PT508161E - Trigo resistente a herbicida que inibe ahas e metodo para a sua seleccao - Google Patents

Description

-1 - DESCRIÇÃO "TRIGO RESISTENTE A HERBICIDA QUE INIBE AHAS E MÉTODO PARA A SUA SELECÇÃO"

CAMPO DO INVENTO

Este invento relaciona-se com a utilização de um método de escolha, de acordo com a reivindicação 1, para a selecção de mutações que confiram ao trigo resistência em relação aos herbicidas que inibem a acetohidroxi ácido sintase. Este invento também se relaciona com a utilização de uma semente de trigo resistente desenvolvida por este método.

FUNDAMENTOS DO INVENTO O primeiro passo enzimático comum à biosíntese em plantas dos amino ácidos de cadeia ramificada (valina, leucina e isoleucina) é catalisado pelo enzima acetohidroxiácido sintase (AHAS; também conhecido como acetolactato sintase; E.C.4.1.3.18). AHAS catalisa duas reacções paralelas: condensação de dois moles de piruvato para dar origem a acetolactato, e condensação de um mole de piruvato e de um mole de alfa cetobutirato para proporcionar aceto-hidroxibutirato. Este enzima é inibido pelos produtos finais da via (valina, leucina e isoleucina) e isto constitui um dos necanismos conhecidos de regulação desta via em plantas superiores. AHAS constitui o sítio alvo de várias classes de herbicidas não relacionados estruturalmente. Estes herbicidas incluem as imidazolinonas, as sulfamoilureias, as sulfonilcarboxamidas, as sulfonamidas e as sulfonilureias. A agricultura comercial em larga escala apoia-se intensamente em práticas de produção de colheitas em linha. A disponibilidade de herbicidas que eliminem de um modo selectivo ervas daninhas que causam problemas deixando entretanto as plantas das colheitas não danificadas constitui um componente major que possibilita estas práticas. Herbicidas que controlam a maior parte das ervas daninhas que causam problemas encontram-se disponíveis para a maior parte das colheitas major. Os herbicidas que inibem AHAS acima mencionados constituem um elemento chave no controlo das ervas daninhas. Estes mesmos herbicidas, podem falhar ervas daninhas importantes em certos nichos de areas de produção de colheitas. Também, herbicidas usados correntemente podem causar problemas de ordem ecológica ou constrangimentos nos custos ligados à sua utilização.

SUMÁRIO DO INVENTO

Existe a necessidade de desenvolver variedades de trigo que sejam resistentes a herbicidas que inibem AHAS. O desenvolvimento dessas variedades resistentes irá permitir que os produtores de trigo utilizem herbicidas que inibem AHAS, cuja utilização dá origem a taxas de aplicação reduzidas, contaminação da água do solo reduzida e toxicidade animal reduzida em comparação com outras classes de herbicidas.

Consequentemente, constitui um objectivo deste invento desenvolver um método de escolha para a selecção de mutações que vão conferir ao trigo resistência à inibição de AHAS.

Constitui um objectivo particular deste invento desenvolver um método de escolha para a selecção de mutações que possam conferir ao trigo resistência ao herbicida imidazolinona que inibe AHAS.

Constitui um objectivo adicional deste invento identificar selecções de trigo identificadas pelo novo método de escolha.

Estes objectivos são conseguidos por mutagénese de sementes de trigo com um mutagénio químico. Num primeiro passo de escolha, sementes são embebidas numa solução contendo herbicida que iniba AHAS. Num segundo passo de escolha após a plantação, solo contendo sementes é pulverizado com um herbicida que iniba AHAS antes da emergência de pequenas plantas a partir do solo. Estas pequenas plantas que emergem demonstram resistência a herbicidas que inibam AHAS.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

Nota: Os nomes químicos dos herbicidas com marcas de fábrica e Números de Compostos nesta Descrição Resumida dos Desenhos são indicados na porção Descrição Detalhada do Invento deste pedido. A Figura 1 representa o efeito do aumento de concentração do herbicida imidazolinona SCEPTER™ sobre o racio do número de plantas que apresentam um aspecto normal versus o número de sementes embebidas numa solução contendo herbicida imidazolinona. A Figura 2 representa o efeito do aumento de concentração do herbicida imidazolinona PURSUIT™ sobre o racio do número de plantas que apresentam um aspecto normal versus o número de sementes embebidas numa solução contendo herbicida imidazolinona. A Figura 3 representa o efeito do aumento de concentração do herbicida imidazolinona ARSENAL™ sobre o racio do número de plantas que apresentam um aspecto normal versus o número de sementes embebidas numa solução contendo herbicida imidazolinona.

As Figuras 4 e 5 representam o aspecto do trigo resistente ao herbicida imidazolinona, tratado com uma embebição da semente mais pulverização na pré-emergência contendo PURSUIT™, em comparação com trigo não resistente, não tratado. 0 trigo resistente situa-se no compartimento mais à esquerda na Figura 4; o trigo resistente situa-se no compartimento médio na Figura 5. A Figura 6 representa o aspecto do crescimento do trigo a partir de pequenas plantas M3, que são progénie de FS4. A Figura 7 representa uma comparação da altura da planta (em cm.) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus sementes M3 - M4 volumosas de FS1 quatro semans após o tratamento na pós-emergência com ARSENAL™. A Figura 8 representa uma comparação da altura da planta (em cm.) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus sementes M3 - M4 volumosas de FS1 quatro semanas após o tratamento na pós-emergência com OUST™. A Figura 9 representa uma comparação da altura da planta (em cm.) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus sementes M3 - M4 volumosas de FS1 quatro semans após o tratamento na pós-emergência com PURSUIT™. A Figura 10 representa uma comparação da altura da planta (em -5- cm.) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus sementes M3 - M4 volumosas de FS1 quatro semanas após o tratamento na pós-emergência com SCEPTER™. A Figura 10a representa uma comparação da altura da planta (em cm.) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus sementes M3 - M4 volumosas de FS1 quatro semans após o tratamento na pós-emergência com Composto 2. A Figura 11 representa uma comparação de crescimento (como uma percentagem de plantas de controlo) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus os mutantes de trigo M4 de FS2 e FS4 quatro semanas após o tratamento na pós-emergência com SCEPTER™. A Figura 12 representa uma comparação de crescimento (comõ uma percentagem de plantas de controlo) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus os mutantes de trigo M4 de FS2 e FS4 quatro semanas após o tratamento na pós-emergência com ARSENAL™. A Figura 13 representa uma comparação de crescimento (como uma percentagem de plantas de controlo) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus os mutantes de trigo M4 de FS2 e FS4 quatro semanas após o tratamento na pós-emergência com PURSUIT™. A Figura 14 representa uma comparação de crescimento (como uma percentagem de plantas de controlo) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus os mutantes de trigo MU de FS2 e FS4 quatro semanas após o tratamento na pós-emergência com herbicida imidazolinona, Composto 2. A Figura 15 representa uma comparação de crescimento (como uma percentagem de plantas de controlo) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus -6- os mutantes de trigo M4 de FS2 e FS4 duas semanas após o tratamento na pós-emergência com PURSUIT™. A Figura 16 representa uma comparação de crescimento (como uma percentagem de plantas de controlo) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus os mutantes de trigo M4 de FS2 e FS4 quatro semanas após o tratamento na pós-emergência com PURSUIT™. A Figura 17 representa uma comparação de crescimento (como uma percentagem de plantas de controlo) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus os mutantes de trigo M4 de FS2 e FS4 duas semanas após o tratamento na pós-emergência com Composto 2. A Figura 18 representa uma comparação de crescimento (como uma percentagem de plantas de controlo) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus os mutantes de trigo M4 de FS2 e FS4 quatro semanas após o tratamento na pós-emergência com Composto 2. A Figura 19 representa uma comparação do peso de rebentos recentes (como uma percentagem de plantas de controlo) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus os mutantes de trigo M4 de FS2 e FS4 sete semanas após o tratamento na pós-emergência com PURSUIT™. A Figura 20 representa uma comparação do peso de rebentos recentes (como uma percentagem de plantas de controlo) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus os mutantes de trigo M4 de FS2 e FS4 sete semanas após o tratamento na pós-emergência com Composto 2. A Figura 21 representa uma comparação do crescimento da planta (em cm.) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus o mutante FS2 a partir de semente M3 - M4 volumosa quatro semanas após tratamento na pós-emergência com CLASSIC™. A Figura 22 representa uma comparação do crescimento da planta (em cm.) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus o mutante FS2 a partir de semente M3 - M4 volumosa quatro semanas após tratamento na pós-emergência com um herbicida sulfonilureia, OUST™. A Figura 23 representa uma comparação do crescimento da planta (em cm.) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus o mutante F2 a partir de semente M3 - M4 volumosa quatro semanas após tratamento na pós-emergência com um herbicida sulfamoilureia, Composto 3. A Figura 24 representa uma comparação do crescimento da planta (em cm.) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus o mutante F2 a partir de semente M3 - M4 volumosa quatro semanas após tratamento na pós-emergência com um herbicida sulfonilureia, BEACON™. A Figura 25 representa uma comparação do crescimento da planta (em cm.) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus o mutante F2 a partir de semente M3 - M4 volumosa quatro semanas após tratamento na pós-emergência com um herbicida sulfonilcarboxamida, Composto 1. A Figura 26 representa uma comparação do crescimento da planta (em cm.) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus o mutante F2 a partir de semente M3 - M4 volumosa quatro semanas após tratamento na pós-emergência com um herbicida imidazolinona, Composto 7. A Figura 27 representa uma comparação da altura da planta (em cm.) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus os mutantes de trigo M4 de FS1, FS2 e FS4 três semanas após tratamento na pós-emergência com PURSUIT™, Composto 2 ou um herbicida imidazolinona, Composto 8. A Figura 28 representa uma comparação da altura da planta (em cm.) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus os mutantes de trigo M4 de FS1, FS2 e FS4 seis semanas após tratamento na pós-emergência com PURSUIT™, Composto 2 ou Composto 8. A Figura 29 representa uma comparação do rendimento (em cm.) de trigo dó tipo selvagem (Fidel) versus os mutantes de trigo M4 de FS1, FS2 e FS4 dez semanas após tratamento na pós-emergência com PURSUIT™, Composto 2 ou Composto 8. A Figura 30 representa uma comparação do crescimento (em cm.) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus os mutantes de trigo M5 de FS4 seis semanas após tratamento na pós-emergência com PURSUIT™, Composto 2, Composto 8, um herbicida imidazolinona, CADRE™, ou um herbicida sulfonilureia, ACCENT™. A Figura 31 representa uma comparação do rendimento médio em pequena porção de terreno (em gramas de grão por pequena porção de terreno) de trigo do tipo selvagem (Fidel) versus os mutantes FS4 (sementes M5) dez semanas após 0 tratamento na pós-emergência com PURSUIT™, Composto 2, Composto 8, CADRE™ ou ACCENT™. A Figura 32 representa um ensaio enzimático in vitro o qual mede a inibição da actividade AHAS em trigo mutante FS1 (marcado WS1), não -9- pulverizado com herbicida após a emergência, por valina e leucina (marcadas V+L) como um controlo, SCEPTER™, PURSUIT™, composto 9 e OUST™.

A Figura 33 representa um ensaio enzimático in vitro o qual mede a inibição da actividade AHAS em trigo mutante FS1 (marcado WS1), pulverizado com herbicida quando as plantas têm três semanas de idade, por valina e leucina (marcadas V+L) como um controlo, SCEPTER™, PURSUIT™, composto 9 e OUST™. A Figura 34 representa um ensaio enzimático in vitro o qual mede a inibição da actividade AHAS em trigo do tipo selvagem (Fidel), não pulverizado com herbicida após a emergência, por valina e leucina (marcadas V+L) como um controlo, SCEPTER™, PURSUIT™, composto 9 e OUST™. A Figura 35 representa um ensaio enzimático in vitro o qual mede a inibição da actividade AHAS em trigo do tipo selvagem (Fidel), pulverizado com herbicida quando as plantas têm três semans de idade, por valina e leucina (marcadas V+L) como um controlo, SCEPTER™, PURSUIT™, composto 9 e OUST™. A Figura 36 representa um ensaio enzimático in vitro o qual mede a inibição da actividade AHAS em trigo mutante FS4, não pulverizado com herbicida após a emergência, por valina e leucina (marcadas V+L) como um controlo, SCEPTER™, PURSUIT™, composto 9 e OUST™. A Figura 37 representa um ensaio enzimático in vitro o qual mede a inibição da actividade AHAS em trigo mutante FS4, pulverizado com herbicida quando as plantas têm três semanas de idade, por valina e leucina (marcadas V+L) como um controlo, SCEPTER™, PURSUIT™, composto 9 e OUST™. A Figura 38 representa um ensaio enzimático in vitro o qual mede a inibição da actividade AHAS em trigo do tipo selvagem (Fidel), não pulverizado com herbicida após a emergência, por valina e leucina (marcadas V+L) como um controlo, SCEPTER™, PURSUIT™, composto 9 e OUST™. A Figura 39 representa um ensaio enzimático in vitro o qual mede a inibição da actividade AHAS em trigo do tipo selvagem (Fidel), pulverizado com herbicida quando as plantas têm três semanas de idade, por valina e leucina (marcadas V+L) como um controlo, SCEPTER™, PURSUIT™, composto 9 e OUST™.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Este invento é dirigido a um novo método para a escolha da selecção de mutações que conferem ao trigo resistência a herbicida inibidor de AHAS. As sementes de trigo são mutagenizadas com um agente mutagénico químico por meios convencionais. Num primeiro passo de escolha, sementes mutagenizadas são embebidas numa solução contendo herbicida inibidor de AHAS contendo uma classe particular de herbicida inibidor de AHAS adaptando ao trigo um processo publicado para a soja.

Num novo segundo passo de escolha, as sementes são então plantadas no solo e submetidas a pulverização com herbicida inibidor de AHAS da mesma classe que o herbicida que foi usado no passo de embebição das sementes antes da emergencia de pequenas plantas a partir do solo. Essas plantas do trigo que emergem e apresentam um aspecto normal são consideradas como sendo resistentes à classe de herbicidas inibidores de AHAS usados no passo dois da escolha. Estas plantas têm assim o benefício de serem capazes de ser plantadas sendo a sua área tratada com uma classe de herbicidas inibidores de AHAS de modo a eliminar ervas daninhas prejudiciais mantendo entretanto as plantas do trigo não danificadas. A herança do traço de resistência ao herbicida inibidor de AHAS é demonstrado testando várias gerações de sementes a partir de mutantes iniciais para resistência a aplicações de uma classe de herbicidas que inibem AHAS. As plantas resultantes podem apresentar, mas não necessariamente, tolerância cruzada a classes de herbicidas que inibem AHAS diferentes das usadas no passo dois da escolha. A mutagénese das sementes é conseguida por meios convencionais usando um mutagénio químico. Um processo é o de Kueh and Bright (Kueh, J.S.H. and Bright, S.W.J., Planta. 153. 166-171 (1981), em que sementes são embebidas em água, sendo feito borbulhar ar através das sementes, seguindo-se tratamento com um agente mutagénico químico tal como azida de sódio. As sementes são então lavadas com água e secas. A utilização de azida de sódio neste processo é particularmente preferida.

Outros agentes mutagénicos químicos e processos para a sua utilização incluem N-metil-N-nitrosoureia e N-etil-N-nitrosoureia (Fluhr, R. and Cseplo, A., Methods Enzvmol. CPlant Mol. Biol ). 118. 611-623 (1986)), metanosulfonato de etilo /Sebastian, S.A., et al., Crop Sei.. 29. 1403-1408 (1989)), e hidroxilamina e hidrazina (Khamankar, Y. G., J. Maharashtra Agric. Univ.. 14.322-325 (1989)).

As sementes mutagenizadas são então escolhidas quanto à sua resistência a herbicidas que inibem AHAS. Inicialmente, são investigadas escolhas in vitro que avaliam a tolerância ao herbicida de embriões de trigo isoládos, meias sementes e sementes inteiras. Contudo, estas escolhas são demoradas e problemáticas devido a problemas de contaminação e a resposta - 12- variável por parte do trigo. Assim, é utilizado outro tipo de escolha. O processo de acordo com o invento é derivado de um protocolo desenvolvido por Sebastian and Chaleff (Sebastian, S. A. and Chaleff, R. S., Crop Science. 27, 948-952 (1987)) para selecção de soja tolerante a herbicida. Este processo de selecção envolve embeber sementes de trigo inteiras, maduras, numa solução contendo herbicida que inibe AHAS contendo uma classe particular de herbicida que inibe AHAS durante um determinado período de tempo após o qual as sementes são plantadas numa mistura de solo estéril. Várias classes de herbicidas que inibem AHAS incluem as imidazolinonas, as sulfamoilureias, as sulfonilcarboxamidas, as sulfonamidas e as sulfonilureias.

Exemplos de herbicidas imidazolinona que são usados no passo de selecção com embebição de sementes incluem ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidiazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil)-4-metil-5-oxo-2-imida-zolin-2-il)-3-quinolinocarboxílico, ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico, ácido 5-formil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 3 -(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-2-metil-crotónico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico, e uma mistura de 6-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato de metilo e 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-p-toluato de metilo. A utilização de ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico e de ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidiazolin-2-il)-nicotínico é preferida. A utilização de ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico é particularmente preferida.

Exemplos de herbicidas sulfamoilureia que são usados no passo de

I

-13-selecção de embebição de sementes incluem l-(4-metoxi-6-metil-s-triazm-2-il)-3-[(o-propionilfenil)sulfamoil]ureia, l-(4,6-dimetoxi-2-pirimidinil)-3-[(o-propionil-fenil)sulfamoil]ureia, l-[(o-acetilfenil)sulfamoil]-3-(4-metoxi-6-metil-2-pirimidi-nil)-ureia, e l-[(o-acetilfenil)sulfamoil]-3-(4-metoxi-6-metil-s-triazin-2-il)ureia. Exemplos de herbicidas sulfonilcarboxamida incluem 2-acetamido-2,3-dimetil-N-(p-tolilsulfonil)butiramida e 2-acetamido-N-[(p-clorofenil)sulfonil]-2,3-dime-tilbutiramida. Um exemplo de uma sulfonamida é N-[2,6-difluorofenil]-5-metil-(l,2,4)-triazolo-[l,5a]-pirimidino-2-sulfonamida. Exemplos de sulfonilureias incluem ácido 2- [4,6-bis=(difhiorometoxi)pirimidin-2-ilcarbamoilsulfamoil)ben-zoico, l-(4,6-dimetoxipirimidin-2-il)-3-(dimetoxicarbamoil-2-piridilsulfonil)-ureia, o éster metílico de o-[[3-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)ureido]sulfonil]-ácido benzoico) e o éster etílico de o-[[(4-cloro-6-metoxi-2-pirimidinil)carbamoil]sul-famoil]ácido benzoico).

Se a embebição das sementes for a única selecção a ser usada, ela será conduzida como se segue: após secagem, as sementes são plantadas e o número de sementes germinadas é contado após um período de tempo pré-determinado, como seja três ou quatro semanas após a plantação. É também registado o tamanho e aspecto das pequenas plantas. Sementes que germinaram e produziram pequenas plantas com tamanho e aspecto normais podem ser resistentes a herbicidas imidazolinona que inibem AHAS.

Contudo, a selecção de embebição de sementes pode originar a possibilidade de "fugas" ou falsos positivos que sobrevivem a tratamento λ herbicida. Para eliminar falsos positivos, um tratamento herbicida na pré-emergência é usado como uma segunda selecção.

Após um passo de embebição da semente, as sementes de trigo são plantadas no solo. Se desejado, o solo poderá ser regado. O solo contendo as - 14- sementes é então pulverizado, antes da emergencia de pequenas plantas a partir do solo, com um herbicida que iniba AHAS numa solução contendo água ou outros solventes aquosos ou orgânicos aceitáveis. A concentração de herbicida a ser pulverizado é avaliada para cada imidazolinona por meio de pequenos ensaios de escala.

Numa primeira apresentação, o herbicida que inibe AHAS usado no paSso de pulverização da semente é seleccionado de entre a mesma classe que foi usada no passo de embebição da semente. O herbicida particular escolhido pode ser igual ou diferente nos dois passos de selecção, mas em cada caso, os herbicidas devem ser escolhidos de entre a mesma classe de herbicidas que inibem AHAS. As classes de herbicidas e exemplos de cada classe usada no passo de pulverização das sementes são tal como foram anteriormente descritas no que se refere ao passo de embebição das sementes.

As sementes submetidas aos dois passos de selecção são então avaliadas após emergência de pequenas plantas a partir do solo. Crescimento que seja normal no que se refere ao tamanho, rendimento e aspecto indica que o trigo contem uma mutação que origina a resistência desejada a herbicidas que inibem AHAS.

Trigo com elevados níveis de tolerância em relação a herbicidas que inibem AHAS é seleccionado por meio destes dois passos do protocolo de escolha. Este sistema de selecção permite a selecção preferencial de plantas de trigo fortemente resistentes expondo a semente a taxas de herbicida letais para plantas do trigo do tipo selvagem em dois pontos da selecção, o tratamento de embebição da semente e a aplicação na pré-emergância. Esta dupla exposição a herbicida elimina falsos positivos e pode servir para eliminar mutantes com fraca resistência. As plantas de trigo resistentes são resistentes a herbicidas da classe -15- -15-

usada na selecção em dois passos. As plantas podem, nalguns casos, apresentar tolerância cruzada a uma ou mais classes de herbicidas que inibem AHAS, mas essa tolerância cruzada não necessita de estar presente.

Os exemplos apresentados mais abaixo são ilustrativos deste invento com a classe imidazolinona de herbicidas que inibem AHAS. As outras classes de herbicidas que inibem AHAS situam-se também no âmbito deste invento porque o seu mecanismo de acção é igual ao das imidazolinonas. Todos os herbicidas que inibem AHAS actuam pelo mesmo mecanismo de acção; têm como alvo o enzima AHAS, desse modo bloqueando a biosintese de valina, leucina e isoleucina. Ao bloquear esta actividade de AHAS os herbicidas inibem o metabolismo da planta, levando à morte da planta.

Quando o método de selecção em dois passos deste invento é usado com a classe imidazolinona de herbicidas, são obtidas selecções de trigo que são resistentes à classe imidazolinona de herbicidas. O trigo resistente ao herbicida apresenta uma tolerância aumentada a imidazolinonas de até 50 vezes mais em comparação com o trigo não mutagenizado, não seleccionado. Verificou-se que as imidazolinonas inibem o enzima AHAS, um dos primeiros enzimas na biosintese de amino ácido de cadeia ramificada. As selecções de trigo são ensaiadas por ensaios enzimáticos in vitro (descritos nos exemplos mais abaixo) e revelam ter actividade AHAS que é insensível a inibição por imidazolinonas. Contudo, existe pouca ou nenhuma evidencia de tolerância cruzada a outras químicas com um modo de acção semelhante sobre AHAS por estudos quer de plantas totais quer enzimáticos.

De entre 117.000 sementes de trigo avaliadas, quatro plantas de trigo são seleccionadas quanto às suas propriedades de resistência. Estas quatro selecções mutantres são designadas FS1, FS2, FS3 e FS4. Amostras de sementes -16- destas plantas do trigo foram depositadas em 28 de Março de 1991, com a American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, e foram-lhes atribuídos numeros de acesso como se segue:

Trieo Mutante Número de Acesso FS1 ATCC 40994 FS2 ATCC 40995 FS3 ATCC 40996 FS4 ATCC 40997

Tendo como base dados genéticos, os mutantes de trigo seleccionados, FS1, FS2, FS3 e FS4, são alélicos e parecem resultar de um único evento mutacional. A tolerância é herdada como um único locus genético e é de expressão dominante ou semí-dominante. É demonstrado que o aumento na tolerância herbicida não apresenta efeitos prejudiciais sobre o rendimento do cereal na presença ou na ausência dos herbicidas imidazolinona testados. A herança das mutações nas selecções de trigo resistente é confirmada testando várias gerações de progénie das sementes, assim como intercruzamentos das selecções mutantes. As sementes testadas são submetidas a aplicações tanto na pré-emergência como na pós-emergência de várias classes de herbicidas que inibem AHAS. O tamanho, rendimento e aspecto das pequenas plantas são observados e comparados com controlos não tratados (Fidel) e com controlos (Fidel) submetidos ao mesmo processo de selecção em dois passos.

Resultados destes testes, tal como é descrito nos exemplos, indicam que as mutações que conferem resistência a imidazolinonas são herdadas de geração para geração de plantas derivadas das selecções FS1, FS2, FS3 e FS4. A especificidade da resistência é demonstrada pelos dados que indicam que as selecções mutantes não são resistentes a outras classes de herbicidas que inibem AHAS tais como sulfonilureias, sulfamoilureias, sulfonamidas ou sulfonilcarboxamidas.

Numa segunda apresentação deste invento, duas classes diferentes de herbicidas que inibem AHAS são usadas no método de selecção em dois passos. No passo de embebição de sementes, é usado um herbicida de uma classe. No passo de pulverização, é usado um herbicida de uma segunda classe. As selecções de plantas resultantes que sobrevivem e crescem normalmente são resistentes a ambas as classes de herbicidas. Embora a frequência de mutações que conferem resistência que são seleccionadas seja grandemente reduzida, devido a diferentes classes de herbicidas usadas, se o número de sementes avaliadas for suficientemente grande, serão obtidas selecções duplamente resistentes.

Para que este invento possa ser melhor compreendido, são indicados os exemplos que se seguem. Os exemplos têm finalidades apenas ilustrativas e não são elaborados para limitarem o âmbito do invento tal como é definido pelas reivindicações. EXEMPLO 1

Desenvolvimento de uma Seleccão de Sementes em Dois Passos 1. Mutagénese de Sementes

Cinco mil sementes de "Fidel", um trigo de inverno Francês, são mutagenizadas seguindo o processo de Kueh and Bright (Kueh, J. S. H. and

Bright, S. W. J., Planta, 153, 166-171 (1981). As sementes de trigo são embebidas em água durante 18 horas a 5o C e em seguida é feito borbulhar ar através das sementes durante seis horas a 20° C. Isto é seguido imediatamente por tratamento com azida de sódio 1 mM, um agente mutagénico químico, a pH 3 durante duas horas. As sementes são lavadas com água durante 30 minutos e em seguida são espalhadas numa camada pouco profunda sòbre toalhas de papel para secagem.Uma vez secas, as sementes são plantadas no campo.

As plantas do trigo são feitas crescer até à maturidade e a semente M2 é colhida. Aproximadamente 117.000 sementes de trigo são colhidas e usadas pra seleccionar trigo resistente à imidazolinona. A frequência de germinação deste material é de 100% 2. Passo 1: Sementes Embebidas A seguir ao protocolo desenvolvido por Sebastian and Chaleff, sementes de trigo são desinfestadas à superfície em 70% de EtOH durante 30 segundos seguindo-se desinfestação em solução a 50% contendo 2,625% de hipoclorito de sódio, com 1-2 gotas de Tween 20™ (um agente tensio activo monolaurato de polietileno sorbitan não iónico, disponível com a marca comercial registada de Atlas Chemical Industries) por 100 ml de solução, durante 30 minutos sob vácuo com agitação suave proporcionada por uma placa de agitação. As sementes são lavadas em água destilada estéril sendo então embebidas numa concentração de herbicida para um determinado período de tempo, tal como é descrito mais abaixo. Conjuntos de vinte e cinco sementes são colocadas em 25 ml de solução herbicida descrita mais abaixo numa placa de petri plastica 100 x 15 mm e embebidas durante o período de tempo designado. As sementes são lavadas com água, secas com toalhas de papel e plantadas (25 sementes/compartimento) a uma profundidade de aproximadamente 1/2" em -19- compartimentos de turfa com 6 x 8 polegadas contendo um solo húmido, estéril, artificial, Metro Mix 350™ (Grace Company, Cambridge, MA). Os tratamentos são avaliados às quatro semanas após tratamento. Os herbicidas, taxas e períodos de tempo avaliados são descritos mais abaixo:

Experimentação 1: ARSENAL™: 0, 1,10, 50,100, 500 μΜ SCEPTER™:0,1,10, 50,100, 500 μΜ durante 48 horas. Cada tratamento é repetido quatro vezes. (ARSENAL™ e SCEPTER™ são marcas comerciais registadas de American Cyanamid Company. ARSENAL™ é ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico e é descrito na Patente dos E.U.A. No. 4.798.619; SCEPTER™ é ácido 2-(4-isopropil)-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3-quinolinocarboxílico e é descrito na Patente dos E.U.A. No. 4.798.619). ARSENAL inibe germinação de sementes e crescimento de pequenas plantas com concentrações crescentes. Embora sejam observados visualmente alguns potênciais falsos positivos em concentrações até 50 μΜ, concentrações mais elevadas inibem totalmente crescimento de pequenas plantas. Nestas concentrações, 100 e 500 μΜ, algumas sementes susceptíveis germinam, mas os rebentos são pequenos, torcidos e geralmente têm um aspecto anormal.

Embora SCEPTER™ também iniba o crescimento de pequenas plantas com concentrações crescentes, em três a quatro semanas, as pequenas plantas recuperam, tal como é observado visualmente. Com efeito, pequenas plantas tratadas com 1-100 μΜ não se conseguem distinguir dos controlos e pequenas plantas tratadas com 500 μΜ são ligeiramente mais baixas do que os controlos.

Experimentação 2: ARSENAL™: 0,10, 50, 100, 500 μΜ SCEPTER™:0, 100, 250, 500, 750, 1.000 μΜ durante 48 horas. Cada tratamento é repetido duas vezes. ARSENAL™ é testado de novo nas mesmas concentrações que foram usadas na experimentação anterior e são obtidos os mesmos resultados que foram acima descritos. Neste estudo, a concentração de SCEPTER™ é aumentada até um máximo de 1.000 μΜ. No final deste estudo, é evidente a partir de observação visual que esta concentração não é ainda suficientementé elevada para evitar "escapes". A duração da exposição ao herbicida também parece ter um efeito sobre o número de falsos positivos. Na experimentação 1, as sementes são embebidas durante mais algumas horas ocorrendo um certo alongamento das raízes; contudo, as sementes nesta experimentação não apresentam todas emergencia de radículas quando o tratamento com herbicida é terminado. O efeito da duração da embebição das sementes sobre a concentração de herbicida necessária para evitar "escapes" é investigado na experimentação que se segue.

Experimentação 3: ARSENAL™: 0, 50, 75, 100 μΜ SCEPTER™: 0,250, 500,750,1.000,1.500 μΜ PURSUIT™: 0,250,500,750, 1.000, 1.500 μΜ

Composto 1: 0, 500,1.000, 1.500, 2.000 μΜ -21 - durante 48 horas. Cada tratamento é repetido duas vezes. (PURSUIT™ é uma marca comercial registada de American Cyanamid Company. PURSUIT™ é ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico e é descrito na Patente dos E.U.A. No. 4.798.619. O Composto 1 é 2-acetamido-N-[(p-clorofenil)sulfonil]-2,3-dimetil-butiramida, e é descrito na Patente dos E.U.A. No. 4.992.094).

Neste estudo, os herbicidas imidazolinona ARSENAL™, SCEPTER™, PURSUIT™ e o Composto 1 sulfonilcarboxamida são avaliados como agentes selectivos na avaliação de sementes imbibidas. E também avaliada a interacção da duração da embebição da semente com herbicida. As Figuras 1-3 apresentam os resultados dos tratamentos com herbicida imidazolinona. Quando as sementes são embebidas durante 48 horas, o número de plantas "normais" diminui com o aumento da concentração de herbicida. Contudo, existem plantas normais mesno com a concentração de herbicida mais elevada testada. A medida que a duração da exposição ao herbicida aumenta, a concentração de herbicida necessária para a letalidade é reduzida. ARSENAL™ a 50 μΜ é suficiente se a exposição for superior a 72 horas, contudo 75 μΜ são necessários se a duração da exposição for inferior. SCEPTER™ não é eficaz com qualquer uma das combinações herbicida/duração da exposição. Pelo contrário, o tratamento das sementes com 1.000 de PURSUIT™ durante 72 horas ou 750 μΜ de PURSUIT ™ durante 96 horas evita a sobrevivência de potênciais falsos positivos. O Composto 1 não apresenta um efeito inibidor quer sobre a germinação das sementes quer sobre o crescimento das pequenas plantas.

Experimentação 4: SCEPTER™ 0, 500,1.000, 1.500, 2.000 μΜ durante 3,4, 7 e 10 dias. Cada tratamento é repetido duas vezes. -22- O protocolo é tal como foi acima descrito exceptuando o facto de 35 sementes serem embebidas por cada placa de petri; 25 sementes estão ainda plantadas por compartimento. Esta experimentação é repetida duas vezes. (Nota: as plantações dos dias 7 e 10 ficam contaminadas com fungos na primeira experimentação e são eliminadas. Na segunda experimentação, o fungicida, Captan, é adicionado à solução de embebição para evitar contaminação).

As durações da embebição de sete e dez dias constituem um período demasiadamente longo para utilização com sementes de trigo. Por esta altura, o alongamento dos rebentos começa a ocorrer em SCEPTER™ com concentrações até 1.000 μΜ; a contaminação por fungos também começa a constituir um problema com estes períodos de tempo.

Os resultados visuais são semelhantes aos observados para PURSUIT™ na Experimentação 3. Tanto 1.000 como 1.5000 uM de SCEPTER ™ durante três dias são apropriados para selecção de mutantes resistentes a imidazolinona com o problema de falsos positivos minimizado. 3. Passo 2: Aplicação de Herbicida na Pré-emergência É realizada uma série de experimentações para determinar a taxa apropriada de herbicida para este tratamento de pulverização na pré-emergência.

Sementes de trigo do cultivar Fidel susceptível são plantadas em Metro Mix 350 ™ em compartimentos de turfa com 6x8 polegadas numa taxa de 100 sementes por compartimento. Três compartimentos são pulverizados por tratamento. Os herbicidas são aplicados com um pulverizador de correia laboratorial a uma taxa de 950 litros por hectare (L/ha) com uma velocidade de correia de 12,8 seg/rev usando um bocal de pulverizador #40015E (Teejet™ Spraying Systems). Após -.23- -.23-

três a quatro semanas, os tratamentos são avaliados por observação visual quanto a toxicidade em relação às sementes de trigo/pequenas plantas. PURSUIT™ e SCEPTER™ são mais eficazes a 300-350 g/ha, enquanto que ARSENAL™ é mais eficaz quando pulverizado a 40-50 g/ha na pré-emergência. 4. Avaliação e Seleccão de Mutantes Resistentes a Herbicida PURSUIT™ é usado como uma imidazolinona exemplificativa para avaliação da resistência herbicida. Sementes de trigo M2 são desinfestadas à superfície em EtOH a 70% durante 30 segundos seguindo-se desinfestação em solução a 50% contendo 2,625% de hipoclorito de sódio tal como foi acima descrito. As sementes são então lavadas três vezes com H20 destilada estéril e colocadas em placas de petri de 100 x 15 mm de plástico estéreis, 250 sementes por placa. Vinte e cinco ml de solução de PURSUIT™ a 1.000 mM são adicionados a cada placa e as sementes são embebidas nesta solução no escuro durante 3 dias. As sementes são então escorridas, secas em toalhas de papel e plantadas em compartimentos de turfa com 6x8 polegadas estéreis contendo Metro Mix com 1.000 sementes plantadas/compartimento. Os compartimentos são regados e pulverizados imediatamente com 300 gramas por hectare (g/ha) de PURSUIT™. O herbicida é aplicado com um pulverizador de correia laboratorial a uma taxa de 950 K/ha com uma velocidade de correia de 12,8 seg/rev usando um bocal de pulverizador #40015E. Após quatro semanas, as pequenas plantas são avaliadas quanto à tolerância herbicida. A semente de trigo M2 é avaliada em lotes de 25.000 sementes de cada vez. De entre aproximadamente 117.000 sementes de trigo M2 submetidas à avaliação em dois passos quanto a resistência ao herbicida, são seleccionadas quatro plantas de trigo que são resistentes a PURSUIT™.

Estas plantas são bastante notáveis no seu aspecto em comparação com o trigo não resistente. Duas destas selecções mutantes são representadas nas -24-

Figuras 4 e 5. O trigo resistente situa-se no compartimento mais à esquerda na Figura 4; o trigo resistente situa-se no compartimento médio da Figura 5. Estas quatro selecções mutantes são designadas FS1, FS2, FS3 e FS4. As plantas resistentes são transplantadas para vasos de turfa com 7,5 polegadas em Metro Mix 350™. EXEMPLOS 2-5

Caracterização de Mutantes Resistentes a Herbicida EXEMPLO 2

Herança do Traço de resistência ao Herbicida 1. Avaliação da Planta M?: In vivo

Plantas M3 das quatro selecções iniciais de plantas (marcadas FS1, FS2, FS3 e FS4) são avaliadas quanto a resistência a PURSUIT™. Cinco sementes M3 de cada floração madura destes mutantes M2 iniciais são desinfestadas em EtOH a 70% durante 30 segundos seguindo-se desinfestação em solução a 50% contendo 2,625% de hipoclorito de sódio (tal como foi acima descrito) durante 20 minutos sob vácuo com agitação suave proporcionada por uma placa de agitação. As sementes são lavadas duas vezes em água destilada estéril.

Cada grupo de cinco sementes é então colocado em 10 ml de uma solução 1.500 μΜ de PURSUIT™ numa placa de petri de plástico com 60 x 15 estéril e embebida durante três dias. As sementes são lavadas com água, secas com toalhas de papel e plantadas a aproximadamente 1/2" de profundidade em compartimentos de turfa com 6" x 8 polegadas contendo humidade, Metro Mix -25- 350™ estéril. Estes compartimentos são pulverizados na pré-emergência com 300 g/ha de PURSUIT™. Controlos incluem sementes M3 de cada selecção resistente que são desinfestadas tal como foi anteriormente descrito, embebidas em água destilada estéril durante três dias sendo em seguida plantadas. Além disso, trigo Fidel susceptivel não seleccionado é desinfestado tal como foi acima descrito e metade das sementes tratadas com PURSUIT™ (processo de embebição e de pulverização da semente) e a outra metade são embebidas apenas em água. O herbicida é aplicado com um pulverizador de correia de laboratorio a uma taxa de 950 L/ha com uma velocidade de correia de 12,5 seg/rev usando bocal de pulverizador #40015E.

Quatro semanas após receberem a imbibição inicial das sementes, as plantas de trigo M3 são avaliadas de acordo com o facto das plantas serem resistentes ao herbicida, serem lesadas pelo herbicida ou serem mortas pelo herbicida. As plantas resistentes ao herbicida são transplantadas individualmente para vasos de Azalea com 7,5 polegadas com Metro Mix 350™. Um fertilizador, Oscomote™ (Sierra Company, Milpita, CA) é adicionado como uma cobertura de topo uma semana depois das plantas serem transplantadas. Além disso as plantas são fertilizadas de um modo regular com Peter's 20-20-20™ (Grace Company, Cambridge, MA). Plantas individuais são avaliadas em comparação com controlos Fidel não tratados.

Sementes Fidel não mutagenizadas, não seleccionadas, não sobrevivem quando tratadas com PURSUIT™ a 1.500 μΜ (embebição da semente) e 300 g/ha (aplicação na pré-emergência). Este mesmo material, quando embebido em água destilada estéril e não pulverizado, germina no espaço de 1-2 semanas com uma frequência de germinação média de 63,3% (média de dois grupos de controlo). Material M3, quando embebido em água destilada estéril e não pulverizado, apresenta uma frequência de germinação de 53,3%. Sementes das selecções de trigo resistente, tratadas com PURSUIT™, germinam com as frequências que se seguem: FS1 - 60%, FS2 - 47,5%, FS3 - 41,2% e FS4 - 55%. Muitas das pequenas plantas M3 expostas a tratamento com herbicida crescem com o mesmo ritmo que os controlos não tratados; contudo, algumas pequenas plantas que são progénie de FS4 são afectadas pelo herbicida, apresentando sintomas de atrofia, torção e/ou desguamecimento clorótico (Figura 6). Muitas destas plantas são capazes de sobrevivência e de posterior crescimento. A altura da planta três semanas após tratamento com herbicida é apresentada no Quadro 1.

Quadro 1: Avaliação de Planta M3: Resultados de avaliação da progénie de M3 das quatro selecções de trigo iniciais na avaliação Embebição de Semente/Aplicação na Pré-emergência. N° Botões N° de Altura Média Variação Alturas Seleccão Testadas Plantas1 Rebentos (cm) Rebentos FS1 16 48/80 9,1 2-15 FS2 16 38/80 11,7 5 -18 FS3 17 35/85 8,0 1 -14,5 FS4 17 44/85 21,1 5-28 Controlo 1 __2 6/15 19,0 10-26 Controlo 2 __2 13/15 21,2 8-30 Controlo M3 3 8/15 28,9 27-31 1 Número de plantas que cresceram / número de sementes plantadas.

Sementes em vez de botões são testadas nos Controlos 1 e 2.

Controlo 1 = Semente de trigo susceptivel (Fidel) embebida em água destilada estéril. Controlo 2 = Semente de trigo susceptivel (Fidel) embebida em solução herbicida. Controlo M3 = semente M3 a partir de selecções iniciais embebidas em água estéril.

As alturas das plantas variam entre 1 e 28 cm para as selecções -27- mutantes. Isto demonstraa variabilidade no grau de tolerância ao herbicida. Plantas de controlo variam entre 8 e 31 cm de altura. Todas as plantas são transplantadas para vasos de turfa de 7 1/2 polegadas com Metro Mix 350™ e são usadas para fazer os cruzamentos na parte 4 deste Exemplo 2 (Estudos sobre Condição Genética). 2. Avaliação de Planta M?: In vitro

Plantas M3 de quatro selecções de plantas iniciais (marcadas FS1, FS2, FS3 e FS4) são avaliadas quanto a resistência a PURSUIT™ in vitro. Sementes M3 da cada floração madura destes mutantes M2 iniciais são desinfestadas em EtOH a 70% durante 30 segundos seguindo-se desinfestação em solução a 50% contendo 2,625% de hipoclorito de sódio (tal como foi acima descrito) durante 20 minutos sob vácuo com agitação suave proporcionada por uma placa de agitação. As sementes são embebidas em água destilada estéril em placas de petri plásticas estéreis com 100 x 15 mm durante 20-24 horas e em seguida os embriões são extirpados e cultivados em meio contendo ΙΟ*4, 10'5, ou 10'6 M de PURSUIT™. Controlos incluem embriões (Fidel) não mutagenizados cultivados em meio com e sem herbicida e material M3 em meio sem herbicida. As avaliações de embriões são registadas às duas e meia ou três semanas após inicio da cultura.

Nenhum dos embriões (controlos Fidel ou M3) cultivados em meio contendo 10"4 M de PURSUIT™ germina, embora alguns dos embriões M3 apresentem uma pequena quantidade de alongamento de raizes primárias (1-5 mm). Embriões M3 são de certo modo tolerantes a PURSUIT™ no meio a uma concentração de 10'5 M; contudo, existe ainda considerável inibição do crescimento. O Quadro 2 apresenta as classificações de embriões, "T" (tolerante), "D" (danificado) e "S" (susceptivel) para os embriões cultivados em meio contendo 10'5 e 10'6 M de PURSUIT™. -28-

Quadro 2: Avaliação de Planta M3: Resultados de avaliação da progénie de M3 de quatro selecções de trigo inicial na avaliação de sementes in vitro. Classificações de Embriões - "T" = Tolerante, "D" = Danificada, e "S" = Susceptivel.

Concentração Pursuit ™ = 10 '5

Avaliação ° Altura Média Variação Altura Seleccão Embriões Rebentos ícm) Rebentos T D S FS1 21 16 42 0-1,5 FS2 21 14 45 — 0-3,5 FS3 12 9 58 — 0-4,5 FS4 16 15 31 — 0-3,0 Controlo 1 60 0 0 15,6 1-28 Controlo 2 0 0 30 — — Controlo M3 27 1 1 14,7 1-28 Concentração Pursuit ™ = 10-6

Avaliação Altura Média Variação Altura Seleccão Embriões Rebentos (cm) Rebentos T D S FS! 70 0 0 9,1 1-22 FS2 64 1 0 11,4 1-23 FS3 34 12 22 5,2 1-23 FS4 59 8 13 13,4 1-33 Controlo 1 20 0 0 23,1 14 - 32 Controlo 2 0 0 15 — — Controlo M3 15 0 0 14,6 2-28

Controlo 1 = Semente de trigo susceptivel (Fidel) em meio sem herbicida. Controlo 2 = Semente de trigo susceptivel (Fidel) em meio com herbicida. Controlo M3 = semente M3 a partir das selecções iniciais no meio com herbicida.

Tendo como base dados in vitro, as selecções de mutantes apresentam um aumento de tolerância entre 10 e 100 vezes em relação a PURSUIT™. 3. Estudo de Segregação É realizado um estudo para avaliar a progénie M4 das selecções de trigo mutante inicial em relação à resistência a imidazolinona e à homogeneidade. Sementes M4, de plantas M3 (derivadas de selecções iniciais, FS1 - FS4) que sobrevivem à selecção em dois passos anteriormente descrita, são usadas neste estudo. Além disso, sementes M4 derivadas de plantas M3 de cada selecção que não são avaliadas (designadas plantas de "stock") são aavliadas assim como controlos Fidel. Sementes, derivadas de plantas M3 tanto de stock como avaliadas representando cada floração de cada selecção de trigo original (FS1-FS4), são plantadas em compartimentos a uma taxa de vinte e cinco sementes por fila e oito filas por compartimento. Uma semana após a plantação, quando as pequenas plantas estão no estádio Z12 (duas folhas), as plantas são pulverizadas com 62,5 g/ha de PURSUIT™. O herbicida é aplicado com um pulverizador de correia de laboratório a uma taxa de 950 L/ha com uma velocidade de correia de 12,5 seg/rev usando bocal de pulverizador #40015E a uma altura de 18 polegadas acima das plantas. Tween 20™ é usado como um agente tensio activo a 0,25% v/v. As plantas são avaliadas três semanas após pulverização.

Fidel é completamente susceptivel a 62,5 g/ha de PURSUIT™ (todas estas plantas morrem). As selecções de trigo de inverno resistente à imidaxolinona apresentam excelente tolerância à aplicação na pós-emergência de PURSUIT™ a 62,5 g/ha nesta avaliação em estufa. As progénies derivadas das selecções FS1, FS2 e FS4 parecem ser homogeneamente resistentes a PURSUIT

™, embora se observam algumas plantas e progénies susceptíveis com fraca germinação. Estas três selecções parecem ser homozigotos em relação à resistência. As progénies à partir de FS3 podem, todas elas, ser susceptíveis, segregadas ou ser todas elas resistentes. Das progénies segregadas com boa germinação, aproximadamente um quarto dos elementos individuais são susceptíveis. Esta selecção é aparentemente heterozigótica, e requere uma geração própria adicional para que se obtenha material unifoimemente homozigoto. Lotes que aumentam as sementes para todas as progénies são plantados no campo. A seguir ao teste em estufa, progénies não segregadas derivadas de cada selecção individual são tomadas volumosas a fim de proporcionar sementes suficientes para um teste de tolerância no campo (Ensaio de Campo I, parte 1 do Exemplo 4). 4. Estudos sobre a Condição Genética A fim de determinar se as selecções de rigo mutante são alélicas (e possivelmente derivadas da mesma mutação) ou diferentes, os mutantes necessitam de ser submetidos a intercruzamento. Acontece também, que linhagens resistentes têm que ser cruzadas com susceptíveis (Fidel) para se estabelecer o padrão de herança para o traço de resitência. Tendo isto em mente, todos os cruzamentos possíveis e os seus recíprocos são formados entre cinco linhagens afins, Fidel, FS1, FS2, FS3 e FS4. Os híbridos F] que resultam destes cruzamentos são avaliados quanto à sua resistência, individualidade e tomados a ser submetidos a cruzamento em teste para os afins susceptíveis a fim de produzir as progénies necessárias para determinar a herança e a informação sobre o alelismo para as selecções.

Experimentação 1: Seis compartimentos contendo Metro Mix 350 ™ são plantados com híbridos Fj derivados de cada um dos cruzamentos que se seguem: FS1 x Fidel; FS2 x Fidel; FS3 x Fidel; FS4 x Fidel e Fidel (susceptiveis, cultivar afim). Uma semana mais tarde, os compartimentos são pulverizados, um compartimento por taxa de herbicida, com PURSUIT™ a 50,100,150,200 e 250 g/ha para determinar a condição genética do traço resistente a herbicida nas selecções, FS1-FS4. O herbicida é aplicado com um pulverizador de correia de laboratório a uma taxa de 950 L/ha com uma velocidade de correia de 12,5 seg/rev usando bocal de pulverizador #40015E. Tween 20™ é usado como o agente tensio activo a 0,25% v/v nas soluções herbicidas. As plantas são avaliadas 10 dias após o tratamento com herbicida.

Os híbridos são atrofiados mas não mortos a 250 g/ha de PURSUIT ™, indicando que mesmo na condição heterozigota, estas plantas expressam níveis relativamente elevados de resistência às imidazolinonas. Fidel é morto a uma taxa de 150 g/ha de PURSUIT™ e é gravemente lesado a taxas de 50 e de 100 g/ha. Os híbridos, FS1 x Fidel, FS2, x Fidel, FS3 x Fidel, e FS4 x Fidel, todos eles expressam resistência a herbicida na geração Fj. Uma taxa de segregação de 1 resistente : 1 susceptivel poderá sugerir uma condição heterozigótica. Contudo, isto não é observado em qualquer uma das quatro selecções. Tendo como base estes dados, o gene que confere resistência herbicda nos mutantes de trigo resistentes é dominante e homozigoto.

Experimentação 2: Esta experimentação continua a avaliação das selecções de trigo mutantes examinando resistência a herbicida em material recíproco cruzado e individualizado. Cruzamentos recíprocos são feitos entre plantas M3 representando cada uma das quatro selecções mutantes originais e entre estas selecções e Fidel. A progénie destes cruzamentos assim como a progénie individual usadas nos cruzamentos são plantadas em vasos de azalea de 6 polegadas em Metro Mix 350™. Dez vasos de cada cruzamento são planatados com duas sementes plantadas por vaso. Dez dias mais tarde, toda a progénie individual e cruzada reciprocamente é pulverizada na pós-emergência com PURSUIT ™ a 200 g/ha. O tratamento herbicida é aplicado tal como foi descrito na Experimentação 1. As plantas são reduzidas a uma planta por vaso (removendo a mais fraca das duas plantas por vaso) uma semana após o tratamento com herbicida. Existe uma germinação de 100% de sementes a partir dos Cruzamentos recíprocos de mutantes e uma germinação superior a 90% de sementes a partir de mutantes individuais. Nenhum dos cruzamentos de mutantes é danificado pelo desafio com PURSUIT™.

Experimentação 3: Cruzamentos em testes de híbridos Fj (descritos na Experimentação 1) de novo com Fidel são pulverizados com 200 g/ha de PURSUIT™. Os cruzamentos em teste que se seguem são plantados em vasos de azáleas com 6 polegadas em Metro Mix 350™. O número de vasos planatados por cruzamento é indicado pelo número após o cruzamento:

Fidel x(Fidel/FSl) 12

Fidel x (Fidel/FS2) 21

Fidel x (Fidel/FS3) 9

Fidel x (Fidel/FS4) 8

Fidel* 20 (* Existem duas plantações de Fidel de vinte vasos cada). Aproximadamente um mês mais tarde, as plantas são pulverizadas (excepto para Fidel). PURSUIT™ (200 g/ha) é aplicado tal como foi anteriormente descrito. As plantas são avaliadas três semanas e meia mais tarde.

Das 49 progénies de cruzamento em teste, 29 sobrevivem e 20 são mortas. A segregação 29:20 aproxima-se da segregação 1:1 esperada se um único gene dominante (ou semi-dominate) controlar a herança. Contudo, os heterozigotos putativos neste estudo são consideravelmente mais danificados do que plantas pulverizadas com a mesma taxa de herbicida num estudo anterior. Não é claro se o tratamento num estádio de crescimento mais tardio leva a danos maiores nos heterozigotos, ou se estarão envolvidos outros factores.

Experimentação 4: As selecções de trigo resistente, FS1-FS4, são cruzados com Fidel e a semente F1 destes cruzamentos é individualizada. Os cruzamentos são como se segue: (Fidel xFSl) (Fidel xFS2) (Fidel x FS3) (Fidel xFS4) individualizado individualizado individualizado individualizado A progénie F2 destes cruzamentos e sua variedade progenitora susceptivel (Fidel) são plantadas em compartimentos. As cinco progénies F2 são usadas para cada um dos quatro cruzamentos. Um compartimento é plantado para cada progénie para cada cruzamento. Os compartimentos consistem em seis filas por compartimento com 25 sementes por fila. Os compartimentos são pulverizados na pós-emergência com 200 g/ha de PURSUIT™ onze dias mais tarde. O PURSUIT™ é aplicado tal como foi anteriormente descrito.

Esta taxa de PURSUIT™ é determinada de modo a ser letal em relação a trigo susceptivel, embora não letal em relação a plantes heterozigotas ou homozigotas em relação à resistência. A segregação em relação à resistência a herbicida nesta progénie confirma que o traço de resistência para cada uma das quatro selecções (FS1-FS4) é herdado como um simples traço dominante ou semí-dominante. As progénies F2 de cada um dos quatro cruzamentos dão origem a rácios puros de 3 (resistentes) : 1 (susceptivel) quando pulverizados na pós-emergência com 200 g/ha de PURSUIT™.

Experimentação 5: Cruzamentos e cruzamentos recíprocos são feitos entre as quatro selecções de trigo nutante. A semente Fi destes três cruzamentos é plantada e permite-se que as plantas se individualizem. A semente F2 é colhida e usada nesta experimentação para determinar alelismo das quatro selecções. Compartimentos completos são preenchidos com Metro Mix 350™ e semeados com 100 sementes por cruzamento (quatro filas com 25 sementes por filas). Além disso uma fila de Fidel susceptivel é semeada em cada compartimento. São usadas três fontes de cada cruzamento. Quando as plantas pequenas atingem 0 estádio Z12, os compartimentos são piulverizados com PURSUIT™ a 200 g/ha. A solução de PURSUIT™ é aplicada tal como foi anteriormente descrito. Quatro semanas após o tratamento é determinado o número de resistentes versus o número de plantas susceptiveis.

Estudos sobre alelismo entre as quatro selecções de trigo resistente demonstram que todas as selecções são alelicas ou ligadas muito intimimamente. Poucos ou nenhuns segregados susceptiveis são observados na geração F2 dos híbridos com intercruzamento entre selecções. No caso dos genes serem não alélicos e não ligados, espera-se que as progénies F2 se segreguem numa relação 15 (resistente) : 1 (susceptivel). O Quadro 3 apresenta os resultados destes estudos da condição genética. -35-

Quadro 3: Estudos da Condição Genética: Número de Plantas que são resistentes/susceptíveis a 200 g/ha de PURSUIT™. Dados recolhidos três semanas após tratamento.

Fonte Resist Susceot (FS1/FS2) X-l 71 1 (FS1/FS2) X-2 85 2 (FS1/FS2) X-3 74 1 Total 230 4 (FSI/FS3) X-l 82 0 (FS1/FS3) X-2 92 0 (FS1/FS3) X-3 93 0 Total 267 0 (FS1/FS4) X-l 96 0 (FS1/FS4) X-2 90 0 (FS1/FS4) X-3 93 2 Total 279 2 (FS2/FS3) X-l 99 0 (FS2/FS3) X-2 87 1 (FS2/FS3) X-3 92 0 Total 278 1 (FS2/FS4) X-l 102 0 (FS2/FS4) X-2 97 0 (FS2/FS4) X-3 97 1 Total 296 1 (FS3/FS4) X-l 98 0 (FS3/FS4) X-2 96 0 (FS3/FS4) X-3 86 0 Total 290 0

Fonte Resist Susceot (FS2/FS1) X-l 95 0 (FS2/FS1) X-2 91 0 (FS2/FS1) X-3 97 0 Total 283 0 (FS3/FS1) X-2 95 0 (FS3/FS1) X-3 97 0 (FS3/FS1) X-5 94 1 Total 286 1 (FS4/FS1) X-l 93 1 (FS4/Fsl) X-2 91 0 (FS4/FS1) X-3 94 1 Total 278 2 (FS3/FS2) X-l 96 0 (FS3/FS2) X-2 94 0 (FS3/FS2) X-3 96 0 Total 286 0 (FS4/FS2) X-l 94 0 (FS4/FS2) X-2 95 1 (FS4/FS2)- X-3 95 0 Total 284 1 (FS4/FS3) X-l 96 0 (FS4/FS3) X-2 100 0 (FS4/FS3) X-3 94 0 Total 290 0 -36-

Em nenhum caso o número de segregados susceptiveis se aproxima de 1/16 do total (Quadro 3). Também não se observam efeitos matemos sobre a herança. Estes dados apoiam a probabilidade de que as quatro selecções são derivadas do mesmo evento mutacional ou estão intimamente ligados.

Experimentação 6: Sementes de progénie individualizada do segundo retrocruzamento dos mutantes resistentes com Fidel (cultivar de progenitor susceptivel) são plantadas em compartimentos padronizados preenchidos com Metro Mix 350™. São plantadas trinta sementes por fonte. Sete a dez dias após a plantação, estes compartimentos são pulverizados com 200 g/ha de PURSUIT™ aplicados tal como foi anteriormente descrito. Três semanas após o tratamento, as plantas são avaliadas quanto a segregação do traço de resistência. Tal como seria de esperar, uma certa progénie é completamente resistente, uma certa progénie é segregada quanto a resistência, isto é, uma certa progénie é resistente e uma certa progénie é susceptivel, enquanto que outra progénie é completamente susceptivel a herbicida. Plantas resistentes homozigotas são seleccionadas e usadas para aumentar as quantidades de sementes (no viveiro) para o cultivar resistente melhorado. EXEMPLO 3

Estudos de Resistência ao Herbicida 1. Nível e Espectro de Resistência a Herbicida

Este teste em estufa examina o nível e espectro de resistência a herbicida das selecções mutantes ao nivel da globalidade da planta. São testados quatro imidazolinonas (PURSUIT™, SCEPTER™, ARSENAL™ e Composto 2 e uma sulfonilureia (OUST™, uma marca comercial registada de E. I. du Pont de -37-

Nemours and Company, que é o éster metílico de [[3-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)ureido]sulfonil]-ácido benzoico). O composto 2 é uma imidazolinona residual de fraco potêncial e é ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico. Taxas de crescimento, tal como são determinadas pela altura da planta, de plantas tratadas são comparadas como controlos não tratados. Sementes M4, derivadas de plantas M3 avaliadas quanto à sua resistência a herbicida usando a avaliação em dois passos (embebimento e pulverização da semente) e plantas de stock M3 não avaliadas, são tomadas volumosas depois de se verificar serem não segregadas (ver Estudo de Agregação). Estas linhagens são tomadas volumosas de acordo com as suas linhagens afins: FS1, FS2, FS3 e FS4. Fidel (tipo selvagem) é usado como um controlo e para fins de comparação de performance. Cinco sementes de cada uma destas linhagens (incluindo Fidel) são plantadas por vaso em vasos de Azalea com seis polegadas e são mais tarde eliminadas até três plantas por vaso. São usadas três répicas por tratamento (químico e taxa) para cada linhagem, e seis repicas por linhagem de trigo são usadas como controlos não tratados. As plantas são pulverizadas na pós-emergência, 10 dias após a plantação, com os herbicidas e taxas que se seguem:

Imidazolinonas: PURSUIT™ 20,40, 80,160,320 g/ha SCEPTER™ 40, 80, 160, 320, 640 g/ha g/ha ARSENAL™ 3,6,12, 24,48

Composto 2 20,40, 80,160,320 g/ha

Sulfonilureia: OUST™ 5,10,20,40, 80 g/ha (*Nota: Plantas pulverizadas com ARSENAL™ são plantadas três dias antes das plantas nos outros tratamentos; contudo, são feitas medições com os outros tratamentos. Além disso, embora existam três réplicas por taxa de ARSENAL™ avaliada, existem apenas duas plantas por vaso em vez de três). Tween 20™ é adicionado a 0,25% v/v às soluções de herbicida antes da pulverização. Os herbicidas são aplicados com um pulverizador de correia de laboratório a uma taxa de 400 L/ha a uma distancia de 45,7 cm (18 polegadas) acima das plantas de trigo com uma velocidade de correia de 8,2 seg/rev e um bocal de pulverizador #65015E. A altura da planta é medida imediatamente antes da pulverização e com uma semana de intervalo durante quatro semanas.

As quatro selecções são semelhantes tanto no seu espectro como no seu nível de resistência. FS3 é ligeiramente menos resistente do que as outras três selecções. Visto que FS3 é seleccionado como um heterozigoto, indivíduos heterozigotos ou indivíduos susceptiveis podem ser incluídos, de um modo inadvertido, durante a criação de volume das sementes para realizar estas experimentações. Tendo como base o crescimento da planta quatro semanas após o tratamento, o trigo mutante é resitente a mais de 320 g/ha de PURSUIT™, a mais de 640 g/ha de SCEPTER™, a mais de 48 g/ha de ARSENAL™, a mais de 80 g/ha de Composto 2, e a mais de 5 g/ha de OUST™. Estes números traduzem aproximadamente uma tolerância aumentada 8 vezes em relação a PURSUIT™, uma tolerância aumentada mais de 16 vezes em relação a SCEPTER™ e ARSENAL™, uma tolerância aumentada 16 vezes em relação ao Composto 2, e uma tolerância aumentada 2 vezes em relação a OUST™. As Figuras 7-10a demonstram esta tolerância para uma das selecções de trigo mutante (FS!) em relação a ARSENAL™, OUST™. PURSUIT™, SCEPTER™, e Composto 2, respectivamente. 2.

Tolerância a Herbicida na Pré-emergência

Neste estudo as imidazolinonas, SCEPTER™, PURSUIT™, ARSENAL™, e Composto 2, e a sulfonilureia, OUST™, são aplicadas na pré-emergência (em vez de na pós-emergência tal como é descrito na parte 1 deste Exemplo 3) à variedade de trigo Fidel e às selecções resistentes FS" e FS4 a fim de avaliar a tolerância a herbicida. A semente M4 de duas das selecções mutantes, FS2 e FS4, e sementes da variedade susceptivel Fidel são usadas nesta experimentação. Cinco sementes de cada linhagem de trigo são plantadas por vaso em solo Sassafras (terra argilosa arenosa) em seis vasos de Azalea de seis polegadas. São usadas quatro réplicas por tratamento (químico e taxa) para cada linhagem, e seis réplicas por linhagem de trigo são usadas como controlos não tratados. No dia após as sementes terem sido plantadas, os vasos são pulverizados com os herbicidas e taxas que se seguem: PURSUIT™ 40, 80, 160, 320, 640 g/ha SCEPTER™ 40,80, 160,320, 640 g/ha ARSENAL™ 2,5, 5, 10, 20, 40 g/ha Composto 2 5, 10, 20, 40, 80 g/ha OUST™ 5, 10,20,40, 80 g/ha

Os herbicidas são aplicados tal como foi acima descrito (Levei and Spectrum of Herbicide Resistence). (Nível e Espectro de Resistência a Herbicida) Os vasos são regados após pulverização. As alturas das plantas são medidas às quatro semanas após o tratamento.

Tendo como base o crescimento da planta após quatro semanas, as selecções FS2 e FS4 apresentam um aumento da tolerância de aproximadamente 8 vezes a ARSENAL™ e a PURSUIT™ (Figuras 12 e 13, respectivamente), um aumento de tolerância de 8 a 16 vezes para o Composto 2 (Figura 14) e SCEPTER™ (Figura 11). O aumento na tolerância a OUST™ parece ser 2 a 4 vezes maior. Resultados semelhantes são observados em relação a dados sobre o peso fresco para raízes e rebentos medidos sete semanas após o tratamento. 3. Tolerância a Herbicida na Pós-emereência

Neste segundo teste em estufa, são examinados os limites superiores da resistência de selecções de mutantes a aplicações na pós-emergência de PURSUIT™ e Composto 2. Semente M4 de duas selecções de mutantes, FS2 e FS4, e semente de Fidel são usadas nesta experimentação. Cinco sementes de cada linhagem são plantadas por vaso em Metro Mix 350™ estéril em vasos de Azalea de seis polegadas. Imediatamente antes do tratamento herbicida, estas plantas são eliminadas até três plantas por vaso. São usadas três réplicas por tratamento (químico e taxa) para cada linhagem, e seis réplicas por linhagem de trigo são usadas como controlos não tratados. As plantas são pulverizadas na pós-emergência, 10 dias depois da plantação, còm os herbicidas e taxas que se seguem (g/ha): PURSUIT™: 10,25,50,100,250,500,1.000,2.500

Composto 2: 2,5, 5,10,25, 50,100,250, 500

Os herbicidas são aplicados tal como foi anteriormente descrito. A altura da planta é medida imediatamente antes da pulverização. As alturas das plantas são também medidas às duas e quatro semanas após o tratamento, e pesos de rebentos frescos são medidos às sete semanas após o tratamento.

As selecções apresentam sintomas iniciais de atrofia às duas semanas após o tratamento para todas as combinações de tratamento quando comparadas com controlos nãò tratados (Figuras 15 e 17). Contudo, pelas quatro semanas após o tratamento, as alturas das plantas FS2 e FS4 são iguais às alturas dos controlos não tratados a taxas que vão até 500-1.000 g/ha de PURSUIT™ (Figura 16) e 25-50 g/ha de Composto 2 (Figura 18). A selecção apresenta uma tolerância aumentada 40 a 100 vezes a PURSUIT™ e a Composto 2 aplicados na pós-emergência neste teste com comparação com Fidel (não seleccionado). Dados sobre peso de rebentos frescos recolhidos sete semanas após tratamento indica que FS2 e FS4, nessas mesmas taxas herbicidas, apresentam pesos frescos que igualam 90-100% dos pesos frescos de controlos não tratados (Figuras 19 e 20). 4. Tolerânica à Sulfamoilureia na Pré-emergência

Duas experimentações são realizados a fim de determinar se as selecções de trigo resistentes à imidazolinona expressam resistência a herbicidas sulfamoilureia. Resistência a quatro herbicidas sulfamoilureia (acimà descritos) e um herbicida sulfonilureia (OUST™) é testada nos testes na pós-emergência e na pré-emergência.

Numa primeira experimentação, a selecção de trigo mutante, FS2, a partir da semente M3- M4 tomada volumosa e da semente Fidel, é plantada êm vasos Azalea de seis polegadas em solo Sassafras (terra argilosa arenosa). Três sementes são plantadas por vaso inicialmente; estas são subsequentemente eliminadas até duas plantas. Há três réplicas de cada tratamento. Além disso, os -42- controlos não tratados consistem em 15 réplicas cada de Fidel e de FS2. As plantas são pulverizadas na pré-emergência com os herbicidas e taxas que se seguem.

Sulfamoilureias: 12,5, 25, 50,100,200 g/ha

Composto 3: Composto 4: Composto 5: Composto 6: 62,5,125,250,500,1.000 g/ha 12,5,25,50,100,200 g/ha 12,5,25, 50, 100,200 g/ha O Composto 3 é l-(4-metoxi-6-metil-s-triazin-2-il)-3-[(o-propionilfenil)sulfamoil]ureia, Composto 4 é l-(4,6-dimetoxi-2-pirimidinil)-3- [(o-propionilfenil)sulfamoil]ureia, Composto 5 é l-[(o-acetilfenil)sulfamoil]-3- / (4-metoxi-6-metil-2-pirimidinil)ureia, e Composto 6 é l-[(o-acetilfenil)sulfamoil]-3-(4-metoxi-6-metil-s-triazin-2-il)ureia. Os quatro compostos são apresentados na Patente dos E.U.A. No. 4.622.065.

Sulfonilureia: OUST™: 1,56,3,125,6,25,12,5,25 g/ha

Os herbicidas são aplicados tal como foi anteriormente descrito. O estudo da prè-emergência revela muito fraca emergência, e de novo, não são observadas visualmente quaisquer diferenças entre Fidel e a selecção resistente. -43- 5. Tolerância à Sulfamoiureia na Pós-emergêmcia

Numa segunda experimentação, a selecção de trigo mutante, FS2, a partir de semente M3 - M4 tomada volumosa, e semente Fidel são plantadas em vasos de Azalea com 6" em Metro Mix 350™ estéril. Três sementes são plantadas por vaso inicialmente; estas são subsequentemente eliminadas até duas plantas. Existem três réplicas de cada tratamento. Além disso, os controlos não tratados consistem em 15 réplicas de cada um de Fidel e de FS2. Plantas são pulverizadas na pós-emergência, 12 dias após a plantação, com os herbicidas e taxas que se seguem:

Sulfamoilureias:

Composto 3: 12,5,25, 50,100,200 g/ha Composto 4: 62,5, 125, 250, 500, 1.000 g/ha Composto 5: 12,5,25, 50, 100, 200 g/ha Composto 6: 12,5,25, 50,100,200 Sulfonilureia: g/ha OUST™: 6,25,12,5,25, 50,100 g/ha

Os herbicidas são aplicados tal como foi anteriormente descrito.

Trigo resistente e trigo susceptivel são tratados com taxas dos herbicidas que se espera causarem lesões graves ou letalidade em relação ao trigo susceptivel. Infelizmente, o cultivar de trigo susceptivel (Fidel) não é afectado (tal como é observado visualmente) mesmo pelas taxas mais elevadas usadas para os herbicidas sulfamoilureiâ testadas no teste da pós-emergência. Mesmo o trigo Fidel é relativamente tolerante aos herbicidas sulfamoilureia, as taxas não são suficientemente elevadas para causar danos, ou os herbicidas não lesam o trigo por qualquer outra razão (formulação, influencia ambiental, etc.). O trigo resistente apresenta aumento de tolerância de 2-4 vezes em relação a OUST™ neste estudo; estes resultados são semelhantes aos resultados obtidos em experimentações anteriores.

6. Espectro de Resistência a Herbicida de Trigo - MU

Nesta experimentação, a tolerância do trigo resistente à imidazolinona em relação a três herbicidas sulfonilureia (BEACON™, CLASSIC ™ e OUST™ (BEACON™ é uma marca comercial registada de Ciba-Geigy e é ácido 2-[4,6-bis=(difluorometoxi)-pirimidin-2-ilcarbamoilsulfamoil]benzoico; CLASSIC™ é uma marca comercial registada de E. I. du Pont de Nemours and Company e é o éster etílico de o-[[(4-cloro-6-metoxi-2-pirimidinil)-carbamoil]-sulfamoil]-ácido benzoico), um herbicida sulfamoilureia (Composto 1), e um herbicida imidazolinona (Composto 7, que é ácido 3-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-2-metil-crotónico), é examinado para verificar se existe tolerância cruzada em relação a herbicidas que inibem AHAS diferentes das imidàzolinonas. A selecção de trigo mutante, FS2, a partir de semente M3 - M* tomada volumosa, e semente Fidel são plantadas em vasos de Azalea de 5" em Metro Mix 350™ estéril. Três sementes são plantadas por vaso inicialmente; estas são subsequentemente eliminadas até duas plantas. Cada tratamento consiste em três réplicas. Além disso, existem seis réplicas de cada um de FS2 e de Fidel que são usados como controlos não tratados. As plantas são pulverizadas na pós-emergência, 7 dias após a plantação, com os herbicidas e taxas que se seguem: -45-

Sulfonilureias: BEACON™: 15,6,31,3,62,5,125,250 g/ha CLASSIC™: 31,3,62,5, 125,250, 500 g/ha OUST™: 6,25, 12,5,25, 50, 100 g/ha • Sulfamoilureia:

Composto 3: 125,250, 500,1.000.2.000g/ha

Sulfonilcarboxamida:

Composto 1: 250, 500,1.000,2.000,4.000 g/ha

Imidazolinona:

Composto 7: 187,5,375,750 g/ha

Os herbicidas são aplicados tal como foi anteriormente descrito. As plantas são avaliadas às duas, três e quatro semanas após tratamento com herbicida.

Resistência-cruzada às sulfoiiilureias (Figuras 21, 22 e 24), a a sulfamoilureia (Figura 23) ou a sulfonilcarboxamida (Figura 25) é 0-2 vezes, semelhante à observada em estudos anteriores com OUST™. A resistência ao Composto 7 imidazolinona é semelhante à observada anteriormente para -46- PURSUIT™ ou ARSENAL™ (superior a 10 vezes) (Figura 26). Não são observados quaisquer aumentos apreciáveis na resistência a herbicidas não imidazolinona. EXEMPLO 4

Ensaios de campo

1. Ensaio de Campo I

Um estudo de campo é conduzido para avaliar a tolerância das selecções de trigo resistentes a imidazolinona, FS1-FS4, a aplicações na pós-emergência de herbicidas imidazolinona. A variedade Fidel, a partir da qual estas selecções são derivadas, é incluída como um controlo susceptível. Porque Fidel é uma variedade de trigo de inverno Francês e não adaptado a New Jersey, este teste tem como finalidade avaliar os efeitos relativos dos tratamentos com herbicida sobre rendimentos de cereais em vez de medirem os reais potênciais de rendimento para os genotipos. Assim, os rendimentos são apresentados como gramas/lote em vez de grandes quantidades/acre ou toneladas métricas/ha.

Sementes tomadas volumosas M4 a partir de linhagens maternais (afins), FS1, FS2, FS3 e FS4 e tipo selvagem Fidel, são usadas neste ensaio de campo. O ensaio é plantado num esquema de lote dividido com o lote principal como uma combinação herbicida-taxa e o lote dividido como genotipos. Existem três réplicas para cada tratamento (química e taxa), contudo as réplicas #2 e #3 não incluem a selecção de trigo mutante F3 devido a falta de semente suficientemente volumosa. Os lotes têm três metros de comprimento e 1,5 metros de largura (7 filas com 17,8 cm (7 polegadas) de espaço entre as filas) com aproximadamente 25 sementes plantadas por fila. Existe um espaço de um metro entre as linhagens de trigo e de dez metros entre as réplicas. O tratamento inclui o que se segue:

Controlos Não Tratados PURSUIT™: Composto 2: Composto 8: 100 e 200 g/ha 50 e 100 g/ha 100 e 200 g/ha O O Composto 8 é ácido 5-formil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, 5-(dimetil acetal), e é descrito no Pedido de Patente Europeia No. 322.616 publicado,

Os tratamentos são aplicados a uma taxa de 400 L/ha com um pulverizador montado num tractor. Tween 20™ é usado como um agente tensio activo a 0,25% v/v. Trigo é tratado no estádio Z22 ou aproximadamente 15,2 cm (6 polegadas) de altura. A altura da planta e as avaliações das lesões são registadas às 3 e 6 semanas após tratamento. Os rendimentos são calculados 10 semanas após tratamento.

Três semanas após o tratamento, as selecções de trigo resistente parecem não ser afectadas por estes tratamentos com herbicida quando medidas pela altura da planta (Figura 27). Não foram observados quaisquer efeitos visíveis dos tratamentos com herbicida sobre as selecções resistentes. Estas selecções quando não tratadas são ligeiramente mais baixas do que Fidel não tratado. O cultivar susceptivel (Fidel) é gravemente deformado por estes mesmos tratamentos.

As alturas das plantas das selecções de trigo resistentes são ainda não afectadas por tratamento herbicida às seis semanas após tratamento (Figura 28). Fidel é gravemente deformado ou morto pelos tratamentos com herbicida enquanto que as selecções resistentes são aparentemente não afectadas pelos tratamentos. As alturas finais das plantas das selecções não tratadas são quase iguais à altura de Fidel não tratado, apesar de às três semanas após tratamento, as selecções não tratadas serem mais curtas do que Fidel não tratado. As selecções de trigo resistentes parecem crescer com um ritmo um pouco mais lento do que Fidel não pulverizado, presumivelmente devido a mutações recessivas prejudiciais. Estas mutações recessivas são removidas por novo cruzamento usando técnicas disponíveis para os especialistas nesta técnica. FS1, FS2 e FS4 não apresentam qualquer redução do rendimento a seguir a tratamento na pós-emergência com quaisquer tratamentos com herbicida. Pelo contrário, Fidel apresenta uma redução do rendimento de 35% quando tratado com PURSUIT™ a 100 g/ha e uma redução do rendimento superior a 75% com os outros tratamentos com herbicida. Fidel não tratado apresenta um rendimento significativamente maior do que FS1 ou FS4 (133 g/lote versus 40 g/lote e 76 g/lote, respectivamente). O rendimento médio para FS2 (98 g/lote) é também inferior ao de Fidel não pulverizado, mas não significativamente inferior às dez semanas após tratamento (Figura 29). Os rendimentos mais baixos das selecções não são inesperados; os mutantes apresentam menos vigor e postura vertical mais fraca do que Fidel, presumivelmente devido à presença de genes prejudiciais causados pelo processo de mutagénese mas não relacionados com o traço de resistência a imidazolinona. É de certo modo surpreendente que FS1, FS2 e FS4 apresentem diferenças tão amplas no rendimento considerando que os três são muito provavelmente derivados do mesmo evento mutacional. As selecções parecem ser completamente resistentes aos tratamentos com herbicida no que se refere à altura da planta e ao rendimento de cereais.

2. Ensaio de Campo II

Um segundo estudo de campo é plantado para avaliar a tolerância das selecções de trigo resistentes à imidazolinona, FS4, a aplicações na pós-emergência dos herbicidas imidazolinona PURSUIT™, CADRE™, Composto 2, e Composto 8, e o herbicida sulfonilureia, ACCENT™. CADRE™ é uma marca comercial registada de American Cyanamid Company. CADRE™ é ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico e é descrito na Patente dos E.U.A. No. 4.798.619. ACCENT™ é uma marca comercial registada de E. I. du Pont de Nemoiurs and Company e é l-(4,6-dimetoxipirimidin-2-il)-3-(3-dimetilcarbamoil-2-piridilsulfonil)ureia. A variedade Fidel é incluída como um controlo susceptivel.

Sementes M5 a partir das linhagens FS4 com o rendimento mais elevado no viveiro do Ensaio de Campo I são tomadas volumosas e usadas neste ensaio de campo juntamente com sementes de Fidel. O ensaio é plantado num esquema de lote dividido incompleto com 0 lote principal representando tratamento herbicida e com o lote dividido representando genotipos. Existem onze tratamentos com três réplicas para cada tratamento (químico e taxa). Os lotes têm três metros de comprimento e 1,5 metris de largura (7 filas com 17,8 (7 polegadas) de espaço entre filas) com uma densidade de sementeira de λ aproximadamente 100 sementes/m . Existe um espaço de 0,5 metro entre linhagens de trigo e três metros entre réplicas.

Os tratamentos incluem o que se segue:

Controlos Não Tratados

Imidazolinonas: PURSUIT™: 100 e 200 g/ha Composto 2: 50 e 100 g/ha Composto 8: 100 e 200 g/ha CADRE™: 50 e 100 g/ha Sulfonilureia: ACCENT™: 20 e 40 g/ha

Os tratamentos são aplicados a uma taxa de 200 L/ha com um pulverizador de trazer às costas X-77™, um agente tensio activo não iónico (Balent Corporation), é usado como o agente de humidificação a 0,25% v/v. O trigo é tratado no estádio Z27-Z28 quando as plantas têm aproximadamente 30-35 cm de altura. A altura da planta e as taxas de lesões são registadas às 1, 2, 3 e 6 semanas após o tratamento. Os rendimentos são registados 10 semanas após o tratamento.

Após três semanas, o crescimento de Fidel é gravemente inibido por todos os tratamentos com herbicida. A selecção resistente FS4 apresenta -51 -

tolerância a todas as imidazolinonas testadas; contudo, não se observa qualquer resistência cruzada com o herbicida sulfonilureia (ACCENT™). A Figura 30 apresenta medições registadas às seis semanas após o tratamento, indicando que não existe qualquer efeito do tratamento na pós-emergencia com PURSUIT™, CADRE™, Composto 2, ou Composto 8 sobre a altura final da planta. O trigo resistente apresenta pouca ou nenhuma tolerância em relação a ACCENT™. A variedade susceptivel comparável é gravemente deformada ou morta com estas taxas de herbicida. Os rendimentos de cereais apresentados como as médias ao longo das três réplicas são apresentados na Figura 31. O rendimento dos cereais da selecção de trigo resistente FS4 não é reduzido por qualquer um dos tratamentos com imidazolinona. Os rendimentos de Fidel são gravemente reduzidos ou eliminados por tratamento com herbicidas imidazolinona. O Fidel tanto resistente como susceptivel dão origem a pouco ou nenhum rendimento de cereal a seguir a tratamento com ACCENT™. Os efeitos sobre o rendimento de cereal resultante de tratamento de Fidel com imidazolinonas são ainda mais graves do que as reduções na altura da planta acima descritas. O trigo resistente usado para plantar este ensaio de campo é obtido fazendo aumentar o volume de sementes de lotes de aumento recolhidos no Ensaio de Campo I. Cada lote de aumento é derivado de uma única planta. Embora não seja feito qualquer novo cruzamento a Fidel com este material, fontes de sementes com fraca germinação e performance agronómica são capazes de ser eliminadas. Consequentemente, os rendimentos de cereais das selecções resistentes são muito melhorados em comparação com os medidos no Ensaio de Campo I. Os rendimentos obtidos para o trigo resistente em lotes de controlo não tratados são iguais aos obtidos para Fidel susceptivel em lotes não tratados. Isto indica que a inclusão de um gene para resistência a imidazolinona não apresenta efeito inerente sobre o rendimento do cereal. -52- EXEMPLO 5

Estudos Enzimáticos 1. Ensaio Inicial (Plantas MV)

Aplicação Herbicida: plantas M3 a partir das quatro plantas mutantes iniciais (FS1, FS2, FS3 e FS4), são testadas quanto a actividade AHAS metabólica (acetohidroxiácido sintase). Plantas apresentando resistência após a primeira avaliação da imbibição e pulverização das sementes com PURSUIT™ são transferidas de compartimentos para vasos individuais. Quando estas plantas têm três semanas de idade, duas plantas de cada selecção mutante, FS1 - FS4, recebem uma segunda aplicação de PURSUIT™ a 62,5 g/ha enquanto que duas—_ de cada selecção são deixadas por pulverizar. Plantas Fidel susceptiveis pulverizadas e não pulverizadas são também incluídas nesta experimentação. Aproximadamente metade da folhagem acima da linha do solo de cada planta é removida e avaliada dois dias após a aplicação de herbicida para inibição de AHAS por valina e leucina (como um controlo), SCEPTER™, PURSUIT™, OUST™. e um herbicida sulfonilcarboxamida, Composto 9. O Composto 9 é 2-acetamido-2,3-dimetil-N-(p-tolilsulfonil)butiramida, e é descrito na Patente dos E.U.A. No. 4.883.914.

Em plantas não pulverizadas, fraca resistência a PURSUIT™ é observada nas linhagens de trigo resistente. Contudo, um aumento dramático na resistência AHAS a PURSUIT™ é observada nas plantas FS1 - FS4 pulverizadas em comparação com o tipo selvagem pulverizado. As Figuras 32-35 demonstram estes resultados para uma das quatro selecções resistentes (FS1) e para as plantas Fidel do tipo selvagem (susceptiveis). Assim, a resistência de FS1 - FS4 a PURSUIT™ parece ser devida à presença de uma AHAS alterada que é resistente a inibição por PURSUIT™.

Extracção do Enzima: Para a extracção de AHAS, 10 gramas de tecido são transformados em pó em azoto líquido sendo em seguida homogeneizados em tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 7,5) contendo piruvato 10 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 5 μΜ, FAD 100 μΜ, vàlina 1 mM, leucina 1 mM, glicerol a 10%, e cisteina 10 mM. O produto homogeneizado é filtrado através de um tecido de nylon (malha de 53 μιη) e é centrifigado a 25.000 g durante 20 minutos. A fracção flutuante é levada a 50% de saturação no que se t refere a (NH4)2S04, e é deixada repousar durante 20-30 minutos em gelo. E então centrifugada a 25.000 g durante 20 minutos e o produto flutuante é eliminado. A pílula de sulfato de amónio é dissolvida em tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,5) contendo EDTA 1 mM e NaCl 100 mM e usada para os processos de ensaio.

Ensaio AHAS: a actividade AHAS é medida por avaliação do produto, acetolactato, após conversão por descarboxilação na presença de ácido em acetoina. Misturas de reacção padronizadas contêm o enzima em tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0) contendo piruvato de sódio 100 mM, MgCl2 10 mM, pirofosfato de tiamina 1 mM, e FAD 10 uM. Esta mistura é incubada a 37° C durante uma hora e em seguida a reacção é interrompida com a adição de H2S04 para se obter uma concentração final de 0,85% de H2S04 no tubo. O produto da reacção é deixado descarboxilar a 60° C durante 15 minutos. A acetoina formada é determinada por incubação com creatina (0,17%) e 1-naftol (1,7% em NaOH 4N) pelo método de Westerfield (Westerfield, W. W., J. Biol. Chem.. 161. 495-502 (1945)). A côr máxima é observada por incubação a 60° C durante 15 minutos e em seguida posterior incubação à temperatura ambiente durante 15 minutos. A absorção do complexo côr é medido a 520 nm. São feitas avaliações apropriadas de formação directa de acetoina durante o ensaio do enzima.. Cada ensaio é realizado pelo menos em duplicado e as experimentações são repetidas pelo menos duas vezes. 2. Ensaio Enzimático (Plantas Mri

Aplicação de Herbicida: Dois compartimentos são plantados com aproximadamente 100 sementes de cada selecção de trigo (FS1, FS2 e FS4) e Fidel e Metro Mix 350 estéril. Dez dias mais tarde, cada compartimento é pulverizado na pós emergência com 62,5 g/ha de PURSUIT™. A taxa de administração de pulverização é de 400 L/ha de com uma velocidade de correia de 8,2 seg/rev usando um bocal #65015E. Tween 20™ é usado como um agente tensio activo a 0,25% v/v. As plantas são recolhidas três dias mais tarde e avaliadas quanto à actividade AHAS.

Extracção de Enzima de Ensaio AHAS: Tal como foi anteriormenté descrito.

3. Ensaio Enzimático II (Plantas MA

Aplicação de herbicida: Tal como foi acima descrito (Ensaio Enzimático I) exceptuando o facto da taxa de libertação do spray ser de 950 l/ha com uma velocidade de correia de 12,8 seg/rev usando bocal #40015E.

Extracção Enzimática e Ensaio AHAS: Tal como foi anteriormente descrito.

Os resultados a partir destes dois grupos de experimentações são muito semelhantes. A actividade AHAS de todas as quatro linhagens de mutantes resistentes homozigotos obtidas a partir de plantas não pulverizadas revela níveis moderados de resistência a PURSUIT™ em comparação com o enzima das plantas de controlo do tipo selvagem (Fidel). Contudo, um nível de resistência -55- mais elevado a PURSUIT™ é observado no enzima a partir de selecções que são pulverizadas em comparação com o enzima de plantas Fidel pulverizadas (Figuras 36-39). É também observada uma certa resistência a SCEPTER™ e a ÕUST™ , mas o nível de resistência é mais baixo do que o observado para PURSUIT™. O espectro e nível de resistência a vários herbicidas é muito semelhante em todos os mutantes o que sugere que os quatro mutantes podem ser o resultado de um único evento mutacional. Esta conclusão é confirmada por abordagens genéticas acima descritas.

Lisboa, 19 de Julho de 2000

JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método de avaliação para a selecção de mutações que proporcionem ao trigo resistência a herbicida que inibe acetohidroxiácido sintase que compreende a mutagénese de sementes de trigo com um mutagénio químico seleccionado de entre o grupo consistindo em azida de sódio, N-metil-N-nitrosoureia, N-etil-N-nitrosoureia, metanosulfonato de etilo, hidroxilamina e hidrazina, imbibição de sementes mutagenizadas numa solução contendo herbicida que iniba acetohidroxiácido sintase contendo uma classe particular de herbicida que iniba acetohidroxiácido sintase, plantação das sementes embebidas em solo e pulverização do solo contendo as referidas sementes com um herbicida que iniba a acetohidroxiácido sintase de uma classe igual ou diferente à usada no paaso de imbibição das sementes antes da emergência de pequenas plantas a partir do sol, de tal modo que as plantas de trigo emergentes que têm aspecto normal sejam resistentes à classe de herbicida que inibe a acetohidroxiácido sintase usado nos passos de imbibição e/ou de pulverização das sementes.
2. 2. O método da Reivindicação 1, em que o herbicida que inibe acetohidroxiácido sintase usado no passo de embebição da semente é igual ao usado no passo de pulverização da semente.
3. 3. O método da Reivindicação 1, em que o herbicida que inibe acetohidroxiácido sintase usado no passo de embebição da semente é diferente do usado no passo de pulverização da semente.
4. 4. O método da Reivindicação 1, em que a classe de herbicida que inibe a acetohidroxiácido sintase é seleccionada de entre o grupo consistindo em imidazolinonas, as sulfonilureias , as sulfonilcarboxamidas, as sulfonamidas e as sulfonilureias. -2-
5. 5. O método da Reivindicação 4, em que a imidazolinona é seleccionada de entre o grupo consistindo em ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il>nicotínico, ácido 2-(4-isopropil)-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3-quinolinocarboxílico, ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazo-lin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(me-toximetil)-nicotínico, ácido 5-formil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, 5-(dimetil acetal, 3-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-2-metil-ácido crotónico), ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico, e uma mistura de 6-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imida-zolin-2-il)-m-toluato de metilo e 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-p-toluato de metilo.
6. 6. Utilização de uma semente derivada de plantas do trigo obtidas pelo método de uma das reivindicações 1 a 5 para a produção de trigo. Lisboa, 19 de Julho de 2000 *

   JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA