CN103710328A

CN103710328A - 大肠杆菌乙酰乳酸合酶的制备及保存方法

Info

Publication number: CN103710328A
Application number: CN201310743685.4A
Authority: CN
Inventors: 高文运; 李恒; 刘楠; 王文婷
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2013-12-27
Publication date: 2014-04-09

Abstract

本发明提供一种制备纯度好、活性高且能够稳定存在的AHAS的方法。该方法包括以下步骤：根据大肠杆菌AHAS催化亚基的基因序列设计上下游引物，设计的上游引物带有Xho I酶切位点，下游引物带有BamHⅠ酶切位点，以大肠杆菌BL21菌株基因组DNA为模板，通过PCR扩增技术得到目的片断ahas；将目的片断ahas连接到表达载体PGEX-AT-1上，得到重组质粒PGEX-4T-1-ahas，并在原核表达系统中实现诱导表达；用谷胱甘肽巯基转移酶（GST）修饰的琼脂糖凝胶树脂对所表达的酶进行纯化，从而获得活性良好的乙酰乳酸合酶。

Description

大肠杆菌乙酰乳酸合酶的制备及保存方法

技术领域

本发明属于遗传工程领域，具体涉及大肠杆菌乙酰乳酸合酶基因的克隆、可溶性表达、纯化以及保存方法。

背景技术

乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase，AHAS，EC4.1.3.18)首先在大肠杆菌（E.coli）中被发现。迄今为止，能够在GenBank中搜索到来源于六十个不同生物种类的AHAS基因，这些生物以细菌、藻类、真菌等为主。通常情况下，在一种生物体中可能有很多个与AHAS基因同源性很高的基因，但并不是每个基因都能起到与AHAS相应的作用，同一生物体内的不同部位AHAS基因的拷贝数也存在较大差异。在一些低等生物中，AHAS的核苷酸序列高度保守，其相似度一般在80%左右。大肠杆菌的AHAS是一个四聚体，由两个大亚基和两个小亚基组成，研究发现其大亚基的分子量约为60-70kD，主要起催化作用，故被称为催化亚基；小亚基的分子量约为10-50kD，主要起调节作用，故被称为调节亚基。高等植物的AHAS是控制其体内合成支链氨基酸公共途径的关键酶，催化支链氨基酸如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等的生物合成途径的第一步反应。

AHAS的底物可以是两分子丙酮酸，在辅酶硫胺素焦磷酸(ThPP)辅助下，首先合成乙酰乳酸，生成的乙酰乳酸再经后续步骤转化为缬氨酸和亮氨酸。该酶也可以一分子丙酮酸和一分子2-丁酮酸为底物，首先合成乙酰羟基丁酸，生成的乙酰羟基丁酸再经后续转化形成异亮氨酸。AHAS酶的活性主要依赖于辅酶ThDP，黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)以及二价阳离子如Mg²⁺，Mn²⁺，Zn²⁺等。E.coli源的AHAS有三种类型，AHAS I无底物偏好，AHAS II与AHASIII均偏好2-丁酮酸。本专利选择具有最强催化活性的AHAS I作为研究对象。

AHAS的应用领域：

（一）AHAS一般分布在细菌，酵母及高等植物体内，并在不同的物种之间有着高度保守的基因序列，但动物体内未发现有AHAS基因，因此AHAS抑制型除草剂对人畜比较安全，所以AHAS便成为筛选除草剂的重要靶点。黄酰脲类和咪唑啉酮类除草剂是目前世界上使用量较大的两类除草剂，其中黄酰脲类除草剂品种很多，成功应用的有近30多种。近年来，随着除草剂的大量滥用，杂草耐药性成为一个很严峻的问题，因此急需寻找新的ASAH抑制剂并在此基础上开发新的除草剂。

（二）此外，近来的研究发现，AHAS除了可催化丙酮酸与丙酮酸或与2-丁酮酸生成乙酰乳酸或2-乙酰基-2-羟基丁酸外，它还可催化丙酮酸与苯甲醛之间的缩合反应生成苯基乙酰甲醇(PAC)。PAC是医药工业中合成α/β-肾上腺素和其它手性邻羟基酮化合物的重要前体，E.coli AHAS I已被成功用于工业化生产PAC。不仅如此，AHAS广泛的底物谱也有望使其应用于合成其它手性医药前体。

（三）同时，随着近年来异丁醇高辛烷值、高能量密度、低吸湿性等燃料特性的发现，利用合成生物学思想生产异丁醇成为世界各国研究热点，而AHAS作为异丁醇代谢途径中的关键酶也引起了大家的广泛关注。

然而，上述研究的顺利进行都要建立在能够获得纯度高、稳定性良好的AHAS的基础之上，但是该酶在生物体内分布不均匀且丰度很低，加上本身稳定性差，易失活，这些因素使它的分离纯化和储存都有一定难度。如有文献报道在pH8的Tris-HCl缓冲液中，4℃条件下AHAS只能存活几天。改进的保存方法也有报道，如在保存缓冲液中加入ThDP，或黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），或支链氨基酸如亮氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，或Mg²⁺等辅助因子，但即使这样，AHAS在4℃条件下也只能存活三十天。利用基因工程技术制备重组AHAS的方法也已有报道，所用的载体多为pET系列载体，但所表达的AHAS蛋白量都比较低，或者是以包涵体形式表达，要经过变性复性等步骤，操作复杂，成本较高，而且这些方法也未能解决该酶稳定性差且易失活的问题，国内外也因此均无商品化的AHAS产品销售。这些问题的存在严重地阻碍了对AHAS的深入全面的研究以及新型AHAS抑制剂的寻找，也在很大程度上限制了它在许多重要工业领域内的广泛应用。

发明内容

为获得纯度高、稳定性良好的AHAS，本发明提出了一种新的大肠杆菌乙酰乳酸合酶的制备及保存方法。

本发明的技术思想如下：

pGEX-4T-1载体是一种常用的原核表达载体，具有Amp抗性，是一种高效的蛋白表达载体，有利于可溶性蛋白的表达；同时，由于其序列中含有谷胱甘肽巯基转移酶（GST）标签序列，故所表达的AHAS为融合蛋白，其中带有GST序列，可用GST修饰的琼脂糖凝胶树脂方便地进行纯化。本发明利用该载体构建大肠杆菌AHAS的表达载体，建立了制备AHAS的方法：

根据GenBank中E.coli AHAS酶的基因序列设计引物，以E.coli基因组DNA为模板，通过PCR扩增技术得到目标酶基因，目的片段全长为1689bp。将目的片段连接到pGEX-4T-1载体上，得到重组质粒pGEX-4T-1-ahas，并在E.coli BL2l(DE3)中实现高效可溶性融合表达；用GST琼脂糖凝胶柱对其进行纯化获得了纯度、浓度和活性皆令人满意的AHAS。并且，进一步研发出合适的保存体系，结果显示所得到的高活性AHAS可在磷酸盐缓冲液中稳定保存，这就解决了AHAS不稳定、不易稳定保存的缺点。究其原因，可能是因为所获得的AHAS中带有GST标签，它才能够在磷酸盐缓冲液（PBS）中得以稳定保存。

本发明给出的技术方案具体如下：

该大肠杆菌乙酰乳酸合酶（AHAS）的制备方法，包括以下步骤：

根据大肠杆菌AHAS催化亚基的基因序列设计上下游引物，设计的上游引物带有Xho I酶切位点，下游引物带有BamHⅠ酶切位点，具体如下：

上游引物：5′-GCAGGATCCATGGCAAGTTCGGGCACA-3′

下游引物：5′-GATCTCGAGTTATTCCCCCACCATTTC-3′；

以大肠杆菌BL21菌株基因组DNA为模板，通过PCR扩增技术得到目的片断ahas；

将目的片断ahas连接到表达载体PGEX-AT-1上，得到重组质粒PGEX-4T-1-ahas，并在原核表达系统中实现诱导表达；

用谷胱甘肽巯基转移酶（GST）修饰的琼脂糖凝胶树脂对所表达的酶进行纯化，从而获得活性良好的乙酰乳酸合酶。

基于上述基本的制备方法，本发明还进一步对各环节作如下优化：

其中，PCR扩增所配置的反应体系，以总体积50μL计，则具体包括以下组分：

PCR反应程序如下：

预变性：95℃，15min；

延伸：72℃，10min；

4℃，保存；

PCR产物用快捷型DNA凝胶回收试剂盒回收。

其中，重组质粒pGEX-4T-1-ahas的制备过程具体如下：

1）用XhoI与BamHI两种限制性内切酶对PCR扩增得到的目的片断ahas和载体pGEX4T-1同时分别进行双酶切，酶切条件为37℃水浴中反应12～16h；配置的酶切体系，以总体积40μL计，则具体包括以下组分：

2）用快捷型DNA凝胶回收试剂盒对PCR产物分别进行胶回收，得到目的片段；

3）用T4DNA连接酶将双酶切后且胶回收的目的片断与双酶切后的载体PGEX-4T-1相连，连接条件为4℃孵育12～16h，配置的反应体系，以总体积10μL，则具体包括以下组分：

反应后，获得pGEX-4T-1-ahas重组质粒；

其中，得到的重组质粒pGEX-4T-1-ahas在原核表达系统中的诱导表达过程具体如下：

1）将测序正确的重组质粒pGEX-4T-1-ahas用热击法转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，得到重组表达菌株E.coliBL21(DE3)-pGEX-4T-1-ahas；

2）取上述表达菌株2～3μL划线于含有氨苄青霉素的LB（Amp⁺LB）固体培养基上，37℃倒置培养12～14h；

3）挑取单克隆转接于5mL Amp⁺LB液体培养基中，37℃、200rpm/min培养10～12h；然后取1mL转接于100mL Amp⁺LB液体培养基中，37℃、200rpm/min培养10～12h；取5ml菌液，转接至500ml Amp⁺LB液体培养基中，37℃、200rpm/min培养至OD₆₀₀在0.6～0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为0.5mM，30℃、200rpm/min诱导4～5h，然后在4℃、10000rpm/min下离心得到菌体沉淀；

4）所得到的菌体沉淀1g中加入3～4ml PBS溶菌酶裂解液并使菌体沉淀重悬，冰上放置30min后继续置于冰上进行超声破碎，超声功率为200W，频率为超声10s，间隙15s，重复25～30次；破碎后在10000rpm/min，4℃下离心20min，保留上清液，即为粗蛋白。

其中，用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱对粗蛋白进行纯化的过程具体如下：

把粗蛋白在室温下与谷胱甘肽琼脂糖凝胶混合并在垂直脱色摇床上结合30min，收集流穿液；然后用10倍柱体积、pH7.3～7.5的PBS清洗未与柱子结合的杂蛋白，收集清洗液；再用10～25mM、pH8.0的还原性谷胱甘肽缓冲液洗脱3次，每次3ml，收集洗脱液，即完成纯化，获得活性良好的乙酰乳酸合酶。

为使以上制得的（带有GST标签的）乙酰乳酸合酶长时间保持稳定的活性.本发明通过大量实验和分析，确定了最佳的保存体系：将带有GST标签的乙酰乳酸合酶于50-100mM、pH7.0-8.5的磷酸盐（PBS）缓冲液中4℃下透析6～10h，将透析后的酶用液氮速冻，然后于-80℃冻存。

本发明具有以下优点：

采用本发明，能够获得纯度高、活性好、稳定性良好的AHAS。

附图说明

图1为本实施例中PCR扩增反应结果的电泳图。图中，1与2泳道分别是目的片断ahas，M泳道为Marker。

图2为本实施例中获得的pGEX4T-1载体质粒的电泳图。图中，pGE1和pGE2泳道分别为获得的载体质粒。

图3为本实施例中目的片断与载体的双酶切结果的电泳图。图中，ahas泳道为目的片断，M泳道为Marker，P1、P2泳道分别为载体质粒。

图4为本实施例双酶切验证的电泳图。图中，M泳道为Marker，1，5泳道为假阳性克隆，2，3，4泳道为阳性克隆。

图5为本实施例中AHAS的表达情况的电泳图。图中，1：未诱导的全菌；2：IPTG诱导的全菌；3：未诱导的上清；4：诱导的上清；5：诱导的沉淀；6：未诱导的沉淀。

图6为本实施例中纯化结果的电泳图。图中，Ft：流穿液；W1、W3：清洗液；E1、E2、E3：纯化的蛋白。

图7为本实施例中乙酰乳酸合酶（AHAS）在不同缓冲液中保存时稳定性对比。曲线1：AHAS在80mM PBS缓冲液（pH7.5）中于-80℃下保存；曲线2：AHAS在80mM PBS缓冲液（pH7.5）+10mM ThPP+1mM FAD+10mM赖氨酸+10mM Mg²⁺中于-80℃下保存；曲线3：AHAS在100mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）+10mM ThPP+1mM FAD+10mM赖氨酸+10mM Mg²⁺中于-80℃下保存。

具体实施方式

本实施例所用主要材料：

培养基及试剂的配制：

（1）LB（Luria-Bertani）液体培养基：分别称取5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g NaCl，溶解于800mL二次蒸馏水（ddH₂O）中，然后用2M NaOH将pH调至7.0，再用ddH₂O稀释至1L，121℃下高压灭菌20min，4℃保存待用；（2）LB固体培养基：分别称取0.5g酵母提取物，1g胰蛋白胨，1g NaCl，1.5g琼脂，溶解于90mL ddH₂O中，然后用2M NaOH将pH调至7.0，再用ddH₂O稀释至100mL，121℃下高压灭菌20min，待液体冷却至60℃左右，平均倒入6个灭菌的培养皿中，冷却后置于4℃保存备用；

（3）氨苄青霉素（Amp）溶液：称取0.1g Amp，溶解于1mL无菌水中，使其终浓度为100mg/mL，分装后于-20℃冻存待用；

（4）异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)溶液：称取0.24g IPTG，溶解于10mL无菌水中，使其终浓度为100mM，分装后于4℃保存待用；

（5）磷酸盐保存缓冲液（PBS，pH7.5）：称取Na₂HPO₄1.54g，NaCl8g，KH₂PO₄0.2g，KCl0.2g溶解于1000ml ddH₂O，用2M NaOH调pH至7.5；

（6）清洗及洗脱缓冲液：

①清洗缓冲液：同（5）中磷酸盐保存缓冲液；

②洗脱缓冲液：50mM Tris-HCl中含10～25mM还原型谷胱甘肽（GSH）（pH=8.0）。

（7）12%电泳分离胶：分别称取甲叉丙烯酰胺0.96g，丙烯酰胺23g，Tris9.8g，十二烷基磺酸钠（SDS）0.2g，溶解于120mL ddH₂O中，用2M HCl将pH值调至8.8，加ddH₂O至100mL，混匀后置4℃避光保存待用；

（8）3.5%电泳浓缩胶：分别称取甲叉丙烯酰胺0.16g，丙烯酰胺4.032g，Tris1.80g，SDS0.12g，溶解于100mL ddH₂O中，用2M HCl将pH值调至6.8，加ddH₂O至60mL，混匀后4℃避光保存待用；

（9）2倍电泳载样缓冲液（2×Loading Buffer）：

①1M Tris-HCl:称取12.11g Tris，将其溶解于90mL ddH₂O中，然后用浓HCl将pH调至6.8，再用ddH₂O稀释至100mL，混匀后室温保存；

②0.1%溴酚蓝：称取0.1g溴酚蓝，用ddH₂O溶解并稀释至100mL，使其质量分数为0.1%，混匀后于4℃保存待用；

③2×Loading Buffer：分别量取0.1%溴酚蓝10mL，甘油10mL，1M Tris-HCl（pH6.8）6.3mL，β-巯基乙醇（β-ME）10mL，再加入SDS5.0g，然后用ddH₂O稀释至50mL，混匀后于4℃保存待用；

（10）5倍电极缓冲液（5×Running Buffer）：分别称取Tris7.57g，甘氨酸36.03g，SDS2.5g，然后加入ddH₂O稀释至500mL，混匀后室温保存待用。

（11）12.5g/ml碱萘酚：称取50mg萘酚溶于4mL2.5M NaOH中。

（12）1.25g/ml肌酸：称取5mg肌酸溶于4mL ddH₂O中。

本实施例具体包含以下操作步骤：

1.AHAS基因ahas的克隆

根据GenBank中E.coli AHAS I开放阅读框的序列设计三对上下游引物，其中上游引物中均带有XhoⅠ酶切位点，下游引物均带有BamHⅠ酶切位点（划线部分），特别之处在于上下游引物的5′端都引入了不同数目的核苷酸保护碱基以提高限制性内切酶的效率。结果显示，引物1效果最佳，故在本实施例中选用引物1。

引物1：

上游引物：5′-GCAGGATCCATGGCAAGTTCGGGCACA-3′

下游引物：5′-GATCTCGAGTTATTCCCCCACCATTTC-3′

引物2：

上游引物：5′-GCAGGGATCCATGGCAAGTTCGGGCACA-3′

下游引物：5′-GATGCTCGAGTTATTCCCCCACCATTTC-3′

引物3：

下游引物：5′-CGCGCCGGATCCATGGCAAGTTCGGGCACAACAT-3′

上游引物：5′-CCGTGCCTCGAGTTATTCCCCCACCATTTCAGTAT-3′

1.1目的片断的获取

1.1.1模板DNA的获得：挑取生长良好的野生型E.coli单菌落加入PCR管中，加入10μL二次蒸馏水（ddH₂O），温和吹吸混匀后，在PCR仪中95℃放置10min，目的是将菌体裂解释放出基因组DNA，从而获得模板DNA。

1.1.2目的片断的克隆：

将1.1.1中得到的模板DNA、引物1（包括上下游引物）及2×Tap plus PCRMaster Mix按照表1所示依次加入反应体系中，用无菌水补足50μL。

表1.PCR反应体系

PCR扩增条件：95℃预变性15min；95℃变性2min，63℃退火2min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。

所得到的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果（如图1中）显示在约1700bp处出现一条带，与理论值相符，表明扩增出目的片段。

目的片段的纯化：

PCR产物的胶回收：用快捷型DNA凝胶回收试剂盒按照试剂盒中给出的方法回收PCR产物。吸取2μL胶回收后的样品用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明纯化出目的片段，可以用于下游酶切实验。

1.2pGEX-4T-1载体质粒的获取

市售的pGEX-4T-1原核表达载体通常以一定浓度保存于缓冲液中。取该溶液1μL以热击法转化200μL E.coli DH5α感受态细胞，取2μL转化液涂布LB固体培养基平板（Amp⁺）37℃过夜培养得到含有质粒pGEX4T-1的单菌落。

在5mL LB液体培养基(100μg/mL Amp)中，接入含有质粒pGEX4T-1的单菌落，37℃，220rpm震荡培养过夜；取3mL菌液，8000rpm离心1min，弃上清，得到菌体沉淀，按照碱裂解法提取质粒。1%琼脂糖凝胶电泳分析结果显示已得到pGEX4T-1载体质粒（结果见图2），可用于下游实验。载体质粒（浓度为254ng/μL）保存在-20℃冰箱中备用。

1.3目的片断与pGEX4T-1载体质粒的双酶切

将1.1中获得的目的片段和1.2中得到的pGEX4T-1载体质粒分别置于两个0.5mL离心管中，用XhoI、BamHⅠ进行双酶切，酶切反应体系见表2。反应条件：37℃水浴，12～16h。

表2.双酶切反应体系

将双酶切后的目的片段和pGEX-4T-1载体质粒分别进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果（见图4）表明酶切较为完全。分别胶回收目的片段和载体质粒pGEX-4T-1（回收过程同1.1.2节中“目的片段的纯化”方法）。胶回收的检测结果见表3。

表3.目的片段和pGEX-4T-1载体质粒双酶切后胶回收的紫外检测结果

1.4目的片段与pGEX-4T-1载体质粒的连接---pGEX-4T-1-ahas重组质粒的制备及鉴定：

1.4.1pGEX-4T-1-ahas重组质粒的制备：用T4DNA连接酶将1.3节中双酶切后的目的片段与pGEX-4T-1载体质粒相连接，获得pGEX-4T-1-ahas重组质粒。连接过程如下：取0.5mL离心管，按照表4中的顺序从上而下依次加入各反应物，于4℃连接12～16h得到pGEX-4T-1-ahas重组质粒。

表4.连接体系

1.4.2pGEX-4T-1-ahas重组质粒的鉴定：

1、重组质粒pGEX-4T-1-ahas转化大肠杆菌感受态细胞DH5α：

将pGEX-4T-1-ahas重组质粒用热击转化法转入E.coli DH5α菌株中，具体步骤如下：

(1)从-80℃冰箱中取出冻存的E.coli DH5α感受态细胞四管，冰上放置大约5min解冻；

(2)将1.4.1中制备的重组质粒pGEX-4T-1-ahas1μL加至200μL E.coliDH5α感受态细胞中，用移液器温和吹吸混合，冰浴30min。同时设置三个对照（如下表5所示），分别为DH5α感受态细胞、DH5α感受态细胞加灭菌水以及DH5α感受态细胞加载体质粒pGEX-4T-1，同样方法处理。

(3)42℃准确热击90s，冰浴2～3min（样品及三个对照，下同）。

(4)加入800μL LB液体培养基，37℃，180rpm复苏45min。

(5)将培养液于室温3500rpm离心5min，弃部分上清，余留底部100μL的培养液。

(6)移液器温和吹吸重悬菌体，各取2μL分别涂布在LB固体培养基平板上(Amp)，37℃正放30min，然后倒置培养12h～16h，观察结果。

表5.转化分组体系

（7）在重组质粒pGEX-4T-1-ahas转化的DH5α感受态细胞涂布的LB平板上随机挑取单菌落分别接种于5mL含有0.1mg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养12h。按照1.2节中“pGEX-4T-1载体质粒的获取”的方法提取重组质粒pGEX-4T-1-ahas。

（8）重组质粒pGEX-4T-1-ahas的双酶切鉴定

重组质粒pGEX-4T-1-ahas的双酶切鉴定方法与1.3节中“目的片断与载体的双酶切”中的相同。结果如图4，可看到2、3、4泳道在1700bp左右和4900bp左右均有条带，初步说明重组质粒pGEX-4T-1-ahas以构建成功。

（9）对重组质粒pGEX-4T-1-ahas的测序鉴定

将（8）中双酶切鉴定阳性的单克隆进行测序，采用T7promoter通用引物作为起始引物单向测序。序列比对结果显它与GenBank中大肠杆菌AHAS IDNA序列一致，说明构建的重组载体序列、读码框正确。

AHAS I cDNA序列：

AHAS I基因相应的蛋白质氨基酸序列：

MASSGTTSTRKRFTGAEFIVHFLEQQGIKIVTGIPGGSILPVYDALSQSTQIRHILARHEQGAGFIAQGMARTDGKPAVCMACSGPGATNLVTAIADARLDSIPLICITGQVPASMIGTDAFQEVDTYGISIPITKHNYLVRHIEELPQVMSDAFRIAQSGRPGPVWIDIPKDVQTAVFEIETQPAMAEKAAAPAFSEESIRDAAAMINAAKRPVLYLGGGVINAPARVRELAEKAQLPTTMTLMALGMLPKAHPLSLGMLGMHGVRSTNYILQEADLLIVLGARFDDRAIGKTEQFCPNAKIIHVDIDRAELGKIKQPHVAIQADVDDVLAQLIPLVEAQPRAEWHQLVADLQREFPCPIPKACDPLSHYGLINAVAACVDDNAIITTDVGQHQMWTAQAYPLNRPRQWLTSGGLGTMGFGLPAAIGAALANPDRKVLCFSGDGSLMMNIQEMATASENQLDVKIILMNNEALGLVHQQQSLFYEQGVFAATYPGKINFMQIAAGFGLETCDLNNEADPQASLQEIINRPGPALIHVRIDAEEKVYPMVPPGAANTEMVGE

2.AHAS的表达纯化

2.1AHAS的表达

将测序正确的pGEX-4T-1-ahas重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，构建重组表达菌株E.coli BL21(DE3)-pGEX-4T-1-ahas进行AHAS的表达。其具体过程如下：

①将测序正确的pGEX-4T-1-ahas重组质粒用热击法转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中（方法与1.4.2节中“重组质粒pGEX-4T-1-ahas转化大肠杆菌感受态细胞DH5α”相同），涂布于LB固体培养基上（0.1mg/mL Amp），37℃培养12～14h，然后挑取生长状态良好的单克隆菌落至5ml LB培养液中（0.1mg/mL Amp），37℃，220rpm培养10-12h，取300μL菌液加入15%灭菌甘油中，存于-80℃冰箱作为菌种。再取1ml转接到100ml LB培养液中（0.1mg/mL Amp），37℃，220rpm培养10-12h；

②取上述菌液5ml，转接至500ml LB培养液中（0.1mg/mL Amp），37℃，220rpm培养至OD₆₀₀在0.6～0.8时，加入IPTG使其终浓度为0.5mM，30℃，200rpm诱导培养4～5h；

③10000rpm，4℃离心20min得到菌体沉淀，存于-80℃待用；

④菌体沉淀按1g菌体沉淀加入3～4ml100mM PBS（pH8.0）缓冲液，加入3-4mg溶菌酶，冰上放置30min，然后置于冰上超声破碎，超声功率为200W，频率为超声10s，间隙15s，重复25～30次。10000rpm，4℃离心20min，得到的上清即为粗蛋白；

⑤SDS-PAGE检测AHAS的表达情况，结果见图5。结果表明所获得的目的蛋白AHAS大部分以可溶性蛋白存在。

2.2AHAS的纯化

利用以pGEX-4T-1为载体得到的重组蛋白都带有GST标签的特点，用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱对其进行纯化。其具体过程如下：

把粗蛋白与谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱在垂直脱色摇床上于室温结合30min，收集流穿液，记为Ft。然后用10倍柱体积的清洗缓冲液清洗未与柱子结合的杂蛋白，收集清洗液，记为W。再用洗脱缓冲液洗脱3次，每次3ml，收集洗脱液，记为E1～E3。

SDS-PAGE检测纯化情况，结果如图6所示，在84KD左右有一条明显的条带，与理论相符合。从图上可以看出所得到蛋白纯度较好。

2.3AHAS浓度的测定

以Bradford法测得粗蛋白的浓度为2.4～3.6mg/ml。测的纯化后的AHAS的浓度为0.18～0.3mg/ml。

3.AHAS的活性检测

3.1比色法测定AHAS的活性

原理：两分子的丙酮酸在ThPP及Mg²⁺存在下被AHAS催化形成乙酰乳酸，乙酰乳酸在强酸性条件下脱羧生成乙偶姻（3-羟基丁酮），乙偶姻在含胍基化合物的存在下与α-碱萘酚形成红色络物，该络合物在A₅₂₅处有最大的吸收峰。利用该反应就可对所得到的AHAS的活性进行检测，反应的体系见表6。

表6.比色法检测的反应体系

反应体系为200μL，37℃反应1h后加10μL4M H₂SO₄，60℃脱羧15min，生成3-羟基丁酮；然后加入100μL12.5g/ml碱萘酚和100μL1.25g/ml肌酸于60～65℃显色15min，室温静置15min后UV观察A₅₂₅处的吸收峰。结果表明酶活力良好，未纯化的重组酶的比活力可以达到277.8μmol/min·mg粗蛋白。纯化后的乙酰乳酸合酶也有良好活性，其比活力可以达到104.2μmol/min·mg蛋白。

4.AHAS的保存

为了解决AHAS不能长期稳定保存的问题，我们尝试了在不同浓度、不同pH值的磷酸盐（PBS）缓冲液中保存该酶。结果表明（如图7所示），当把AHAS保存在PBS保存缓冲液（pH7.5）中时它的稳定性大大提高，在-80℃下保存4个月仍有近70%的活性，保存8个月后仍有大于40%的活性，甚至在该条件下保存达到10个月后，该酶仍有一定活性。在该PBS缓冲液中加入稳定剂如ThPP、FAD、赖氨酸及Mg²⁺等时并不能改善AHAS的保存稳定性。而如果将AHAS保存在100mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）中时，既使其中加入了ThPP，FAD，亮氨酸及Mg²⁺等辅助因子，AHAS在-80℃下保存2个月后仅余50%的活性，保存4个月后仅有20%的活性。