CS105292A3 - Selection process of wheat resistant to herbicides and inhibiting ahas - Google Patents

Description

-1-

Pšenice rezistentní vůči herbicidům inhibujícím AHASa způsob její selekce

Oblast techniky

Tento vynález se týká použití screeningové metodyvýběru mutací pšenice rezistentních vůči herbicidům,inhibujícím acetohydroxykyselina-synthasu. Tento vyná-lez se také týká pšenice vyvinuté touto metodou.

Dosavadní stav techniky

První enzymatický stupeň: společný v biosyntézeaminokyselin o rozvětveném řetězci /valin, leucin aisoleucin/ je u rostlin katalyzován enzymem, acetohyd-roxykyselína-synthasou /JH4S, známý zaké jako acetolaktát-synthasa, E.C.4.1.3.18/. JILáS katalyzuje dvě paralelníreakce: kondenzaci dvou mol pyruvátu za tvorby aceto-laktátu a kondenzaci mol pyruvátu a mol alf a-ketobuty- .rátu. Tento enzym je inhibován konečnými produkty cyklu,kde při kondenzaci vzniká acetohydroxybutyrát, kte-rými jsou valin, leucin a isoleucin/, což je jeden zeznámých mechanismů regulace tohoto cyklu u vyššíchrostlin.

MdS je cíleným místem několika tříd strukturněrozdílných herbicidů, ^yto herbicidy zahrnují imidazo-linony, sulfamoylmočoviny, sulfonylkarboxamidy, sulfon-amidy a sulfonylmočoviny.

Zemědělská velkovýroba je založena především napraxi řádkových kultur. Hlavním činitelem, umožňujícím f tuto praxi, je dostupnost herbicidů selektivně eliminu— -2- jícich obtížné plevely, přičemž nedochází k poškozenípěstovaných rostlin· herbicidy, které potlačují většinuobtížných plevelů, jsou dostupné pro většinu hlavníchpěstovaných plodin· Výše zmíněné herbocody inhibující/Ά1Β jsou klíčovým prvkem při' potlačování plevelů. Ty-to herbicidy však nemusí zasáhnout důležité plevelyv meziprostorech produkční plochy. Běžně užívané her·*bicidy mohou také vyvolávat ekologické problémy nebojejich užiti může být omezeno z cenových důvodů.

Podstata vynálezu

Je zapotřebí vyvinout odrůdy pšenice rezistentnívůči herbicidům, inhibujícím /HJS. Vývoj takových re-zistentních odrůd by umožnil použití herbicidů, inhi-bujících JHjSS na rostoucí rostliny pšenice, což by měloza následek snížení aplikačních dávek, snížení kontami-nace: spodních vod a redukci toxicity vůči živočichůmve srovnání s ostatními skupinami herbicidů. Z toho vyplývá, že předmětem tohoto vynálezu jevývoj screeningové metody výběru mutaci pšenice rezis-tentních vůči jSHJS inhibici. Cílem tohoto vynálezu je zejména vývoj screeningp-vé metody výběrem mutací pšenice rezistentních vůči her·bicidu, inhibujícímu JHJB na bázi imidazolinonu.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je identifikaceselekce pšenice provedená touto novou screeningovoumetodou. -3- Těchto cílů se dosáhne mutagenižací semen pšenicechemickým mutagenem. V prvním stupni screeningu se se-mena namočí do roztoku, obsahujícího herbicid, inhibu-jící V druhém stupni screeningu , po setí, se pů- da, obsahující semena postříká herbicidem, inhibují-cím 4HJS před vyklíčením rostlin z půdy. Tý^Bostliny, pšenicekteré vyklíčí, vykazují rezistenci vůči herbicidůminhibujícím JHáS.

Stručný popis obrázků

Poznámka: chemické názvy chráněných značek a číselsloučenin: v tomto stručném popisu obrázků jsou uvedenyv další části popisu.

Obrázek: 1 znázorňuj® účinek zvyšující se koncentraceherbicidu, na bází. imidazolinonu, SCEPTER^1, na poměrmezi počtem rostlin, majících normální vzhled: a počtemsemen, namočených v roztoku, obsahujícím imidazolinoaývýherbicid.

Obrázek. 2 znázorňuje účinek zvyšující se koncentraceherbicidu na bázi imidazolinonu, PURSUIT , na poměrmezi počtem rostlin, majících normální vzhled a počtemsemen namočených v roztoku, obsahujícím imidazolinono-nový herbicid.

Obrázek 3 znázorňuje účinek zvyšující se koncentrace* herbicidu na bázi imidazolinonu, JRSERJL· , na poměrmezi počtem rostlin, majících normální vzhled a poč-tem semen namočených v roztoku, obsahujícím imidazo-linonový herbicid. -4-

Obrázek 4 a 5 znázorňuje vzhled pšenice rezistentnína imidazolinonový herbicid, ošetřené namočením semena preemergentním postřikem, obsahujícím PURSUIT®1 vesrovnání s neošetřenou nerezisten tni pšenici. Sezis-tentní pšenice je v levé části plochy obrázku 4, rezis-tentní pšenice je v prostřední části plochy obrázku 5·

Z\ V wbrázek 6 znázorňuje vzhled pšenice vzešlé ze seme-náčů M3, které pocházejí z FS4.

Obrázek 7 znázorňuje srovnání výšek rostlin /v cm/divokého typu pšenice /FIDEL/ vůči souboru z; FSí čtyři týdny po postemergentním ošetření éRSENJ&em™.

Obrázek 8 znázorňuje srovnání výšek rostlin /v cm/divokého typu pšenice /řidel/ vůči souboru « FS1 čtyři týdny po postemergentním ošetření OUSTenr®.

Obrázek 9 znázorňuje srovnání výšek rostlin /v cm/divokého typu pšenice /Fidel/ vůči souboru Μ,-Μ.. z FS1čtyři týdny po postemergentním ošetření PURSIUTem1 ·

Obrázek 10 znázorňuje srovnání výšek rostlin /v cm/ divokého typu pšenice /Fidel/ vůči souboru M -M. z PSTJ e n»w čtyři týdny po postemergentním ošetření SCEPTERem ·

Obrázek 10a znázorňuje srovnání výšek rostlin /v cm/divokého typu pšenice /Sídel/ vůči souboruz FS1 čtyři týdny po postemergentním ošetření slouče-ninou 2.

Obrázek 11 znázorňuje srovnání růstu /v procentech/vůči kontrolním rostliňím/ divokého typu pšenice /Fidel/ vůči pšeničným M4 mutantům, pocházejícím z FS2 a FS4ΦΜ čtyři týdny po preemergentním ošetření SCEPTERem . -5-·

Obrázek 12 znázorňuje srovnání růstu /v procentech vůčikontrolním rostlinám/ divokého typu páenice /Fidel/vůči páeničným M4 mutantům, pocházejícím z FS2 a FS4čtyři týdny po preemergentním ošetření JESMJLem™.

Obrázek 13 znázorňuje srovnání růstu /v procentech: vůčikontrolním rostlinám/ divokého typu pšenice /Fidel/vůči pšeničným M4 mutantům, pocházejícím z FS2 a FS4čtyři týdny po preemergentním ošetření PURSUITEM™.

Obrázek: 14 znázorňuje srovnání růstu /v procentechvůči kontrolním rostlinám/ divokého typu pšenice /Fi-del/ vůči. pšeničným M4 mutantům, pocházejícím z FS2a FS4 dva týdny po preemergentním ošetření imidazo-linonovýnt herbicidem, sloučeninou 2.

Obrázek 15 znázorňuje srovnání růstu /v procentechvůči kontrolním rostlinám / divokého typu páenice /Fi-del/ vůči pšeničným M4 mutantnům, pocházejícím z FS2

TO a FS4 dva týdny po postemergentním ošetření PURSUITem .

Obrázek 16 znázorňuje srovnání růstu /v procentech,vůči kontrolním rostlinám/ divokého typu páenice /Fi-del/ vůči pšeničným M4 mutantům, pocházejícím z FS2

_ TO a FS4 čtyři týdny po postemergentním ošetření PURSUITem .

Obrázek 17 znázorňuje srovnání růstu /v procentechvůči kontrolním rostlinám/ divokého typu pšenice /Fi-del/ vůči pšeničným M4 mutantům, pocházejícím z FS2 aFS4^čtyřij týdny po postemergentním ošetření sloučeni-nou 2.

Obrázek 18 znázorňuje srovnání růstu /v procentechvůči kontrolním rostlinám/ divokého typu páenive /Fi-del/ vůči pšeničným M4 mutantům, pocházejícím z FS2 aFS4 čtyři týdny po postemergentním ošetření sloučeni- nou 2.

Obrázek 19 znázorňuje srovnání hmotnosti /v procentechvůči kontrolním rostlinám / čerstvých rostlin divoké-ho typu páenice /Pidel/ vůči pšeničným mutantům 144, po-cházejícím z PS2 a FS4 sedm týdnů po postemergentním.ošetření PUHSUITem™.

Obrázek 20 znázorňuje srovnání hmotnosti /v procentech,vůči kontrolním rostlinám/ čerstvých rostlin divoké-ho typu pšenice /Pidel/ vůči pšeničným mutantům. 144, po-cházejícím z PS2 a PS4 sedm týdnů po postemergentnímošetření sloučeninou 2·

Obrázek 21 znázorňuje srovnání růstu rostlin /v cm/ di-vokého typu páenice /Pidel/ vůči PS2 mutantům ze sou-boru semen čtyři týdny po postemergentním ošet- ření CLéSSICem™·

Obrázek 22 znázorňuje srovnání růstu rostlin /v cm/ di-vokého typu pšenice /Fidel/ vůči PS2 mutantům ze sou-boru semen čtyři týdny po postemergentním ošet- ření sulfonylmočovinovým herbicidem, OUSTem™.

Obrázek 23 znázorňuje srovnání růstu rostlin /v cm/divokého typu pšenice /Pidel/ vůči PS2 mutantům ze? sou·boru semen čtyři týdny po postemergentním ošet- ření sulfamoylmočovinovým herbicidem, sloučeninou 3·

Obrázek 24 znázorňuje srovnání růstu rostlin /v cm/divokého typu pšenice /Pidel/ vůči PS2 mutantům ze sou·

7-

Obrázek 2g znázorňuje srovnání růstu rostlin /v cm/divokého typu pšenice /Pidel/ vůči PS2 mutantu zesouboru M3-M4 semen čtyři týdny po postemergentnímošetření sulfonylkarboxamidovým herbicidem, slouče-ninou 1 ·

Obrázek: 26 znázorňuje srovnání růstu rostlin /v cm/divokého typu pšenice /Fidel/ vůči FS2 mutantu zesouboru seaen Styři týdny po postemergentním ošetření imidazolinonovým herbicidem, sloučeninou 7·

Obrázek 27 znázorňuje srovnání výšek rostlin /v cm/divokého typu pšenice /Pidel/ vůči pšeničným mutautům. pocházejícím z PS1, FS2 a FS4 tři týdny po post-emergentním ošetřeni PURSUITem , sloučeninou 2 neboimidazolinonovým herbicidem, sloučeninou 8.

Obrázek: 28 znázorňuje srovnání výšek rostlin /v cm/ divokého typu pšenice /Pidel/ vůči pšeničným mutautům

M.- pocházejícím z PS1, PS2 a PS4 tři týdny po post-TM emergentním ošetřeni PURSUITem , sloučeninou 2 nebesloučeninou 8.

Obrázek 29 znázorňuje srovnání výtěžku /v procentechvůči kontrolním rostlinám/ divokého typu pšenice /Pi-del/ vůči pšeničným mutantům M4, pocházejícím z PS1, PS2a PS4 10 týdný po postemergentním ošetření PURSUITem ,sloučeninou 2 nebo sloučeninou 8.

Obrázek 30 znázorňuje srovnání růstu /v procentechvůči kontrolním rostlinám/ divokého typu pšenice /Pidel/vůči pšeničným mutantům M5, pocházejícím z FS4 6 týdnůpo postemergentním ošetření PURSUITem^®, sloučeninou 2, -8- *ΓΜ

sloučeninou 8, imidazolinonovým herbicidem, CéDREemTM nebo sulionylmočovinovým herbicidem, JCCENTBa .

Obrázek 31 znázorňuje srovnání středního plošného vý-nosu /v gramech zrní na perceiu/ divokého typu pšenice/Pidel/ vůči pšeničným mutantů® PS4 /&5 semena/ 10týdnů po postemergentním ošetření PURSUITem®, slouče-ninou 2, sloučeninou 8, CJDREem™ nebo JCCENTem®.

Obrázek: 32 znázorňuje in vitro enzymatické stanovení,měřící inhibiči aktivity ŠHŠS u PSI mutantů pšenice/označovaných WS1/ nepostříkaných po vyklíčení herbi-cidem, za použití valinu a leucinu /označeno V+L/ jakokontrolních, látek, SCEPTERu®, PUHSUITu®, sloučeniny9 a OUSTt™.

Obrázek 33 znázorňuje in vitro enzymatické stanova-ní, měřící inhibiči aktivity áffáS u PSI mutantů pše-nice /označovaných WS1/, postříkaných herbicide® vestáří rostlin, tři týdny, valíte® a leuclnem /značenoY+L/ Mako kontrola, SCEPTERem™, PURSUITem®, sloučeni-nou 9 a UUSTem®.

Obrázek 34 znázorňuje i® vitro enzymatické stanovení,měřící inhibicl aktivity JEEJS u divokého typu pšenice/Pidel/, nepostříkaných po vyklíčení herbicidem, za po-užití valinu a leucinu /označeno V+L/ jako kontrolníchlátek, SCEPTERem®, PURSUITEM®, sloučeninou 9 a OUSTem®.

Obrázek 39 znázorňuj® in vitro enzymatické stanovení,měřící inhibicl aktivity JHJS u divokého typu pšenice/Pidel/, postříkaných herbicidem; ve stáří rostlin třitýdny, valinem a leucine® /značeno V+L/ jako kontrola,SCEPTERem®, PURSUITem®, sloučeninou 9 a OUSTem®. 9-

Obrázek 36 znázorňuj© in vitro enzymatické stanoveniměřící inhibici aktivity áHáS u ES< mutantů pšenice,nepostříkaných, po vyklíčení herbicidem, valinem aleucinem /značeno V+L/ jako kontrolními látkami, SCEP-TERem™, PURSUITem™, sloučeninou 9 a OUSTem™.

Obrázek 37 znázorňuje in vitro enzymatické stanoveníměřící inhibici aktivity áHáS u FS4 mutantů pšenice,postříkaných herbicidem ve stáří rostlin tři týdny,valinem.a leucinem /značeno V+I»/ jako kontrolnímilátkami, .SCEPTERem™, PURSUITem™, sloučeninou 9 aOUSTem™.

Obrázek 38 znázorňuje in vitro enzymatické stanoveníměřící inhibici JÉ4S aktivity u divokého typu pšenice/Fidel/, nepostříkaných herbicidem po vyklíčení, va-linem- a leucinem /označeno V+L/ jako kontrolními lát-kami, SCEPTERea™, PURSUITem™, sloučeninou 9 a OUSTem™·

Obrázek 39 znázorňuje in vitro enzymatické stanoveníměřící inhibici JÉJS aktivity u divokého typu pšenice/Fidel/, postříkaných herbicidem ve stáří rostlin třitýdny, valinem a leucinem /označeno V+L/ jako kontrol-ními látkami, SCEPTERea™, PURSUITem™, sloučeninou 9a OUSTem™.

Podrobný popis vynálezu

Tento vynález je zaměřen na nový způsob scree-ningu výběru mutací pšenice, majících rezistenci vůčiherbicidům, inhibujícím J!H-SS. Semena pšenice se muta-genizují chemickým mutagenem konvenčními způsoby. 7prvním stupni screeningu se mutagenizovaná semena ponořído roztoku ŠHáS inhibujícího herbicidu za použití upra-·veného publikovaného postupu pro sojové boby na pšenici. -10- V novém druhém stupni screeningu se pak semenavsací do půdy a podrobí postřiku herbicidem, inhibu-jícím ŠHéS stejné třídy, jaké byla použita ve stupnipředcházejícími při namáčení semen před vyklíčením seme-náčů z půdy. ®y rostliny pšenice, které nevyklíčily amají normální vzhleď, se pokládají za rezistentní vůčité třídě herbicidů, inhibujících éHŠS, která byla po-užita v těchto dvou stupních. Výhoda těchto rostlin, jeproto v tom, že mohou být pěstovány na ploSe, kterámůže být oěetřována třídou herbicidů, inhibujících JHéStak, aby došlo: k eliminaci obtížných plevelů, zatímcorostliny pšenice zůstávají nepoškozeny, ^ědičnost tétorezistence vůči herbicidům ,inhibujícím JHJS je de-monstrována testováním: několika generací semen z původ-ních mutantů na rezistenci vůči třídě herbicidů, Inhi-bujících áHA3. Výsledné rostliny mohou být, ale nemusí,křížově tolerantní k jiným: třídám herbicidů, inhibu-jících JHAS, než byly použity v uvedeném dvoustupňovémpostupu.

Uutagenesze semen se docílí konvenčními způsoby zapoužití.chemického mutagenu. bedním z popsaných postupůje postup Kueha a Sfrighta /Kueh J.S.H a Bright S.W.J.,Planta, 153, 166-171 /1931/, kde se semena namočí dovody, probublává se jimi vzduch a dále následuje ošet-ření chemickým mutagenem jako je azid sodný· Semena sepak pro my jí vodou a vysuší. Použiti azidu sodného v tom-to postupu je zvláště výhodné.

Další chemické mutageny a postupy pro jejich po-užiti zahrnují B^methyl-B-nitrosomočovinu a N-ethyl—ΪΓ- nitrosomočovinu /Fluhr B.· a Cseplo A., ^ethods Enzymol./Plent Mol.Biol./, 118, 611-623 /1986/, ethylmethansul-fonátu /Sebastian S.A., a spol·, Crop Sci,, 29 > 1403-1408 /1989/ a hydroxylamina hydrazin /Khamankar Y.G., J.Maharashtra TJgric.Univ., 14, 322-325 /1989//· -η

Mutagenizovaná semena se pak.zkoumají na jejichrezistenci vůči herbicidům, inhibujícím -áHAS. Původněbyly prováděny in vitro testy, hodnotící snášenlivostna herbicid! u izolovaných pšeničných embyyí, půleksemen, a celých semen· Tyto testy jsou však Sašově ná-ročné a problematická vzhledem k problémům spojenýms kontaminací a proměnnou odezvou u pšenice· rroto bylpoužit další typ výběru. Tento postup je odvozen oďpráce vyvinuté Sebastianem, a Chalefře® / Sebastian.S. A. aChaleff R.S., Crop Science, 27, 948 až 952 /1987//,pro výběr sojových bobů tolerantních k herbicidu. Ten-to screeningový postup zahrnuje namočení celých, zra»lých semen pšenice do roztoku, obsahujícího herbicid!,inhibující 4HJ5S dané třídy herbicidů, inhibujících4HJ6 na danou časovou periodu, po které se semena zasa-dí do sterilní půdní směsi· Různé.třídy herbicidů, inhibujících ŠH4S zahrnujiimidazolinony, sulfamoylmočoviny, sálfonylkar box amidy,sulfonamidy a sulfonylmočoviny. ..... Příklady imidazolinonových herbicidů, která se po-užijí ve screeningovém stupni namáčení semenzahrnuji2-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin<-2-yl/-niko-tinovoukyselinu, 2-/4-isopropyl/-4-methyl-5-oxo-2-imi-dazolin-2-yl/-3-chinolinkarboxylovou kyselinu, 5-ethyl-2-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-niko-tinóvoix kyselinu, 2-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imi-dazolin-2-yl/-5-/methoxymethyl/-nikotinovou kyselinu,5-formyl-2á/4*isopropy1-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-nikotinovou kyselinu, 5-/dimethyl-acetal/, 3-/4-i s opr opyl-4-me thyl- 5-oxo- 2- imid azolin- 2-yl/-2-methyl-krotonovou kyselinu/, 2-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-5-methylnikotinovou kyselinu a směs: -12< methyl-&amp;-/4-isopropyl~4-methyl-5-oxo-2-iaidazolin-2-yl/-m-toluát ataethyl-2-/4-isopropyl-4-«nethyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-p-toluát. Použití 5-ethyl-2-/4-iso-prepyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-nikotinovékyseliny a 2-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazo-lin-2-yl/-nikotinové kyseliny je preferováno. Zvláštěje preferováno použití 5-ethyl-2-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-nikotinové kyseliny. Příklady sulfamoylmočovinových herbicidů, kterése použijí ve screeningovém. stupni namáčení semenz shrnují 1-/4-methoxy-6-methyl-s-triazin-2-yl/-3-//o«-propionylf enyl/sulf amoyl/ močovinu, 1 -/4,6-dimethoxy—2-pyrimidinyl/-3-//o-propionylf enyl/sulf amoyl/mpčovi-nu, 1 —//o—acetylf enyl/sulf amoyl/-3-/4-methoxy-S-methyl- 2- pyrimidinyl/-močovinu a 1-//o-acety lf enyl/sulf amoyl/- 3- /4-methoxy-6-methyl-s-triazin>-2-yl/-močovinu. Pří-klady sulfonylkarboxamidpvých herbicidů zahrnují 2-acetamido-2,3-dimethyl-B-/p-tolylsulfonyl/butyrsmiď a2- ac e t amido-K-//p-chlorfenyl/sulfonyl/-2,3-dime thyl-butyramid. Příkladem sulfonamidu je ffi-/2,6-difluorfe- nyl/-5-methyl-/1,2,4/-triazolo-/1,5a/-pyrimidin-2-sul-..... fonamid. Příklady sulfonylmočovin zahrnují 2-/4,6-b i s-/difluormethoxy/pyrimidin-2-ylkarbamoylsulf amoyl/ben-zoovou kyselinu, 1-/4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl/-3-/di-methoxykarbamoyl-2-pyridylsulfonyl/močovinu, methylester Ο-//3-/4,6-dimethylúyrimidin-2-yl/ureido/sulfo-nyl/-benzoové kyseliny/ a ethylester O-///4-chlor-is-me thoxy- 2-pyr imidinyl/kar b amoyl/s ulf amoyl/ benzoovékyseliny/.

Jestliže se namočení semen provede za účelem výběru,použije se následující postup: po vysušení se semenazasadí a po předemi stanovené době, jako jsou tři nebočtyři týdny po zasazení se spočítá počet vyklíčených: se-men. Rovněž se pozoruje velikost a vzhled semenáčů. Semena, -13- která vyklíčí a poskytnou semenáče normální velikostia vzhledu, mohou být rezistentní na imidazolinonovéherbicidy, inhibující JffLAS.

Nicméně i u semen.z tohoth výběru po namočpniexistuje možnost "úniku" nebo falešně pozitivních: pře-žití po ošetření herbicidem· K eliminaci těchto faleš-ně pozitivních výsledků se jako druhý výběr· použije pre-emergentmC ošetření herbicidem·.

Po stupni namočeni semen se semesaa pšenice zasadído půdy. Je-li to žádoucí, může se půda zavlažovat· Půda, obsahující semena se pak postříká-ještě před vy-klíčením semen z půdy herbicide®, obsahujícím: JHáS vevodném roztoka nebo v roztoku, obsahujícím další vhodnávodná nebo organické rozpouštědla· Koncentrace herbi-cidu určeného k postřiku se zjistí pro každý. imidazo-linon v předběžných zkouškách v malém měřítku· -. Herbicid, inhibující ŠHJB, který se použije vestupni postřiku.semen, se vybere ze stejné t_řídy, jakobyl herbicid použitý ve stupni namáčení semen· Daný zvo-lený herbicid může být v tomto dvoustupňovém výběrutotožný nebo rozdílný, ale v každém případě musí být ty-to herbicidy vybrány ze stejné třídy herbicidů, inhibu-jících ŠHŠS· Týto třídy herbicidů včetně příkladů, kterése použijí ve stupni postřiku semen, jsou popsány výšes ohledem na stupeň namáčení semen·

Semena podrobená tomuto dvoustupňovému výběru sepak. déle hodnotí po vyklíčení semenáčů z půdy. Růst nor-mální velikosti, výtěžku a vzhledu indikuje, že pšenicezahrnuje mutace, mající požadovanou rezistenci herbicidů,inhibujících. ěHlflS. -14' Pšenice s vysokou hladinou snášenlivosti vůči her-bicidům, inhibujícím áELáS, se vybere pomocí tohoto dvou-stupňového screeningu. Tento screeningový systém umož-ňuje preferenční výběr silně rezistentních rostlinpšenice expozicí semen, herbicidním dávkónt, letálním prodivoký typ pšenice ve dvoustupňovém výběru, namočenímsemen a preemergentní aplikací. -?ato dvojí expozice her-bicidu eliminuje falešná pozitiva a tím slouží k tomu,aby eliminovala slabě rezistentní mutantyr ^yto re-zistentní rostliny pšenice jsou rezistentní na herbi-cidy té třídy, která byla použita ve dvoustupňovém vý-běru. Kostliny mohou být v určitých: případech 'křížovětolerentní k jedné nebo více dalším třídám herbicidů,inhibujícím JHáS, ale tato křížová tolerance nemusíbýt přítomna· Příklady uvedené níže ilustruji tento vynález naimidazolinonové třídě herbicidů, inhibujících. JEáS.

Další třídy herbicidů, inhibujících JSHJS jsou rovněž, vrozsahu tohoto vynálezu, jelikož mechanismus jejich účin-ku je stejný jako u imidazolinonů. Všechny herbicidy, in-hibující 4H4S mají stejný mechanismus účinku, působína iHJS-enzym, čímž blokují biosyntézy val inu, leucinua isoleucinu: HLokovéním účinnosti 4HJS tyto herbicidyinhibuji metabolismus rostlin, což vede k jejich úhynu.

Jestliže se použije dvoustupňové screeningová metodapodle vynálezu s imidazolinonovou třídou herbicidů, získáse výběr pšenice, který je rezistentní na imidazolino-novou třídu herbicidů. Pšenice rezistentní na herbicid,má zvýšenou toleranci na imidazolinony a to až 50ti ná-sobnou. ve srovnání s němutagenizovanou neselektovanoupšenicí. U imidazolinonů byl prokázán inhibiční účinekna enzym áHAS, jden z prvních enzymů v biosyntéze ami-nokyselin s rozvětveným řetězcem, Selektované pšenicee -15- vykazují účinnost JHJS, která není inhibována imida-zolinony, jak bylo zjištěno in vitro enzymatickým sta-novením /popsaným, v příkladech dále/. Bohužel je jenmálo nebo žádný důkaz o křížové toleranci na další chemikálie? s podobným mechanismem účinku na áHáS z hlediskarostlin nebo enzymatických studií.

Ze 117000 semen pšenice, která byla screenována,byly zvoleny čtyři typy rostlin pšenice pro jejichrezistenci- Výběry těchto čtyř mutantů jsou označenyPS1, PS2, PS3 a PS4. Vzorky semen těchto rostlin pše--nice byly uloženy 28, března 1991 v Aaerican Type: CultureCollection, 12301 Parklawn Drive, Bockville, MD 20852 a byly označeny následujícími ukiádacími čísly: mutant pšenice ukládací číslo PSI JffiCC 40994 PS2 AECC 40995 PS3 JTCC 40996 PS4 ATCC 40997 . Ma základě genetických údajů, selektované pšeničnémutanty PSI, PS2, PS3 a PS4, jsou alelické a zdá se, žejsou výsledkem jednoho mutačního účinku. Tolerance jedědičná jako jeden genetický lokus a při expresi jedominantní nebo semidominantní. Ukázalo se, že zvýšenáherbicidní tolerance nemá žádný škodlivý vliv na výtěžek,zrní jak v přítomnosti tak v nepřítomnosti testovanýchimidazolinonových herbicidů. Dědičnost mutací u rezistentních selekcí pšeniceje potvrzena testováním několika generací potomstva se-men, rovněž jako kříženců výběru mutantů. testovaná se-mena se podrobí jak preemergentní tak postemergentní -16- aplikaci různých tří £ herbicidů, inhibujících JHJS.Pozoruje se velikost, výtěžek a vzhled, semenáčů vesrovnání sneošetřenými kontrolními rostlinami /Fidel/a kontrolními rostlinami /Fidel/,podrobenými stejnému' dvoustupňovému screeningovému postupu. / Výsledky těchto testů, jak jsou popsány v příkla-dech indikuji, že mutace, mající rezistenci na imida-zolinony jsou dědičné z generace na generaci rostlinodvozených z výběrů FS1, FS2, FS3 a FS4. Specifičnostrezistence je demonstrována údaji, které indikují, žesvýběry mutantů nejsou rezistentní na: další třídy her*»bicidů, inhibujících, 4H4S jako jsou sulfonylmočoviny,sulfamoylmočoviny, sulfonamidy nebo sulfamoylkarbox-amidy. V® druhém provedení tohoto vynález se ve dvoustup-novém screeningovém postupu použijí dvě různé třídy her-bicidů, inhibujících JHJS. Ve stupni namáčení semen sepoužije? herbicid jedné třídy. V postřikovém stupni sepoužije herbicid druhé třídy. Výběry rostlin, které pře-žijí a normálně rostou, jsou rezistentní na obe třídyherbicidů. Jčkoliv četnost mutací, majících rezistencia jejich výběr' se značně sníží vzhledem: k různým třídámpoužitých herbicidů, je-li počet vybraných semen dosta-tečně velký, získají se výběry s dvojí rezistenci. K lepšímu porozumění tomuto vynálezu jsou uvedenynásledující příklady. Příklady jsou pouze ilustrativnía nelze je chápat jako omezení rozsahu tohoto vynálezu. -17- Příklady provedeni vynálezu Výváj dvoustupňového výběru semen* I. Mutageneze semen Pět, tisíc semen francouzské ozimé pšenice "Fidel"se mutagenizuje postupem podle £ueha a ^righta /Kueh J. S.H. a Bright S.W.J., Planta, 153, 166 až 171 /1981//. semena pšenice se namočí do vody na dobu 18 hodin při 5 °C a probublávají se vzduchem po dobu 6 hodin přiO ϋ ' r 20 C. ezprostředně potom následuje ošetření 1 mítážidem sodným, chemickým, mutagenem, při pH 3 po dobudvou hodin, ^emena se pák.promývají vodou po dobu 30minut, a pak se rozprostřou ve slabé vrstvě na papírovouosušku k vysušení. Po vysušení se semena vysázejí napole. fiostliny pšenic® se nechají růst do ukončení vývi-nu a sklidí se semena M2. Sklidí se asi 117000 pšeničnýchsemen, která.se použijí k výběru pšenive rezistentní naimidazolinon. četnost klíčení tohoto materiálu je 100 #. 2. Stupen. 11. Máčení semen

Postupem vyvinutými Sebastianem a ^haleffem sa seme-na pšenice povrchově odhmyzují po dobu 30 sekunď. v 70#

EtOH, načež následuje odhmyzení v 50# roztoku, obsahují-TM clm 2,625 # chlornanu sodného a 1 až 2 kapky Tweenu 20/neionogenní povrchově aktivní látka, polyethylen sorbi-tan mono1aurát/, dostupného pod registrovanou ochrannouznámkou fy Atlas Chemical Industries/ ve 100 ml roztokupo dobu 30 minut za vakua při mírném míchání za použitímíchací desky. Semena se pák promyjí ve sterilní desti-lované vodě a pák se namočí do roztoku herbicidu na stáno'vénou dobu jak je uvedeno mýše Sada dvacetipěti semen se 18- pak umístí do 25 ml roztoku herbicidu uvedeného níževe sterilní plastikové petriho misce a nechají se namo-čena po stanovenou dobu. Semena se pak promyjí vodou,vysuší papírovou utěrkou a vysejí /25 semen/plocha/ asi1/2” hluboko do rašelinového kontejneru o rozměrech6x8 palců, obsahujícího vlhkou sterilní půdu typu MetroMix.35.0®*/ Grace; Company, Cambridge, MJ/· Výsledky ošet-ření se hodnotí čtyři týdny po ošetření. Herbicidy, jejichdávky a doba působení jsou uvedeny níže:

Pokus 1:

ARSENAL™: 0, 1, 10, 50, 100, 500 /uM

SCEPTER™: 0, 1, 10, 50, 100, 500 /UM po dobu 48 hodin» Každé ošetření se čtyřikrát opakuje. / ARSEN AL™ a SCEPTER®1 jsou ochranné známky Anerican Cyan- mr amidl Company. ARSENj® 2-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-nikotinová kyselina a je popsánav US patentu č· 4798619, SCEPTER™ je 2-/4-isopropyl/-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-8-chinolinkarboxylovákyselina a je popsána v US patentu č. 4798619/· ARSENAL inhibuje klíčení semen a růst semenáčů sezvyšující se koncentrací- ^atímco při koncentracích, aždo 50 yum lze vizuálně pozorovat určité falešně pozitivnívýsledl^F, vyšší koncentrace zcela inhibují růst semenáčů.Při těchto koncentracích 100 a 500 /UM, některá vnímavásemena klíčí, ale semenáče jsou malé, zkroucené a obecněabnormálního vzhledu. Přestože SCEPTER™ také inhibuje růst semenáčů sezvyšující se koncentrací, tři až čtyři týdny po vyklí-čení se tento jev vyrovnává, jak lze pozorovat vizuálně.Ve skutečnosti semenáče, ošetřené 1—100 yuM nelze? od kon- -19- trolních rostlin rozlišit a semenáče ošetřené 500 ^uMmají nepatrně nižší růst- než rostliny kontrolní·

Pokus 2

JRSEříáL™ 0, 10, 50, 100, 500 /UM TBff

SCEPTEIT“ 0, 100, 250, 500, 750, 1000 /UM po 48 hodin. Každý pokus je prováděn dvakrát. roi/r JRSEN.áL pyl znovu, zkoušen ve ste jných koncentra- cích. jako v předcházejícím pokusu a byly získány stejné výsledky jak. je popsáno výše. V tomto pokusu byla zvý-»jnr

Sena koncentrace-SCEPTERu na maximum, 1000 /uM. Nakonci tohoto pokusu bylo zřejmé z vizuálního pozorování,že koncentrace stále není dostatečně vysoká, aby zabrá-nila “únikům*·. Zdá se, že také doba expozice herbicidumá také vliv na počet falešně pozitivních nálezů. 7 pří-kladě 1 při namočení semen o několik, hodin déle?se obje-vilo určité prodloužení kořínků, nicméně v tomto pokususe u semen neobjevily po ukončení ošetření herbicidem:klíční kořínky vůbec. *činek doby namočení semen na kon-centraci herbicidu nutnou k zabránění "úniků", je hodnocenv následujícím pokusu.

Pokus 3 JRSEN áL™ o, 50, 75, 100 /UM TM SCEPTER o, 250, 500, 750, 1000, 1500 /UM PURSUIT™ o, 250, 500, 750, 1000, 1500 /UJÍ

sloučenina 1 0, 500,1000, 1500, 2000 /UM -20- po 48, 72 nebo 96 hodin. Každé ošetření se třikrát opa-kuje /PURSUIT1^ je ochrsnhá známka American ^yanamidCompany. PURSUIT^ je 5-ethyl-2-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-nikotinbvá kyselina a ge po-psána v US patentu č. 4798619· Sloučenina 1 ge 2-acet-amido-N-//p-chloxrf enyl/ sulf onyl/-2,3-úimethyl-bUtyramida ge popsán v US patentu δ. 4992094/· 7 tomto pokuse byly hodnoceny imidazolinonovéherbicidy JESEŇáL™, SCEPTES™, PURSUIT™ a sulfonyl-karboxamidová sloučenina 1 jako selektivní činidla přivýběru pomocí namočení semen, jyla hodnocena taká in-terakce mezi dobou namočení semen a koncentrací her-bicidu. Na obrázcích 1 až 3 jsou. uvedeny výsledky ošet-řeni imidazolinonovými herbicidy· Jestliže se semenamáčí .48 hodin, počet "normálních/ rostlin, klesá se zvy-šující se koncentrací'herbicidu· Se zvyšující se dél-kou expozice herbicidu se snižuje, koncentrace herbici-du nutná pro letalitu. ?ro JSBSSS£L·^ je dostatečnákoncentrace: 50 /ulí, je-li expozice větší než 72 hodin,nicméně 75 /taM je nutných, je-li délka expozice kratší·SCEPTER™ není účinný v žádných koncentracích herbicid/délka expozice, ^aproti tomu ošetření semen bu3 1000 _imj /ulí PURSUITU po dobu 72 hodin nebo 750 /Ulí po dobu96 hodin zabraňuje přežití možných falešných pozitiv.Sloučenina 1 nemá inhibiční účinek ani na klíčení semenani na růst semenáčů.

Pokus 4

SCEPTER™ 0, 500, 1000, 1500, 2000 /UM po 3, 4, 7 a 10 dnů. Každé ošetření se opakuje dvakrát. 21

Použije se postupu popsaného výše s výjimkou toho,Že se do Petriho misky namočí 3550 semen· Po kontejneruse opět sází 25 semen. Tento pokus byl opakován dvakrát./Poznámka: V prvním pokusu 7 až 10 den byla sadba kon-taminována plísní a byla zlikvidována. Ve druhém po-kusu byl k namáčecímu roztoku přidán fungicid., Captan,tak, aby se kontaminaci zabránilo/·

Doby namáčení sedm a deset dni jsou příliš dlou-hé pro použití u semen pšenice. V této době se začínáobjevovat u SCEPTERu®1 prodlužování kořínků při kon-centracích: až Bo 1000 /uM; při těchto časových obdo-bích začínají také být problémy s kontaminací plísněmi.

Vizuální výsledky jsou podobné těm, které bylyzjištěny pro PURSUIT v pokusu 3. Pro selekci mutantů re-zistentních na imidazolinon jsou vhodné koncentraceSCEPTERut bu3: 1,000 nebo 1500 /uM po dobu 3 dnů s minima-lizací problému falešně pozitivních výsledků. 3· Stupen 2: Freemergentni aplikace herbicidu

Serie pokusů byla provedena ke stanovení vhodnéhomnožství herbicidu pro tuto preemergentni aplikaci po-střikem. Semena pšenice vhodného kultivaru Fidel se vy-seji do kontejnerů z rašeliny o rozměrech 6 x 8 palcůnaplněných Metro Mix 350®® v dávce 100 semen, na kontej-ner. Před ošetřením herbicidem se kontějnery zavlaží· Při ošetření se postříkají tři kontejnery, herbicidy seaplikují laboratorním pásovým rozprašovačem v dávce 950litrů na hektar /l/ha/ při rychlosti pásu 12,8 s.ot"^za použití trysky rozprašovače č. 40015^ /Téejet®^ Spra-ying Systems/. Po třech až čtyřech týdnech se provede -22- vizuální hodnocení ošetřených rostlin z hlediska toxi-city na semena pšenice /semenáče. PURSUIířa SCEPTER^jsou nejúčinnějši v dávce 300 až 350 g/ha, zatímco

TM JSRSENáL je nejúčinnější při preemergentním postřiku40 až 50 g/ha. 4« Screening a selekce mutantů rezistentních na her-bicid.

Pro screening herbicidní rezistence byl použitPURSUIT jako příklad imidazolinonu. Semena pšenice Mgse povrchově odhmyzila po dobu 30 sekund, naše&amp; násle-dovalo odhmyzení v 50$ roztoku, obsahujícím 2,625 $chlornanu sodného jak je popsáno výše. Semena se pakpromyla třikrát sterilní destilovanou vodou a bylaumístěna do sterilní plastikové Petriho misky o rozmě-rech 100 x 15 mm, 250 semen na misku. Do každé misky pák ___ wu bylo vneseno dvacet pět ml 1000 mM roztoku PURSUITu asemena, bylo ponechána namočená v tomto roztoku ve tměpo dobu 3 dnů. Semena se pák odvodnila a byla vysuše-na na.papírové osušce a pak vyseta do sterilních raše-linových kontejnerů o rozměrech 6x8 palců, obsahují-cích Metro Mix, 1000 vysetých semen/kontejner. Kon-tejnery byly za laženy a bezprostředně postříkány 300 gna hektar /g/ha/ PURSUITu®^. Herbicid byl aplikován la-boratorním pásovým postřikovačem v dávce 950 l/ha přirychlosti pásu 12,8 s.ot"1 za použití trysly rozprašo-vače č. 400152· Po čtyřech týdnech byly semenáče hod-noceny z hlediska tolerance na herbicid. Screening se-men pšenice Μ^ probíhal postupně v souborech 25000 semen.Z asi 117000 semen, pšenice, která prošla dvoustupňo-vým výběrem, herbicidní rezistence, byly selektovány čty-ři rostliny pšenice rezistentní na PURSUIT®. 23- lyto rostliny jsou výrazně nápadné vzhledem vesrovnáni s nerezistentní pšenicí. Dvě z těchto mutač-ních selekcí jsou vyobrazeny na obrázcích. 4 a 5. Rezis-tentní pšenice je v komůrce nejvíce vlevo na obrázku 4,rezistentní pšenice je v prostředním kontejneru obrázku 5.Tyto čtyři, mutační selekce jsou označeny FS1, PS2, PS3a PS4. Rezistentní rostliny byly přesazeny do rašelino-vých květináčů 7,5 palce do Metro Mix 350 . Příklady 2-5

Charakterizace mutantů rezistentních na herbicid Přiklaď 2 Dědičnost herbicidní rezistence 1. screen rostlinJ in vivo

Rostliny M^ ze čtyř původních selekcí rostlin /ozna-čených PS1j_PS2, PS3 a PS4/ byly hodnoceny na rezistencina PURSUIT . Pět semen M^ z každé zralé rostliny těchtopůvodních mutantů bylo odhmyzeno v 70S6 ethanolu podobu 30 sekund, načež následovalo odhmyzení v 50$> rozto-ku, obsahujícím 2,625 % chlornanu sodného /jek je popsánovýše/ po dobu 20 minut za vakua za mírného míchání pomocímíchací plotny· Semena pak byla promyta dvakrát ve sterilnídestilované vodě.

Každá sada pěti semen pak byla umístěna do 10 ml1000 /UM roztoku PURSUITu™ ve sterilní plastikové ^etrihomisce o rozměrech 6ú x 15 mm a namočena po dobu tří dnů.Semena pak byla promyta vodou, vysušena papírovou utěr-kou a vyseta do rašelinových kontejnerů rozměrů 6Hx8 palců,přibližně 1/2" hluboko do sterilní Metrů Mix 350®* půdy.^yto kontejněřy byly preemergentně postříkány PURSUITBm -24 v dávce 300 g/ha. Kontrolní vzorky obsahovaly semenaM^ z každého rezistentního výběru, která byla odhmyze-na jak je popsáno výše, namočena ve sterilní destilo-vané vodě a pak vyseta. Kromě toho byla odhmyzena vý-....še uvedeným způsobem neselektovaná semena citlivé pše-nice Fidel, z nichž jedna polovina byla ošetřena PURSUITem/máčením semen a postřikem/ a druhá polovina byla má-čena v samotné vodě. Herbicid byl aplikován laborator-ním pásovým rozprašovačem v dávce 950 Ι/ha při rych-losti pásu 12,5 s.ot~1 za použití rozprašovací tryskyč.. 4001533. čtyři týdny po úvodním namočení semen byly rostlinypšenice M^ hodnoceny z hlediska, zda jsou na herbicid re-zistentní, poškozeny herbicidem nebo usmrceny. Rostlinyna herbicid rezistentní pak byly přesazeny jednotlivědo 7,5 palcových azalkových květináčů, obsahujících mg

Metro Mix 350 . Jeden týden po přesazení rostlin se rostliny hnojily na list pomocí hnojivá Osmocote/Sierra Company, Milpita, Cá/· ^romě toho byly rostli-ny pravidelně hnojeny hnojivém Peter*» 20-20-20/GraceCompany'Cambridge, Má/· Jednotlivé rostliny byly hodno-ceny vůči neošetřeným kontrolním rostlinám Fidel.

Memutagenizovaná, neselektovaná semena ^idel nepře-žila ošetření PUBSUITem™ v koncentraci 1500χθΜ /Máčenísemen/ a 300 g/hs /preemergentní aplikace/. Stejná.se-mena při namáčení v destilované vodě a bez postřiku klí-čí v rozmezí 1-2 týdnů s průměrnou klíčivostí 63»3 %/průměr ze dvou sad kontrolních rostlin/. Semena M^.přlnamáčení ve sterilní destilované vodě a bez postřiku mělaklíčivost 53,3 %· Semena rezistentních výběrů pšenice,ošetřené PUBSUITem™ měla následující klíčivost: PS1- 60 %,PS2 - 47,5 FS3 - 41,2 % a PS4 - 55 %· “noho semenáčů —25· podrobených ošetření herbicidem má stejný stupenrůstu jako neošetřené kontrolní rostliny, nicméněněkteré semenáče, pocházející z FS4 jsou ovlivněnyherbicidem, mají zakrslý růst, jsou pokroucené a/nebomají chlorotické pásy /obrázek 6/. většina z nich je*schopná přežití a dalšího růstu· Výška rostlin třitýdny po ošetření herbicidem je uvedena v tabulce 1.

Tabulka 1: íí^ screen rostlin: výsledky screeningu potomstva čtyř původních výběrů pšenice přihodnocení pomocí pomocí máčení semen/pre-emergentní aplikace.

Selek- počet počet prům.výška rozmezí vý- ce klasů rostlin^ výhonu /cm/ honů /cm/ FS1 16 48/80 9,1 2-15 FS2 16 38/80 11,7 5-18 FS3 17 35/85 8,0 1—14,5 FS4 17 44/85 21,1 5-28 kontrola 1 —2 6/15 19,0 10-26 kontrola 2 -2 13/15 21,2 8-30 kontrola 3 8/15 28,9 27-31 1Počet vzešlých rostlin/počet zasazených . 2U kontrolních vzorků 1 a 2 se jedná spíše o početsemen, než o klasy.

Kontrola 1 = citlivá semena pšenice /Fidel/ namočenádo sterilní destilované vody.

Kontrola 2 » citlivá semena pšenice /Fidel/ namočená doroztoku herbicidu. Kontrola My® semena z původníchselekcí, namočená do sterilní vody. -26- Výška rostlin mutautových selekcí je v rozmezí1 až 28 cm. To ukazuje na variabilitu ve stupni sná-šenlivosti na herbicid. Kontrolní rostliny měly výškurostlin v rozmezí 8 až 31 cm. Všechny rostliny byly pře-sazeny do 71/2 palcových raáelinových květináčů dopůdy Metro Mix 350 a použity ke křížení popsanému včásti 4 tohoto příkladu 2 /studie genetických atavů/. 2. screen rostliní in vitro fiostliny ze čtyř původních výběrů rostlin /ozna- čených FS1, PS2, FS3 a PS4/byly hodnoceny in vitro zhlediska rezistence na Pursuit™. Semena Bí^ potomstvakaždá zralé.rástliny těchto Kg mutantů byla odhmyzena v7OS6 ethanolu po dobu 30 sekund, načež následovalo odhmy-zení v 5056 roztoku, obsahujícím 2,625 % chlornanu sod-ného /jak je popsáno výše/ po dobu. 20 minut za vakua amírného míchání pomocí míchcí plotny· Semena se pak.namočí do sterilní destilované vody v plastikové ste-rilní Petr iho misce rozměrů 100 a 15 mm-po dobu 20 až24 hodin, načež byla vyjmuta embrya a kultivována na me-diu, obsahujícím buá 10“^, 10*"^ nebo 10“^M PURSUITu^. ,Kontrolní vzorky obsahovaly nemutagenizovaná embrya /Pi-del/ kultivovaná na.mediu bez herbicidu a s herbicidema vzorky na mediu bez herbicidu· Hodnoceni embryí byloprovedeno buá dva a půl týdne nebo 3 týdny po zahájeníkultivace· Žádné z embryí Aontrolní vzorky ^idel nebo M,/kultivované v médiu, obsahujícím 10 PURSUITu nevyklí-čilo, ačkoliv určitá embrya vykázala malé prodlouženíprimárních kličkových kořínků /1 až 5 mm/. M3 embrya jsouo něco tolerantnější na PURSUIT™ v mediu při koncentraci10"“^M, nicméně přetrvává významná inhibice růstu. V ta-bulce 2 jsou uvedena hodnocení embryi, kde ”T” je snášenlivý, -27- "D” poškozený, "S” citlivý vliv na embrya, kultivovanáv mediu, obsahujícím 10“5M a 10"% PURSUITu™.

Tabulka 2: screen rostlin: Výsledky screeningu potomstva čtyř původních výběrů pšenice přihodnocení semen in vitro. Hodnocení embryí-"T"- tolerantní, "DM-poškozující, MS"- cit-livý. PURSUIT™ koncentrace » 10"5

Selekce hodnocení eabyí prům.výškavýhonů/cm/ rozmezí výškyvýhonů /cm/ T D S PS1 21. 16 42 0 - 1 ,5 PS2 21 14 45 0 - 3,5 PS3 12 9 58 —— 0 - 4,5 PS4 16 15 31 -— 0 - 3,0 kontrola 1 kontrola «0 0 0 15,6 í - 28 0 0 30 2 kontrola 27 1 1 14,7 1 - 28 PURSUIT™ koncentrace= 10"6

Selekce hodnocení embryí prům.výškavýhonů/cm/ rozmezí výškyvýhonů /cm/ Τ' D S PS1 70 0 0 9,1 1 - 22 PS2 64 1 0 11,4 1 - 23 PS3 34 12 22 5,2 1 - 23 PS4 59 8 13 13,4 1 - 33 kontrola 1 kontrola 20 0 0 23,1 14 - 32 0 0 15 2 kontrola 15 0 0 14,6 2-28 -28-

Kontrola 1 = citlivá semena pšenice /Fidel/ na mediueí.bez herbicidu. Kontrola 2 = citlivá semena pšenice /Pi-del/ na mediu s herbicidem. Kontrola Μ^= semena způvodních výběrů na mediu s herbicidem. ^a základě těchto in vitro výsledků mutantové vý-běry vykazují 10ti až 100násobně zvýšenou toleranci naSURSUIT™. 3. Segregační studie

Studie byla provedena ke stanovení rezistence;na imldazolinony a homogenitu potomstva původníchvýběrů mutantů pěenice. V táto studii bylju použita.semena z rostlin /odvozených, od původních selekcí.PS1-PS4/, které přežily dvoustupňový screen popsaný výše.Kromě toho byla hodnocena semena odvozená z rostlin . každé selekce, která nebyla zahrnuta do výběru /ozna-čena jako "zásobní” rostliny/ rovněž jako kontrolnírostliny Fidel. Semena odvozené jak ze zásobních tak z®screenovaných rostlin představujících, výsledek kaž-dého původního výběru pšenice /PS1-FS4/ byla vyseta dokontejnerů v množství dvacet pět semen na řádku a.osmřádek na kontejner. Jeden týden po setí, ve stadiu seme-náčů Z12 /dva lístky/, byly rostliny postříkány RURSUITem^v dávce 62,5 g/ha. Hebicid byl aplikován laboratornímpásovým rozprašovačem v dávce 950 l/ha při rychlostipásu 12,5 s.oť** za použití rostřikovací trysky č. 40015Evevýšce 18 palců nad rostlinami. Jako surf akt ant bylpoužit Twéen 20®^ při koncentraci 0,25 % obj./obj.. Rost-liny byly hodnoceny tři týdny po postřiku,

Vzorky Eidel.jsou naprosto citlivé na aplikaci 62,5 fe/ha PURSUITu™ /všechny rostliny zahynuly/. Imida-zblínon-rezistentní výběry ozimé pšenice vykázaly výbornou -29- toleranci na postemergentní aplikaci PURSUITu™ v dáv-ce 62,5 g/ha při tomto hodnocení ve skleníku. Potomstvoodvozené z výběrů FS1, FS2 a FS4 se projevilo homogenněrezistentní na PURSUIT®^ i když bylo pozorováno několikcitlivých rostlin a potomků s' nízkou citlivostí ke klí-čení. Tyto tři výběry se zdají být homozygotně rezistentníPotomstvo z.FS3 může být citlivé, může se rozdělovatnebo může být úplně rezistentní. Potomstvo s rozdělený-mi vlastnostmi s dobrou klíčivostí má asi jednu čtvrti-nu jedinců citlivých. Tento výběr je zjevně heterozy-gotní a vyžaduje další samogeneraci k. získání jednotnéhohomozygotního materiálu. Výsevy pro zvýšení počtu semen,jsou prováděny na polích. Po uvedeném testu ve skleníkujsou potomstva.s nedělitelnými vlastnostmi od každéhojednotlivého výběru shromážděna tak, aby bylo k dispo-zici dostatečné množství semen pro toleranční test napoli /zkouška na poli 1, část 1 příkladu 4/· 4. Studie genetického stavu éby se stanovilo, zda výběry mutantů. pšenice jsou.alelické. /a snad odvozeny od stejné mutace/ nebo různé,je třeba mutanty křížit. Také je nutné křížení rezis-tentních: typů s citlivými typy /Fidel/ ke stanovení dě-dičnostAích vlastností jevu rezistence. Z tohoto hledis-ka byla provedena všechna možná křížení a jejich reci-proční provedení mezi rodičovskými liniemi Fidel, FS1, FS2, FS3 a FS4· Hybridy F^, které vzešly to těchto kří-žení byly hodnoceny na rezistenci, samoopylení a bylyzpětně testovány křížením: s citlivými jedinci k produkci-potomstva ke stanovení dědičnosti a informace o hllelismupo dobu selekce. -30—

Pokus 1: Šest komůrek, obsahujících Metro Six 350®®bylo oseto P^ hybridy odvozenými z následujících kříže-ní: PS1 3K Pidel, PS2 x Pidel, PS3 x Pidel, PS4 x Pidela Pidel /citlivý základní kultivar/. Po jednom týdnubyly komůrky postříkány, každá dávkou herbicidu, PUR-SHFITu®®, v dávce 50, 100, 150, 200 a 250 g/ha ke stano-vení genetického stavu rysu herbicidní rezistentnívlastnosti selekce PS1-PS4. herbicid byl aplikován la-boratorním pásovým postřikovačem v dávce 950 l/ha přirychlosti pásu 12,5 s.ot"^ za použití rozprašovací

trysky δ. 40015Β· 0"ako surfaktant byl v roztocíchTO herbicidu použit Tween 20 v koncentraci 0,25%·

Rostliny byly hodnoceny 10 dnů po ošetření herbicidem. ^yto hybridy jsou omezeny růstem, ale nejsou usmr-ceny při dávce 250 g/ha PURSUITu®®, což indikuje, žedokonce v heterozygotních stavech tyto rostliny vykazu-jí relativně vysokou hladinu rezistence na imidazolino-nyr. Rostliny Pidel jsou usmrceny v dávce 150 g/ha PDR-SUITu®® a jsou těžce poškozeny v dávkách 50 a 100 g/ha.lyto hybridy, PSI x Pidel, PS2 x Pidel, PS3 x Pidel aPS4 x Pidel všechny vykazuji v generaci Pí herbicidnírezistenci. Segregační poměr 1 rezistence : 1 citlivýjedinec by mohl svědčit o heterozygotním stavu. Nicméně*toto nebylo pozorováno v žádném ze čtyř výběrů, ^a zá-kladě těchto údajů gen, nesoucí herbicidní rezistenciv rezistentních mutantech pšenice je dominantní a ho-mozygotní.

Pokus 2: Tento pokus byl proveden k hodnocení selekcímutantů pšenice? vzhledem k jejich herbicidní rezistencipři vzájemném kříženi a samoopylení. Vzájemné kříženíbylo provedeno mezi rostlinami M^, představujícími selekcez původních čtyř mutantů a mezi těmito selekcemi a ty-pem Bidel. Potomstvo těchto kříženců rovněž jako potom*·stvo samoopylení rostlin použitých při křížení se vy-seje do ópalcových azalkových květináčů do půdy Metro -31-

Mix 350™* Deset květináčů pro každé kříženi se oseje dvěma semeny na květináč· Deset dní potom bylo veškeré po-tomstvo, samoopylené i recipročně křížené, postemergent-ně postříkáno PURSUITém™ v dávce 200 g/ha. Ošetření her-bicidem bylo aplikováno; postupem v pokusu 1· Počet rost-lin pak byl omezen' na jednu rostlinu na květináč /odstra-něním slaběí ze dvou rostlin z květináče/ jeden týdenpo aplikaci herbicidu· Klíčivost semen mutantů z recip-ročního křížení byla 100 % a více než 90 % u mutantůsemen, pocházejících ze samoopylení. Žádný vzorek kří-žení mutantů nebyl poškozen podnětem aplikace PURSUITu™.

Pokus 3í Kříženci P^ hybridů /popsaných v pokusu 1/ atypu Pidel jsou postříkány dávkou 200 g/ha PURSUITu™.

Do 6 palcových azalkových květináčů jsou vysety následu-jící kříženci do půdy Metro-Mix 350™. Počet osázenýchkvětináčů pro jedno křížení je uveden číslem: za křížením:

Pidel x /Pidel/PSl/ 12

Pidel x. /Pidel/PS2/ 211

Pidel x /Fidel/FS3/ 9

Pidel x /Pidel/PS4/ 8

Fidel? 20 /ÍF každém ze dvaceti květináčů jsou dvě rostliny typuPidel/. Přibližně za měsíc jsou rostliny postříkány /mimotyp Pidel/. PURSUIT™ /200 g/ha/ byl aplikován jak jepopsáno výše. Hodnocení rostlin bylo provedeno tři a půltýdne poté. 32

Ze 49 testovaných potomků kříženců, které bylypostříkány, 29 přežilo a 20 bylo usmrceno· Rozdělení 29:20 se blíží rozděleni asi 1:1 předpokládanému pro domi-nantní /nebo semidominantní/ genově řízenou dědiěnost·Nicméně předpokládané heterozygoty v tomto pokusu bylypoškozeny výrazně více než rostliny postříkané stejnoudávkou herbicidu v pokusu předchozím· Není zcela jasné,zda ošetření v pozdějším stadiu růstu působí zvýšenápoškození heterozygotů, nebo zda zde působí jiné fak-tory.

Pokus 4: Rezistentní výběry pšenice FS1-PS4 byly křiže>ny s typem. Pidel a semena Fj. z těchto křížení byla pod-robeny samoopylení. Křížení byla následující: /Pidel x PS1/, /Pidel x PS2/, /Pidel x PS3/, /Pidel x PS4/, samoopylení samoopylení samoopylení samoopylení

Pg potomstvo z těchto křížení a jejich vnímavámateřská odrůda Pidel byly vysety do komůrek. Pro každéze čtyř křížení bylo použito pěti potomstev Pg. Jednakomůrka byla oseta každým potomstvem, z každého křížení.V komůrkách bylo jritt šest řádek v každé, v řádku bylo25 semen. Komůrky pak tyly postříkány postemergentnějedenáct dní později PURSUITem^ v dávce 200 g/ha. PUR-SUIT™ byl aplikován jak je popsáno výše. -33-

Tato dávka PURSUITu™ se ukázala jako lethálnípro vnímavý typ pšenice, zatímco se ukázala jako nelethál-ní pro heterozygotjí nebo homozygotní rezistentní typy.Segregace na herbicidní rezistenci u tohoto potomstvapotvrdila, že vlastnost rezistence pro každou ze Čtyřselekcí /FS1-FS4/ je dědičná jako jediná dominantní nebosemidominantní vlastnost. Fg potomstvo každého ze čtyřkřížení poskytuje zřejmý poměr 3i1 /rezistentní/vní-mavý/ při postemergentním: postřiku PURSUITem™ v dávce200 g/ha.

Pokus 5: Eyla provedena křížení a reciproční kříženíčtyř mutantovýcH selekcí pšenice. Semena Fj z těchtokřížení byla vyseta a rostliny byly ponechány k samo-opylení. Byla sklizena semena Fg a v tomto pokusu bylapoužita ke stanoveni alelismu těchto čtyř selekcí. Ko-můrky byly naplněny půdou ^etro ^ix: 350®1 a osety 100semeny z jednoho křížení /čtyři řádky po 25 semenech nařádku/· Kromě toho byla oseta v každé komůrce jednařádka citlivé pšenice Fidel. Z každého křížení bylypoužity tři zdroje. Při dosažení semenáčů stadia Z12 bylykomůrky.postříkány PUHSUITem^ v dávce 200 g/ha. RoztokPURSUITu^4 byl aplikován jak již bylo popsáno, čtyřitýdny po ošetření byl stanoven počet rezostentních je-dinců vůči počtu vnímavých rostlin.

Studie alelismu mezi čtyřmi rezistentními selekce-mi pšenice prokazují, že všechny selekce jsou alelickénebo těsně spjaté, ^ři mezikřížení mezi selekcemi v ge-neraci Fg bylo zjištěno jen málo nebo žádné vnímavé vní-mavé rostliny. I v případě, že geny jsou nealelické a.nepojené předpokládá se, že potomstvo se dělí v poměru15 /rezistentní/:1 /vnímavé/. V tabulce 3 jsou uvedenyvýsledky těchto geneticky podmíněných stavů. 34-

Tabulka 3 : Studie genetických stavů: Počet rostlin,které jsou rezistentní/citlivé na 200 g/haPUBSUITu®4. Údaje jsou vztaženy na dobu třítýdnů po ošetření.

Zdroj rezistentní vnímání zdroj rezistentní vnímavý /FS1/FS2/S-2 71 1 /FS2/FS1/X-1 95 0 /FS1/FS2/X-2 85 1 /FS2/FS1/X-2 91 0 /FS1/FS2/X-3 74 t /FS2/FS1/X-3 97 0 celkem 230 4 celkem 283 0 /fsi/fs3/x-i 82 0 /FS3/FS1/X-2 95 0 /FS1/FS3/X-2 92 0 /FS3/FS1/X-3 97 0 /FS1/FS3/X-3 93 0 /FS3/FS1/X-5 94 i celkem 267 0 celkem 286 t /FS1/FS4/X-1 96 0 /FS4/FS1/X-1 93 1 /FS1/FS4/X-2 90 0 /FS4/FS1/X-2 91 0 /FS1/FS4/X-3 93 2 /FS4/FS1/X-3 94 1 celkem 279 2 celkem 278 2 /FS2/FS3/X-1 99 0 /FS3/FS2ýX-1; 96 0 /FS2/FS3/X-2 87 1 /FS3/FS2/X-2 94 0 /FS2/FS3/X-3 92 0 /FS3/FS2/X-3 96 0 celkem 278 1 celkem 286 0 /FS2/FS4/X-1 102 0 /FS4/FS2/X-1 94 0 /FS2/FS4/X-2 97 0 /FS4/FS2/X-2 95 1 /FS2/FS4/X-3 97 1 /FS4/PS2/X-3 95 0 celkem 296 1 celkem 284 1 ZPS3ZPS4/X-1 98 0 /FS4/FS3/X-1 96 0 /FS3/FS4/X-2 96 0 /FS4/TS3/X.-2 100 0 /FS3/PS4/X-3 96 0 /FS4/FS3/X-3 94 0 celkem 290 0 celkem 290 0 35- 7 žádném případě není počet vnímavých segregantůblížící se 1/16 celkového počtu /tabulka 3/. Rovněž ne-byly pozorovány žádné mateřské účinky na dědičnost. Tytoúdaje podporuji pravděpodobnost, že všechny čtyři se-lekce jsou odvozeny od té semé mutační událostí nebojsou s ní velmi těsně spojeny.

Pokus 6: Semena potomstva samoopylení z druhého zpět-ného křížení rezistentních mutantů s typem í*idel /vní-mavý progenitorový kultivar/ byla vyseta do standardníchkomůrek naplněných půdou Metro Mix 350™. Třicet semen

bylo vyseto na jeden zdroj. Sedm až deset dnú po vysetiTM byly tyto komůrky postříkány PURSUITem v dávce 200g/ha jak je výše popsáno. Tři týdny po ošetření bylyrostliny hodnoceny z hlediska segregace vlastnosti re-zistence. Jak bylo předpokládáno, určitá část potomstvaje zcela rezistentní, další část se z hlediska resisten-ce dělíjtj. někteří potomci jsou rezistentní a někteřípotomci.jsou vnímaví, zatímco další část potomstva jeplně vnímavá na herbicid. Homozygotně rezistentní rost-liny se vyberou a použijí k namnožení semen /ve školce/k získání rezistentního kultivaru zlepšených vlastností. Příklad 3

Studie herbicidní rezistence 1· úroveň a spektrum herbicidní rezistence V tomto testu ve skleníku byla hodnocena úroveň a spektrum herbicidní rezistence mutautových selekcína úrovni celého kultivaru, Uyly zkoušeny čtyři imidazo-linony /PURSUIT™, SCEPTER™, JRSEN^L™ a sloučenina 2/a jedna sulfonylmočovina /OUST™, registrovaná ochrannáznámka E.l.du Pont De Nemours and Company, kterou jemethylester· Ο-//3-/4,6-dimethylpyrimidin-2-yl/ureido/- -36 sulfonyl/-benzoové kyseliny/· Sloučenina 2 je imidazoli-non s potenciálně krátkým reziduálním účinkem a znamená2-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-5-/metho-xymethyl/-nikotlnovou kyselinu· Rychlost růstu, stanovenávýškou.rostlin, se srovnává s neoáetřenými kontrolnímivzorky. Semena odvozená od rostlin které bylyscreenovény na herbícádní rezistenci za použití dvou-stupňového výběru /namáčení semen a postřik/ a z nescree-novaňých zásobních rostlin, byla shromážděna poté, cobyla.prokázána jejich nesegregační vlastnost /viz sefcre-gační studie/· Tyto linie byly shromažďovány podle jejichmateřských linií: PSI, PS2, PS3 a FS4. Jako kontrolnívzorek. a pro srovnávací účely byl použit typ Pidel/divoký typ/· Pět semen z každé z těchto linii /včetnětypu Pidel/ bylo samostatně vyseto do ěestipalcovýchazalkových květináčů a později byl jejich počet omezenna tři rostliny na květináč· Na jedno ošetření /druhchemického ošetření a dávka/ byla užita tři stanovenípra každou linii a šest stanovení pro linie pšenice po-užité jako neošetřené kontrolní vzorky· Rostliny bylypostříkány postemergentaě deset dní po vysetí následují-cími herbicidy v následujících dávkách: imidazolinony: pursuit™ 20, 40, 80, 160, 320 g/ha SCEPTER™ 40, 80, 160, 320, 640 g/ha áRSENáL™* 3, 6, 12, 24, 48 g/ha sloučenina 2 20, 40, 80, 160, 320 g/ha sulfonylmočovina· OUST™ 5, 10, 20, 40, 80 g/ha -37- /*Poznámka: Rostliny stříkané ARSEN ALEM™ se vysejí třidny dříve než rostliny ošetřované ostatními způsoby,nicméně hodnocení je provedeno současně s ostatnímizpůsoby ošetření· Kromě toho, přest&amp;Že byly hodno-ceny tři pokusy jednotlivých dávek ARSEN ALu™, v kvě-tináčích byly přítomny převážně dvě rostliny místotří/· K roztokům herbicidů byl před postřikem přidán K roztokům herbicidů byl před postřikem přidán Tween 20™v dávce 0,25 % obj./obj. Herbicidy bylyr aplikovány labo-ratorním pásovým rozprašovačem v dávce 400 l/ha vevýšce 18 palců nad rostlinami pšenice při rychlosti pá-su 8,2 s«ot"1 za použití rozstřikovací trysky č. 65015E.Výšky rostlin se měří bezprostředně před postřikem a pákv jednotýdenních intervalech po dobu čtyř týdnů.

Uvedené čtyři selekce jsou podobné jak z hlediskajejich spektra tak z hlediska úrovně jejich rezistence.

Typ PS3 je o něco méně rezistentní než ostatní tři se-lekce. Jelikož typ PS3.byl selektován jako heterozygot,mohou být v těchto pokmsech zahrnuta neúmyslně semenaheterozygotní nebo vnímavá. Na základě vzrůstu rostlinčtyři týdny po ošetření bylo zjištěno, že mutantní pše-nice je rezistentní na dávku více než 320 g/ha PURSUITu ,více než 640 g/ha SCEPTERu™, více než. 48 g/ha ARSENALu™,více než 80 g/ha sloučeniny 2 a více než 5 g/ha OUSTu™· •Fy to hodnoty lze předvést na přibližně 8násobné zvýšenítolerance vůči PURSUITu™, více než 16-násobné zvýšenítolerance vůči SCEPTERu™ a ARSENALu™, 16-násobné zvý-šení tolerance vůči sloučenině 2 a 2-násobné zvýšenítolerance vůči OUSTů™. Na obrázcích 7-10a je znázorněnatolerance jednoho mutantu selekce pšenice /PS1/ vůčipříslušným herbicidům, ARSEN AL™, OUST™, PURSUIT™,SCEPTER™ a sloučenině 2. —38— 2. Preemergentní herbicidní tolerance

TM V tomto pokusu byly aplikovány imidazolinony PURSUIT ,áRSEMJL , sloučenina 2 a suli onylmočovina - préemergentně/na rozdíl od postemergentní aplikace popsané v části 1příkladu 3/ na odrůdu pšenice Pidel a herbicidně rezis-tentní selekce PS2 a FS4 k hodnocení jejich tolerance naherbicid. V tomto pokusu byla použita semena dvou mutša-tových selekci FS2 a FS4 a semena vnímavé odrůdy Fidel.

Do šestipalcových azalkových.květináčů bylo vyseto popěti semeneclx od každého typu pšenice do Sassafras-půdy/písčité zeminy/· Pro jeden typ ošetření a danou dávkuse použilo čtyř paralelních.pokusů pro každý typ pše-nice a šest paralelních pokusů pro každý typ pšenice vneoáetřených kontrolních vzorcích. Následující den povysetí semen byly květináče postříkány následujícími her- bicidy « uvedených dávkách: PURSUIT™ 40, 80, 160, 320, 640 g/ha Sceptejr™ 40, 80, 160, 320, 640 g/ha ársenal™ 2,5, 5, 10, 20, 40 g/ha sloučenina 2 5, to, 20, 40, 80 g/ha oust™ 5, 10, 20, 40, 80 g/ha

Herbicidy byly aplikovány postupem výše uvedeným./Hladina a spektrum herbicidní rezistence/· Po postřikubyly květináče zavlaženy. Výška rostlin byla měřena čty-ři týdny po ošetření. -39-

Na základě růstu rostlin po čtyřech týdnech bylozjištěno, že selekce PS2 a FS4 mají přibližně Qnásobnězvýšenou toleranci, vůči ŠRSEřULu™ a PURSUITu™ /obr·12 a 13/ a 8 až 16ti násobně zvýšenou toleranci vůčisloučenině 2 /obr. 14/ a SCEPTERu™ /obr.11/. Zvýšenítolerance vůči OUSTu se ukazuje být 2 až 4násobné.Podobné výsledky byly pozorovány pro přírůstky kořenůa výhonů /hmotnostní/, stanovených sedm týdnů po ošet-ření. 3. Postemergentní herbicidní tolerance V tomto druhém pokusu ve skleníku tyly hodnoceny horní limity rezistence na postemergentní aplikace PUS-_ TM" SUITu a-sloučeniny 2. V tomto pokusu byla použita se-mena mutantových selekcí PS2 a PS4 a semena typuPidel. Pět. semen každého typu bylo vyseto na jedenšestipalcový azalkový květináč db; sterilní půdy MetroMix 350®®. Bezprostředně před ošetřením herbicidem byXpočet rostlin zmenšen na tři rostliny na květináč. Třiparalelní stanoveni byla použita na jedno ošetření /typherbicidu a dávka/ pro každý typ pšenice a šest para-lelních stanovení pro neošetřené kontrolní vzorky.

Rostliny pak byly ošetřeny postřikem postemergentně 10dní po vyseti následujícími herbicidy a dávkami /g/ha/:PURSUIT™: 10, 25·, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500 sloučenina 2:2,5, 5, 10, 25, 90, 100, 250, 500 herbicidy byly aplikovány jak již bylo popsáno. Výš-ka rostlin byla měřena bezprostředně před postřikem. Výška rostlin byla také měřena dva a čtyři týdny po ošet-ření a hmotnostní přírůstky výhonů byly měřeny {jeden týdenpo ošetření. -40-

Dva týdny po ošetření ve všech kombinacích vykazo-valy selekce opožďující symptomy ve srovnání s neošet-řenými kontrolními vzorky /obr. 15 až 17/· Nicméně čtyřitýdny po ošetření byly výšky rostlin PS2 a FS4 stejnéjako u neošetřených kontrolních rostlin při dávkách 500až 1000 g/ha PURSUITu™ /obr.16/ a 25 až 50 g/ha slouče-niny 2 /obr. 18/, Uvedené selekce vykazují 40 až lOOná- TKff sobné zvýšení tolerance vůči PURSUITu a sloučenině 2aplikovaným postemergentně postupem, v tomto testu vesrovnáni s typem. Fidel /neselektováným/. Údaje vztaženéke hmotnostním přírůstkům výhonů sedm týdnů po ošetřeníukazují, že ^S2 a PS4 mají hmotnostní přírůstek výhonůrovný 90 až 100 % vzhledem, k přírůstkům kontrolních rost-lin /obr.19 a 20/. 4· Preemergentni tolerance na sulfamoylmočovinu K určení, zda selekce pšenice rezistentní k imida-zolinonům. znamenají rovněž rezistenci na herbicidy nabázi sulfamoylmoČoviny byly provedeny dva pokusy. Rezis-tence na. čtyři suliamoylmočovinové herbicidy /popsanédále/ a jeden sulfamoylmočovinový herbicid /OUST™/ bylatestována v postemergentním a preemergentním testu· V prvním pokuse byla vyseta semena selekto- vaných mutantů pšenice PS2 a semena typu Pidel do šesti-palcových azalkových květináčů do Sassafrasové půdy /pís-čitá zemina/· Původně byla vyseta tři semena na květl-náč,potom byly rostliny omezeny na dvě. yljR provedenytři paralelní stanovení pro každé ošetření, Mimoto bylopoužito patnáct paralelních pokusů s neošetřenými rost-linami jsk pro typ Ridel ták pro PS2. Rostliny byly po-stříkány preemergentně následujícími herbicidy a dávkami. 41-

Sulfamoylmočovinyi sloučenina 3 12,5, 25, 50, 100, 200 g/ha sloučenina 4 62,5, 125, 250, 500, 1000 g/ha sloučenina 5 12,5, 25, 50, 100, 200 g/ha sloučenina 6; 12,5, 25, 50, 100, 200 g/ha

Sloučenina 3 je 1-/4-methoxy-6-methyl-s-triazin-2-yl/-3-//o-propionylfenyl/sulfamoyl/močovina, slouče-jšlna 4 je1-/4,6-dimethoxy-2-pyrimidinyl/-3-//o-pro-pionylfenyl/sulfamoyl/močovina, sloučenina 5 je 1.-//o-ac e ty lf enyl/s ulf amoyl/- 3-/4-me thoxy-6-me thyl- 2-pyri-midinyl/močoyina a sloučenina 6 je 1-//o-acetylfenyl/-s ulf amoyl/- 3~/4-me thoxy-6-me thyl-s- tri azin- 2-yl/no č ovi-ne. Všechny čtyři sloučeniny jsou popsány v US patentuč. 4622065·

Sulf onylmočovin a : OUST™ 1,56, 3,125, 6,25, 12,5, 25 g/ha

Herbicidy byly aplikovány jak je popsáno dříve. V preemergentním testu byla pozorována velmi nízkáemergence a opět nebyly pozorovány Žádné rozdíly mezitypem Pidel a rezistentními selekcemi. 5. Postemergentní tolerance vůči sulf amoylmočovině V druhém pokusu byla vyseta semena M^-M^ z mutan—tové pšeničné selekce PS2 a semena typu Pidel do šesti-palcových azalkových květináčů do sterilní půdy ^etroMix 3501^. Původně byla vyseta tři semena na květináč,postupně byly rostliny omezeny na dvě. Pro každý typošetření byla použita tři paralelní stanovení. Mimoto -42- bylo zahrnuto 15 paralelních pokusů neoSetřených kon-trolních rostlin jak typu Pidel ták ^32. Rostliny bylypostříkány postemergentně, 12 dní po vysetí následující-mi herbicidy v? uvedených dávkách:

Sulfamoylmočoviny:sloučenina 3 12,5, sloučenina 4 62,5, sloučenina 5 12,5, sloučenina 6 12,5, s ulf ony lmo Č ovina:OUST™ 6,25, 25, 50, 100, 200 g/ha125, 250, 500, 1000 g/ha25, 50, 100, 200 g/ha25, 50, 100, 200 g/ha 12,5, 25, 50, 100 g/ha

Herbicidy byly aplikovány jak je dříve popsáno.

Rezistentní a vnímavá pšenice byla ošetřována dávkamiherbicidů, o kterých se předpokládalo, že způsobí výraz-né, poškození až lethalizu vnímavých typů pšenice. Bohužel,vnímavý kultivar pšenice /Pidel/ nebyl ovlivňováni /přivizuálním, hodnocení/ ani nejvyššími dávkami sulfamoyl-močovinových herbicidů v postemergentním testu. Buňto je?pšenice typu Fidel relativně tolerantní na herbicidy^ nabázi sulf amoylmočoviny, nebo? dávky nejsou dostatečněvysoké, aby vyvolaly poškození, nebo herbicid nenyvolávápoškození z nějakých jiných důvodů /formulace, vliv ži-votního prostředí atd./. Týp rezistentní, pšenice vyká—zuje 2-4násobné zvýšení tolerance vůči OUSTu v tomto?pokusu. ®yto výsledky jsou podobné výsledkům získanýmiv předchozích pokusech. -43- 6. Spektrum. herbicidní rezistence pšenice 7 tomto pokusu byla zkoumána tolerance imidazolinon- rezistentní pšenice na tři sulfonylmočovinové herbicidy/BEJCON™, CláSSIC™ a OUST33* /BEJCOH™ Je registrova-ná ochranná známka Ciba-Geigy a je to 2-/4,6-bis=/difluor methoxy/-pyrimidin-2-ylkarbamoylsulfamoyl/benzoová

TM kyselina, CLJSSIC ge registrovaná ochranná známka E.I.du Pont de Nemours and Company a je to ethylester O-///4-c hlor-6-methoxy-2-pyrimi dinyl/-k arb amoy1/sulfamoy1/-benzoové kyseliny/, sulfamoylmočovinovým herbocódem/sloučenina 3/, sulfonylkarboxamidem /sloučenina 1/ aimidazolinonovýmherbicidem /sloučenina 7, kterýk je 3-/4-isopropyl-4-me thy1-5-oxo-2-imid azolin-2-yl/- 2-methyl-krotonová kyselina/ s cílem zjištění křížovétolerance vůči herbicidům unhibujícím áHJlS jiným než imi-dazolinonům. .Semena mutantové selekce pšenice PS2 a semena typu Pidel byla vyseta do pětipalcových azalko-vých květináčů do sterilní půdy Metro-líix 350^. Ρύνοφ-ně byla vyseta tři semena na květináč, později byl po-čet; rostlin omezen na dvě· Každý pokus s ošetřením spo-číval vetřech paralelních stanoveních. Kromě toho jakokontrolních neošetřených rostlin bylo použito šesti pa-ralelních stanoveni oď. typu FS2 i od typu Pidel. Rost-liny byly-postříkány postemergentně;, sedm dní po vyse-tí následujícími herbicidy a dávkami*

SulfonyImočoviny * BEXON™ 15,6, 31,3, 62,5, 125, 250 gAa CLáSSIC™ 31,3, 62,5, 125, 250, 500 g/ha OUST™ 6,25, 12,5, 25, 50, 100 g/ha -44

Sulf amoylmoč ovin a: sloučenina 3 125, 250, 500, 1000, 2000 g/ha

Sulfonylkarboxamid:

Sloučenina 1 250, 500, 1000, 2000, 4000 g/ha

Imidazolinony:

Sloučenina 7í 187,5, 375, 750 g/ha

Herbicidy byly aplikovány způsobem, již popsaným.Bostliny byly hodnoceny druhý, třetí a čtvrtý týden, poaplikaci herbicidu· Křížová rezistence na sulfamoylmočoviny /obr.21,22 a 24/, sulfamoylmočovinu /obr .23/ nebo sulf onylkar box amid

Xobr.25/ je 0 e&amp; 2násobná a je podobná rezistenci po-ww zorované v dřívějších pokusech s OUSTem. , fiezis tence naimidazolinonovou sloučeninu 7 je podobná rezistencidříve pozorované pro PUHSUIF® nebo JRSENéL·®^ /větší než10ti násobná/· Nebylo pozorováno žádné patrné zvýšenírezistence na ne-imidazolinonové herbicidy. Příklad 4 - Zkoušky na poli

1.Polní pokus I

Polní zkouška byla provedena k hodnocení toleranceimidazolinon-rezistentních pšeničných selekcí FS1-FS4 naposteaergentně aplikované imidazolinonové herbicidy. Od-růda Fidel, od které jsou tyto selekce odvozeny, je zahr-nuta jako kontrolní. Jelikož Bidel je francouzská odrůdaozimé pšenice nevhodná pro New Jersey, byl tento testurčen spíše k hodnocení relativních, účinků hernicidníchošetřeni, na výtěžkjjt obilí než na absolutní výtěžek jed-notlivých genotypů. řroto jsou také výtěžky uváděny jako -45- gramy/políčko místo bušly/akr nebo t/ha. Při tomto pokusu na poli byla použita shromážděnásemena M4 mateřských linií PS1, FS2, PS3 a PS4 a původ-ního typu Fidel. Zkouška byla provedena na neúplně roz-děleném políčku s hlavní plochou pro herbicidní ošet-ření a oddělenou plochou pro genotypy. Pro každé ošet-ření byly provedeny tři pokusy /pro dávku a druh chemi-kálie/, pro mutantovou pšeničnou selekci však nebylaprovedena souběžná stanovení č.2 a č.3 vzhledem k malé-mu počtu shromážděných semen. Políčka jsou přibližná třimetry dlouhá a 1,5 metru široká /7 řádek se 7 palcovýmimezerami mezi řádky/ s výsevem asi 25 semen na řádek.Mezi jednotlivými pšeničnými liniemi je metrová mezeraa mezi souběžnými pokusy mezera desetimetrová. . E|yla provedena následující ošetření:neošetřené kontroly PDESUIT™ 100 a 200 g/ha sloučenina 2 50 a 100 g/ha sloučenina 8 100 a 200 g/ha

Sloučenina 8 je 5-formyl-2-/4-isopropyl-4-methyl—5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-nikotinová kyselina -5-/di-methylacetal/ a je popsána v publikované evropské paten-tové přihlášce č. 322616. Ošetření bylo provedeno v dávce 400 1/ha postřiko-vačem napojeným na traktor. Jako povrchově aktivní látkabyl použit Tween 20™. Pšenice byla ošetřena ve stadiuZ22 nebo přibližně při výšce 6 palců. Výška rostlin astupeň poškození byly hodnoceny v době 3 a 6 týdnů popšetření. Výtěžky byly hodnoceny 10 týdnů po ošetření. -46- Tři týdny po ošetření se rezistentní selekce pše-nice jeví být neovlivněny herbicidními ošetřeními přihodnocení výšky rostlin /obr. 27/. Žádné zjevně viditelnéúčinky ošetřeni herbicidy nebyly pozorovány. V neošetře-ném stavu byly tyto selekce nepatrně kratší ve srovnánis neošetřeným/ typem Fidel. Vnímavý kultivar Fidel bylnásledkem těchto ošetření težce zakrnělý. Šest týdnů po ošetření byla výška rostlin rezis-tentních selekcí pšenice stále neovlivněna ošetřenímherbicidem /obr. 28/. Týp Fidel byl těžce zakrnělý neborostliny uhynuly následkem ošetření herbicidy ve srovnánís rezistentními selekcemi, které jsou zjevně těmito ošet-řeními neovlivněny. Konečná výška rostlin neošetřenýchselekcí, byla téměř stejná jako výška neošetřených rost-lin typu Fidel, ačkoliv v době tří týdnů po ošetření se-lekce hyly nižší než neošetřené rostliny typu Fidel.zdé se, že rezistentní selekce pšenice rostou poněkud po-maleji než neošetřené rostliny typu Fidel pravděpodobněvzhledem k nežádoucím recesivním. mutacím. Týto recasivnímutace lze odstranit metodami zpětného křížení, kteréjsou pracovníkům v oboru známy.

Typy FS1, FS2 a FS4 nevykazují žádná snížení výtěžkůpo postemergentním ošetření jakýmkoliv z uvedených her- ______ ΦΜ bicidů. Ha rozdíl od nich typ Fidel při ošetření PUBSUITemvykazuje 3596 snížení výtěžku a více než. 7556 snížení výtěž-ku při ošetření ostatními herbicidy, ^eošetřené rostlinytypu Fidel .měly výrazně vyšší výtěžek než typ FS1 neboFS4 /příslušné výtěžky 133 g/políčko, 40 g/políčko a 76g/políčko/. Střední výtěžek typu FS2 /98 g/políčko/ byltaké nižší než výtěžek neošetřeného typu Fidel, ale desátýtýden po ošetření nebyl nižší výrazně /obr. 29/. Hižší -47- výtěžky těchto selekcí nejsou neočekávané, autanti vy-kazují menší vitalitu a naturalizaci rostliny pravděpo-dobně díky přítomnosti nežádoucích genů, působícíchmutagenezi, ale nemajících souvislost s vlastností re-zistence vůči. imidazolinonu. Poněkud překvapující je, žetypy FS1, FS2 a FS4 vykazují tak velké diference vevýtěžcích vezmeli se v úvahu, že všechny tři typy jsouvelmi pravděpodobně odvozeny od stejného mutačníhopodnětu· Tyto selekce se jeví být zcela rezistentní naošetření herbicidy jak z hlediska výšky rostlin tak z.hlediska výtěžků zrn.

2.Polní poku H

Druhá studie na poli byla provedena s cílem hodno-cení tolerance imidazolinon-rezistentní selekce pšeniceFS4 na postemergentní aplikaci imidazolinonových her-bicidů - PURSUITu™, C4DRE™, sloučenina 2 a sloučenina8 a sulfonylmočovinového herbicidu*- JCCENT™. CěDRE™je registrovaná ochranná známka American Cyanamid Com-pany. C-fiDRE je 2-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imida-zolin-2-yl/-5-methylnikotinováÍ kyselina a je popsána vUS.patentu č. 4798619· JCCENT je registrovanou znám-kou E.I.du Pont de Nemours and Company a je 1-/4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl/-3-/3-dime thylk arb amoyl-2-pyridylsulfonyl/močovina. *?ako vnímavá kontrolní odrůda bylzahrnut typ ^idel.

Semena z linii PS4 nejvyššího výtěžku při polnízkoušce I byla shromážděna a použita v této polní zkouš-ce současně se semeny typi Pidel. Zkouška byla proves-denana neúplně rozděleném políčku s hlavní plochou ur-čenou pro herbicidní ošetření a oddělenou plochou urče-nou pro genotypy. Bylo provedeno jedenáct ošetření otřech opakováních pro každé ošetření /druh chemikálie adávka/. Políčka byla tři metry dlouhá a 1,5metru široká -4ε-

Imidazolinony:PUBSUIT™ 100 a 200sloučenina 2 50 a 100 sloučenina 8 100 a 200 CJDRE™ 50 a 100 sulfonylmočovina:éCCEÍT™· 20 a 40 /7 řádek se 7 palcovou mezerou mezi řádky/ s hustotousadby přibližně 100 semen/m . Mezi liniemi pšenice bylaudržována mezera 0,5 metru a mezi dalšími stanovenímimezera tři metry·

Syla provedena následující ošetření:neošetřené kontrolní rostliny g/hag/hag/hag/ha g/ha Ošetření bylo provedeno dávkou 200 1/ha pomocízpětného postřikovače· Jako smáčecí činidlo byl použitX-77"^, neionogenní povrchově aktivní látka, o koncentraci0,2? % obj./obj·. Pšenice byla ošetřena ve stadiu Z27-Z28,kdy rostliny byly přibližně 30-35 cm vysoké. Hodnocenívýšky rostlin a stupem jejichž poškození bylo provedeno1.r 2., a 3· a 6. týden po ošetření. Hodnocení výtěžkůbylo provedeno 10 týdnů po ošetření.

Po třech týdnech bylo zjištěno, že růst rostlin typuPidel je těžce inhibován všemi typy herbicidních ošetření.Rezistentní selekce PS4 vykazují toleranci ke všem testo-vaným imidazolinonům, nicméně nebyla pozorována křížovárezistence, na sulfonylmočovinový herbicid /JCCENT®^/· Obr.30 znázorňuje hodnocení provedená v šestém týdnu po ošet-ření, ze kterých vyplývá, že postemergentní ošetření PUR- -49-

TM TM SUITem. , CJDREa , sloučeninou 2 nebo sloučeninou 8nemá žádný vliv na konečnou výšku rostliny, ^ato rezis-tentní pšenice má však malou nebo žádnou snášenlivá^ vůči TM w áCCENTu . Srovnávací vnímavá odrůda těžce zahrnuje nebohyne při těchto dávkách, herbicidů. Výtěžky zrní vyjádře-né jako průměr ze tří stanovení jsou znázorněny na obr.31· Výtěžek zrní rezistentní selekce pšenice FS4 nenísnížen při žádném z ošetření imidazolinonovým herbici-dem. Výtěžky typu Fidel jsou těžce omezeny nebo elimi-novány pj£o ošetření imidazolinonovým! herbicidy. Jak:rezistentní typy tak vnímavý typ Fidel poskytují jen.malý nebo žádný výtěžek zrní po ošetření herbicidemJCCENT^. Účinky, vyplývající z ošetření typu Fidel.imidazolinony jsou. daleko horší než redukce výšek rost-lin popsaná výše.

Rezistentní pšenice použitá v této zkoušce na polibyla získána shromážděním několika výtěžků sklizených přizkoušce na poli I» Na každé další políčka byla vysetasemena od jedné rostliny, ^řestože s tímto typem mate-riálu nebylo provedeno žádné zpětné křížení na typ Fi-del, zdroje semen, s nízkou klíčivosti a agronomiekou účinností bylo možné vyloučit. Výsledkem bylo, Že výtěžky-zrní rezistentních selekcí se o mnoho zlepšily ve srov-nání s pokusem na poli I. Výtěžky získané u rezistentníchtypů pro neošetřené kontrolní rostliny byly stejné jakopro neošetřené rostliny vnímavého typu Fidel. To indi-kuje, že zahrnutí genu pro imidazolinonovou rezistencinemá vlastní účinek na výnos zrní. Příklad 5

Enzymová studie 1 · Úvodní stanovení rostliny/ .Aplikace herbicidu: rostliny, pocházející ze čtyř -50- původních mutantních rostlin /PS1, PS2, PS3 a PS4/, byly testovány na cnetabolickou. účinnost AHAS /acetohydroxyky- selina-syntása/. Rostliny, vykazující rezistenci po na- močení semen a screenu po postřiku PURSUITem™ byly pře- vedeny z komůrek do jednotlivých květináčů. Po dosažení stáří rostliny tři týdny, održely dvě rostliny každé mutantové selekce PS1-PS4 další PURSUITu™ v dávce 62,5 g/ha, zatímco dvě rostliny od každé selekce zůstaly neošetřeny. V tomto pokusu byljr rovněž zahrnuty ošetře- ní a neošetřenécrostliny vnímavého typu Pidel. Přibližně jedna polovina listoví nad linií zeminy z každé rostliny se odejme dva dny po aplikaci herbicidu a stanoví se in- hibice AHAS pomocí valinu a leucinu /jako kontroly/, SCEPTERu™, PURSUITu™, OUSTu™ a sulfonylkarboxamldo- vého herbicidu, sloučeniny 9. Sloučenina 9 je 2-acet- amido-2,3-dimethyl-®-/p-tolylsulfonyl/butyrami<$ a je popsána v US patentu č. 4883914· U nepostříkaných rostlin byla patrná slabá rezis-

tence na PURSUIT- u rezistentních typů pšenice. NicméněTM výrazné zvýšení AHAS rezistence na PURSUIT je patrné při postřiku typů PSI-PS4 ve srovnání s postříkaným nešlechtěným typem. Obr.32-35 znázorňují výsledky pro . j jedem ze čtyř rezistentních selekcí ?FS1/ a pro nešlech-těný /vnímavý/ typ Fidel. Z těchto výsledků se jeví, že rezistence PS1-PS4 na PURSUIT™ je způsobena přeměnoutu AHAS, která je rezistentní k inhibici PURSUITem ·

Extrakce enzymu: Pro extrakci AHAS bylo upráškováno10 graaů tkáně v kapalném dusíku a pák homogenizovánov pufru fosforečnanu draselného 100 mM /pH 7,5/, obsahu-,jícím 10 mM pyruvátu,5 mM MgClg, 5 /uM BOTA, 100 /UM PAD, -51- 1 mM valinu, 1 mM leuci.au, 10 % glycerinu a 10 mM cys-teinu. Homogenát byl pak zfiltrován přes nylonovou tka-ninu /53 uM mesh/ a pák odstředěn při 25 000 g po dobu20 minut. Supernatant byl uveden, do 50% nasycenosti po-mocí /HH^/gSO^ a ponechán stát 20 až 30 minut na ledu.^ak byl odstředěn při 25000 g po dobu 20 minut a super-natant byl odstraněn. Pelety síranu amonného byly roz-puštěny v pufru fosforečnanu draselného 50 mM /pH 7,5/,obsahujícím: 1 mM EDTA a 100 mM NaCl a roztok byl po-užit. pro stanovení obsahu.

Stanovení JffiUS: Účinnost ěHJS byla měřena hodnocenímproduktu, acetolaktátu, po konverzi dekarboxylací zapřítomnosti kyseliny na acetoin· Standardní reákčnísměsi obsahovaly. enzym v 50 mM pufru fosforečnanu dra-selného /ρΗ*7,0/, který obsahoval 100 mM pyruvátu sod-ného, .10 mM MgClg, .1 mM thiaminpyrofosfátu a 10 /uM P JD.Tato směs byla inkubována při 37 °C po dobu jedné hodiny;a pák byla reakce ukončena přídavkem kyseliny sírové tako-vém, aby výsledná koncentrace; ve zkumavce byla 0,85 %HgSQ^. Keakční-produkt se nechá dekarboxylovat při-60°Cpo dobu 15 minut. Vytvořený acetoin se stanoví inkubacís kreatihent /0,17 %/ a 1-naftolea /1,7% roztok ve 4N NaOH/postupem podle? Westerfielda /Westerfieldi W.W., ď.Biol.Chem.,.161, 495-502 /1945//· Maximální zabarveni se dosa-huje po inkubaci při 60 °C po dobu 15 minut s další ίπ>kubací při teplotě místnosti po dobu 15 minut. -Absor-bance - barevného komplexu se měří při 520 nm. Kj» o vedeš sepříslušné ověření přímé tvorby acetoinu během, enzyma-tického stanovení. Každé stanovení se provede nejméněduplicitně a pokus se opakuje nejméně dvákrát. -52- 2. Enzymové stanovení I /rostliny M^/ -Aplikace herbicidu: Dvě komůrky byly osety přib- ližně 100 semeny od selekce pšenice /PSI, FS2 a PS4/ atypu FideL do sterilní půdy Metro Mix 350. Po desetidnech byla každá komůrka postříkána postemergentně tnu PURSUITem v množství 62,5 g/ha. Dávka postřiku byla400 l/ha při rychlosti pásu 8,2 s.ot"^ za použití tryskyδ. 65015E. Jako povrchově aktivní látka byl použitTween 20 o koncentraci 0,25 % obj./obj.. Rostliny bylysklizeny o tři dny později a byla stanovena účinnostIHéS.

Extrakce enzymu a stanovení ěHJS bylo provedenozpůsobem: výše popsanými. 3· Enzymové stanovení II /rostliny M^/

Jplikace: herbicidu: Byla provedena způsobem popsa-ným výše /enzymové stanovení 1/ s výjimkou toho, žedávka postřiku byla 950 l/ha při rychlosti pásu 12,8:s.ot“*1 za použití trysky δ. 40015E.

Extrakce enzymu a stanovení JHJS: bylo provedenozpůsobem: výše popsaným. Výsledky těchto dvou pokusů byly velmi podobné,účinnost /HŠS u všech čtyř homozygotníeh mutantovýchliní nepostříkaných rostlin je mírně rezistentní na PUR-SUIT™ ve srovnání s enzymem divokého typu &amp; kontrol-ních, rostlin /Pidel/. Nicméně výrazně vyšší hladiny mwr rezistence na PURSUÍT byly pozorovány u enzymu ze se-lekcí, které byly postříkány ve srovnání s enzymem, zpostříkaných rostlin typu Pidel /obr. 36-39/. Také byla -53- pozorována určitá rezistence na SCEPTER^ a OUST™, alev *PK/f úroveň rezistence oe nižší než pro PURSUIT . Spektruma úroveň; rezistence na různé herbicidy je u všechčtyř mutantů velmi podobná, z čehož lze usoudit, ževšechny čtyři mutanty vznikly následkem jednoho muta-genního podnětu. Tento závěr je potvrzen genetickýmipokusy popsanými výše·

Claims (10)

V /, \ -54- Γ i Ί3 S '' • .X7 'í i y · · « í o c· «- -2 j>m r-g< r--C ΓΠ N -< < ! LC X? cx o; PATENTOVÉ N A*H O K Y

1. Způsob screeningu pro výbě>r mutací, které zahrnujírezistenci vůči herbicidům inhibujícím acetohydrohy-kyselina-synthasu u pšenice, vyznačující se tím, že zahrnuje mutagenizaci semen, pšenice chemic-kým mutagenem vybraným ze skupiny, zahrnující azid sod-ný, N-methyl-N-nitrosomočovinu, N-ethyl-N-nitrosomo-δovinu, ethylmethansulfonát, hydroxylamin. a hydrazin,máčení pí mutagenizovaoých. semen do roztoku, obsahují-cího herbicid inhibující acetohydroxykyselina-synthasu,kde tento roztok obsahuje určitou třídu herbicidu inhi-bujícího acetohydroxykyselina-synthasu, vysetí těchtonamočených semen do půdy a postříkání půdy, obsahujícísemena herbicidem, inhibujícím acetohydroxykyselina-synthasu stejná nebo rozdílní třídy, která byla použitapři namočení semen. před. emergencí semenáčů z půdy,tak, že vyklíčení rostliny pšenice jsou normálníhovzhledu a jsou rezistentní ke třídě herbicidů, inhi-bujících acetohydroxykyselina-synthasu, použité vestupních namáčení semen a/nebo postřikování·

2» Způsob podle nároku 1, vyznačujíc í s ·t í.m, že herbicid inhibující acetohydroxykyselina-syn-thasu-použitý ve stupni namáčení semen je stejný jakove stupni postřiku.s®®®*!·

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující setím, že herbicid inhibující acetohydroxysynthasi použi-tý ve stupni namáčení semen je odlišný od herbicidupoužitého ve stupni postřiku semen· -55-

4* Způsob podle nároku 1, vy za a δ u j í c íse tím, že skupina herbicidů, inhibujících acetohyd-roxykyselina-synthasu. je vybrána ze skupiny, zahrnu-jící imidazolinony, sulf amoylmodoviny, sulfonylkarboxa-midy, sulřonamidy a sulfonylmočoviny.

5· Způsob podle nároku 4, vyznadující setí m, že imidazolinon je vybrán ze skupiny, zahrnující2-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-ni-kqtinovou kyselinu, 2-/4-isopropyl/-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-3-chinolinkarboxylovqu kyselinu,5-ethyl-2-/4-isopřopyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-nikotiňovou kyselinu, 2-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2- imidazolin-2-yl/-5-/methoxymethyl/-nikotinovqukyselinu, 5-formyl-2-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-nikotinoyou kyselinu, 5-/dimethyl-acetal/, 3-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-2-methyl-krotonovou kyselinu/, 2-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-5-methylnikotinoyottkyselinu a směs methyl-6-/4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl/-m-toluétu a methyl-2-/4-isopropyl·- 4-methyl-5-oxó-2-ímidazolin>-2-yl/-p-toluátu.

6. Mutant pšenice, který je rezistentní vůči tříděherbicidů, inhibujících acetohydroxykyselina-synthasu.

7· Semena, ze kterých může vyrůst rostlina pšenice,která je rezistentní ke třídě herbicidů, inhibujících.acetohydroxykyselina-synthasu.

8« Změněný enzym acetohydroxykyselina-synthasa,který je rezistentní ke třídě herbicidů, inhibujícíchacetohydroxykyselina-synthasu, kde je uvedený enzymzískán, a produkován v pšenici pěstované podle způsobuuvedeného v nároku 1· -56-

9· Mutant pšeničné rostliny, který je rezistentnívůči dvěma různým, třídám, herbicidů, inhibajícím aceto-hydroxykyselina-synthasu.

10· Semeno, ze kterého může být vypěstována rostlinapšenice, které je rezistentní ke dvěma různým třídám her-bicidů, inhibujícím acetohydroxykyselina-synthasu.