KR19990029084A

KR19990029084A - 돌연변이화된 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타아제,그 단백질을 코딩하는 유전자 및, 그 유전자를 함유하는 형질전환된 식물

Info

Publication number: KR19990029084A
Application number: KR1019980700388A
Authority: KR
Inventors: 미셀 르브룅; 알랭 셀랑; 죠지 프레이씨네
Original assignee: 크리스티앙 쥘랭; 롱-쁘랑 아그로쉬미
Priority date: 1995-07-19
Filing date: 1996-07-18
Publication date: 1999-04-15
Also published as: DK1217073T3; DE69635995T2; OA10788A; SK285144B6; HU226302B1; CA2223875A1; DK0837944T3; EP0837944B1; UA75315C2; EA199800138A1; PL189453B1; ES2255534T3; JP4691733B2; HUP9900463A2; SI0837944T1; DE69635913T2; IL122941A0; CN1196088A; BG64628B1; EP1217073A2

Abstract

트레오닌 102 의 이소루이신으로의 치환을 하나 이상 함유하고, 글리포세이트-내성의 형질전환 식물을 제조하는데 유용한, 5-에놀 피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타아제 (EPSPS) 의 돌연변이화된 글리포세이트 내성 유전자를 공개한다.

Description

돌연변이화된 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타아제, 그 단백질을 코딩하는 유전자 및, 그 유전자를 함유하는 형질전환된 식물

본 발명은 EPSPS 활성의 포스포에놀피루베이트 (PEP) 에 대해 경합적 저해제인 제초제에 대해 증가된 내성을 나타내는 신규 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타아제 (즉, EPSPS) 에 관한 것이다. 이 증가된 내성을 갖는 EPSP 신타아제는 하나 이상의 "이소루이신으로의 트레오닌" 치환을 함유한다. 본 발명은 또한 그러한 단백질을 코딩하는 유전자, 그 유전자를 함유하는 키메라 유전자 제조에 의해 형질전환된 식물 세포, 그 세포로부터 재생된 식물, 및 그 형질전환된 식물을 이용하여 교잡하여 생긴 식물에 관한 것이다.

글리포세이트, 술포세이트 및 포사메틴은 포스포노메틸글리신 계통의 광범위한 스펙트럼의 계통성 제초제이다. 그것들은 본질적으로 PEP (포스포에놀피루베이트) 에 대해 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타아제 (EC 2.5.1.19) 즉, EPSPS 의 경합적 저해제로서 작용한다. 그것들은 식물에 적용된 후, 그것들이 급속 성장 부분, 특히 줄기와 뿌리 끝에 축적되는 식물에 이식되면, 민감성 식물이 파멸에 이르게 되는 피해를 입게 된다.

플라스티드 EPSPS, 이 생성물의 주요 목적은 방향족 아미노산의 생합성 경로의 효소로서, 하나 이상의 핵 유전자에 의해 코딩되어 세포질 전구체 형태로 합성된 후, 성숙 형태로 축적되는 플라스티드로 도입된다.

글리포세이트 및 그 계통의 생성물에 대한 식물의 내성은, 글리포세이트의 하기 유전자 생성물 저해 특성에 있어 돌연변이 등이 일어난, 식물 또는 세균 기원의 EPSPS 유전자가 그것들의 게놈으로 안정하게 도입됨으로써 수득된다. 글리포세이트의 작용 형태 및 사용되는 유전자의 생성물인 글리포세이트에 대한 내성 정도의 측면에서, 플라스티드에 상당량 축적되도록 하기 위해서, 그 유전자의 번역 생성물을 발현할 있는 것이 유익하다.

예로서 미국 특허 제 4,535,060 호에는 플라스티드 구획 중의 EPSPS 효소가 위치한 후, 그 효소가 그것의 경합적 저해제 (글리포세이트) 에 대해 더욱 내성을 갖도록 하는 하나 이상의 돌연변이를 동반하는 EPSPS를 코딩하는 유전자를 식물의 게놈에 도입함으로써 상기 형태의 제초제, 특히 N-포스포노메틸글리신 또는 글리포세이트에 대해 내성을 부여함을 제시한다. 그러나 이 기술은 농업 조건 하에서 그 식물들의 용도에 있어 더 큰 신뢰도를 얻기 위해 개선될 필요가 있다.

본 명세서에서, "식물"은 모든 광합성 가능한 분화 다세포 유기체를 의미하는 것을 간주되고, "식물 세포"는 식물로부터 발생되고 유합조직과 같은 미분화 조직 또는 배 또는 식물 부분 또는 종자와 같은 분화 조직을 구성할 수 있는 모든 세포를 의미하는 것으로 간주된다.

본 발명의 목적은 이 제초제들에 대한 내성을 위한 유전자를 함유하는 신규 키메라 유전자에 의해 형질전환된 세포의 재생으로써, 포스포노메틸글리신 계통의 제초에 대해 내성이 증가된 형질전환된 식물을 생성하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 전사 방향으로 프로모터 지역, 임의적으로는 트랜짓 (transit) 펩티드 지역, 글리포세이트 내성 효소를 코딩하는 유전자 서열, 및 3' 말단에 있는 비번역 폴리아데닐화 시그널 지역을 포함하는, 그 표제로서 EPSPS 를 갖는 제초제에 대해 증가된 내성을 제공하기 위한 키메라 유전자로서, 글리포세이트 내성 유전자는 그것이 유도된 유전자에 대해 "aroA" (EPSPS) 지역에 "이소루이신로의 트레오닌 102" 치환을 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 그것은 부가적으로 동일한 지역에 "세린으로의 프롤린 106" 치환을 포함한다. 이 치환들은 모든 기원, 특히 식물, 세균, 조류 또는 균류 기원의 EPSPS 서열에 도입되거나 존재할 수 있다.

이제까지 공지된 바, 트랜짓 펩티드 지역에 사용가능한 트랜짓 펩티드는 식물 기원, 예로서 옥수수, 해바라기, 완두, 담배 등에서 유래될 수 있다. 제 1 및 제 2 트랜짓 펩티드는 동일, 유사하거나 상이할 수 있다. 또한 EP 0 508 909 에 따라 그것들은 각기 하나 이상의 트랜짓 펩티드를 함유한다. 플라스미드 구획에 최대 효능으로 성숙된 본래 단백질, 특히 상기 돌연변이화된 EPSPS 의 방출을 허용하는 것은 그 특정 지역의 역할이다.

본 발명에 따른 키메라 유전자의 프로모터 지역은 유리하게 식물에서 본래 발현되는 하나 이상의 프로모터 또는 프로모터 단편을 함유할 수 있다 (튜불린, 인스트론, 액틴, 히스톤).

키메라 유전자의 3' 말단에 있는 비번역 전사 종결 시그날 지역은 모든 기원, 예로서 노팔린 신타아제 유전자 등의 세균 기원이거나, 유럽 특허 출원 (유럽 출원 제 633 317 호) 에 따라 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 히스톤 H4A748 유전자의 경우 등의 식물 기원일 수 있다.

본 발명에 따른 키메라 유전자는 상기 필수 부분에 부가하여, 하나 이상의 비번역 중간 (링커) 지역을 함유할 수 있고, 그 지역은 상기 상이한 전사된 지역 사이에 위치할 수 있다. 이 중간 지역은 모든 기원, 예로서 세균, 바이러스 또는 식물 기원일 수 있다.

옥수수 EPSPS를 코딩하는 cDNA 의 단리

두 가지 돌연변이를 도입하기 위한 기질로서 작용하는 옥수수 EPSPS cDNA를 수득하기 위한 여러 단계들이 아래에 기재되어 있다. 하기 모든 작용들은 실시예에 의해 설명되고, 동일한 결과에 도달하는데 유용한 갖가지 방법들 중에 선택하도록 되어 있다. 이 선택은 결과의 질에 어떠한 영향도 미치지 않고, 결과적으로 동일한 결과에 도달하기 위해 당 분야의 숙련가가 모든 적당한 방법을 이용할 수 있다. 대부분의 DNA 프래그먼트의 조작은 Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1989) 가 발간한 Ausubel F.M. 등의 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology"] 제 1 권 및 제 2 권에 기재되어 있다 (이 후, 본 연구에 기재되는 프로토콜 참조를 "ref. CPMB" 라고 칭함). 본 연구에 기재되는 프로토콜에 따라 수행되는 DNA 에 관한 조작은 특히 다음과 같다 : DNA 단편의 접합, 클레노우 DNA 폴리머라아제 및 T4 DNA 폴리머라아제로의 처리, 소량 제조 (minipreparation) 또는 대량 제조 (maxipreparation) 으로서의 플라스미드 및 박테리오파지 λ DNA 의 제조, 및 서던 앤드 노던 (Southern and Northern) 기술에 따른 각각의 DNA 및 RNA 분석. 본 연구에 기재되는 다른 방법들이 아래에 나와 있고, 이 프로토콜에 단지 중요 개질 또는 부가만을 아래에 기재하였다.

실시예 1 :

1. 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) EPSPS 단편의 제조

a) 아래 각기 서열 :

의 2 개의 20-mer 올리고뉴클로오티드를 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 유전자의 서열로부터 합성한다 (Klee H.J. 등 (1987) Mol. Gen. Genet., 210, 437 - 442). 이 두가지 올리고뉴클레오티드는 각기 반대 배향으로 공개 서열의 위치 1523 내지 1543, 및 1737 내지 1717 에 있다.

b) 아라비돕시스 탈리아나 (변종 : 콜롬비아 (colombia)) 총 DNA를 클론테크 (Clontech ; 참조 번호 : 6970-1) 로부터 수득한다.

c) 50 ng 의 DNA를 300 ng 의 각 올리고뉴클레오티드와 혼합하여, 공급자가 권하는 증폭용 표준 배지 조건 하에서 퍼어킨-엘머 9600 장치를 이용하여, 35 증폭 사이클을 실시한다. 수득되는 204-bp 단편은 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 단편을 구성한다.

2. BMS 옥수수 세포 계열의 cDNA 라이브러리의 구성

a) 5 g 의 여과된 세포를 액체 질소에 분쇄하고, 총 핵산을 Shure 등이 기재한 방법에 따라 하기와 같이 개질하여 추출한다 :

- 용해 완충액의 pH를 pH 9.0 으로 조정하고 ;

- 이소프로판올을 이용한 침전 후, 펠렛을 물에 넣어, 용해시킨 후, 2.5 M LiCl 로 조정한다. 0 ℃에서 12 시간 동안 인큐베이션한 후, 30,000 g 으로 4 ℃에서 15 분간 원심분리하여 수득된 펠렛을 재용해시킨다. 이어서 LiCL 침전 단계를 반복한다. 재용해된 펠렛은 총 핵산의 RNA 단편을 구성한다.

b) 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology"] 에 기재된 바에 따라 RNA 분획의 폴리(A)⁺RNA 분획을 올리고(dT) 셀룰로스 칼럼 상의 크로마토그래피로써 수득한다.

c) 합성 EcoRI 말단을 갖는 이중 나선 cDNA 의 합성을 키트 [인 비트로겐 사제의 "카피 키트 (copy kit)"] 형태의 이 합성에 필요한 여러 시약의 공급자의 프로토콜에 따라 수행한다.

각각의 하기 서열 :

5'-AATTCCCGGG-3'

5'-CCCGGG-3' (후자는 인산화됨)

을 갖는 두 개의 단일 나선 및 부분 보완 올리고뉴클레오티드를 블런트 말단을 갖는 이중나선 cDNA 에 접합시킨다.

이 아답터 (adaptor) 의 접합은 이중나선 cDNA 에 부착된 SmaT 부위 및 이중나선 cDNA 의 각 말단에 있는 접착 형태의 EcoRI 부위를 만들어낸다.

d) 라이브러리의 제조 :

각 말단에 인위적인 접착성 EcoRI 부위를 갖는 cDNA 를 EcoRI 로 절단된 박테리오파지 λgt10 cDNA 에 접합시키고, 공급자 뉴 잉글랜드 바이오랩의 프로토콜에 따라 탈인산화한다.

접합 반응의 앨리콧을 공급자의 지시에 따라 인캡시데이션(encapsidation) 된 추출물로 시험관 내 인캡시데이션하고 ; 이 라이브러리를 박테리아 E. coli C600hfl을 이용하여 적정한다. 이에 수득된 라이브러리를 동일한 공급자의 지시에 따라 증폭하고 저장하고, BMS 옥수수 세포 현탁 cDNA 라이브러리를 구성한다.

3. 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 프로브를 이용한 BMS 옥수수 세포 현탁 cDNA 라이브러리의 감별.

하기 프로토콜은 Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1989) (CPMB) 가 발간한 Ausubel F.M. 등의 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology"] 제 1 권 및 제 2 권의 프로토콜이다. 간략히 말하자면, 약 10⁶재조합 파지를 100 파지/cm²의 평균 밀도로 LB 디쉬에 놓는다. 용해 플라크를 아머샴 하이본드 (Amersham Hybond) N 멤브레인 상에 두배로 복제한다.

DNA를 1600kJ UV 처리 (스트라타겐 스타라탈링커)를 이용하여 필터에 고정한다. 필터를 65 ℃에서 2 시간 동안 6 x SSC / 0.1 % SDS / 0.25 탈지유에 예비 혼성한다. 공급자의 지시에 따라 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 프로브에 무작위 프라이밍에 의해 [³²P] dCTP 로 라벨링한다 (Pharmacia Ready to Go kit). 수득된 고유 활성은 단편의 ㎍ 당 10⁸cpm 로 나타낸다. 100 ℃에서 5 분간 변성시킨 후, 프로브를 예비 혼성 배지에 첨가하고, 55 ℃에서 14 시간 동안 계속해서 혼성화한다. 필터를 -80 ℃에서 48 시간 동안 코닥 XAR5 필름 및 아머샴 하이퍼스크린 RPN 강화 스크린을 이용하여 플루오로그래피한다. 필터 상의 양성 스포트의 그것이 발생한 디쉬와의 배열은 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 프로브로 양성 혼성 반응을 보이는 파지에 대응하는 영역이 디쉬로부터 취해질 수 있도록 한다. 연속적으로 정제된 파지의 디쉬 중의 모든 스포트가 혼성에서 100 % 양성를 나타낼 때까지 도말하고, 옮기며, 혼성하고 회수하는 이 단계를 반복한다. 이어서 파지 용해의 독립적 플라크를 희석된 λ 배지 (트리스-Cl pH 7.5 ; 10 mM MgSO₄; 0.1 M NaCl ; 0.1 % 젤라틴)에서 취하고 ; 용액 중의 이 파지는 BMS 옥수수 세포 현탁액의 EPSP-양성 클론을 구성한다.

4. BMS 옥수수 세포 현탁액의 EPSP-양성 클론의 DNA 제조 및 분석

약 5 x 10⁸파지를 2/ml 의 OD_600nm값에서 20 ml 의 C600hfl 박테리아에 첨가하고, 37 ℃에서 15 분간 인큐베이션한다. 이어서 이 현탁액을 1 ℓ 의 엘렌마이어 내의 200 ml 의 박테리아 성장 배지에 희석하고, 250 rpm에서 회전 교반기로 교반한다. 혼탁한 박테리아의 용해에 상응하여, 배지가 맑아질 때 용해가 관찰되고, 약 4 시간 동안의 교반 후에 용해가 일어난다. 이어서 이 상등액을 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology"] 에 기재된 식으로 처리한다. 수득된 DNA 는 BMS 옥수수 세포 현탁액의 EPSP 클론에 상응한다.

이 DNA 의 1 내지 2 ㎍ 을 EcoRI 로 절단하고, 0.8 % LGTA/TBE 아가로스 겔 상에 분리한다 (ref. CPMB). 최종 증명은 정제된 DNA 가 실제로 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 프로브와 혼성화 시그날을 나타내는 것을 확인하는 것으로 이루어진다. 전기영동 후, DNA 단편을 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology"] 에 기재된 Southern의 프로토콜에 따라 아머샴 하이본드 N 멤브레인으로 옮긴다. 필터를 상기 섹션 3 에 기재된 조건에 따라 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 프로브와 혼성화한다. 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 프로브와 혼성화 시그날을 나타내고, 최장 EcoRI 단편을 함유하는 클론은 겔 상에 약 1.7 kbp 로서 측정되는 크기를 가진다.

5. 클론 pRPA-ML-711 의 제조

1.7-kbp 삽입을 함유하는 10 ㎍ 의 파지 클론을 EcoRI 로 절단하고, 0.8 % LGTA/TBE 아가로스 겔 상에 분리한다 (ref. CPMB). 1.7-kbp 삽입을 함유하는 겔 단편을 BET 염색으로 겔로부터 절제하고, 그 단편을 공급자인 뉴 잉글랜드 바이오랩의 프로토콜에 따라 β-아가로스로 처리한다. 1.7-kbp 단편의 정제된 DNA를 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology"] 에 기재된 접합 프로토콜에 따라 EcoRI 로 절단된 플라스미드 pUC 19 (뉴 잉글랜드 바이오랩) 의 DNA 에 14 시간 동안 12 ℃에서 접합한다. 상기 접합 혼합물의 2 ㎕를 전기 수용능력을 갖는 E. coli DH10B의 앨리콧의 형질전환에 사용하고 ; 형질전환을 하기 조건을 이용하여 전기천공법으로 수행한다 : 수용능력을 갖는 박테리아 및 접합 배지의 혼합물을 미리 0 ℃ 로 냉각시킨 두께 0.2 cm (Biorad) 의 일렉트로포레이션 (eletroporation) 세포로 도입한다. Biorad 가 제조한 일렉트로포레이터를 이용한 일렉트로포레이션의 물리적 조건은 2500 볼트, 25 μF 및 200 Ω 이다. 이 조건들 하에서, 컨덴서의 평균 방출 시간은 4.2 밀리초이다. 이어서 박테리아를 1 ml 의 SOC 배지에 취한 후 (ref. CPMB), 15 ml 용량의 코닝(Corning) 튜브에서 회전 교반기로 200 rpm에서 1 시간 동안 교반한다. 100 ㎍/ml 의 카르베니실린으로 보충된 LB/아가 배지 상에 도말한 후, 37 ℃에서 하룻밤 동안 성장한 박테리아 클론을 "Current Protocols in Molecular Biology" 에 기재된 프로토콜에 따라 소량 제조한다. EcoRI 로 DNA를 절단한 후, 0.8 % LGTA/TBE 아가로스 겔 상에 전기영동으로 분리한다 (ref. CPMB). 최종 증명은 정제된 DNA 가 실제로 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 프로브와 혼성화 시그날을 나타내는 것을 확인하는 것으로 이루어진다. 전기영동 후, DNA 단편을 "Current Protocols in Molecular Biology" 에 기재된 Southern 의 프로토콜에 따라 아머샴 하이본드 N 멤브레인으로 옮긴다. 필터를 상기 섹션 3 에 기재된 조건에 따라 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 프로브와 혼성화한다. 1.7-kbp 삽입을 함유하고, 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 프로브와 혼성화된 플라스미드 클론을 보다 큰 규모로 제조하고, 박테리아의 용해로부터 수득되는 DNA를 "Current Protocols in Molecular Biology" 에 기재된 CsCl 구배로 정제한다. 정제된 DNA 는 공급자의 지시에 따라, 프로머로서 동일한 공급자로부터 주문된 M13 직접적이고 역행 보편적 프라이머를 이용하여 파마시아 키트로 부분 서열된다. 수득된 이 부분 서열은 약 1.5 kbp 에 달한다. 성숙된 단백질 지역의 유도된 아미노산 서열 (약 50 개의 아미노산 잔기) 은 미국 특허 제 4,971,908 호에 기재된 성숙된 옥수수 EPSP 의 상응하는 아미노산 서열과 100 % 로 동일함을 보인다. BMS 옥수수 세포 현탁액의 EPSP DNA 의 1.7-kbp EcoRI 에 상응하여 이 클론은 pRPA-ML-711 로 칭한다. 이 클론의 완전한 서열은, 파마시아 키트의 프로토콜을 이용하고, 보완적 올리고뉴클레오티드 및 약 매 250 bp 역배향의 그것을 합성하는 양 나선으로 결정된다. 이 1713-bp 클론의 수득된 완전한 서열이 서열 번호 1 에 나와 있다.

6. 클론 pRPA-ML-715 의 제조

클론 pRPA-ML-715 의 서열 분석, 특히 유도 아미노산 서열과 옥수수의 그것의 비교는 옥수수 EPSP 의 성숙된 부분의 NH₂-말단 알라닌을 코딩하는 GCG 코돈의 92 bp 상류의 서열 확장을 보여준다 (미국 특허 제 4,971,908 호). 유사하게, 옥수수 EPSPS (미국 특허 제 4,971,908 호) 의 성숙된 부분의 COOH-말단 아스파라긴을 코딩하는 AAT 코돈의 288 bp 하류의 확장이 관찰된다. 이 두 부분은 플라스티드 배치를 위한 트랜짓 펩티드의 서열 부분으로의 NH₂-말단 확장의 경우 및 COOH-말단 확장의 경우, cDNA 의 비번역 3' 지역에 상응할 수 있다.

옥수수 EPSPS cDNA 의 성숙된 부분을 코딩하는 cDNA 을 수득하기 위해, 미국 특허제 4,971,908 호에 기재된 바대로, 하기 조작을 수행한다 :

a) 비번역 3' 지역의 제거 : pRPA-ML-712 의 구성 :

클론 pRPA-ML-711 을 제한효소 AseI를 이용하여 절단하고, 이 절단으로 수득되는 말단을 CPMB에 기재된 프로토콜에 따라 DNA 폴리머라아제 I 의 클레노우 단편으로 처리하여 블런트하게 만든다. 이어서 제한효소 SacII를 이용한 절단을 수행한다. 이 조작으로부터 수득되는 DNA를 1 % LGTA/TBE 아가로스 겔 상에 전기영동으로써 분리한다 (ref. CPMB).

상기 섹션 5 에 기재된 프로토콜에 따라 0.4-kbp "AseI-블런트 말단/SacII" 삽입을 함유하는 겔 단편을 겔로부터 절제하여 정제한다. 클론 pRPA-ML-711 의 DNA를 클로닝 벡터 pUC19 의 폴리링커에 위치한 HindIII 부위에서 제한효소 HindIII 로 절단하고, 이 절단으로부터 수득된 말단을 DNA 폴리머라아제 I 의 클레노우 단편으로 처리함으로써 블런트하게 만든다. 이어서 제한효소 SacII를 이용한 절단을 수행한다. 이 조작으로 수득되는 DNA를 0.7 % LGTA/TBE 아가로스 겔 상의 전기영동으로써 분리한다 (ref. CPMB).

상기 섹션 5 에 기재된 프로토콜에 따라 약 3.7-kbp HindIII-블런트 말단/SacII 삽입을 함유하는 겔 단편을 겔로부터 제거하여 정제한다.

섹션 5에서 기재된 바대로 두 삽입을 접합하고, 2 ㎕ 의 접합 혼합물을 사용하여, E. coli DH10B를 형질전환한다.

pRPA-ML-711을 위해 기재된 방법에 따라 다른 클론들의 플라스미드 DNA 함량을 분석한다. 선택된 플라스미드 클론 중 하나는 약 1.45-kbp EcoRI-HindIII 삽입을 함유한다. 이 클론의 최종 말단의 서열은 삽입의 5' 말단은 pRPA-ML-711 의 상응 말단과 그대로 상응하고, 3'-최종 말단이 하기 서열을 가짐을 보여준다 :

"5'-...AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3'".

밑줄 친 서열은 COOH-최종 아미노산 아스파라긴의 코돈에 상응하고, 그 다음 코돈은 번역 중지 코돈에 상응한다. 뉴클레오티드 하류는 pUC19 폴리링커의 서열 요소에 상응한다. 성숙된 옥수수 EPSPS 의 번역 종결 부위까지 pRPA-ML-711 서열을 함유하고, HindIII 부위까지 pUC 19 폴리링커의 서열이 이어지는 이 클론을 pRPA-ML-712 라고 칭한다.

b) pRPA-ML-712 의 5' 말단의 개질 : pRPA-ML-715 의 구성 :

클론 pRPA-ML-712을 제한효소 PstI 및 HindIII를 이용하여 절단한다. 이 조작으로 수득되는 DNA를 0.8 % LGTA/TBE 아가로스 겔 상의 전기영동으로써 분리한다 (ref. CPMB). 상기 섹션 5 에 기재된 프로토콜에 따라 1.3-kbp PstI-EcoRI 삽입을 함유하는 겔 단편을 겔로부터 제거하여 정제한다. 이 삽입을 하기 서열의 동 몰량의 각 두 일부 보완 올리고뉴클레오티드의 존재 하, 또한 제한효소 BamHI 및 HindIII 로 절단되는 플라스미드 pUC19 DNA 의 존재 하에 접합한다 :

상기 섹션 5 에 기재된 바대로 2 ㎕ 의 접합 혼합물을 사용하여, E. coli DH10B 를 형질전환한다. 상기 섹션 5 에 기재된 방법에 따라 상이한 클론의 플라스미드 DNA 함량을 분석한 후, 약 1.3-kbp 삽입을 보유하는 클론 중 하나를 연속 분석하기 위해 보유한다. 선택된 클론의 5'-최종 말단의 서열은 이 지역의 DNA 서열이 다음과 같음을 보여준다 : EcoRI 에서 BamHI 부위까지의 pUC19 폴리링커의 서열, 이어서 클로닝에 사용되는 올리고튜클레오티드의 서열, 그 다음 pRPA-ML-712 에 존재하는 서열의 나머지. 이 클론을 pRPA-ML-713 이라고 칭한다. 이 클론은 성숙된 EPSP 신타아제의 N-말단 알라닌 코돈의 NcoI 부위 상류에 포함되는 메티오닌 ATG 코돈을 보유한다. 또한 N-최종 말단의 알라닌 및 글리신 코돈은 보존되나, 제 3 가변성 염기로 개질된다 : 처음의 GCGGGT는 개질된 GCCGGC를 제공한다.

클론 pRPA-ML-713을 제한효소 HindIII 로서 절단하고, DNA 폴리머라아제 I 의 클레노우 단편으로 처리하여 그 절단 말단을 블런트하게 만든다. 이어서 제한효소 SacI 를 이용한 절단을 수행한다. 이 조작으로부터 수득되는 DNA 를 0.8 % LGTA/TBE 아가로스 겔 상에 전기영동으로써 분리한다 (ref. CPMB). 상기 섹션 5 에 기재된 프로토콜에 따라 1.3-kbp "HindIII-블런트 말단/SacI"를 함유하는 겔 단편을 겔로부터 제거하여 정제한다. 이 삽입을 제한효소 XbaI로 절단된 플라스미드 pUC19 DNA 의 존재 하에 접합하고, 이 절단의 말단을 DNA 폴리머라아제 I 의 클레노우 단편으로 처리함으로써 블런트하게 만든다. 이어서 제한효소 SacI 를 이용한 절단을 수행한다. 상기 섹션 5 에 기재된 바대로 접합 혼합물의 2 ㎕를 사용하여, E. coli DH10B를 형질전환한다. 상기 섹션 5 에 기재된 방법에 따라 상이한 클론의 플라스미드 DNA 함량을 분석한 후, 약 1.3-kbp 삽입을 함유하는 클론 중 하나를 연속 분속하기 위해 보유한다. 선택된 클론의 최종 말단의 서열은 DNA 서열이 다음과 같음을 보여준다 : EcoRI 에서 SacI 부위까지의 pUC19 폴리링커의 서열, 이어서 올리고뉴클레오티드 1 의 4 bp GATCC를 삭제하게 되는 클로닝에 사용되는 올리고튜클레오티드의 서열, 그 다음 HindIII 부위까지 pRPA-ML-712 에 존재하는 서열. 이 클론을 pRPA-ML-715 이라고 칭한다.

7. 돌연변이화된 옥수수 EPSPS을 코딩하는 cDNA 의 수득

모든 돌연변이화 단계를 공급자의 지시에 따라 파마시아 U.S.E. 돌연변이 키트를 이용하여 수행한다. 이 돌연변이 시스템의 원리는 다음과 같다 : 플라스미드 DNA 는 열에 의해 변성되고, 한편 돌연변이 뉴클레오티드, 다른 한편으로는 폴리링커에 존재하는 고유 제한효소 부위를 제거할 수 있도록 하는 올리고뉴클레오티드의 과다 몰량이 존재할 때 재결합된다. 재결합 단계 후, T4 DNA 리가아제의 존재 하의 T4 DNA 폴리머라아제, 및 공급되는 적당한 완충액 중의 유전자 32 단백질의 작용으로 보완 나선의 합성을 수행한다. 합성물을 부위가 돌연변이화로 인해 제거된 것으로 추정하게 되는 제한 효소의 존재 하에 인큐베이션한다. 특히 mutS 돌연변이를 보유하는 E. coli 균주를 이 DNA 의 형질전환의 숙주로 사용한다. 액상 배지 중 성장 후, 총 플라스미드 DNA 를 제조하여 이전에 사용한 제한효소의 존재 하에 인큐베이션한다. 그러한 처리 후, E. coli 균주 DH10B를 형질전환용 숙주로 사용한다. 단리된 클론의 플라스미드 DNA를 제조하고, 도입된 돌연변이의 존재를 서열을 통해 입증한다.

A) 원칙적으로 EPSP 신타아제 활성의 경합적 저해자인 생성물에 대한 옥수수의 EPSPS-내성 특성을 영향 주지 않는, 부위 또는 서열의 개질 : pRPA-ML-715 에서의 내부 NcoI 부위 제거.

pRPA-ML-715 서열은 위치 1 에 N-말단 알라닌 코돈 GCC 의 첫 번째 염기를 둠으로써 전단적으로 규명된다. 이 서열은 위치 1217 에 NcoI 부위를 보유한다. 부위-개질 올리고뉴클레오티드는 하기 서열을 가진다 :

5'-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3'.

상기 참조를 따라 서열한 후, 돌연변이가 사용된 올리고뉴클레오티드의 것에 상응한 후, 서열한다. NcoI 부위는 실제로 제거되고, 이 지역에서의 아미노산으로의 번역은 pRPA-ML-715 에 있는 초기 서열을 보존한다.

이 클론을 pRPA-ML-716 이라고 칭한다.

이 클론의 1340-bp 서열은 서열 번호 2 및 3 에 있다.

B) EPSP 신타아제 활성의 경합적 저해자인 생성물에 대한 옥수수의 EPSPS-내성 특성을 증가시키도록 하는 서열 개질.

하기 올리고뉴클레오티드를 사용한다 :

a) 돌연변이 Thr 102 → Ile.

5'-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3'

b) 돌연변이 Pro 106 → Ser.

5'-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'

c) 돌연변이 Gly 101 → Ala 및 Thr 102 → Ile.

5'-CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3'

d) 돌연변이 Thr 102 → Ile 및 Pro 106 → Ser.

5'-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'

서열 후, 세 개의 돌연변이화된 단편 상에 돌연변이 후, 읽혀진 서열은 모 pRPA-ML-716 DNA 서열과 동일하나, 단 사용된 돌연변이 올리고뉴클레오티드에 상응하는 돌연변이가 일어난 지역은 예외이다. 이 클론들은 하기와 같이 칭하게 된다 : pRPA-ML-717 돌연변이 Thr 102 → Ile, pRPA-ML-718 돌연변이 Pro 106 → Ser, pRPA-ML-719 돌연변이 Gly 101 → Ala 및 Thr 102 → Ile, 및 pRPA-ML-720 돌연변이 Thr 102 → Ile 및 Pro 106 → Ser.

pRPA-ML-720 의 1340-bp 서열은 서열 번호 4 및 5 에 있다.

1395-bp NcoI-HindIII 삽입은 EPSPS 의 경합적 저해제인 제초제에 대한 내성, 특히 글리포세이트 내성의 도입을 위한 식물의 형질전환에 사용되는 모든 구조의 기초가 된다. 이 삽입은 "옥수수 EPSPS 이중 돌연변이체" 라고설명한 잔류체에 칭하게 된다.

실시예 2:

상이한 돌연변이의 시험관 내 글리포세이트 내성

2.a : EPSP 신타아제의 추출

상이한 EPSP 신타아제 유전자를 NcoⅠ-HindⅢ 카세트 형태로 플라스미드 벡터 pTrc99a 로 도입되고 (Pharmacia, ref: 27-5007-01), NcoⅠ 과 HindⅢ 로 절단된다. 상이한 EPSP 신타아제를 과발현하는 재조합E.coliDH10B 박테리아는 펠렛화된 세포 10 g 당 완충액 40 ml 내에서 초음파 분쇄하고, 상기 동일한 완충액 (200 mM 트리스-HCl pH 7.8, 50 mM 메르캅토에탄올, 5 mM EDTA 및 1 mM PMSF) 으로 세척하고, 폴리비닐피롤리돈 1 g 을 첨가한다. 현탁액을 4 ℃ 에서 15 분 동안 교반하고, 이어서 27,000 g 및 4 ℃ 에서 20 분 동안 원심분리한다.

황산 암모늄을 상등액에 첨가하여, 용액이 황산 암모늄에 대해 40 % 포화가 되도록 한다. 상기 혼합물을 27,000 g 및 4 ℃ 에서 20 분 동안 원심분리한다. 황산 암모늄을 새로운 상등액에 첨가하여, 용액이 황산 암모늄에 대해 70 % 포화가 되도록 한다. 상기 혼합물을 27,000 g 및 4 ℃ 에서 30 분 동안 원심분리한다. 상기 단백질 펠렛에 존재하는 EPSP 신타아제를 완충액 (20 mM 트리스-HCl pH 7.8 및 50 mM 메르캅토에탄올) 1 ml 내에 취한다. 상기 용액을 4 ℃ 에서 상기 동일한 완충액 2ℓ 에 대해 밤새 투석한다.

2.b : 효소 활성

글리포세이트 내성 뿐만 아니라, 각 효소의 활성을 하기 반응 혼합물 내에서 37 ℃ 에서 10 분에 걸쳐, 시험관 내 측정한다: 100 mM 말레산 pH 5.6, 1 mM 포스포에놀피루베이트, 3 mM 쉬키메이트 3-포스페이트 (Knowles P.F. 및 Sprinson D.B. 1970. Methods in Enzymol 17A, 351-352 에 따라에어로박터 에어로진(Aerobacter aerogenes) 균주 ATCC 25597 로부터 제조) 및 10 mM 플루오르화 칼륨. 효소 추출물은 글리포세이트의 첨가 후 마지막에 첨가하고, 최종 농도는 0 내지 20 mM 에서 변화한다.

상기 활성은 Tausky H.A. 및 Shorr E. 1953. J.Biol.Chem. 202, 675-685 의 기법에 따라 유리된 포스페이트를 정량함으로써 측정된다.

상기 조건 하에서, 와일드형 (WT) 효소는 글리포세이트 농도 0.12 mM 에서 이미 85 % 저해된다. 상기 농도에서, Ser106 으로 공지된 돌연변이 효소는 겨우 50 % 저해되며, 기타 세 개의 돌연변이 Ile102, Ile102/Ser106 및 Ala101/Ile102 는 저해를 거의 나타내지 않는다.

글리포세이트 농도는 돌연변이 효소 Ile102 의 50 % 저해를 일으키고, 돌연변이 Ile102/Ser106, Ala/Ile 및 Ala 는 여전히 저해되지 않도록 10 배, 즉 1.2 mM 가 되어야 한다.

돌연변이 Ala/Ile 및 Ala 의 활성은 글리포세이트 농도 10 mM 이하까지는 저해되지 않으며, 돌연변이 Ile102/Ser106 은 글리포세이트 농도가 2 배, 즉 20 mM 이 되더라도 감소하지 않음이 인지되어야 한다.

실시예 3:

형질전환된 담배 묘목의 내성

1-1- 형질전환

벡터 pRPA-RD-173 은 코스미드 pTVK291 (Komari 등, 1986) 을 갖는아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 EHA101 (Hood 등, 1987) 으로 도입된다. 형질전환 기법은 Horsh 등 (1985) 의 방법에 기초한다.

1-2- 재생

잎 이식으로부터 PBD6 담배 (프랑스 세이타 산) 의 재생이 카나마이신 200 ㎍/ml 뿐만 아니라 쉬크로오스 30 g/ℓ 을 함유하는 무라시게 및 스쿡 (MS) 기본 배지 상에서 수행된다. 잎 이식은 온실 또는 시험관 내에서 재배된 묘목으로부터 제거되고, 잎 디스크 기법 (Science, 1985, Vol.227, pp.1229-1231) 에 따라, 연속적인 세 단계로 형질전환된다: 첫 번째는 나프틸아세트산 (NAA) 0.05 mg/ℓ 및 벤질아미노푸린 (BAP) 2 mg/ℓ 을 함유하는 쉬크로오스 30 g/ℓ 가 보충된 배지 상에서 15 일 동안 새싹의 유도를 포함한다. 상기 단계 동안 형성된 새싹은 이어서, 어떠한 호르몬도 함유하지 않은 쉬크로오스 30 g/ℓ 가 보충된 MS 배지 상에서 배양함으로써 10 일 동안 발육된다. 이어서, 발육된 새싹은 제거되고, 염류, 비타민 및 당 함량을 절반으로 가지며, 어떠한 호르몬도 함유하지 않는 MS 뿌리 배지 상에서 배양된다. 약 15 일 후에, 뿌리내린 새싹은 토양으로 옮겨진다.

1-3- 글리포세이트 내성

형질전환된 20 개의 묘목을 재생시키고, 구성 pRPA-RD-173 을 위해 온실로 옮긴다. 상기 묘목은 5-잎 단계에, 헥타아르 당 글리포세이트 활성 물질 0.8 kg 에 상응하는 라운드업(RoundUp) 의 수성 현탁액으로 온실 내에서 처리하였다.

결과는 처리 3 주 후 기록된 식물 독성 지표의 관찰에 상응한다. 상기 조건 하에서, 구성 pRPA-RD-173 으로 형질전환된 묘목이 매우 우수한 내성을 나타내는 반면, 비형질전환된 대조구 묘목은 완전히 파괴되는 것이 발견되었다.

상기 결과는 글리포세이트 내성을 코오드화하는 동일한 유전자에 대한 본 발명에 따른 키메라 유전자의 사용에 의한 개선을 분명히 나타낸다.

실시예 4

옥수수 종자의 형질전환 및 선택

지수성장기 내에서 BMS (흑 멕시코 스위트) 옥수수 종자는 Klein 등, 1987 (Klein T.M., Wolf E.D., Wu R. 및 Sandford J.C. (1987) : High Velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells, NATURE Vol. 327 pp. 70-73) 에 의해 기술된 원칙 및 조약에 따라 구성 pRPA-RD-130 으로 흩뿌린다.

흩뿌림 2 일 후, 종자는 2 mM N-(포스포노메틸)글리신을 함유하는 동일한 배지로 옮긴다.

상기 배지 상에서 선택 8 주 후, 발육된 유합조직이 선택되고, 이어서, 확대되고, PCR 에 의해 분석되고, 키메라 OTP-EPSPS 유전자의 존재를 분명하게 나타낸다.

2 mM N-(포스포노메틸)글리신을 함유하는 동일한 배지 상에서 흩뿌려지고, 성장하지 않은 종자는 제초제에 의해 저해되지 않으며, 발육하지 않는다.

본 발명에 따라 형질전환된 묘목은 도입된 키메라 유전자의 발현에 상응하는 표현형 특성을 갖는 가계 및 잡종을 수득하기 위한 모체로서 사용될 수 있다.

플라스미드 구성의 설명

pRPA-RD-124 : 옥수수 이중 돌연변이 EPSPS 유전자를 함유하는 클로닝 카세트를 창출하면서 (Thr 102 → Ile 및 Pro 106 → Ser), "노스 (nos)" 폴리아데닐화 시그날을 pRPA-ML-720 에 첨가함. pRPA-ML-720을 HindIII 로 절단하고,E.coliDNA 폴리머라아제 I 의 클로노우 단편으로 처리하여, 블런트 말단을 만든다. 두 번째 절단을 NcoⅠ를 이용하여 수행하고, EPSPS 단편을 정제한다. 이어서 EPSPS 유전자를 정제된 pRPA-RD-12 (노팔린 신타아제의 폴리아데닐화 시그날을 갖는 클로닝 카세트) 에 접합하여, pRPA-RD-124를 수득한다. 유용한 정제된 벡터 pRPA-RD-12를 수득하기 위해, 후자를 SalI 로써 미리 절단하여, 클로노우 DNA 폴리머라아제로 처리한 후, NcoI 로써 두 번째 절단해야 한다.

pRPA-RD-125 : 플라스미드 상에 목표가 되는 EPSPS 유전자를 함유하는 클로닝 카세트를 창출하면서, 최적화 트랜짓 펩티드 (OTP)를 첨가함. pRPA-RD-7 (유럽 특허 제 652 286 호)를 SphI 로서 절단하고, T4 DNA 폴리머라아제로써 처리한 후, SpeI로 절단하고, OTP 단편을 정제한다. 이 단편을 미리 NcoI 로써 절단된 pRPA-RD-124 에 클로닝하고, 클레노우 DNA 폴리머라아제로써 처리하여, 튀어나온 3' 부분을 제거한 후, SpeI 로써 절단한다. 이어서 이 클론을 서열하여, OTP 와 EPSPS 유전자 간의 번역 융합이 바로 되도록 한다. 이어서 pRPA-RD-125를 수득한다.

pRPA-RD-130 : 단자엽 식물의 조직의 이중 돌연변이 EPSPS 유전자의 발현을 위한 식물의 발현 카세트를 창출하면서, pRPA-RD-125 에 H3C4 옥수수 히스톤 프로모터 및 pRPA-RD-123 (유럽 특허 제 507 698 호) 의 adhl 인트론 1 서열을 첨가함. pRPA-RD-123을 NcoI 및 SacI 로써 절단한다. 이어서 pRPA-RD-123(adhl 인트론 1 로 융합된 H3C4 옥수수 히스톤 프로모터를 함유하는 카세트) 으로부터 유도된 프로모터를 함유하는 DNA 단편을 정제하고, 미리 NcoI 및 SacI 로써 절단된 pRPA-RD-125에 접합한다.

pRPA-RD-159 : 2 자엽 식물의 "OTP-이중 돌연변이 EPSPS 유전자" 의 발현을 위한 식물의 발현 카세트를 창출하면서, pRPA-RD-125 에 H4A748 아라비돕시스 히스톤 이중 프로모터 (유럽 특허 제 507 698 호)를 첨가함. pRPA-RD-132(H4A748 이중 프로모터 (유럽 특허 제 507 698 호)를 함유하는 카세트) 을 NcoI 및 SacI 로써 절단한다. 이어서 정제된 프로모터 단편을 미리 EcoI 및 SacI 로써 절단된 pRPA-RD-125 로 클로닝한다.

pRPA-RD-173 : 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobactrium tumefaciens) 형질전환 벡터를 창출하면서 플라스미드 pRPA-BL-150A (유럽 특허 제 508 909 호) 에 "H4A748 프로모터-OTP-이중 돌연변이 EPSPS 유전자"를 첨가함. pRPA-RD-159를 NotI로 절단하고, 클레노우 폴리머라아제로 처리한다. 이어서 이 단편을 SmaI 로써 pRPA-BL-150A 에 클로닝한다.

서열 목록

(1) 일반 정보 :

(i) 출원인 : 르브룅, 미셸, 드로즈, 리챠드 티, 샐랑 알랭

(ii) 발명의 명칭 : 돌연변이화된 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타아제, 그 단백질을 코딩하는 유전자 및, 그 유전자를 함유하는 형질전환된 식물

(iii) 서열 번호 : 5

(iv) 대응 주소 :

(A) 주소 : 프랑스와 크리스티엥

(B) (가) 스트리트 : 420 뤼 삐에르 배제

(C) 도시 : 리용 세덱스 09

(D) 국가 : 프랑스

(E) 집 (zip) : 69263

(v) 컴퓨터 해독 형태 :

(A) 매체 형태 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환

(C) 조작 시스템 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : 팜텐인 릴리스 #1.0, 버전 #1.25

(vi) 현 적용 데이터

(A) 적용 번호 :

(B) 기록일 :

(C) 구별 :

(viii) 대리인 정보

(A) 이름 : 크리스티엥, 프랑스와

(ix) 연락 정보 :

(A) 전화 : (33) 72-29-26-46

(B) 팩스 : (33) 72-29-28-43

(2) 서열 번호 1 의 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 1713 개 염기 쌍

(B) 형태 : 핵산

(C) 나선 : 이중

(D) 형태 : 직선형

(ii) 분자 형태 : cDNA

(vi) 기원 :

(A) 유기체 : Zea mays

(B) 균주 : 블랙 멕시칸 스위트

(F) 조직 형태 : 칼루스 (Callus)

(vii) 직접적 기원 :

(A) 라이브러리 : 람다 gt10

(B) 클론 : pRPA-ML-711

(탸) 서열 기술 : 서열 번호 1 :

(2) 서열 번호 2 의 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 1340 개 염기 쌍

(B) 형태 : 핵산

(C) 나선 : 이중

(D) 형태 : 직선형

(ii) 분자 형태 : cDNA

(vi) 기원 :

(A) 유기체 : Zea mays

(B) 균주 : 블랙 멕시칸 스위트

(vii) 직접적 기원 :

(B) 클론 : pRPA-ML-716

(ix) 특성 :

(A) 이름/키 : CDS

(B) 위치 : 6..1337

(xi) 서열 기술 : 서열 번호 2 :

(2) 서열 번호 3 의 정보

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 444 개 아미노산

(B) 형태 : 아미노산

(D) 형태 : 직선상

(ii) 분자 형태 : 단백질

(xi) 서열 기술 : 서열 번호 3 :

(2) 서열 번호 4 의 정보

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 1340 개 염기 쌍

(B) 형태 : 핵산

(C) 나선 : 이중

(D) 형태 : 직선상

(ii) 분자 형태 : cDNA

(vii) 직접적 기원 :

(B) 클론 : pRPA-ML-720

(ix) 특성 :

(A) 이름/키 : CDS

(B) 위치 : 6..1337

(xi) 서열 기술 : 서열 번호 4 :

(2) 서열 번호 5 의 정보

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 444 개 아미노산

(B) 형태 : 아미노산

(D) 형태 : 직선상

(ii) 분자 형태 : 단백질

(xi) 서열 기술 : 서열 번호 5

Claims

하나 이상의 트레오닌 102 → 이소루이신 치환을 함유함을 특징으로 하는, 돌연변이화된 5-에톨피루부빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타아제(EPSPS)를 코딩하는 DNA 유전자.
제 1 항에 있어서, 부가적으로, 첫 번째 돌연변이와 상이한, EPSPS 내에 두 번째 돌연변이를 하나 이상 함유함을 특징으로 하는 DNA 유전자.
제 2 항에 있어서, 부가적으로, 프롤린 106 의 세린으로의 치환을 이루어지는 돌연변이를 함유함을 특징으로 하는 DNA 유전자.
제 2 항에 있어서, 부가적으로 글리세린 101 의 알라닌으로의 치환을 이루어지는 돌연변이를 함유함을 특징으로 하는 DNA 유전자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 기원임을 특징으로 하는 DNA 유전자.
제 5 항에 있어서, 속 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 의 박테리아로부터 발생됨을 특징으로 하는 DNA 유전자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 기원임을 특징으로 하는 DNA 유전자.
제 7 항에 있어서, 옥수수 기원임을 특징으로 하는 DNA 유전자.
트레오닌 102 의 이소루이신으로의 치환을 하나 이상 함유함을 특징으로 하는 돌연변이화된 EPSPS 단백질.
코딩 서열로서 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 서열을 포함함을 특징으로 하는, 이질이며 식물에서 작용가능한 위치 5' 및 3' 에 조절 요소 뿐만 아니라 코딩 서열을 함유하는 키메라 유전자.
제 9 항에 있어서, 식물 바이러스 프로모터를 함유함을 특징으로 하는 키메라 유전자.
제 10 항에 있어서, 식물 프로모터 (예 : α-튜불린, 히스톤, 인트론, 액틴 등) 를 함유함을 특징으로 하는 키메라 유전자.
제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 유전자를 하나 이상 함유함을 특징으로 하는, 식물의 형질전환 벡터.
제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 유전자를 하나 이상 함유함을 특징으로 하는 식물 세포.
제 14 항에 따른 세포로부터 재생함으로써 수득됨을 특징으로 하는 식물.
식물 세포 또는 원형질체가 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 유전자로 형질전환되고, 형질전환된 세포를 재생시킴을 특징으로 하는, 목표로서 EPSP 신타아제를 갖는 제초제에 대해 향상된 내성을 갖는 식물의 제조 방법.
제초제를 제 15 항에 따른 식물에 적용함을 특징으로 하는, 목표로서 EPSPS 를 갖는 제초제를 이용한 식물의 처리 방법.
제 17 항에 있어서, 글리포세이트 또는 글리포세이트 전구체를 적용함을 특징으로 하는 방법.