO：14)   taacaaaatagagggagaggatgcaagattatagctacctaacagg   140bp   CA 2,206,673
  Gene16  16-1(SEQ ID NO：15)16-2(SEQ ID NO：16)   tgttcagcatttagtttcgcccttgttcagttccaccaccagcc   471bp   WO 03/006622
  Gene26  26-1(SEQ ID NO：17)26-2(SEQ ID NO：18)   gctcacctcatccatcttcctcagctcgtcctttaccttctgtggttg   530bp   WO 03/006622
  OPY17  PR0004F(SEQ ID NO：19)PR0004R(SEQ ID NO：20)   acgtggtgaggacatgccctttctgctggtgtattctacctcatcattaaa   300bp   Syngenta
 PR0001F1(SEQ ID NO：40)PR0001R1(SEQ ID NO：41)   gacgtggtgaacaagatgacgtggtgataataaattggc 420bp Syngenta
 AFLP标记和引物
 E2M4   E2(SEQ ID NO：25)M4(SEQ ID NO：26)   ctcgtagactgcgtaccaattaacgacgatgagtcctgagtacat
 E2M13   E2M13(SEQ ID NO：27) gacgatgagtcctgagtacta
 E2M14   E2M14(SEQ ID NO：28) gacgatgagtcctgagtactc
 E3M1   E3(SEQ ID NO：29)M1(SEQ ID NO：30)   ctcgtagactgcgtaccaattaaggacgatgagtcctgagtacaa
 E3M12   E3M12(SEQ ID NO：31) gacgatgagtcctgagtacgt
 E4M14   E4(SEQ ID NO：32)M14   ctcgtagactgcgtaccaattaat
 E5M1   E5(SEQ ID NO：33)M1   ctcgtagactgcgtaccaattaca
 E5M4   E5M4
 E5M16   E5M16(SEQ ID NO：34) gacgatgagtcctgagtactt
 E6M3   E6(SEQ ID NO：35)M3(SEQ ID NO：36)   ctcgtagactgcgtaccaattaccgacgatgagtcctgagtacag
 E8M1   E8(SEQ ID NO：37)M1   ctcgtagactgcgtaccaattact
 E8M14   E8M14
                               表4
Figure A20058000351900321
实施例4：用于检测BLR1重组事件的试剂盒和方法
从大约1cm2的芸苔属植物叶组织中使用Wizard Magnetic 96DNA植物系统(Promega)分离总DNA。在一个实施方案中，本发明的Multiplex PCR试剂盒和方法检测相应于OPY17(第3仓)和E33M47(第2仓)的PCR扩增产物的存在与否。
向反应混合物中加入4种引物PR0004F、PR0004R、1159和1160(表4)，浓度各7.5pmol。除了多元性质外，此PCR反应的组成是本领域中标准的，使用来自Invitrogen的Platinum Taq聚合酶。扩增条件如下：94℃初始变性5分钟，之后35个循环——94℃ 30秒、57℃ 30秒和72℃ 90秒。PCR扩增产物在2.0％琼脂糖凝胶上分离。
作为PCR反应的结果，当引物扩增出相应于E33M47的140bp产物但不扩增出相应于OPY17的300bp产物时，可以确立存在BLR1重组事件。还证明，PCR反应针对原始Ogura恢复基因易位片段以及衍生的重组事件Pioneer 97838、97839、209001和来自INRA的Lutin事件，扩增了OPY17和E33M47。另一方面，Pioneer重组事件209002显示出无E33M47和OPY17扩增产物。这些结果说明，选择性扩增来自第2仓和第3仓的标记(例如E33M47和OPY17)的引物可以成功地用于单个多元PCR试验中以在植物材料中区分和鉴定BLR1重组事件。
可以理解，本发明的试剂盒和方法可以合并第3仓的一个或多个标记以及第2仓的一个或多个标记，以检测植物中BLR1重组事件的存在。本发明范围内包括：根据本文描述的方法开发和使用属于第1、2、3或4仓之一的其它标记。
实施例5：恢复系(restorer)的改良
芸苔属自交系BLR-038(2003年8月28日保藏，保藏号NCIMB41193)，与高性能冬油籽油菜繁殖系(用作回归亲本)杂交。在这些杂交中，自交系BLR-038用作雌性以维持CMS细胞质。所得F1植物与回归亲本杂交以置换更多的自交系BLR-038基因组。由于每一代中的CMS细胞质，可以通过育性评分来检测恢复基因的存在与否。在F2代中，在温室中通过所述的标记分析检测到纯合的恢复系植物，并自交。将该纯合F2植物的F3后代种植在大田中，以便仅仅在期望的纯合恢复系植物中进行选择。这有助于克服通过测交证实的纯合子代数量的减少。然后将F3植物自交。使用几种CMS Ogura雄性不育系，并使用一组遗传不同的F4代或之后世代的自交植物作为包含本发明BLR1重组事件的雌性亲本，进行测交。在温室中播种后代，并在开花期间计数能育和不育植物。含有BLR1重组事件的植物也可以使用本文所述试剂盒和方法进行选择。
实施例6：杂种开发
使用CMS Ogura和恢复系，应用常规杂种生产方案。如上所述，雄性不育的雌性CMS A系不能自花传粉，因此通过其与保持系B系——该系为雄性能育且与A系具有遗传一致性——的杂交来维持。此杂交的结果是雄性不育CMS A系。恢复系R系可以通过自交维持。
恢复系R系与雄性不育CMS系杂交，产生在A系上生成的F1种子。
可以商业销售此F1种子用于生产F2种子。本发明的F2种子具有低的芥子油苷水平，如表5中所示。表5显示了使用芸苔属自交系BLR-038向三种不同的CMS近交系传粉，以产生三种不同的杂种。通过授精的CMS植物产生的F2种子的GSL含量显示出实质性地低于常规Ogura恢复系杂种的GSL含量，与常规的非恢复系例如EXPRESS和SMART的期望GSL水平相当。
实施例7：从杂交cms系×BLR01系产生杂种
BLR-038系(2003年8月28日保藏，保藏号NCIMB 41193)和专有繁殖系01 25853-03杂交。在温室中使F1代植物自交。在大田中播种F2代，并在下一年的春季使用由两个SCAR标记组成的共显性PCR试验通过两个标记分析F2代植物，其中所述两个SCAR标记与恢复基因座处于互引相或互斥相。将鉴定的纯合恢复系植物中的一些与雄性不育系RNX 4801一起移栽到种子繁殖隔离地中。通过一张网隔离具有两个亲本的地块以避免异花传粉。从雄性不育的雌性亲本收获了760g杂种种子，并播种在7号位产量试验田中以确定完全恢复的BLR杂种的产量、农艺和品质参数。
实施例8：确定Ogura Rf基因型
确定植物例如来自Ogura-cms系和Ogura恢复系的杂交的F2植物，是否是纯合的恢复系、纯合的保持系或杂合的恢复系的一种可能方案是，用恢复基因座的分子标记和非恢复基因座的分子标记检查该植物。对于此检查，将四种引物PR0001F1(SEQ ID NO：40)、PR0001R1(SEQ ID NO：41)、1137(SEQ ID NO：5)和1138(SEQ ID NO：6)加入反应混合物中，浓度各为7.5pmol。除了多元性质外，该PCR反应的组成是本领域中标准的，使用Invitrogen的Platinum Taq聚合酶。扩增条件如下：94℃初始变性5分钟，之后35个循环——94℃ 30秒、℃ 30秒和72℃ 90秒。PCR扩增产物在2.0％琼脂糖凝胶上分离。
如果仅存在大约760bp的一个PCR产物，则该植物是纯合的恢复系植物。如果仅存在大约420bp的一个PCR产物，则该植物是保持系。如果同时存在两个PCR产物(420bp和760bp)，则该植物是杂合的恢复系植物。
或者，可以根据CA2,206,673中描述的，使用点印迹检测试验。
表5
  油％   GSL μmol
  CMS雌性亲本×BLR-038
  CMS系RNX4801×01 21615-05(BLR 038恢复系)   40   13.9
  CMS系RNX4002×01 21615-08(BLR 038恢复系)   38   16.65
  CMS系RNX4901×01 21615-05(BLR 038恢复系)   41.9   12.55
  CMS系RNX4801×RNX 6001(常规恢复系)   41.3   29.7
  EXPRESS(常规系品种)   39.3   15.6
  SMART(常规系品种)   39.9   12.0
为了清楚和理解的目的，前面的发明已经通过举例说明和实施例进行详细描述。然而，明显地，可以在本发明范围内进行某些改变和修饰，例如单基因修饰和突变、体细胞克隆变体、选自本自交系的大植物群体的变异个体等，本发明的范围仅仅受到后附权利要求的范围的限制。
                           序列表
<110>Syngenta Participations AG
<120>Ogura胞质雄性不育芸苔属植物的改良的育性恢复及方法
<130>70279WOPCT
<150>GB 0402106.9
<151>2004-01-30
<160>41
<170>Patentln version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1127
<222>(1)..(20)
<400>1
ggggaaggaa ggaaggactc                                              20
<210>2
<211>21
<212>DNA
<220>
<223>引物1128
<222>(1)..(21)
<400>2
tcaggttcac acagcagcat a                                            21
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1135
<400>3
ataggttcct ggcagagatg                                              20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1136
<400>4
atagcagtca gaaaccgctc                                              20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1137
<400>5
ctgatgaatc tcggtgagac                                              20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1138
<400>6
ccgtatgcct tggttatctc                                              20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1218
<400>7
tctgtaaatc ctttccaccc                                              20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1219
<400>8
aaaaaagcac ccgagaatct                                              20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1222
<400>9
gcgtgatgat ctgttgagaa                                              20
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1223
<400>10
ggatttgtgg gattggaaa                                               19
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1224
<400>11
gaggttcagg aatgctgttt                                              20
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1225
<400>12
gctcctgtta gtgactcttc a                                            21
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1159
<400>13
taacaaaata gagggagagg atg                                          23
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1160
<400>14
caagattata gctacctaac agg                                          23
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物16-1
<400>15
tgttcagcat ttagtttcgc cc                                           22
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物16-2
<221>Misc_feature
<400>16
ttgttcagtt ccaccaccag cc                                           22
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物26-1
<400>17
gctcacctca tccatcttcc tcag                                         24
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物26-2
<400>18
ctcgtccttt accttctgtg gttg                                         24
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PR0004F
<400>19
acgtggtgag gacatgccct ttctg                                        25
<210>20
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PR0004R
<400>20
ctggtgtatt ctacctcatc attaaa                                       26
<210>21
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EcoRI-衔接子  正向引物
<400>21
ctcgtagact gcgtacc                                                 17
<210>22
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EcoRI-衔接子  反向引物
<400>22
aattggtacg cagtctac                                                18
<210>23
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MseI-衔接子  正向引物
<400>23
gacgatgagt cctgag                                                  16
<210>24
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MseI-衔接子  反向引物
<400>24
tactcaggac tcat                                                    14
<210>25
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物E2
<400>25
ctcgtagact gcgtaccaat taac                                         24
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物M4
<400>26
gacgatgagt cctgagtaca t                                            21
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物M13
<222>(1)..(21)
<400>27
gacgatgagt cctgagtact a                                            21
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物M14
<400>28
gacgatgagt cctgagtact c                                            21
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物E3
<400>29
ctcgtagact gcgtaccaat taag                                         24
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物M1
<400>30
gacgatgagt cctgagtaca a                                            21
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物M12
<400>31
gacgatgagt cctgagtacg t                                            21
<210>32
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物E4
<400>32
ctcgtagact gcgtaccaat taat                                         24
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
ctcgtagact gcgtaccaat taca                                         24
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物M16
<400>34
gacgatgagt cctgagtact t                                            21
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物E6
<400>35
ctcgtagact gcgtaccaat tacc                                         24
<210>36
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物M3
<400>36
gacgatgagt cctgagtaca g                                            21
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物E8
<400>37
ctcgtagact gcgtaccaat tact                                         24
<210>38
<211>626
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>标记
<400>38
gacgtggtga taaaagcgga gaagatggca tccctatgct actgaagatt ccacgcatgt  60
tcgatccgtg gggaggctac agcattattg gattcggtga tattcttttg cccggtttgc  120
taatcgcatt tgctctcagg tccaaaaacc tttttttatc atctcagagt ttcctttcac  180
cgagttccaa gttttcctaa catttgtttc ttctttgcag atatgactgg ttagctaaca  240
agactcttcg aaccggctat tttatatggg cgatggttgc ttacggatta ggtaaaaaaa  300
tcacacacaa atccgcataa tctcactggt gtattctacc tcatcattaa aaccatttga  360
aaacctcgca ggtcttttga ttacttacgt ggctctaaac ctaatggatg gacacggcca  420
accagcattg ctctacattg tcccttttac tctcggttag ctggaaaatc tctctctctt  480
attcctctct ataacggcat tgaatgagta ttgagagaaa tctcgtgatg aaaaatatag  540
gaacgatgct tacactagct cgaaaacgag acgacctttg gactctatgg acgaaagagc  600
cagaaagggc atgtcctcac cacgtc                                       626
<210>39
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RAPD引物Y17
<400>39
gacgtggtga                                                         10
<210>40
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PR0001F1
<400>40
gacgtggtga acaagatg                                                18
<210>41
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PR0001R1
<400>41
acgtggtgat aataaattgg c                                            21

Claims (39)

1.含有包括Ogura细胞质雄性不育的育性恢复基因座的DNA片段的芸苔属植物，其中所述DNA片段能够通过至少一个第2仓标记鉴定，但不能被至少一个第3仓标记检测到。
2.含有包括Ogura细胞质雄性不育的育性恢复基因座的DNA片段的芸苔属植物，其中所述DNA片段能够通过至少一个第2仓标记鉴定，但不能通过任何第3仓标记鉴定。
3.根据权利要求2的含有包括Ogura细胞质雄性不育的育性恢复基因座的DNA片段的芸苔属植物，其中所述DNA片段能够通过所有的第2仓标记鉴定，但不能通过任何第3仓标记鉴定。
4.根据权利要求1-3任一项的芸苔属植物，其中第2仓由标记E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2和E8M14-2组成。
5.根据权利要求1-3任一项的芸苔属植物，其中第3仓由标记OPY17、OPN20和E8M1-2组成。
6.根据权利要求4的芸苔属植物，其中所述标记在聚合酶链式反应中使用分别由1159和1160；E2和M4；E3和M1；E4和M14；E5和M1；E5和M4；E8和M14表示的引物对扩增。
7.根据权利要求5的芸苔属植物，其中所述标记在聚合酶链式反应中使用分别由PR0004F和PR0004R；1135和1136；及E8和M1表示的引物对扩增。
8.根据权利要求1-7任一项的芸苔属植物，其中所述DNA片段是BLR1重组事件。
9.根据权利要求1-8任一项的芸苔属植物，其中所述植物是自交植物。
10.根据权利要求1-8任一项的芸苔属植物，其中所述植物是杂种植物。
11.根据权利要求8的芸苔属植物，其中所述BLR1重组事件能够从芸苔属自交系BLR-038获得，自交系BLR-038的种子样品已经以保藏号NCIMB 41193保藏在NCIMB。
12.检测包含恢复基因的芸苔属植物的方法，包括步骤：
a)从芸苔属植物获得样品；
b)在所述样品中
i)通过至少一个第2仓标记，但不能通过至少一个第3仓标记；
ii)通过至少一个第2仓标记，但不能通过任何第3仓标记；
iii)通过所有的第2仓标记，但不能通过任何第3仓标记检测到DNA片段。
13.根据权利要求12的检测芸苔属植物的方法，还包括：选择含有所述DNA片段的所述芸苔属植物或其部分。
14.根据权利要求12的检测芸苔属植物的方法，还包括步骤：使含有所述DNA片段的所述芸苔属植物自交。
15.根据权利要求12的检测芸苔属植物的方法，还包括步骤：使所述芸苔属植物与另一芸苔属植物杂交。
16.根据权利要求12-15之任一项的选择芸苔属植物的方法，其中所述DNA片段包含BLR1重组事件。
17.根据权利要求12的选择芸苔属植物的方法，其中所述第2仓标记包含E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2或E8M14-2。
18.根据权利要求12的选择芸苔属植物的方法，其中所述第2仓标记与E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2或E8M14-2部分同源。
19.根据权利要求12的检测芸苔属植物的方法，还包括步骤：在所述样品中检测能够使用引物1159和1160通过PCR扩增获得的DNA片段，而且所述DNA片段不被引物PR0004F和PR0004R扩增。
20.用于检测BLR1重组事件的存在的标记组合，包含第2仓标记和第3仓标记。
21.根据权利要求18的用于检测BLR1重组事件的存在的标记组合，其中所述第2仓标记包含标记E33M47、E2M4-1、E3M1-1、E4M14-1、E5M1-2、E5M4-2或E8M14-2，且其中所述第3仓标记包含OPY17、OPN20或E8M1，或者与这些标记之任一具有部分同源性的标记。
22.用于筛选芸苔属植物以确定其是否含有BLR1重组事件的方法，包括从所述芸苔属植物提取DNA，在引物1159、1160、PR0004F和PR0004R代表的DNA片段存在下将该提取物进行聚合酶链式扩增反应，和确定通过引物1159和1160从提取的DNA发生了DNA片段扩增以及从提取的DNA缺乏相应于引物PR0004F和PR0004R的DNA片段的扩增。
23.产生能育F1杂种芸苔属植物的方法，包括步骤：
a)在含有BLR1重组事件的雄性能育恢复系亲本中，以及任选地也在雌性的雄性不育CMS亲本中，确定总芥子油苷含量；
b)使雌性和雄性亲本杂交以产生F1杂种种子。
24.用于产生能育F1杂种芸苔属植物的方法，包括步骤：
a)在雄性能育的恢复系亲本的种子或植物中，通过标记分析检测BLR1重组事件；
b)使雌性和雄性亲本杂交以产生F1杂种种子。
25.根据权利要求23-24之任一项的方法，包括额外步骤：在所述恢复系亲本的种子或植物中通过标记分析检测DNA片段。
26.根据权利要求23-25之任一项的产生能育F1杂种芸苔属植物的方法，包括额外步骤：种植所述F1杂种种子。
27.根据权利要求23-26之任一项的产生能育F1杂种芸苔属植物的方法，包括额外步骤：收获从来自所述F1种子的植物生长出来的F2种子。
28.根据权利要求27的方法，包括额外步骤：在来源于F1杂种植物的F2种子中测定总芥子油苷含量。
29.通过权利要求23-28之任一项的方法产生的杂种F1芸苔属植物。
30.包含BLR1重组事件的芸苔属植物，其中所述事件能够从芸苔属自交系BLR-038获得，自交系BLR-038的种子样品已经以保藏号NCIMB 41193保藏在NCIMB。
31.用于产生包含BLR1重组事件的芸苔属植物的方法，包括步骤：获得含有BLR1重组事件的芸苔属植物，使该植物与另一芸苔属植物杂交，获得由该杂交产生的杂种种子，和种植该杂种种子以产生含有BLR1重组事件的芸苔属植物。
32.用于检测BLR1重组事件的试剂盒，包括：
a)扩增第2仓标记的第一对引物；和
b)不扩增第3仓标记的第二对引物。
33.包含BLR1重组事件的芸苔属植物。
34.根据权利要求29的芸苔属植物，其中所述BLR1重组事件能够从芸苔属自交系BLR-038获得。
35.根据权利要求1-11、29、30、33和34之任一项的芸苔属植物，其中所述植物是欧洲油菜(Brassica napus)、芸苔(Brassicacampestris)、甘蓝(Brassica oleracea)、Brassica nigra、Brassicacarinata或属于十字花科(Brassicacea)的任何其它物种。
36.根据权利要求35的芸苔属植物，其中所述植物是所述物种的有性或无性重组或克隆。
37.根据权利要求1-11、29、30和33-35之任一项的芸苔属植物，所述植物包含等于或低于双低芸苔属植物品种的芥子油苷水平的总芥子油苷水平。
38.包含重组事件的芸苔属植物，其中所述重组事件由沿着核酸区段在来源于Ogura萝卜的Ogura细胞质雄性不育的育性恢复基因座和芥子油苷基因座间的断裂、以及随后的重连接产生新核酸区段所导致，所述植物表现出由于萝卜恢复基因表达所致的育性恢复活性以及不高于双低自由传粉品种中正常发现的GSL含量，但优选为9％湿度下每克(g)种子0.5至18μmol总芥子油苷(GSL)，尤其是9％湿度下每克(g)种子2至15μmol总芥子油苷(GSL)，更尤其是9％湿度下每克(g)种子3至14μmol总芥子油苷(GSL)，但特别是9％湿度下每克(g)种子3.5至10μmol总芥子油苷(GSL)的GSL含量。
39.根据权利要求38的芸苔属植物，其中GSL含量为9％湿度下每克(g)种子3.6至6.0μmol，但特别是3.6至4.2μmol总芥子油苷(GSL)。
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