CZ295649B6

CZ295649B6 - Mutovaná 5-enolpyruvátšikimát-3-fosfát syntáza, geny, které ji kódují a jejich použití

Info

Publication number: CZ295649B6
Application number: CZ1998174A
Authority: CZ
Inventors: Eric Degryse; Michel Lebrun; Alain Sailland; Georges Freyssinet
Original assignee: Bayer Cropscience Sa
Priority date: 1995-07-19
Filing date: 1996-07-18
Publication date: 2005-09-14
Also published as: UA80895C2; SK285144B6; WO1997004103A2; DE69635913D1; SI0837944T1; EP0837944A2; AP9801195A0; NZ313667A; AU6619196A; JP4691733B2; SK6498A3; OA10788A; JPH11510043A; CZ17498A3; DE69635995T2; HUP9900463A3; RO120849B1; AP886A; US6566587B1; HU226089B1

Abstract

Popisuje se nová forma enzymu 5-enolpyruvátšikimát-3-fosfát syntázy (zkráceno EPSPS), která vykazuje zvýšenou toleranci k herbicidům, které jsou kompetitivními inhibitory aktivity EPSPS vzhledem k fosfoenolpyruvátu (PEP). Tato odolnější forma enzymu ve své sekvenci obsahuje alespoň jednu substituci aminokyselin, a to záměnu treoninu za izoleucin.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález popisuje novou formě enzymu 5-enolpyruvátšikimát-3-fosfát syntázy (zkráceno EPSPS), která vykazuje zvýšenou toleranci k herbicidům, které jsou kompetitivními inhibitory aktivity EPSPS vzhledem k fosfoenolpyruvátu (PEP). Tato odolnější forma enzymu ve své sekvenci obsahuje alespoň jednu substituci aminokyselin a to záměnu threoninu za izoleucin. Vynález se dále vztahuje ke genu kódujícímu tento protein, k rostlinným buňkám transformovaným chimérickými genovými konstrukty, které obsahují tento gen, k rostlinám regenerovaným z těchto buněk a také k rostlinám vzniklým křížením za použití těchto transformovaných rostlin.

Dosavadní stav techniky

Glyfosat, sulfosat a fosametin jsou širokospektré systémové herbicidy patřící do rodiny fosfometylglycinových herbicidů. Působí v podstatě jako kompetitivní inhibitory 5-enolpyruvátšikimát-3-fosfát syntázy (EC 2.5.1.19) neboli EPSPS, vzhledem kPEP (fosfoenolpyruvátu). Po jejich aplikaci na rostliny se tyto herbicidy v rostlině lokalizují do rychle rostoucích částí, zvláště do stonkových a kořenových vrcholů, kde se akumulují a způsobují poškození, které vede až k destrukci citlivých rostlin.

Plastidová EPSPS, hlavní cíl těchto herbicidů, je enzym, který se v metabolizmu účastní biosyntézy aromatických aminokyselin. EPSPS je kódovaná jedním nebo více jadernými geny a syntetizovaná ve formě cytoplazmatického prekurzoru, kteiý je potom importován do plastidů, kde se enzym akumuluje ve své maturované formě.

Tolerance rostlin ke glyfosatu a obdobným herbicidům ze stejné skupiny se získá začleněním EPSPS genu do jejich genomu. Gen je rostlinného nebo bakteriálního původu a je mutován nebo jinak pozměněn, a to tak, aby došlo ke změně charakteru inhibice produktu genu glyfosatem. Z hlediska působení glyfosatu a stupně tolerance produktu užitých genů ke glyfosatu, je výhodné, aby bylo možné exprimovat produkt translace tohoto genu tak, aby došlo k jeho akumulaci v dostatečném množství přímo v plastidech.

V patentu US 4 535 060, je popisována tolerance rostlin k herbicidům výše zmíněného typu, zvláště pak N-fosfonometylglycinu nebo glyfosatu, které bylo dosaženo zavedením genu kódujícího EPSPS s alespoň jednou mutací do rostlinného genomu. Tato mutace učinila zmíněný enzym po jeho lokalizaci vplastidovém kompartmentu resistentnější kjeho inhibitoru (glyfosatu).

Uvedené techniky však by měly být vylepšeny tak, aby byla získána větší spolehlivost při užití těchto rostlin v zemědělských podmínkách.

Podstata vynálezu

Pojmem „rostlina“ se dále rozumí každý mnohobuněčný organizmus schopný fotosyntézy, a pojmem „rostlinná buňka“ se rozumí každá buňka odvozená od rostliny, schopná tvořit jakákoli nediferencovaná pletiva, jako jsou kalusy nebo diferencovaná pletiva, jako jsou embrya, rostlinné části nebo semena.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále příprava transformovaných rostlin se zvýšenou tolerancí k herbicidům fosfonometyl-glycinové skupiny, a to regenerací buněk transformovaných pomocí nových chimérických genů, které obsahují gen pro toleranci ktěmto herbicidům.

-1 CZ 295649 B6

Předmětem vynálezu je také chimérický gen, o kterém je známo, že u rostlin zvyšuje toleranci k herbicidům s cílovým působením na EPSPS. Tento gen obsahuje ve směru transkripce po sobě: promotorovou oblast, volitelně i tranzitní peptidovou oblast, sekvenci genu pro toleranci enzymu ke glyfosatu a nepřekládanou oblast s polyadenylačním signálem na 3' konci. Gen pro rezistenci ke glyfosatu obsahuje v porovnání s genem, ze kterého je odvozen, substituci threoninu 102 za izoleucin v „aroA“ oblasti. Ve výhodném uspořádání tento gen obsahuje navíc ve stejné oblasti substituci prolinu 106 za serin. Tyto substituce mohou být zavedeny nebo již přítomny v EPSPS sekvenci jakéhokoli původu, zvláště potom rostlinného, bakteriálního, nebo v enzymu ze řas či hub.

Tranzitní peptidy, které mohou být užity v tranzitní peptidové, oblasti mohou být rostlinného původu, například odvozené z kukuřice, slunečnice, hrachu, tabáku nebo z dalších libovolných rostlin. První a druhý tranzitní peptid mohou být identické, podobné nebo různé. Dále mohou obsahovat jednu nebo více jednotek tranzitních peptidů, jak je uvedeno v Evropské patentové přihlášce EP 0 508 909. Úlohou této charakteristické oblast je umožnit uvolnění maturovaných a nativních proteinů, zvláště výše zmíněné mutované EPSPS, v plazmidových kompartmentech s nejvyšší možnou účinností.

Ve výhodném uspořádání vynálezu se promotorova oblast chimérického genu skládá z nejméně jednoho promotoru genu nebo promotorového fragmentu, který je v rostlinných pletivech přirozeně exprimován (tubulin, introny, aktin, histon).

Nepřekládaná oblast se signálem pro terminaci transkripce na 3'konci chimérického genu může být různého původu, například bakteriálního původu, jako signál z genu pro nopalin syntázu, nebo rostlinného původu, jako signál z genu pro histon H4A748 z Arabidopsis thaliana, jak je uvedeno v evropské patentové přihlášce 633 317.

Chimérický gen podle vynálezu může obsahovat kromě výše zmíněných částí ještě alespoň jednu nepřekládanou spojující oblast (linker), která může být umístněna mezi dvěma různými transkribovanými oblastmi, které byly popsány výše. Tato spojující oblast může být jakéhokoli původu, například bakteriálního, virového nebo rostlinného.

Příklady provedení vynálezu

Izolace cDNA kódující kukuřičnou EPSPS:

V následující části jsou popsány různé postupy vedoucí k získání cDNA kódující EPSPS z kukuřice. Tato cDNA slouží jako základ pro zavedení dvou mutací, jak je popsáno níže. Všechny operace popsané níže jsou popsány formou příkladů a odpovídají jednomu možnému vybranému způsobu z mnoha, které vedou k dosažení stejných výsledků. Tento výběr nemá žádný vliv na kvalitu výsledků, a tak lze pro dosažení shodných výsledků použít jakoukoli vhodnou metodu, dle vůle odborníka v daném oboru. Většina metod týkajících se molekulárního inženýrství DNA fragmentů je popsána v „Current Protocols in Molecular Biology“ Díl 1 a 2, Ausubel a další, vydaného Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1989) (dále uváděné odkazy na protokoly popsané v této práci budou označeny zkratkou „ref.CPMB“). Operace vztahující se k DNA, které jsou prováděny podle protokolů popsaných v této práci jsou zvláště následující: ligace DNA fragmentů, působení Klenowova fragmentu DNA polymerázy I a T4DNA polymerázy, příprava plazmidové DNA a DNA z bakteriofága λ, dále také minipreparace a maxipreparace a analýza RNA a DNA pomocí Southem a Northem hybridizace. Další metody popsané v této práci byly prováděny podle uvedených protokolů a jen významné modifikace a dodatky k těmto protokolům jsou popsány níže.

-2CZ 295649 B6

Příklad 1: Získání fragmentů EPSPS z Arabidopsis thaliana

a) dva 20-merové oligonukleotidy následných sekvencí:

5'-GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3' '-GCCCGCCCTTGAC AAAGAAA-3' byly syntetizovány podle sekvence genu pro EPSPS z Arabidopsis thaliana (Klee H. J. a další (1987) Mol. Gen. Genet., 210, strana 437 až 442). Tyto dva oligonukleotidy odpovídají pozicím 1523 až 1543 a 1737 až 1717 dle publikované sekvence a v opačných orientacích.

b) celková DNA z Arabidopsis thaliana (var.columbia) byla získána z katalogu Clontech (citace katalogu: 6970 až 1).

c) 50 nanogramů (ng) DNA se smíchá s 300 ng každého oligonukleotidu a podrobí se 35 amplifíkačním cyklům v přístroji Perkin-Elmer 9600, za použití standardního média pro amplifikaci, které je doporučeno výrobcem. Výsledný fragment o délce 204-bp tvoří fragment EPSPS z Arabidopsis thaliana.

2. Konstrukce knihovny cDNA z BMS buněčné linie kukuřice

a) 5g filtrovaných buněk je rozetřeno v kapalném dusíku, veškeré nukleové kyseliny se extrahují způsobem podle Shura a dalších, s následujícími modifikacemi:

- pH lyžuj ícího pufru je upraveno na pH 9,0

- po precipitaci izopropanolem se pelet rozpustí ve vodě a přidá se chlorid lithný do koncentrace 2,5M. Po dvanáctihodinové inkubaci při °C se pelet získaný centrifugací po dobu 15 minut při 30.000 g při 4 °C resolubilizuje. Precipitace chloridem lithným se potom opakuje. Rozpuštěný pelet obsahuje RNA frakci z celkových nukleových kyselin.

b) Póly (A)⁺ RNA frakce se získá chromatografíi na oligo (dT)-celulózovém sloupci jak je popsáno v „Current Protocols in Molecular Biology.

c) Syntéza dvouvláknové cDNA obsahující syntetický EcoRI konec: tato syntéza se provádí podle protokolu výrobce dodávajících různé chemikálie potřebné pro tuto syntézu ve formě kitů například-„copy kit“ od firmy InVitrogen.

Dva jednovláknové a částečně komplementární oligonukleotidy následujících sekvencí:

5'-AATTCCCGGG-3

5-CCCGGG-3' (tento oligonukleotid je fosforylován) se ligují na tupé konce dvouvláknových cDNA.

Ligace adaptorů má za následek vytvoření Smál míst připojených k dvouvláknové cDNA a kohezních EcoRI míst na každém konci dvouvláknovýdi cDNA.

d) Vytvoření knihovny:

cDNA s uměle vytvořenými kohezními EcoRI místy na koncích se ligují s cDNA bakteriofága XgtlO po štěpení pomocí EcoRI a defosforylaci podle protokolu dodavatele kitu New England Biolabs.

-3CZ 295649 B6

Část produktů ligační reakce je enkapsidována in vitro s enkapsidačními extrakty, zejména s Gigapack Gold, podle instrukcí dodavatele. Knihovna je dále titrována za použití bakterie E.coli C600 hfl. Takto získaná knihovna se namnoží a skladuje podle instrukcí stejného dodavatele a obsahuje cDNA knihovnu pro BMS buněčnou suspenzi kukuřice.

3. Prohledávání cDNA knihovny BMS buněčné suspenze kukuřice pomocí EPSPS sondy z Arabidopsis thaliana

Protokol používaný pro tento screening sleduje návody uvedené v „Current Protocols in Molecular Biology“ díl 1 a 2, Ausubel a další, publikované u Greene Publishing Associates a WileyInterscience (1989) (CPMB).

Ve zkratce, přibližně 10⁶ rekombinantních fágů se vyseje při průměrné hustotě 100 fágů na cm²na LB misky. Lytické plaky se replikují v duplikáty na Amersham Hybond N membránách.

DNA se fixuje na filtry pomocí působení 1600kJ UV (Stratagene Stratalinker). Filtry se prehybridizují v 6xSSC/ 0,1% SDS/0,25% odtučněné mléko po dvě hodiny při 65 °C. Hybridizační sonda pro EPSPS z Arabidopsis thaliana byla označena fosforem ³²P dCTP metodou náhodných primerů podle instrukcí dodavatele kitu (Pharmacia Ready to Go kit). Získaná specifická aktivita je řádově 10⁸ cpm na pg fragmentu. Po denaturaci trvající 5 minut při 100 °C se sonda přidá do prehybridizačního média a hybridizace pokračuje dalších 14 hodin při 55 °C. Filtry byly vyhodnocovány 48 hodin trvající expozicí při -80 °C na film Kodak XAR5 a za použití kazety zesilující signál na filmu Amersham Hyperscreen RPN. Porovnání pozitivních skvrn na filtru s plotnami, ze kterých byly odvozeny, umožní odhalení fágů odpovídajících pozitivním hybridizačním odpovědím s EPSPS sondou z Arabidopsis thaliana. Tyto fágy se poté jednotlivě odeberou z kultivačních ploten a vysejí se, přenesou, hybridizují se opětovně vysejí dokud všechny skvrny v misce z úspěšně purifikovaných fágů nevykazují 100% pozitivitu při hybridizaci. Jednotlivé plaky z lyžovaného fága jsou potom převedeny do ředicího média λ (Tris-HCl pH7,5, lOmM MgSO₄, 0,lM NaCl, 0,1% želatina). Tyto fágy tvoří v roztoku EPSPS-pozitivní klony BMS buněčné suspenze kukuřice.

4. Příprava a analýza DNA z EPSPS klonů BMS buněčné suspenze kukuřice

Přibližně 5 x 10⁸ fágů se přidá ke 20 ml CóOOhfl bakterií při hodnotě optické hustoty OD₆₀onm 2/ml a inkubuje se 15 minut při 37 °C. Tato suspenze se naředí do 200ml bakteriálního růstového média v 11 Erlenmeyerových baňkách a míchá se rotačním míchadlem při 250 rpm. Lyže je patrná, jakmile se médium projasňuje, což odpovídá lyži turbidních bakterií a projevuje se přibližně po 4 hodinách míchání. S tímto supematantem se zachází dle instrukcí popsaných v „Current Protocols in Molecular Biology“. Získaná DNA odpovídá EPSP klonům buněčné suspenze kukuřice BMS.

Jeden až dva mikrogramy této DNA se štěpí EcoRI a dělí se na 0,8% LGTA/TBE agarózovém gelu (ref.CPMB).

Konečné ověření se zakládá na kontrole toho, že purifikovaná DNA vykazuje hybridizační signál s EPSPS sondou z Arabidopsis thaliana. Po elektroforéze jsou fragmenty DNA přeneseny na Amersham Hybond N membrány podle protokolu popisujícího Southem blotting a popsaného v „Current Protocols in Molecular Biology“. Tento filtr se hybridizuje se sondou EPSPS z Arabidopsis thaliana podle podmínek popsaných výše v sekci 3. Klon vykazující hybridizační signál s touto sodnou pro EPSPS z Arabidopsis thaliana a obsahující nejdelší EcoRI fragment by měl mít odhadovanou velikost na gelu přibližně 1.7 kbp.

-4CZ 295649 B6

5. Získání klonu pRPA-ML-711

Deset mikrogramů klonu fága obsahujícího l,7kbp dlouhý inzert se podrobí působení restrikčního enzymu EcoRI a rozdělí se na 0,8% LGTA/TBE agarózovém gelu (ref.CPMB). Část gelu obsahující 1,7 kbp dlouhý inzert se po obarvení pomocí BET vyřízne z gelu a na vyříznutou část agarózového gelu se působí agarázou podle instrukcí dodavatele, New England Biolabs. Vyčištěná DNA získaná z fragmentu 1,7-kbp se liguje při 12 °C po dobu 14 hodin s DNA plazmidu pUC 19 (New England Biolabs) naštěpenou pomocí restrikčního enzymu EcoRI podle protokolu pro ligaci popsaného v „Current Protocols in Molecular Biology“. Dva mikrolitry výše zmíněné ligační směsi byly použity pro transformaci části elektrokompetentních buněk E.coli DH10B, transformace se provádí elektroporací za následujících podmínek: směs kompetentních bakterií a ligační médium se přenese do elektroporační cely o tloušťce 0,2cm (Biorad), která se dříve vychladí na 0 °C. Fyzikální podmínky elektroporace za použití elektroporátoru vyrobeného firmou Biorad jsou následující: 2500 V, 25 pF a 200 Ω. Za těchto podmínek je střední doba vybití kondenzátoru řádově 4,2 milisekundy. Bakterie se potom převedou do lml SOC média (ref.CPMB) a míchají se jednu hodinu při 200rpm na rotační míchačce v patnáctimililitrových zkumavkách Corning. Po vysetí na LB/agarové médium, které je doplněno o 100 pg/ml karbenicillinem, se provádí minipreparace bakteriálních klonů, které narostly přes noc při 37 °C. Minipreparace se provádí dle návodu popsaného v „Current Protocols in Molecular Biology“. Po naštěpení DNA enzymem EcoRI a separaci elektroforézou v 0,8% LGTA/TBE agarózovém gelu (ref. CPMB), se vyberou klony mající 1,7-kbp dlouhý inzert. Konečné ověření se skládá z kontroly toho, že purifíkovaná DNA vykazuje skutečně hybridizační signál s EPSPS sondou z Arabidopsis thaliana. Po elektroforéze se DNA fragmenty přenesou na Amersham Hybond N membrány, tak, jak je popsáno v návodu na Southem blotting v „Current Protocols in Molecular Biology“.

Filtry se hybridizují s EPSPS sondou z Arabidopsis thaliana dle podmínek popsaných výše v sekci 3. Klonovaný plazmid s 1,7-kbp dlouhým inzertem a hybridizující s EPSPS sondou z Arabidopsis thaliana byl připraven ve větším množství a výsledná DNA z bakterie byla purifikována na CsCl gradientu, jak je popsáno v „Current Protocols in Molecular Biology“. Purifíkovaná DNA byla částečně sekvenovaná pomocí Pharmacia kitu dle návodu výrobce a za užití primerů, jako jsou M13 přímý a zpětný (reverzní) univerzální primer dodané stejným výrobcem. Částečná sekvence kryje přibližně 0,5 kbp. Odvozená aminokyselinová sekvence v oblasti maturovaného proteinu (přibližně 50 aminokyselinových zbytků) vykazuje 100% totožnost s odpovídající aminokyselinovou sekvencí maturované kukuřičné EPSPS popsané v Americkém patentu US 4 971 908. Tento klon odpovídající 1,7-kbp EcoRI fragmentu EPSPS DNA z BMS buněčné suspenze kukuřice, byl označen jako pRPA-ML-711. Kompletní sekvence tohoto klonu byla určena sekvenováním obou vláken při užití postupu dle Pharmacia kitu a syntetizováním komplementárních oligonukleotidů k těmto vláknům, ale opačně orientovaným, přibližně pro každých 250 bp. Kompletní sekvence získaného 1713-bp dlouhého klonuje uvedena v Sekvenci id. č. 1.

6. Získání pRPA-ML-715 klonu

Analýza sekvence klonu pRPA-ML-711, a zvláště pak srovnání odvozené aminokyselinové sekvence s odpovídající sekvencí z kukuřice, vykazuje prodloužení sekvence o 92 bp proti směru transkripce od GCG kodónu kódujícího NH₂-koncový alanin maturované části kukuřičné EPSPS (Americký patent US 4 971 908). Podobně je pozorováno prodloužení sekvence o 288 bp po směru transkripce od AAT kodónu kódujícího COOH- koncový asparagin maturované části kukuřičné EPSPS (Americký patent US 4 971 908). Tyto dvě části by mohly odpovídat v případě prodloužení NH₂ konce části sekvence tranzitního peptidu pro lokalizaci v plastidu a v případě prodloužení COOH konce, nepřekládané 3'oblasti cDNA.

V případě získání cDNA kódující maturovanou část kukuřičné EPSPS, jak je popsáno v US 4 971 908, jsou prováděny následné operace:

-5CZ 295649 B6

a) Odstranění 3' nepředkládané oblasti: konstrukce pRPA-ML-712:

Klon pRPA-ML-711 byl štěpen restrikčním enzymem Asel. Na výsledné získané štěpy se působilo Klenowovým fragmentem DNA polymerázou I dle protokolu popsaném v CPMB, tak byly získány tupé konce. Produkt byl potom podroben restrikčnímu štěpení enzymem Sac II. Výsledná DNA byla dělena elektroforézou v 1% LGTA/TBE agarózovém gelu (ref. CPMB).

Část gelu obsahující inzert o velikosti 0,4-kbp, se zarovnaným koncem po působení restrikčního enzymu Asel a sahající až po místo štěpení enzymu SacII, byla vyříznuta z gelu a purifikována dle protokolu uvedeného výše v oddílu 5. DNA získaná z klonu pRPA-ML-711 se podrobila restrikčnímu štěpení enzymem HindlII v místě HindlII ležícím v polylinkeru klonovaného vektoru pUC19. Přesahující konce vzniklé uvedeným štěpením byly zarovnány na tupé Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I. Dále následovalo štěpení restrikčním enzymem SacII. DNA vzniklá touto manipulací byla dělena pomocí elektroforézy v 0,7% LGTA/TBE agarózovém gelu (ref. CPMB).

Část gelu obsahující fragment o přibližně velikosti 3,7 -kbp s tupými konci po štěpení restrikčním enzymem HindlII a sahající až po štěpné místo pro restrikční enzym SacII, byla vyříznuta z gelu a purifikována dle protokolu popsaném výše v oddílu 5.

Tyto dva inzerty byly spojeny ligaci a 2 μΐ ligační směsi byly použity k transformaci E.coli DH10B, jak již bylo popsáno výše v oddílu 5.

Obsah plazmidové DNA z různých klonů byl analyzován dle postupu popsaného pro pRPA -ML-711. Z klonovaných plazmidů byl vybrán plazmid obsahující inzert o velikosti přibližně 1,45-kbp dlouhý EcoRI-HindlII fragment. Sekvencováním terminálních částí DNA tohoto klonu se potvrdilo, že 5'konec inzertu přesně odpovídá korespondujícímu konci pRPA-ML-711 a že 3'-konec má následující sekvenci:

5'- ... AAT TAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT- 3'

Podtržená sekvence odpovídá kodónu pro COOH-koncovou aminokyselinu Asparagin, další kodón odpovídá translačnímu stop kodónu.

Nukleotidová sekvence po směru transkripce odpovídá sekvenci částí polylinkeru pUC19. Tento klon vykazuje sekvenci odpovídající sekvenci pRPA -ML-711 až k místu pro terminaci translace maturované kukuřičné EPSP syntázy. Za tímto místem následuje sekvence polylinkeru pUC19 až k místu HindlII. Celý tento konstrukt se nazývá pRPA -ML-712.

b) Modifikace 5' konce pRPA-ML-712: konstrukce pRPA-ML-715:

Klon pRPA-ML-712 byl štěpen restrikčními enzymy Pstl a HindlII. DNA vzniklá ztěchto manipulací byla separována pomocí elektroforézy na 0,8% LGTA/TBE agarózovém gelu (ref. CPMB). Část gelu obsahující inzert o velikosti 1,3-kbp Pstl-EcoRI byla vyříznuta z gelu a purifikována podle návodu popsaného výše v oddíle 5.

Tento inzert byl ligován za přítomnosti ekvimolámího množství každého ze dvou částečně komplementárních oligonukleotidů následujících sekvencí:

Oligo 1: 5'- GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3

Oligo2: 5'- GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3

-6CZ 295649 B6 a také za přítomnosti DNA plazmidu pUC19 naštěpené restrikčními enzymy BamHI a HindlII.

Dva mikrolitry ligační směsi byly použity pro transformaci E.coli DH10B jak je popsáno výše v oddíle 5. Po analýze plazmidové DNA obsažené v různých klonech, která byla provedena dle návodu v části 5 bylo zjištěno, že jeden klon obsahuje sekvenci inzertu o přibližně 1,3 -kbp. Tento byl podroben další analýze. Sekvence DNA 5'konce vybraného klonu se skládá z následujících částí: sekvence pUC19 polylinkeru, a to od štěpného místa pro EcoRI až po místa štěpení BamHI, potom následuje sekvence oligonukleotidů použitých pro klonování, dále následuje zbytek sekvence nacházející se vpRPA-ML-712. Tento klon byl označen pRPA-ML.-713. V tomto klonu je kodón ATG pro methionin zahrnut do vazebného místa pro restrikční enzym Ncol, a to proti směru transkripce N-koncové části kodónu pro alanin maturované EPSPS syntázy. Dále kodóny pro alanin a glycin nacházející se na N-konci jsou zachovány, ale jsou modifikovány třetí variabilní bází“ počáteční GCG GGT dá po modifikaci GCCGGC.

Klon pRPA-ML-713 byl štěpen restrikčním enzymem HindlII. Na výsledné získané štěpy se působilo Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I. DNA byla potom podrobena restrikčnímu štěpení enzymem Sac I. Výsledná DNA byla dělena na elektroforéze v 0,8 % LGTA/TBE agarózovém gelu (ref. CPMB).

Část gelu obsahující inzert o velikosti 1,3-kbp „HindlII-tupý konec/SacI“ byla vyříznuta z gelu a purifikována dle protokolu uvedeného výše v oddílu 5. Tento inzert byl ligován za přítomnosti DNA z plazmidu pUC19, která byla štěpena restrikčním enzymem Xbal a přesahující konce vzniklé tímto štěpením byly zarovnány pomocí Klenowova fragmentu DNA polymerázy I. Výsledný produkt byl štěpen restrikčním enzymem Sací.

μΐ ligační směsi byly použity pro transformaci E.coli DH10B jak je popsáno výše v oddíle 5. Po analýze plazmidové DNA obsažené v různých klonech, která byla provedena dle návodu v části 5, bylo zjištěno, že jeden klon vykazuje sekvenci inzertu o přibližně 1,3 -kbp. Tento byl podroben další analýze. Sekvence DNA terminálních částí tohoto vybraného klonu se skládá z následujících částí: sekvence pUC19 polylinkeru, a to od štěpného místa pro EcoRI až po místa štěpení Sací, potom následuje sekvence oligonukleotidů použitých pro klonování, z nichž byla vynechána sekvence o délce 4bp GATCC z oligonukleotidů 1 popsaného výše. Dále následuje zbývající sekvence přítomná v pRPA-ML-712 až po místo štěpení pro HindlII a sekvence polylinkeru pUC19 od místa pro Xbal po místo pro HindlII. Tento klon byl označen pRPA-ML715.

7. Příprava cDNA kódující mutovanou formu kukuřičné EPSPS

Všechny kroky vedoucí kmutagenezi byly provedeny pomocí soupravy Pharmacia U.S.E. podle instrukcí dodavatele. Princip tohoto systému pro generování mutací je tento: plazmidová Dna se tepelně denaturuje a reasociuje se v molárním přebytku oligonukleotidů jednak použitého pro zavedení mutace a rovněž v přebytku oligonukleotidů, který má eliminovat jedinečné cílové místo pro ten restrikční enzym, který se vyskytuje v polylinkeru. Po reasociaci se nasyntetizuje komplementární vlákno pomocí T4 DNA polymerázy v přítomnosti T4 DNA ligázy a proteinu genu 32 ve vhodném pufru, který je dodáván výrobcem. Produkt syntézy je inkubován v přítomnosti restrikčního enzymu, jehož cílové místo se mělo mutagenezí odstranit. Jako hostitelské buňky pro transformaci touto DNA se použijí bakterie E. coli, především pak takového kmene, který obsahuje mutaci mutS.

Buňky se nechají narůst v kapalném médiu, vyizoluje se z nich celková plazmidová DNA a ta se poté inkubuje s uvedeným restrikčním enzymem. Poté se jako hostitel pro transformaci touto DNA použijí bakterie E. coli kmene DH10B. Vyizoluje se plazmidová DNA jednotlivých klonů a přítomnost mutace se otestuje sekvenací.

-7CZ 295649 B6

A) - modifikace cílových míst nebo sekvence, bez významného zásahu do charakteru rezistence kukuřičné EPSPS k metabolickým produktům, které jsou zároveň kompetitivními inhibitory ESPS syntázy: vypuštění vnitřního cílového místa pro Ncol zplazmidu pRPA-ML-715.

Sekvence plazmidu pRPA-ML-715 byla očíslována tak, že jako počátek byla určena první báze N-koncového alaninového kodónu GCC. Tato sekvence obsahuje cílové místo Ncol na pozici 1217. Oligonukleotid určený k modifikaci cílového místa má sekvenci:

5-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3'.

Vlastní sekvenování bylo provedeno postupem uvedeným v referencích a bylo přitom zjištěno, že po mutagenezi odpovídá sekvence použitému oligonukleotidu. Cílové místo Ncol bylo opravdu odstraněno a translace aminokyselin v této oblasti zachovává počáteční sekvenci podle plazmidu pRPA-ML-715.

Tento klon byl označen jako pRPA-ML-716. 1340 bp dlouhá sekvence tohoto klonuje znázorněna v Sekvenci id. č.: 2 a v Sekvenci id. č.:3.

B) - modifikace sekvence genu zvyšující rezistenci kukuřičné EPSPS k metabolickým produktům, které jsou zároveň kompetitivními inhibitory ESPS syntázy.

Pro zavedení mutací byly použity následující oligonukleotidy:

a) pro zavedení mutace Thr 102 —> Ile.

5'-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3'

b) pro zavedení mutace Pro 106 -> Ser.

5'-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'

c) pro zavedení mutace Gly 101 —> Ala a Thr 102 —> Ile.

5'-CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3'

d) pro zavedení mutace Thr 102 -> Ile a pro 106 —> Ser.

5-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'

Po sekvenování bylo zjištěno, že sekvence tří mutovaných fragmentů odpovídala DNA sekvenci původního klonu pRPA-ML-716, s výjimkou oblastí s cílenou mutací, které odpovídaly použitým oligonukleotidům. Jednotlivé klony byly označeny takto: klon s mutací Thr 102 -> Ile jako pRPA-ML-717, klon s mutací Pro 106 -> Ser jako pRPA-ML-718, klon s mutacemi Gly 101 —> Ala a Thr 102 -> Ile jako pRPA-ML-719 a konečně klon s mutacemi Thr 102 -> Ile a Pro 106 Ser jako pRPA-ML-720.

1340-bp dlouhá sekvence plazmidu pRPA-ML-720 je znázorněna na Sekvenci id. č.:4 a Sekvenci id. č.:5.

1395-bp dlouhý inzert NcoI-HindlII je základem pro všechny konstrukty použité pro transformaci rostlin a zaměřené na vložení genu pro rezistenci k herbicidům, které fungují jako inhibitory EPSPS. Ve výhodném provedení vynálezu jsou tyto konstrukty použity pro zavedení genu rezistence ke glyfosatu. Tento inzert bude dále označován jako dvojitý mutantní kukuřičné EPSPS dvojnásobné množství mutantní.

-8CZ 295649 B6

Příklad 2: In vitro tolerance různých mutantů ke glyfosatu

2.a: Extrakce EPSP syntázy

Různé geny pro EPSP syntázu se formou NcoI-HindlII kazety vloží do plazmidového vektor pTrc99a (Pharmacia, ref. č.: 27-5007-01), který byl předtím naštěpen restrikčními enzymy Ncol a HindlII. Rekombinantní bakterie E. coli kmene DH10B exprimující tyto různé EPSPS syntázy se sonikují ve 40 ml pufru na 10 g zpeletovaných buněk a poté se stejným pufrem promyjí (200mM Tris-HCl pH 7,8, 50mM merkaptoethanol, 5mM EDTA a lmM PMSF), do kterého se přidá 1 g polyvinylpyrrolidonu (PVP). Suspenze se 15 minut míchá za teploty 4 °C a poté se 20 minut centrifuguje při 27,OOOxG a 4 °C.

K supematantu se přidá síran amonný za vzniku roztoku se 40% saturací síranem amonným. Směs se 20 minut centrifuguje při 27,OOOxG a 4 °C. Poté se k novému supematantu přidá další síran amonný do 70% saturace. Směs se poté 30 minut centrifuguje při 27,OOOxG a teplotě 4 °C. EPSP syntáza obsažená v proteinové peletě se převede do 1 ml pufru (20mM Tris-HCl, pH 7,8 a 50mM merkaptoethanol). Tento roztok se přes noc dialyzuje proti 2 litrům tohoto pufru při teplotě 4 °C.

2.b: Enzymatická aktivita

Aktivita jednotlivých enzymů jakož i jejich rezistence ke glyfosatu se měří in vitro v průběhu 10 minut při teplotě 37 °C v reakční směsí obsahující lOOmM kyselinu maleinovou pH 5,6, lmM fosfoenolpyruvát, 3mM šikimát-3-fosfát (připravený podle práce Knowles P. F. a Sprinson D. B. 1970, Methods in Enzymology 17A, strana 351 až 352, pomocí bakterií Aerobacter aerogenes kmene ATCC 25597) a lOmM fluorid draselný. Jako poslední, po přídavku glyfosatu v rozmezí 0 až 20mM, se k reakční směsi přidá enzymatický extrakt.

Enzymatická aktivita se změří na základě uvolněného fosfátu za použití techniky popsané v práci Tausky H. A. a Shorr E. 1953. J. Biol. Chem. 202, strana 675 až 685.

Za uvedených podmínek je enzym divokého typu (WT) z 85 % inhibován při 0,12mM koncentraci glyfosatu. Při stejné koncentraci glyfosatu je mutantní enzym, označený jako SerlOó inhibován pouze z 50 % a další tři mutantní enzymy Ilel02, Ilel02/Serl06 a Alal01/Ilel02, vykazují nepatrnou nebo dokonce žádnou inhibici.

Koncentrace glyfosatu se musí zvýšit desetinásobně, to jest na 1,2 mM, aby bylo dosaženo 50% inhibice mutantního enzymu Ilel02, přičemž mutantní enzymy Ilel02/Serl06, Ala/Ile a Ala stále ještě nevykazují známky inhibice.

Je třeba poznamenat, že aktivita mutantních enzymů Ala/Ile a Ala není ovlivněna ani při lOmM koncentraci glyfosatu, a že mutantní enzym Hel02/Serl06 nijak dotčen dokonce ani po zdvojnásobení koncentrace glyfosatu (to jest při 20mM).

Příklad 3: Rezistence transformovaného tabáku

1.1 Transformace

Vektor pRPA-RD-173 byl vložen do bakterií Agrobacterium tumefaciens kmene EHA101 (Hood a další, 1987) obsahující kosmíd pTVK291 (Komáři a další, 1986). Transformační technika je založena na postupu Horshe a dalších (1985).

-9CZ 295649 B6

1.2 Regenerace

Regenerace tabáku PBD6 (dodaného firmou SEITA, Francie) z listových explantátů se provádí na bazálním médiu Murashige-Skoog (MS) obsahujícím 30 g/1 sacharózy a 200 pg/ml kanamycinu. Explantáty se odeberou z rostlin pěstovaných ve skleníku nebo in vitro a řízky listů se transformují standardním způsobem (Science, 1985, svazek 227, strana 1229 až 1231) ve třech po sobě jdoucích stupních: prvním je indukce výhonků na médiu doplněném 30 g/1 sacharózy s přídavkem 0,05 mg/1 naftyloctové kyseliny (NAA) a 2 mg/1 benzylaminopurinu (BAP). V tomto médiu se listové disky inkubují 15 dnů. Výhonky, které během této doby vzniknou se poté 10 dnů vyvíjejí na MS médiu doplněném 30 g/1 sacharózy, ale bez přídavku hormonů. Vyvinuté výhonky se poté vyjmou a kultivují se na MS médiu pro tvorbu kořenů, které má poloviční obsah solí, vitamínů a cukrů a neobsahuje žádné hormony. Po přibližně 15 dnech se zakořeněné výhonky přesadí do půdy.

Rezistence ke 1-3- glyfosatu

Bylo regenerováno a přesazeno do skleníku dvacet transformovaných rostlin, které byly použity pro konstrukci pRPA-RD-173. Tyto rostliny byly ve skleníku ošetřeny ve stádiu pátého listu vodnou suspenzí herbicidu Round-Up odpovídající použití 0,8 kg aktivní substance (glyfosatu) na 1 hektar plochy.

Výsledky odpovídají pozorováním fytotoxicity zaznamenané 3 týdny po ošetření. Za těchto podmínek bylo prokázáno, že rostliny transformované konstruktem pRPA-RD-173 vykazují velmi dobrou míru tolerance, zatímco netransformované kontrolní rostliny byly zcela zničeny.

Tyto výsledky jasně dokazují zlepšení způsobené použitím chimérického genu podle vynálezu.

Příklad 4: Transformace a výběr buněk kukuřice

Buňky kukuřice odrůdy BMS (Black Maxican Sweet) v exponenciální fázi růstu byly ostřelovány konstruktem pRPA-RD-130 postupem popsaným Kleinem a dalšími, 1987 (Klein T. M., Wolf E. D., Wu R. a Sanford J. C. (1987): High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into livind cells, Vysokorychlostní mikroprojektily vhodné pro vpravení nukleových kyselin do živých buněk, Nátuře sv. 327, strana 70 až 73).

Dva dny po transformaci se buňky převedou do stejného média s obsahem 2 mM N-(fosfonomethyl)-glycinu.

Po 8 týdenní selekci na tomto médiu byly vybrány vyvinuté kalusy a pomocí PCR v nich byla prokázána přítomnost chimérického genu OTP-EPSPS.

Buňky, které nebyly transformovány, ale byly pěstovány na totožných médiích s obsahem 2 mM N-(fosfonomethyl)glycinu jsou herbicidem blokovány a nevyvinou se z nich žádné kalusy.

Transformované rostliny podle vynálezu mohou být použity jako rodičovské rostliny pro získávání linií a hybridů s fenotypem odpovídajícím expresi vloženého chimérického genu.

Popis konstrukce plazmidů

Plazmid pRPA-RD-124: byl vložen polyadenylační signál „nos“ do plazmidu pRPA-ML-720 za vzniku klonovací kazety obsahující dvojnásobný mutant kukuřičného genu EPSPS (Thrl02—>Ile a Prol06->Ser). Plazmid pRPA-ML-720 byl naštěpen restrikčním enzymem HindlII a ošetřen Klenowovým fragmentem E. coli DNA polymerázy I za vzniku tupých konců. Druhé štěpení

-10CZ 295649 B6 byló provedeno enzymem Ncol a poté byl purifíkován EPSPS fragment. Gen EPSPS byl poté ligován s přečištěným plazmidem pRPA-RD-12 (klonovací kazeta obsahující polyadenylační signál nopalin syntázy) za vzniku plazmidu pRPA-RD-124. Použitelný, přečištěný vektor pRPA-RD-12 byl získán tak, že plazmid byl nejprve naštěpen restrikčním enzymem Sáli, konce zarovnány Klenowovým fragmentem DNA polymerázy a poté naštěpen enzymem Ncol.

Plazmid pRPA-RD-125: byl vložen optimalizovaný tranzitní peptid (OTP) do plazmidu pRPARD-124 za vzniku klonovací kazety obsahující gen EPSPS se signálním peptidem pro lokalizaci do plastidů. Plazmid pRPA-RD-7 (Evropská patentová přihláška EP 652 286) byl naštěpen enzymem Sphl, ošetřen T4 DNA polymerázou a poté naštěpen enzymem Spěl. Poté byl purifikován OTP fragment. Tento OTP fragment byl nakloňován do plazmidu pRPA-RD-124, který byl předtím naštěpen restrikčním enzymem Ncol, ošetřen Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I z E. coli a poté ještě jednou naštěpen enzymem Spěl. Tento klon byl poté sekvenován, aby mohla být určena správná translační fúze mezi OTP a EPSPS. Vzniklý klon byl nazván pRPA-RD-125.

Plazmid pRPA-RD-130: byl vložen promotor histonu z kukuřice H3C4 a sekvence intronu 1 adhl z plazmidu pRPA-RD-123 (viz Patentová přihláška EP 507 698) do plazmidu pRPA-RD125 za vzniku expresivní kazety pro použití v rostlinách pro expresi dvojnásobné mutantní formy EPSPS genu v tkáních jednoděložných rostlin. Plazmid pRPA-RD-123 (kazeta obsahující promotor histonu z kukuřice H3C4 fúzovaný s adhl intronem 1) byl naštěpen restrikčními enzymy Ncol a Sací. DNA fragment obsahující promotor odvozený z plazmidu pRPA-RD-123 byl poté přečištěn a ligován s plazmidem pRPA-RD-125, který byl ještě předtím naštěpen restrikčními enzymy Ncol a Sací.

Plazmid pRPA-RD-159: k plazmidu pRPA-RD-125 byl vložen dvojitý promotor H4A748 histonu z Arabidopsis (viz patentová přihláška EP 507 698) za vzniku kazety pro expresi fúzního genu „OTP-dvojnásobný mutant genu EPSPS“ v dvouděložných rostlinách. Plazmid pRPA-RD132 (kazeta obsahující dvojitý promotor H4A748 histonu z Arabidopsis, viz patentová přihláška EP 507 698) byla naštěpena restrikčními enzymy Ncol a Sací. Purifíkovaný fragment s promotorem byl poté nakloňován do plazmidu pRPA-RD-125, který byl předtím naštěpen enzymy Ecol a Sací.

Plazmid pRPA-RD-173: do plazmidu pRPA-BL-150A (viz Evropská patentová přihláška 508 909) byl vložen gen pro fúzní protein „H4A748 promotor -OTP -dvojitý mutant EPSPS genu“ z plazmidu pRPA-RD- 159 a byl vytvořen transformační vektor v Agrobacterium tumefaciens. Plazmid pRPA-RD-159 byl naštěpen enzymem Notl a ošetřen Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I z E. coli. Tento fragment byl poté nakloňován do plazmidu pRPABL-150A do restrikčního místa Smál.

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. :1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1713 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

-11 CZ 295649 B6 (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Zea mays (B) KMEN: BMS (Black Mexičan Sweet) (vii) KONKRÉTNÍ ZDROJ:

(A) KNIHOVNA: lambda gtlO (pIVB 3-420) o (B) KLON: pRPA-ML-711 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č: 1 aatcaattyc acacagciaaa οαλτϊλτολο otgattacg aáttcgggčc csogckwtg A7CCGGCSGC CGCWXGCG GCGGCGCTGC AGGCGGGTGC CGAGGAGATC CTGCTGOCC CCATCAAGGA GATCTCCSGC ATOTTCAAGC TCCCCCGGTC OAA07CGCT7 TCCA*CO3GA TCCTCC7AC7 CGCCSCCCTG TCCGAGCGGA CTACAQTOOT TQKXMOCW CTOAAOCTC A0CATG7CCA CTACATGC7C GGCGCCTTGA GGACTCTTOG TCTCTCTSTC GAAGCCCACA AAGGTGCSÁA AAGAGCTG7A G í rb IW t GTtJGTGGAAA GT7CCOC77 GAOfiATGCIA AASAGGAACTt GCWCTCTTC TTCOGÍGAATG CTOOAACTCC AWOCGGCCA ΤΤΟΑΟβΟ» CTímACTGC TGCTGCTGGA MÍGCWŽTT ACGTGCTTQA TOGÁGTACCA AOMKAGGC

TCAWJCAÍÍCT rzrrřXlAGAT GTTGATIVl Γ TCAA7<3GAA7 CSOA/jrtGCTA CC7CGTGGCA a/ttacttqu: τ<κχΓΓ7'ΧΓτπ ATqsctccrc 7CATT<ÍA7AA AT7AA7ZTCC ATTGXTACG T7GGTGTGAA AGCAGAGCAT 7C7GA7AGCT M7ACMC7C CCCTAAAAAT GCCTA7GTTG 7GGC7GGTGC TGCAATTACT GGACGGSCTff TGCTEGGTCA TOTGAASTTT GCTCAGGTAC CCGAGACTAG OCTAACTOTT ACTGCJCCCTC aogosattgA TGTCAACAM AAOAGATGC CCCTCT77GC CGA7GGCCCG ACAGCOMCA CtXAGASGA? GGT7GCGATC CGGXXGAOC GGCmGACZA CTGCATCATC ACGCCGCCCG ACSACGACGA CASGX7CGOC ATCGCCTTCT COJCTrZA ČCCTGGGTOC ACCOGGAACA CT77C5TCAA GAAT7AA7AA ACCGTGCGA? CTTG7GC7GA GGAAATAČtó TTCTTTTGTJ GAGTCTGXAA C377ACTTGT TTGTAGCAAC GTAAGCCAAA TTTCATTTCA AGAGTGGT7C TCVJTtlAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA at-miacccat trrTfrrcncAT

Tcrrr.-xOv; τλπ.·»χλ crrrrroTrG ArxrrcAAíizr < rrcrvzncc atcac-cattc ΤΓΓΤ'ΧΧΤΓσΓ Tí-javíAtrrTG gagattgaaa 7CGAAATGAC ATTGAGAT7G ATGíiMXXTT ΟΓΧΙΑΞΛΛΛΤΤ ctacattaas GSAOGTCAAA AAGGTGA7CC CTCAAGCGGA AGCTATTTCT 7GAG7GTGGA AGGTTGTGGC ACCVXAGTT 7GGAGA7GA7 GGGACCGAAa CTTACATGOA CGCGGGAŮCC ATTTGGGWS AJUCACC7CA CTGATGTeSC OATGACTCrr GC7GTGCT7G GAGACG7GGC TTCCTGGASA G7AAAGGAGA 7AACCMGC7 GSCAacATCT GTTGA5OAAS AGAAGCTGAA CGTGACSGCG ATCGAGMOTT CCOTTGCCGC CTGTGCCGAG CTCCCCCTCA CCTTGCCCSA CTACTTCGAT stgcwsca ACTACCACSC AGCTTCATTG AAGTGAXAGO crcřrrrTTcr στττοΛακχ» ΑττΑΑσπττ rrrcTATrrc c^atcttaa: tttgtgcact GTTGGAA7AA TAAGAA7AA7 AAA77AC077 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AACCCSGGAA £0

120 ltO

240

Joo sw «20 <80 $40 •100 «Ό

120

180

840

SCO

M0

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620 1680

1113

- 12CZ 295649 B6

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. :2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1340 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(B) KLON: pRPA-ML-716 (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) JMÉNO:KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 6 až 1337 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č: 2

so

55

C.7T

z—·/*

TCT

CTC

GAA

gcg

GAC

AAA

GCT

GCC

AAA

AGA

GCT

CTA

CTT

23’

«1/

Lru

3<r

V.1 1

GIm

AU

Ajp

Al*

Uyu

Arg

AU

•/»1

V.il

Vol

70

'·>

tct

GCT

GGA

AAG

TTC

CCA

CTT

GAG

GAT

GCT

AAA

KM

GAA

•CTG

CAG

:*/

ílý

Gl/

•U/

Lys

phw

Pro

V«l

Glu

ArfJ>

Al*

Uy/

Glu

¥.51

Gin

40

55

šo

ctc

ttc

TTG

GGG

AAT

GCT

GGA

ACT

GCA

ATG

CGG

CCA

TTG

ACA

GCA

GCT

335

L4U

Ph·

L*u

Gly

A*n

Al*

Gly

Thr

Al*

H*€

Arg

Pro

lAU

Thr

Al*

15

100

105

110

GTT

ACT

GCT

GGT

GGA

AAT

GCA

ACT

TAC

GT3

CTT

GAT

GGA

GTA

CCA

3*3

V«I

Thr

Al*

AJ*

Gly

A»n

Al*

Thr

Tyr

v«i

1a>u

Ajrp

Gly

Vel

Pro

115

120

125

AGA

ATG

AGG

GAG

AGA

GCC

ATT

GGC

GAC

TTG

GTT

GTC

GGA

TTG

AAG

CAG

431

A>rg

Arg

Glu

Arg

Pro

11»

Gly

w

L-*u

V»1

V*1

Gly

b»U

Í,JF*

Gin

130

135

140

CTT

GGT

GCA

GAT

GTT

GAT

TGT

TTC

CTT

GGC

ACT

GAC

TGC

CCA

CCT

GTT

47»

L*U

Gly

Al*

Λ»ρ

V«1

Ajrp

cy»

et*

t*u

Gly

Thr

A»p

cy*

Pro

Val

14$

150

155

-13CZ 295649 B6

CGT

GTC

AAT

CGA

ATC

CGA

. GGG

CTA CTT

GCT

GGC

' .AAG

CTC

AM CTG

TCT

521

Arg

Val

AWí

Gly

11«

Gly

^: Gly

Leu Pro

Gly Gly

* Lye

Val

Lye Leu

Ger

i«o

1«

110

GGC

TCT

ATC

AGC

ACT

CAG

TAC

TTG ACT

GCC

TTG

CTG

ATG

GCT GCT

CTT

515

Gly

a«t

11«

s«r

S«r

Gin

Tyr

Leu S»r

Ala

Leu

Met

Al· Al·

Pro

115

180

185

150

TTG

GCT

GGG

GAT

CTG

GAG

ATT GAA

ATC

ATT

GAT

AAA

TLA ATC TCC

523

Leu

AU

Leu

Gly

Aap

Val

Glu

11· Glu

XI·

Aep

Lye

Leu Xle

1«

200

205

ATT

CCG

TAC

CTC

GAA

MG

ACA

TTG AGA

T?G

ATG

GAG

CST

TTT GCT CTG

«71

11·

Pro

Tyr

v«i

Glu

Met

Thr

Leu Arg

Leu

Met

Glu Arg

Phe Gly ν·1

210

215

220

AAA

GCA

GM

CW

TCT

GAT

AGC

TGG GAC

AGA

TTC

TAC ATT

AAG GGA GCT

113

Ly»

Al*

Glu

Ml*

S«r

Aep

Ser

Trp A*p Arg

tyr

Ile

Ly» Gly Gly

225

230

235

CAA

AAA

TAC

AAG

TCC

CXTT

AAA

AAT GCC

TAT

GTT

GAA

GCT

GAT .GGC TCA

7 «7

Gin

Ly»

Tyr

Lye

Ser

Pro

Ly»

Aen AJ*

Tyr

Val

Glu

Gly Aep Al·

s«r

240

2*5

250

AGC

CGA

AGC

TAT

TTC

TTG

GCT

GCT GCT

GCA

ATT

ACT

GGA

GGG ACT

sts

815

S«r

Al*

S«r

Tyr

pn·

Leu

Al*

Gly AJ*

Al*

Zle

Thr

«iy

Gly Thr

Val

255

260

285

210

ACT

CTO

CAA

GCT

TGT

GGC

ACC

ACC ACT

TTG

CM

GCT

GAT CTG AM

Wř

««3

thr

v«i

Glu

Gly

Cye

Gly

Thr

Thr Ser

Leu

Gin

Gly Aep val Lye

Ph·

215

z«o

285

GCT

GM

CTA

CTG

GAG ATG

ATG

GGA GCG

AM

GTT

ACA TGG ACC GM

ACT

311

Al·

Glu

v<i

Leu

Glu Met

Met

Gly Al·

Lye

Vel

Thr Trp ^eiu

Thr

230

2»S

300

MC CTA ACT GTT ACT GGC CCA CCG CGG GM 3»r Vil Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu 305 310 »53

CCA ΤΓΤ CCG MG AAA CM

Pro Ph» Gly Arg-Lys Hle

315

CTC Leu

AAG GCG ATT GAT CTC AAC ATG AAC AM MG

CTT Pro 330

GAT Aep

CTC Val

GCC Al·

ATG Met

10Ó7

Lye Al* 32:0

11· Aep Val Aen 325

Met

Aen

Lye

Met

ACT

CTT

GCT

GTG

CTT

GCC

CTC

TTT

GCC

GAT

GGC

COG

ACK

GCC

ATC

AGA

1055

Thr 335

leu

Al*

V«1

Ala 340

L»u

Ph·

Al*

Aep

Cly 345

Pro

Thr

Ala

Zle

Arg 350

GAC

CTG

GCT

TCC

TGG

AGA

CTA AAG

GM

MC GM

AGG

ATG

CTT

GCG ATC

1103

Aep

Vil

Al*

S.r

Trp Arg 355

Vel

Lye

Glu

Thr 380

Glu

Arg

Het

Vtl

Al* 343

Zle

CGG

ACG

GM

CTA

ACC

AAG

CTG

GGA

GCA

TCT

GTT

GM

GAA

GGG

cca

GM

1151

Arg

Thr

Glu

Leu

Thr

Lyw

Leu

Gly Ala

8er

Val

G1U

Glu

Gly

Pro

Aep

J’u J15 JBO

t*c tgc atc atc ag:

CCě 4 CC· »

GM am CTC AAC CTG ACT GCT ATC GAC

1134

Tyr

Cyu

ru· JH·.

t le

Thr

Prj

Pru

Glu J'W

Lys

L-eu Ajen

Val Thr AU J15

CU Asp

ΑΟΐ

TAC

GAC

f *AC

CAC

ACG

ATG

GCT

ATG

GCT

TTC

TCT

CTT GCT

GCT TCT

1211

Thr

Tyr

A.:p

A^rp

Hir

ACJ

H»r.

Ala

Hvt

AU

Phw

Šer

Lru Ale

Al* Cys

400

4 05

410

GCC

GM

CTC

CCC

CTC

ao;

ATC

CGG

GAC

CCT

GGG

TGC

ACT CGG

AM MC

1235

Al*

Glu

Val

Pro

Val

Thr

Zle

Arg

A*p

-Pro

Gly

Cye

Thr Arg

Lys Thr

415

420

425

430

TTC

ccc

GAC

TAC

TTC

GAT

CTG

AGC

ACT

TTC

CTC

AAG AAT

1331

Ph·

Pro

Aep

Tyr

Ph·

Aep

Val

Leu

ser

Thr

Phe

Val

Lye Aen

435

440

TAA

1340

- 14CZ 295649 B6

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. :3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 440 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č: 3

Ala Gly Ala Glu Glu 11« Val Lau Gin. Pro II· Ly» Glu II· Sar Cly

1

5

10

15

The

Val

Lya

Leu

Pro

Gly

Sar

Lya

Sar Lau Ser Aar

i Arg

' Ila

Lau Leu

20

25

30

Leu

Ala

Leu

Sar

Glu

Gly

Thr

Thr Val Val

A«P

i Aan

Lau

Leu Aen

3S

40

45

Ser

Glu

Aap

Val

Hle

Tyr

Mat

Lau

Gly Al* Lau

Arg

Thr

Lau

Gly Lau

50

55

eo

Sar

val

Glu

Ala

Aap

Lya

Al*

Ala

Lya Arg Ala

val

v*x

Val

Gly Cya

«5

10

TS

80

Gly

Cly

ty»

Ph*

Pro

Val

Glu

A»P

Ala Lya Glu

Clu

Val

Gin

Leu Phe

85

50

S5

L«u

Gly

Asn

Ala

Gly

Thr

Ala

Met

Arg Pro Leu

Thr

Ala

Val Thr

100

105

110

Ala

Cly

Aen

Ala

Thr

Tyr

Val Lau Aap

Gly

v* i

Prd

Arg Mat

US

120

1Z*

Arg

Glu

Arg

Pro

11·

Gly

Aap

Leu

V.l Val Gly

Lau

Ly·

cm

Lau Gly

130

133

140

Ala

Aap

Val

Aap

Cya

Pha

Leu

Gly

Thr Aap cya

Pro

P«

Val

Arg val

14$

150

1SS

140

Aan

Cly

11«

Gly

Lau

Pro

«ty

Gly Lya Val

ty»

Lau

Sar

Gly sar

1Í5

no

IT*

Ila

Sar

Gin

Tyr

Leu

Sar

Ala

Lau Lau Mat:

Ala

Pro

Lau Ala

íao

185

1*0

Lau

Cly

Aap

Val

Glu

Ila

Glu

Xle

Ila Aap Ly»

Lau

Zla

Sar

XI» Pro

1*5

200

20*

Tyr

Val

Glu

Mat

Thr

Lau

Arg

Uru

Mat. Glu Arg

Pha

Gly

Val

Ly» Ala

210

21$

220

Clu

Hle

Sar

Asp

s«r

Trp

Aap

Ar?

Ph· Tyr Ila

Ly«

Gly

Gly <

Gin Ly»

225

230

235

24G

Tyr ty» »·γ Pro 1*1* Aan Α1» «Υ

24* 250 «Μ

t-r Tyr

lew*

Alt

r.ly

Ala

Ila

Thr

r.ir

Gly

Tfcr

val

Thr

val

T+O

í-íS

270

'il·. '<ty

o

'•i/

Thr

5vf

Lau

Gin

Gly

Aap

Val

Lys

Phe

Ala

Glu

O '4^

iuo

’1‘ Ur**

*

Kr'

Met

Cly

Ala

Lya

Val

Thr

Trp

Thr

*»1’4

Thr

Sve

v*.

r-

2’5

JOO

The Vai

Thr

1/

Pro

Arg

Glu

Pro

Ph·

Gly

Arg

i*·/»

Hla

Leu

Lya

JOS

310

315

320

-15CZ 295649 B6

Ala

£1· Aep

Val

A»n

M«C

. Aen

Lya M«t

Pro

Aep

ν·1

Ala H»C

Thr

Lev

325

330

335

Ala

V*i V«1

AJ«

Leu

Ph·

Ala

Aorp Gly

Pro

Thr

Ala

ΧΙβ'Ατβ Aap

Val

340

345

350

Α1»

Ser Trp

Arg

Val

Lys

Glu

Thr

Glu

Arg

M«t

Val

.Ala 11·

Αχ®

Thr

J55

340

345

Glu

Leu Thr

Lys

Leu

Gly

Ala

Ser

Val

Glu

Gly

Pro Aatp

Tyr Cy»

370

375

380

11»

XI· Thr

Pro

Glu

Ly»

Leu

Aan

Val

Thr

Ala

Ile-Aap

Thr

Tyr

385

390

395

400

Aap

Aap Hl·

Arg

Mat

Ala

Ph·

S«r

Leu

ΛΧβ

Ala Cya

Ala

Glu

<05

410

415

val

Pro val

Thr

11«

Am Am

Pra

Gly cya Thr Ara Lya Thr

Ph·

Pro

420

425

' 430

a*p

Tyr Ph·

Aap

Val

Leu

S»r

Thr

Ph· Val Ly« Aen

05

440

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. :4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(B) KLON: pRPA-ML-720 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č: 4

CCATG GCC GGC GCC GAG GAG ATC GTG CM CAG « ATC AAG GAG ATC4?

Al· Gly Al· Glu Glu XI· Val Lmi Gla P« XI· Ly» Glu XI·

510

TCC GGC ACC GTC AAG CTG CCG ®3G TCC AAG TOÍ CTT TOS AAC CGG ATC95

3»r Gly Thr val tya L«u fga Gly lar Lyv ttg Xau Λγ Am *cvII·

20 2330

CTC CTA CTC GCC GCC CTG TCC GAG GGG ACA ACA GTG GTT GAT AAC CTG143

Uu Uu Uu Ali Ala Lma 8ar Glu Gly Thr Thr Val Vel Aap AmLeu

40<5

CTG AAC AGT GAG GAT GTC CAC TAC ATG CTC «00 COS TTO AGG ACT CTT 1*1

Leu Am S»r Glu A«p Val Hl· Tyr M«C Leu Gly Ala Leu Aps Thr Leu

	30			55				«0
GGT CTC TCT	GTC	GAA GCG	GAC AAA GCT	GCC AAA AGA GCT	OSA	GTT	GTT	23»
Gly Leu Ser	Val	Glu Ala	An» Ly· Má	Ala		Ala	Val	Val	Vel
<5				70		Ti
T/TT r/TT CZU W. TTC	CCA	rrrr 'au;	<5AT	říCT AAA	ntó	GAA	GTG	caus	287
ur cru <;ty <	Uy Ly.: 4*h«	Pro	val Gl«	Ai<p	AX4 lefV	Glu	Glu	Vel	Clo
HO			•45			no

-16CZ 295649 B6

,._r.

: rTC

: rn:

. .ru;

AAT >ÍCT

rzu

> ATC

: »Ό

AT»:

CU

: TCT

: ttí

t ACJV 4

, GCT

335

. Ph·.·

i i i ·/

A. i< AI·

Gly

' tis·

AU»

Met

Arg

Ser

le*U

< Thr

Al»

A14

1<1O

105

110

ACT

GCT

<XJT

fX7T GGA

AAT

GCA

ACT

TAC

GTG

err

GAT

cm

. CTA

CCA

383

V«i.

Thr

Ala

Al·

Cly Gly

Aen

Ala

Thr

Tyr

V»l

Leu

Aep

Gly

Val

Pru

117

120

125

AGA

ATG

AGG

GAG

AGA CCC

ATT

GGC

GAC

TTG

GTT

GTC

GGA

TTG

AAG

CAG

431

Arg

Met

Arg

Glu

Arg Pro

11·

Gly Aep

Leu

ν·1

Val Gly

Leu

Lya

Gin

130

135

140

CTT

GGT

GCA

GAT

GTT GAT

TGT

TTC

CTT

GGC

ACT

GAC

TGC

CGA

CCT

GTT

47»

Leu

Gly

Ala

Aep

Vel Aep

Cy»

Ph·

Leu

Gly

Thr

Aep

Cy·

Pro

V»1

145

150

155

CGT

GTC

AAT

GGA

ATC GGA

GGG

CTA

CCT

GGT

GGC

AAG

GTC

AAG

CTG

TCT

527

Arg

V·!

Aen

Gly

11· Gly

Gly

Leu

Pro

Gly Gly Ly»

V«1

Lya

Leu

Ser

i«o

165

170

GGC

TCC

ATC

AGC

AGT CAG

TAC

TTG

AGT

GGC

TTG

CTG

ATG

GCT

CCT

575

Gly

ser

11·

s«r

Ser Gin

Tyr

Leu

3«r

Ala

Leu

Leu.

Met

Ala

Pro

175

íso

185

190

TTG

GCT

CTT

GGG

GAT GTG

GAG

ATT

GAA

ATC

ATT

GAT

AAA

TTA

ATC

TCC

«23

Leu

Ala

Leu

Gly

Aep Val

Glu

11«

Glu.

XI·

11·

Aap Lya

Leu

11·

s«r

195

200

205

TAC

GTC

GAA ATG

AEA TTG

AGA TTG

ATG

GAG

CGT

•m

GGT

GTG

«71

ii·

Pro

Tyr

v«l

Glu H«t

Thr

Leu

Arg Leu

Met

Glu

Arg

Ph·

Gly

Val

210

215

220

AAA

GCA

GAG

CAT

TCT GAT .

AGC

TGG

GAC .

AGA ¹

TTC

7A£e

ATT

AAG

GGA

GGT

71»

Ly» Ala Glu Hia Ser Aep s«r Trp Aap Arg Ph· Tyr II· Ly» Gly Gly

225 230 235

CAA AAA TAC AAG TCC CCT AAA, AAT GCC TAT GTT GAA GGT GAT GCC TCA 7«?

Gin Lya Tyr Lya Ser Pro Lya Aen Ala Tyr Val Glu Gly Aep Ala S»r

240

245

250

AGC

GCA

AGC

TAT

TTC

TTG

GCT

GGT

GCT

GCA ATT

ACT

GGA GGG ACT GTG

815

S«r 255

Ala

Ser

Tyr

Ph·

Leu 260

Ala

Gly Ala

Ala

tle 265

Thr

Gly Gly Thr Val 270

ACT

CTG

GAA

GGT

TGT

GGC

ACC

AGC

AGT

TTG

CAG

GGT

GAT GTG AAG TTT

863

Thr

Val

Glu

Gly

Cy» 275

Gly

Thr

Ser

Leu 280

Gin

Gly

Aap Val Ly« Ph· 2B5

GCT

GAG

GTA

CTG

GAG

ATG

GGA

GCG

AAG

GTT

ACA

TGG ACC GAG ACT

911

Ala

Glu

val

Leu 290

Glu

M»t

Met

Gly

Ala 2»5

Ly»

Val

Thr

trp Thr Glu Thr 300

AGC

GTA ACT

GTT

ACT

GGC

CCA

CO3

CGG

GAG

CGA TTT

GGG AGG AAA CAC

»5»

5«r

Val

Thr 305

Vel

Thr

Gly

Pro

Pro 3X0

Arg

Glu

Pro

Ph·

Gly Arg Ly· Hl· 313

CTC

AAG

GCG

ATT

GAT

GTC

AAC

ATG

AAG

ATG

CXJT

GAT GTC GCC ATG

1007

Leu

Lya 320

Al·

Ile

Aep

Vel

Aen 325

Met

Aen

Lya

Met

Pro 330

Aep Val Ala Met

ACT

CTT

GCT

GTG

GTT

GCC

CTC

TTT

GCC

GAT

GGC

COSI

ACA GCC ATC AGA

1055

Thr 335

Leu

Ala

Vel

Val

Ale 340

Leu

Phe

Α1»

Aep

Gly 345

Pro

Thr Al· 11· Arg 350

GAC GTG GCT TCC

TGG AGA GTA AAG GAG ACC GAG AGG ATG GTT GCG ATC

1103

Aep

Val Ala Ser

Trp Arg 355

Val

Ly» Glu

Thr 3«0

Glu

Arg

Met V.l

Ala XI· 3«S

CGG

ACG

GAG

CTA

ACC

AAG

CTG

GGA GCA

TCT

GTt

GAG

GAA

GGG

CCG

GAC

1151

Arg

Thr

Glu

Leu

Thr

Lya

Leu

Gly Ala

••r

Val

G1U

Glu

Gly

Pro

Aap

370

375

3»0

TAC

TGC

ATC

ACG

rys*;

CCG

GAG AAG

CTG

AAC

GTG

ACG

CCSS3

ATC

GAC

11»»

Tyr Cy»

Zla

11·

Thr

Pro

Glu Lya

Leu

Aen

Val

Thr

Al·

Zle

Aap

385

3»0

395

17CZ 295649 B6

Aer;

TAC

CAC

»JAC

CAC

AT»

ATC

CCT!

ATC

CCC

TTC

TCC

CTT

CCC

TCT

1247

Thr

Tyr

A«p

A»!p

m.<

Arg

Met

AU

n«t

AU

Phe

Ser

Uru

AU

Cy»

no

405

410

'XX

-W5

CTC

CCC

'ÍTC

ACC

ATC

CCC

CAC

CCT

OW

TCC

ACS

ran

AAG

ACC

12’5

Α» 7

JI·.»

Val

Pr-í

v₃ l

Thr

ti«

Arg

A-P

ciy

Cy«

Thr

Arg

Ly*

Thr

O

420

4 Ji

4 JO

ccc

GAG

TAC

TTC

GAT

GTC

CTG

AGC

ACT

TTC

GTC

AAC

AAT

1JJ7

Phe

Pro

Aep

Tyr

Phe

A»p

vu

Uu

Ser

Thr

Um

Val

ty*

Aen

4J5

uo

taa

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. :5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 444 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č: 5

Ala

Gly

' Ala

Glu

Ile

Val

Leu

Gin

Pro

XI·

Ly*

Glu

Zle

Sar

Giy

1

S

10

15

Thr

Val

Ly·

Leu

Pro

Gly

Ser

Ly*

ser

Uu

S«r

Aen

Arg

Ile

Leu

20

25

30

Leu

Ala

Leu

Ser

Glu

Gly

Thr

Val

Aep

Am

Leu

Asn

35

40

45

Ser

Glu

Aep

Val

Η1»

Tyr

Met

Leu

Gly

Ala

Leu

Arg

Thr

Leu

Gly

Leu

50

55

60

Ser

Val

Glu

Ala

Asp

Lye

Ala

Lye

Arg

Ala

Val

Gly

Cy»

65

70

75

10

Gly

Ly»

Phe

Pro

Val

Glu

Asp

Ala

Ly*

Glu

Val

Gin

Leu

Phe

85

ÍO

»5

L«u

Gly

Asn

AU

Gly

11«

Ala

H«t

Arg-

S«r

Leu

Thr

Ala

Val

Thr

100

105

110

Ala

Gly

Aen

Al«

Thr

Tyr

Val

Leu

Aep

cly

Val

Pro

Arg :

Mat

US 120 125

Arg

Glu

Arg

Pro

Ile

Giy

Aep

Leů

Val

val

Gly

Leu

Ly»

Gin

leu

Gly

130

13S

140

Ala

Aep

Vil

Aep

Cye

Phe

Leu

cly

Thr

A«P

cy»

Pro

Val

Arg

Val

145

150

155

160

Asn

Gly

11«

Gly

Leu

Pro

Gly

Ly«

Val

Ly*

Leu

S*r

Gly

Ser

165

170

175

Ile

Ser

Gin

Tyr

Leu

Sar

Ala

Leu

Met

Ala

Pro

Leu

Ala

180

185

l>0

Uu

Gly

Arp

Val

Glu

Ile

Glu

Ile

Aep

Ly»

Leu

Ile

Ser

IX s

Pro

193

200

205

- 18CZ 295649 B6

Tyr Val

Glu M«t

Thr Lvu

Arg Lsu H«t 213

Glu Arg pft« Gly Val Lys Ala 220

210

Glu

His

s«r

Asp

9«r

Trp Asp Arg

Ph·

Tyr

11· Ly» Gly Oly Gin

Lys

223

230

235

240

Tyr

Ly«

s»r

Pro

Ly»

Asn

Ala

Tyr

Val

Glu

Gly Asp Ala

«•r

S«r

Ala

243

230

255

Ser

Tyr

Ph·

Leu

Ala

Gly

Ala

Al·

11·

Thr

Gly Gly Thr

Val

Thr

Val

2(0

2C5

270

Glu

Gly Cya

Gly

Thr

3«r

Leu

Gin

Gly Aep Val Lys

Phe

Ala

Olu

275

2(0

205

v.H

L»u

Glu

Mvt

Hul

Gly

Ala

Lys

Val

Thr

Trp

Thr

Giu Tnr

Sec

v· 1

?·>ο

245

300

Thr

7a l

Thr

Giy

Pro

Ari

Glu

Pro

Pho

Cly

Arg

Lr- His

Leu

Lv»

JO'.

J10

315

J20

Ala

i Ir

A.P

'M .

Ai<n

Met

Asn

Lys

NttC

Pro

Asp

vsi

Ala Het

Thr

Leu

J25

JJO

3J5

Ala

Val

Ala

Leu

Phe

Ala

Asp

Gly

Pro

Thr

Ala

11· Arg

Asp

Val

J4 0

345

350

Ala

S«r

Trp

Arg

Val

Lys

Glu

Thr

Glu

Arg

Met

Val

Ala Ile

Arg

Thr

355

330

365

Glu

Lsu

Thr

Lya

Leu

Gly

Ala

Ser

Val

Glu

Gly

Pro Asp

Tyr

cys

370

373

380

11«

Thr

Pro

Glu

Ly«

Leu

Asn

Val

Thr

Ala

11· Asp

Thr

Tyr

385

390

3 95

400

Asp Asp Hle Arg K«t Ala Kac Ala Ph· Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu 4GS 410<15

Val Pro val Thr II· Arg Asp Pro Oly Cya Thr Arg Lys Thr Ph· pru 420 425430

Asp Tyr Ph· Asp Val Lsu S«r Thr Ph· Val Lys Aen

433440

Claims

1. Sekvence rostlinné DNA, která kóduje mutovanou formu 5-enolpyruvátšikimát-3-fosfát syntázy (EPSPS), kde tato mutace obsahuje alespoň jednu substituci threoninu za izoleucin, přičemž threonin odpovídá pozici 102 v sekvenci EPSPS z kukuřice, a jednu substituci prolinu za serin, přičemž prolin odpovídá pozici 106 v sekvenci EPSPS z kukuřice.

2. Sekvence rostlinné DNA podle nároku 1, která navíc obsahuje mutaci spočívající v substituci glycinu 101 za alanin.

3. Sekvence rostlinné DNA podle nároku 1 nebo 2, která pochází z kukuřice.

4. Sekvence rostlinné DNA podle nároku 3, která je v popisu uvedena jako SEKV. ID. C. 4.

5. Mutovaný rostlinný protein EPSPS, který obsahuje alespoň jednu substituci threoninu za izoleucin, přičemž threonin odpovídá pozici 102 v sekvenci EPSPS z kukuřice, a jednu substituci prolinu za serin, přičemž prolin odpovídá pozici 106 v sekvenci EPSPS z kukuřice.

6. Mutovaný rostlinný protein EPSPS podle nároku 5, který má sekvenci v popisu uvedenou jako SEKV. ID. Č. 5.

7. Chimérický gen obsahující kódující sekvenci a regulační prvky v poloze 5' a 3', které jsou heterologní a schopné činnosti v rostlinách, přičemž gen obsahuje jako kódující sekvenci alespoň jednu sekvenci DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.

8. Chimérický gen podle nároku 7, který obsahuje promotor z rostlinného viru.

9. Chimérický gen podle nároku 7, který obsahuje rostlinný promotor, jako je například promotor a-tubulinu, histonů, intronů, aktinu a další.

10. Vektor pro transformaci rostlin, který obsahuje alespoň jeden chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 8 a 9.

11. Rostlinná buňka, která obsahuje alespoň jeden chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 8 a 9.

12. Rostlina, která byla získána regenerací z rostlinné buňky podle nároku 11.

13. Způsob přípravy rostlin ze zvýšenou tolerancí k herbicidům působícím proti EPSP syntáze jakožto svému cíli, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy se rostlinné buňky nebo protoplasty transformují sekvencí DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 a kdy se transformované buňky regenerují.

14. Způsob ošetření rostlin herbicidem působícím proti EPSP syntáze jakožto svému cíli, vyznačující se t í m , že herbicid se aplikuje na rostliny podle nároku 12.

15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že se aplikuje glyfosat nebo jeho prekurzor.