JP2001519671A

JP2001519671A - 酸化ストレス耐性遺伝子

Info

Publication number: JP2001519671A
Application number: JP54363898A
Authority: JP
Inventors: デアーク，マーリア; デュディツ，デーネス; テレク，カーロイネー; サス，ラースロー; バラース，バルナ; キラーリ，ゾルターン
Original assignee: BTG International Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-16
Publication date: 2001-10-23
Also published as: ZA983196B; CN1252839A; CA2283750A1; HUP9700762A2; IL131580A0; NZ337463A; AU7062098A; AR012445A1; HU9700762D0; EE9900447A; US20010039670A1; AU750821B2; EP0975779A1; HUP9700762A3; US6563019B1; WO1998046775A1; BR9808439A

Abstract

(57)【要約】本発明は、鉄結合性タンパク質（例えばフェリチン）を過産生し、広範囲の生物的及び非生物的ストレス条件に対して（パラコートあるいはフザリン酸処理、またはウイルス、バクテリア、及び菌類の感染に対して）高耐性を持つ植物、特にトランスジェニック植物、植物部分、及び植物細胞に関する。本発明はまた、アルファルファフェリチンあるいはその機能的変異体をコードする核酸配列及び、酸化ストレス条件に対し植物に耐性を与えるための前記配列の使用を含む。本発明は、広範囲のストレス条件により引き起こされる作物の環境的なダメージを軽減することに有効である。

Description

【発明の詳細な説明】酸化ストレス耐性遺伝子本発明は植物、特に鉄結合性タンパク質（例えばフェリチン）を過産生し、そして広範囲な非生物的、生物的酸化ストレス条件（例えば、パラコートあるいはフザリン酸での処理、及びウイルス、バクテリア、菌類の感染に対して）に対して高耐性を有すトランスジェニック植物、植物の部分、及び植物細胞に関する。本発明はまた、アルファルファのフェリチン又はその機能的変異体をコードする核酸配列、及び酸化ストレス条件に対して植物に耐性を与えるためのその配列の使用を含む。本発明は、広範囲のストレス条件によって引き起こされる、農作物の環境的損害を軽減することに有用である。本明細書及び請求の範囲に関して、出願人は定められた定義に従って、次のような技術用語を使用する。本発明の解釈に関しては、以下に定義する用語はその定義がその技術用語の通常の解釈と完全に一致するとは限らないが、定められた定義に従って使用されると解することとする。あるタンパク質の“機能的変異体”は、そのアミノ酸配列が、元々のタンパク質のアミノ酸配列の１またはそれ以上のアミノ酸残基置換、欠失及び/または付加に由来可能であるポリペプチドであり、しかもそのアミノ酸配列の変化にも拘わらずその機能的変異体は少なくとも、当業者が検出できる元のタンパク質の生物学的活性を最低一つは保持している。機能的変異体は、由来するタンパク質と通常少なくとも５０％の相同性があり（すなわち５０％同一のアミノ酸配列）、より好ましくは少なくとも７０％、さらに望ましくは少なくとも９０％の相同性があるものである。タンパク質のいずれの機能的部分、あるいはその変異体もまた機能的変異体と名付けられる。 “過産生（ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）”という用語は本明細書において、可能な限り最も一般的な意味で使用される。分子の特殊な型（通常ポリペプチドあるいはＲＮＡ）が、細胞内で自然の状態より有意にかつ検出限界をこえたレベルで高く（例えは２０％以上）検出されるならば、“過産生”と言われる。細胞内での分子の過産生は、伝統的な変異及び、選別技術及び遺伝子操作法の両方によって達せられる。“異所性の発現”という用語は、本明細書においては過産生物の特殊な存在を意味することに使用され、例えば異所的に発現したタンパク質は、本来は全く発現しない（あるいは検出されない）ような植物のある場所で産生されるものであり、すなわちそのタンパク質がその場所で過産生されるということである。ある植物、植物の部分、植物組織又は植物細胞が、ダメージをもたらす試薬のようなあるダメージ効力に対して、例えば同じ試薬の用量や強度をより強くしてもダメージを被ることなく、自然の対象物よりも有意に検出可能な範囲で（少なくとも２０％以上）耐性があるならば、そのダメージ効力に対して“高耐性”を持つという。本明細書中に記載の“フェリチンタンパク質”は、この分野において通常定義されているように鉄イオン結合性タンパク質として定義される（ＴｈｅｉｌＥ．Ｃ．，１９８７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：２８９−３１５）。真核生物のフェリチンファミリーの仲間は、それらのアミノ酸配列及び三次元構造両方が高く保存されている（Ｌｏｂｒｅａｕｘ，Ｓら、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８８：９３１−９３９）。 “酸化ストレス”という用語もまた、酸化的に誘導された活性ラジカルが検出可能な役割を果たすようなダメージ効果が現れる、あらゆる種類の非生物的（例えば異なる化学薬剤処理又は、高温若しくは低温若しくは干ばつのような極度の気象条件下）、及び生物的（異なる感染性の病原体による感染）ストレス条件を含む、非常に一般的な意味で使用される。様々な生長段階において、植物は非常に広範囲の生物的及び非生物的両方のストレス条件にさらされる。従って、通常のストレス耐性より高めた新しい繁殖体を開発することは、高い経済的重大性を持つ非常に重要な課題である。高光強度、ＵＶ−Ｂ照射、重金属汚染、高温または低温、水の欠乏、洪水、傷、ウイルス、バクテリア若しくは菌類の感染、昆虫及びそれに類するものによって引き起こされるダメージ等のストレス条件下で、酸素の毒性は農作物のダメージに重大な影響を及ぼしうる。一重項酸素、スーパーオキサイドラジカル（Ｏ₂ ^- ）、ヒドロキシラジカル（ＯＨ⁺）、及び過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）のような反応性のある酸素の類は、ストレスにさらされた植物の損傷にカギとなる役割を果たす。スーパーオキサイド及び過酸化水素による生物学的ダメージは、鉄の存在に依存しているという良い証拠がある。フリーの鉄の細胞内プールは、Ｈａｂｅｒ −ＷｉｅｓｓあるいはＦｅｎｔｏｎ反応（ＨａｌｌｉｗｅｌｌａｎｄＧｕｔｔｅｒｉｄｇｅ、１９８４、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１９：１−１４）による高反応性のヒドロキシラジカルを引き起こさせるＨ₂Ｏ₂あるいはＯ₂ ^-と反応可能である。細胞内において非代謝鉄はフェリチン内に封鎖されており、従ってフェリチンは鉄の有用性及び高反応性ヒドロキシラジカルの発生を制限することが可能である。フェリチンをコードするｃＤＮＡは様々な植物種から分離されている。これらのタンパク質は、アミノ酸配列及び三次元構造の両方が高く保存されている（ＬｏｂｒｅｏｕｘＳ．ら、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８８：９３１−９３９．）。フェリチンは葉緑体に存在し、鉄はその生合成を活性化することも可能である（Ｓｅｃｋｂａｃｈ，Ｊ．１９８２，Ｊ．Ｐｌａｎｔ．Ｎｕｔｒ．５：３６９−３９４；Ｌｏｂｒｅａｕｘら、１９９２、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：５６３−５７５）。通常の生育条件下で、フェリチンは根及び葉のような栄養器官ではなく、胚でのみ生合成される（Ｌｏｂｒｅａｕｘ及びＢｒｉａｔ：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９１，２７４：６０１−６０６）。フェリチン分子の重要な抗酸化効果は、フェリチンの生合成及び分解が通常の代謝制御からはずれたシステム内で期待可能である。酸化ストレス条件においてフェリチン分子の分解が起き、それにより放出された鉄イオンがダメージを与えるラジカル種の生成率を高促進することがこれまで示されている（Ｃａｉｒｏら、１９９５，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７０：７００−７０３）。非常に多くの伝統的植物の繁殖及び遺伝子操作法によるアプローチは、あらかじめ選択した所望のストレス条件（例えば、寒気、干ばつ、紫外線、あるいは病原体）に対して特定の農作物の耐性を向上するための技術として知られている。しかしこれらの既知の方法は、すべて本発明の方法とはかなり相違しており、本明細書では個別に詳述されていない。これらのすでに開示された方法すべての一般的特徴は、例えば特定の耐性遺伝子の発現により、選択したある一つのストレス条件（又は同起源の、ある限定された一群のストレス条件）に対し様々な植物の耐性を高めている。しかし非生物的及び生物的両方の広範囲なストレス条件に対する耐性を植物に与える特定の方法は、この分野ではまだ知られていない。従って、本発明の目的の一つは、農作物、特にトランスジェニック農作物に、広範囲の非生物的及び生物的両方のストレス条件に対し高耐性をもたせる新規のかつ、一般的な方法を提供することである。別の側面によれば、広範囲の非生物的及び生物的両方のストレス条件に対して高められた耐性を有する、農作物及び育種材料、都合よくは形質転換されたものを提供することもまた、本発明の目的の一つである。従って前述の開示に基き、先に定義した目的を達成するために様々な非生物的及び生物的ストレス条件のダメージを与えるメカニズムにおける共通のステップを標的とした、実質的に新しい遺伝子操作方法が開発されるべきであることが本発明者に明らかとなってきた。従って本発明の方法は、植物の様々な器官において、植物過産生または異所的に発現されたフェリチン、またはその他の鉄結合タンパク質、例えばトランスフェリンが、細胞内の鉄濃度を低下させ、従って酸素が誘導するフリーラジカルのダメージ効果を減少させるであろうという、新しい理論的概念を基にする。本発明の方法は、広範囲の非生物的及び生物的両方のストレス条件に対する耐性を植物に付与する方法がこの分野では開示されていないことで、絶対的に新しいということを強調することが重要である。さらにはあらゆる理由にでも、あらゆる方法によっても、フェリチンタンパク質が植物内で過産生されるというような開示された方法はこれまでにない。従って、先に定義した本発明の目的を達するために、本発明者はアルファルファ（ＭｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａＬ．）からフェリチンｃＤＮＡをクローンし、及びタバコ植物の栄養組織において過産生させた。本発明の基本的概念に従って、アルファルファフェリチンを栄養組織に異所的に発現させたトランスジェニックタバコ植物は、非生物的（様々な化学品処理）及び生物的（ウイルス、バクテリア及び菌類の感染）両方のストレス条件に対し、元のタバコ植物よりも有意に高い耐性を示し、同様に形質転換体は、一般的な適応及び特徴の再生を示すことが明らかになった。本発明の基本的概念に従って、過産生されたフェリチン分子が植物細胞内でフリーの鉄イオンの結合を介して一般的な保護効果を現すことが期待されること、そしてそれはトランスフェリンのような他の鉄結合性タンパク質の過産生によって類似の保護効果が得られると推定できることもまた強調されるべきである。従って本発明は、鉄結合性タンパク質を過産生し、そして酸化ストレスに対する高耐性を有する植物細胞を提供する。本発明における植物は、都合よくは実質的に知られている遺伝子操作方法により生産されるが、しかしまた伝統的な変異及び選択技術により生産することも可能である。本発明の形質転換植物は、酸化ストレス条件に対し、その鉄結合性タンパク質が高レベルには発現しない転換前の対照物よりも有意に高い耐性を示す。本発明による植物細胞は、都合よくはフェリチンのような鉄結合性タンパク質の発現をコードする、例えばベクター形態の核酸の導入により形質転換されたトランスジェニック細胞である。本発明の好ましい態様により、本発明で提供される植物細胞は、添付の配列表に示される配列番号２のアミノ酸配列を有するフェリチン、あるいはその機能的変異体を過産生する。その機能的変異体は前記のフェリチンポリペプチドと少なくとも５０％、より都合よくは少なくとも７０％、さらに都合よくは少なくとも９０％の相同性があるものとする。本発明は更に、本発明の植物、都合よくはトランスジェニック植物、及び細胞を含むその部分を提供する。本発明の好ましい態様において、本発明の植物の葉を７０時間１０μＭのパラコート処理したが、光合成反応の強さは低下しない。本発明の植物、植物部分、あるいは植物細胞は、都合よくはフザリン酸処理、及び／又はウイルス、及び／又はバクテリア、及び／又は菌類由来の感染に対して耐性が高められている。本発明はまた、明細書に含む配列表に示す配列番号２の配列を持つアルファルファフェリチン及びその機能的変異体をコードする核酸配列を含む、あるいは構成する、分離し、濃縮した、無細胞の、及び／又は組換え型の核酸及び、その機能的変異体を提供する。好ましくはその核酸は、配列番号１（図１のＤＮＡ配列）と少なくとも９０％の相同性があり、より好ましくは少なくとも９５％、さらに望ましくは少なくとも９８％の相同性があるものである。これらの核酸は、ｃＤＮＡ、組換え型ベクター、又はその他の組換え型構造物である。本発明はまた、本発明の植物細胞、植物部分、及び植物の調製のためのこれらの核酸の使用を含む。本開示及び以下の実施例は、植物の栄養細胞における鉄結合性タンパク質フェリチンの合成は、パラコートによって生成されたフリーラジカルに対し耐性を付与することを示す。この観察と一致して、本発明者らはまた、本発明におけるトランスジェニック植物の、それぞれ関連のない広範囲な病原体の感染後の徴候が有意に減少することを示す。本発明のこの新規な技術は、鉄結合性タンパク質の異所的発現に基づき、従って非生物的又は生物的ストレス条件のいずれかによって引き起こされる、農作物の初期の酸化ダメージを低減可能であることにおいて潜在的に高い作物学的重要性を持つ。いかなる理論的説明とも結びつけられることを望むわけではないが、本発明者らは前記の発見は、鉄イオンが本発明による植物内で鉄結合性タンパク質（フェリチン）の過産生の結果、より効果的に結びつき、そして、従って、酸素により誘導されるフリーラジカルにより引き起こされるダメージが低減され、そして一般的に適応し及び、本発明で改良された植物の特性が再生されるという仮定を支持するものと考える。本発明による植物はまた、そのような低下を仲介された鉄が影響を受ける、例えば極度の低温又は高温、及び干ばつといったようなこれまでにテストしていない他のストレス条件に対しても、耐性を示すことが可能である。当業者には前記の開示より全く明らかなことと考えられるであろうが、出願人はまた、本発明による方法の普遍性をここに強調したい。本発明者らは、栄養組織におけるアルファルファ由来の鉄結合性タンパク質の異所的発現が、広範囲の様々な種類のストレス条件に対しトランスジェニックタバコ植物に耐性を与えることを示した。標的とする組織での鉄イオン濃度の減少という、絶対的に一般的な概念を基にする本発明の先駆的方法としては、当業者は、本発明の利点は示された特定の態様に制限されないばかりか、植物の一般的なストレス耐性を確実にするこの新規の方法は、作物学又は園芸学的に重要な他のどんな作物の場合にも使用可能であることを理解するだろう。また、２つの異なる型のプロモーター（１つは植物、もう１つはウイルス由来）を用いた、タバコ植物の栄養組織での胚特有アルファルファフェリチンの異所的過産生は、標的の組織に少しもダメージを与えないことを示す。従って、本発明において目的の植物部分又は組織において鉄結合性タンパク質を過産生するために、いかなる型の植物特有のプロモーター（実質的、又は場所的、及び／又は発生的に制御されたいずれか）も用いることができると企図されるべきである。光合成が行われる緑色組織において有害なラジカル濃度は一般に最高であるので、これらの組織が本発明による方法の最初の有用な標的である。しかしながら前記で示した非常に普遍的な基本概念のために、本発明は緑色組織にストレス耐性を与えることに全く限定されないばかりでなく、推定上あらゆる種類の酸化ストレス条件（例えばいかなる型の病原体による感染）にさらされることがある、関係あるその他全部の植物部分（例えば、根、茎、花、果実、又はそれらの特定部分）に耐性を作ることに有用であることを理解されるべきである。図面図１アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ）から単離されたフェリチンｃＤＮＡの核酸配列及び、推定されるアミノ酸配列。下線部分は輸送用ペプチドに相当する。図２様々な種由来のフェリチンアミノ酸配列の比較。ＨｕＨｆｅｒ：ヒトＨサブユニット（Ｂｏｙｄら、１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１１７５５）ＨｏＬｆｅｒ；ウマ脾臓Ｌ鎖（Ｈｅｕｔｅｒｓｐｒｅｕｔｅ及びＣｈｒｉｃｈｔｏｎ，１９８１，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．１２９：３２２）Ｐｅａｆｅｒ：マメ種子フェリチン（Ｌｏｂｒｅｏｕｘら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８８：９３１）Ｍｓｆｅｒ１：アルファルファフェリチン（未発表）図３本発明のトランスジェニックタバコ植物の、栄養組織におけるフェリチンｍＲＮＡの蓄積。図４本発明のトランスジェニックタバコ植物の葉からの細胞抽出物中の、ＳＤＳ− ＰＡＧＥ後のフェリチンの検出。図５本発明のトランスジェニックタバコ植物の葉からの細胞抽出物中の、ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロット解析によるフェリチンの検出。図６本発明の形質転換植物Ｃ３及び、コントロールＳＲ１のリーフディスクにおける、１０μＭパラコート処理中の蛍光強度（Ｆｖ／Ｆｍ）の変化。図７本発明の様々な形質転換植物及び、コントロールＳＲ１のリーフディスクにおける、１０及び２０μＭパラコート処理後の蛍光強度（Ｆｖ／Ｆｍ）の変化。図８本発明の形質転換植物及び、コントロールＳＲ１の葉における１０及び２０μ Ｍパラコート処理３日後の葉緑体の含有量。いくつかの好ましい態様及び本発明の概念は、以下の実験的実施例の方法でより説明されるであろう。しかしながら、以下の実施例は本発明の思想のより包括的理解のためにのみあり、請求の範囲に定義された本発明の範囲に関して、決して実例的又は制限的ではないことを理解されるべきである。以下の実施例において、本発明者らは実施例をまとめて非常に多くの本発明の利点を示す。本発明者らは新しいアルファルファフェリチンポリペプチドをコードする全長のｃＤＮＡ（ＭｓＦＥＲ１）を単離し、及び様々なプロモーターの転写コントロール下でトランスジェニックタバコ植物の栄養組織内でのフェリチンの発現にこのｃＤＮＡを使用した。フェリチンを発現するトランスジェニックタバコ植物の生化学的特徴を解析後、本発明者らはそれらのほとんどが、非常に異なる起源の非生物的（ダメージを引き起こす化学試薬）及び生物的（ウイルス、バクテリア、及び菌類の病原体の感染）に対して有意に耐性が高められたことを示した。実施例１アルファルファフェリチンｃＤＮＡクローン（ＭｓＦＥＲ１）全長の同定及び、核酸及び推定されるそのアミノ酸配列ｃＤＮＡライブラリーを構築し、そしてフェリチンをコードするｃＤＮＡクローンを単離するため、ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｆ．Ｆ．，ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓＴ．による“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”（２．ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＮ．Ｙ，１９８９）に記載の、一般的な方法である組換え型DNA技術を用いた。具体的には、アルファルファフェリチンのｃＤＮＡクローンは以下のように単離した。主に体細胞の胚から成る、インビトロで培養したアルファルファ組織より、全細胞ＲＮＡを分離した。サンプル中にはまた、少量のカルス組織が存在した（Ｃａｔｈａｌａら、１９８３，ＤＮＡ，２：３２９−３３５）。体細胞の胚の形成は、Ｄｕｄｉｔｓらによる（１９９１，Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ，９９：４７３−４８２）オーキシン（２，４ジクロロフェノキシ酢酸）ショックにより誘導した。そして、オリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィー（ＡｖｉｖＨ．及びＬｅｄｅｒＰ．，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９：１４０８−１４１２）により単離した全細胞ＲＮＡから、ｍＲＮＡを精製した。それから、オリゴ−ｄＴプライマー存在下、ＡＭＶ逆転写酵素により第一鎖ｃＤＮＡを生合成した。ＤＮＡポリメラーゼＩにより第二鎖を生成した。ＲＮａｓｅＨ処理後、ターミナルトランスフェラーゼとｄＣ及びｄＧホモリンカーを添加し、ＰｓｔＩ消化ｐＧＥＭ２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）とｃＤＮＡをアニールさせた。その生成物をＥ．ｃｏｌｉＭＣ１０６１系に形質転換し、アンピシリン１００ｍｇ／ｌで選択した。ｃＤＮＡ２５μｇを用いて２．５×１０⁵の最初の形質転換体が生成された。９６％のクローンが有意な長さのｃＤＮＡの挿入を含んでいた。この操作はＤｅＬｏｏｓｅらにより詳細に述べられている（１９８８，Ｇｅｎｅ７０：１３−２３）。そして、前もって選んだｃＤＮＡクローンのランダム配列決定によって、５０のＥＳＴが同定された。ファルマシアＴ７シーケンスキット又は、ＵＳＢシーケンスキットを製造者の説明書に従い使用した。体細胞の胚より調製したＲＮＡプローブを用いたｃＤＮＡクローンのノーザンハイブリダイゼーションによりプレセレクションを行った。強くハイブリするクローンを選別した。ＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬデータバンクを基にした配列の整合性は、一つのｃＤＮＡクローン（ＭｓＦＥＲ１と呼ぶ）が、既知のフェリチンの推定されるアミノ酸配列と高い相同性を持つことが示された。図１にＭｓＦＥＲ１クローンの核酸配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）の双方を示す。このクローンが含むｃＤＮＡの挿入物は、長さ１０３６ｂｐであり、４０から７８９部位の間にコード領域が見られる。コードされるタンパク質は２５１アミノ酸により構成され、及び異なる起源のフェリチンと高いアミノ酸配列の同一性を共有する。図２に示すように、植物のフェリチンはヒトＨ及びウマＬフェリチンと３９ −４９％の同一性を持つ一方、成熟タンパク質におけるマメ及びアルファルファフェリチンの配列はお互い非常に似ている（８９％のアミノ酸同一性）。けれども二つの植物のフェリチンは、葉緑体のリーダー配列に相当する領域で有意に異なる。この部分ではアミノ酸配列の同一性は４７％しかない。従って新しく述べるアルファルファフェリチンは、フェリチンファミリーの新たな変異体と考えることが可能である。実施例２栄養組織内におけるこのタンパク質の異所的発現のためのタバコ植物へのアルファルファフェリチンｃＤＮＡの導入適用した形質転換技術は、Ｈｉｎｃｈｅｅらにより概説された（“ＰｌａｎｔＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ”ｐｐ．２３１−２７０ｅｄｓ．Ｉ．Ｋ．ＶａｓｉｌＴ．ＡＴｈｏｒｐｅ，ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒ１９９４）アグロバクテリウム遺伝子搬送システムを基にする。本実施例において本発明者らは，Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｅｓｃｈｉらにより記載された（１９９５，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙＴｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ２３：２４７−２５０）ベクターのシステムを使用した。ＭｓＦＥＲ１ｃＤＮＡは、リブロース１．５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーターに機能的に結合した形質転換用ベクターの、ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ部位にクローン化した。このプロモーターは最初はＭａｕｅｒ及びＣｈｕｉにより記載され（１９８５，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．７：２３７３−２３８７）、そして特に植物の緑色組織においての発現に有用である。Ａ２、Ｃ３及びＣ８と名付けられた、タバコ植物に形質転換後得られたトランスジェニッククローンは、この構築物を持つ。あるいはＭｓＦＥＲ１ｃＤＮＡはまた、Ｂｅｎｆｅｙらにより記載された（１９８９，ＴｈｅＥＭＢＯＪ．８：２１９５−２２０２）ウイルスのプロモーターＣａＭＶ３５Ｓに結合された。全長の構築物を単離するため、本発明者らはＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅｓ自動ＤＮＡシンセサイザーにより合成した以下のＰＣＲプライマーを使用した。（配列番号３）ＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＥｃｏＲＩ部位フェリチン輸送用ペプチドコード領域本発明者らはまた、標的とするリーダー配列（図１参照）の重要な部分を欠いたＭｓＦＥＲ１ｃＤＮＡの短縮版を生成した。このクローニング操作において、本発明者らは以下のPCRプライマーを使用した。（配列番号４）ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＧＴＧＡＴＡＡＧＡＧＧＥｃｏＲＩ部位輸送用ペプチド内のコード領域同定されたＤＮＡ断片のPCR増幅には、上記に記載のオリゴヌクレオチド及びＴ７シーケンスプライマー（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を使用した（Ｍｕｌｌｉｓ及びＦａｌｏｏｎａ，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５）。ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで消化したＰＣＲ産物（Ｔ７プライマー配列に由来するＫｐｎＩ制限部位）を同じ制限酵素で消化したｐＦＬＡＧ−ＡＴＳベクター（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍＫｏｄａｋ，ＵＳＡ）にクローン化した。これらの構築物に存在するＦＬＡＧ配列は、抗ＦｌａｇＭ２抗体（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍＫｏｄａｋ，ＵＳＡ）を使用することによりタンパク質合成の免疫学的追跡を可能とする。全ＦＬＡＧＦＥＲＲ及び部分的（ｐｔ）ＦＬＡＧＦＥＲＲ構築物を生成するため、本発明者らは以下のＢａｍ−Ｆｌａｇオリゴヌクレオチドを合成した。（配列番号５）ＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＧＧＡＢａｍＨＩ部位ＭＥＴＦＬＡＧコード領域このプライマー及びｐＦＬＡＧベクターのＣ２４シーケンスプライマーを用いＰＣＲ産物を生成し、及びＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ部位で形質転換用ベクターにクローン化した。このようにして構築した二成分ベクターをアグロバクテリウム株に移動させた。それからタバコリーフディスクをアグロバクテリウム細胞と共培養し、Ｃｌａｅｓらにより記載された（１９９１，ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ１：１５−２６）カナマイシン含有培地で形質転換体を選択した。一次の形質転換体は自己受粉し、及びＴ２植物をさらに特徴化した。実施例３トランスジェニックタバコ植物フェリチンの異所的合成の分子的証拠誘導した構築物の機能的活性を示すためには、最初にノーザンブロットハイブリダイゼーションを行った。ノーザンハイブリダイゼーションは広く用いられるプロトコール（ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．，ＦｒｉｔｓｃｈＦ．Ｆ．，及びＭａｎｉａｔｉｓＴ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”２．ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＮ．Ｙ．，１９８９）により行った。最初に、形質転換体の栄養組織より全ＲＮＡサンプルを単離した（Ｃａｔｈａｌａら、１９８３，ＤＮＡ２：３２９−３３５）。ホルムアルデヒド存在下アガロースゲル電気泳動後、ＲＮＡはハイボンド−Ｎフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）上に転移させた。ランダムプライム³²Ｐ−ラベルにより放射性ラベルプローブを作製した（ＦｒｅｉｎｂｅｒｇＡ．Ｐ．及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎＢ．，１９８３，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：２６６−２６７）。ホルムアルデヒド存在下、４ −１２時間のプレハイブリダイゼーション後、４２℃、１６−２４時間ハイブリダイゼーションを行った。以下に示す条件で洗浄を行った。：６５−７２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ。図３に示すように、形質転換植物内に多量のフェリチンｍＲＮＡが蓄積した。フェリチンの合成は、Ｌａｕｌｈｅｒｅ及びＬａｕｌｈｅｒｅにより記載された（１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：３６２９−３６３５）部分的な精製後、生化学的方法により解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、コントロールＳＲ１及び形質転換体（Ｃ３，Ａ２，Ｃ８）のタンパク質の外観は有意に相違した。後者は、分子量２６ｋＤａを有するフェリチンの蓄積量が変化した（図４）。ＦＬＡＧ検出システムを用い、本発明者らはまた、化学発光（ＳｕｐｅｒＳｉｇｆｎａｌ^RM−ＣＬ−ＨＲＰＳｙｓｔｅｍ，Ｐｉｅｒｃｅ）によりいくつかのトランスジェニックタバコ植物におけるフェリチンの合成を示す（図５）。ここに示した分子的情報は、コントロール植物におけるフェリチンの欠失及び、形質転換体の栄養組織内にこのタンパク質が蓄積されていることを表す。実施例４フェリチンの異所的合成はトランスジェニック植物に酸化ストレス耐性を付与する本発明の基本的概念を調べるため本発明者らは、コントロール及び形質転換タバコ植物のパラコート（Ｐｑ）耐性を解析した。光合成の電子輸送中に生じる電子が、Ｐｑを減少させ、フリーラジカルを生じさせることがよく証明されている（ＡｓｈｔｏｎＦ．Ｍ．及びＣｒａｆｔｓＡ．Ｓ．，１９８１，Ｍｏｄｅｏｆａｃｔｉｏｎｏｆｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ，Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。コントロール及び形質転換植物のリーフディスクは、１０又は２０μＭＰｑで処理された。ＶａｓｓＩ．らにより記載された（１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：８９６４−８９７３）ＰＡＭ蛍光計を用いた光活性化した蛍光発光を測定することにより機能的ダメージを監視した。例えば、図６は、６０時間、１０μ ＭＰｑ処理後のコントロールＳＲ１葉の光合成機能は失われた一方、Ｃ３形質転換体はその期間の解析中光合成機能を保持していたことを示す。フェリチン遺伝子をＣａＭＶ３５Ｓプロモーター制御下で発現させた、他２つの形質転換体（Ｆｕｌｌ９，Ｐｔ２）のＰｑ処理後にも類似の反応が観察可能である。これらの実験は数回繰り返して行われ（図７参照）、及びこの形質転換体の場合パラコート耐性を持つという機能的特徴が説得力を持って証明された。この耐性は、葉緑素含量をモニターした場合にも観察できる（図８）。フリーラジカルの誘導体としてパラコートを用いて示された結果は、栄養組織でフェリチンを合成する形質転換植物は、フリーラジカルにより引き起こされるダメージに対し耐性が高められたという結論を支持する。ここで本発明者らは解析した形質転換植物は、その生長及び温室の状態に何ら目に見える変性がなかったことに言及しなければならない。形質転換体の光合成機能はコントロールＳＲ１植物と同等である。コントロール条件下でこれらの植物は通常の葉緑素含有量を示す（図８）。実施例５フザリン酸処理に対して高耐性を持つフェリチン過産生の形質転換植物病原性におけるフリーラジカルの関与は、Ｋ．Ｅ．Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａｃｋ及びＪ．Ｄ．Ｇ．Ｊｏｎｅｓにより提案されている（１９９６，ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ８：１７７３−１７９１）。従って本発明者らは、緑色組織でアルファルファフェリチン遺伝子を発現させた形質転換体で徴候の発生を調べた。最初に、本発明者らは非特異的菌性毒であるフザリン酸の効果を解析した。異なる濃度のフザリン酸をコントロール（ＳＲ１）及びトランスジェニックタバコ葉（Ａ２，Ｃ３，及びＣ８）に注入した。注入２日後、本発明者らは葉組織の壊死の度合を解析した。表１に３つの実験の結果を要約する。表１フザリン酸処理後の、フェリチン発現形質転換植物の壊死の減少 − 壊死なし；ＸＸＸ＝深刻な壊死（又は損傷した葉面積の壊死度％）示したデータは、形質転換植物の葉の壊死が相当減少していることを表す。これらの結果よりまた、菌類の感染により引き起こされるダメージに対しても耐性を高める見込みがある。実施例６フェリチン過産生形質転換植物はシュードモナス感染に対し高耐性を有した同じ概念により本発明者らは、タバコ植物の葉にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｒ細胞懸濁液（１０⁷／ｍｌ）を注入した。２０時間後、壊死（ＨＲ）の度合を解析した。表２に２つのトランスジェニック系（Ａ２，Ｃ８）における、壊死の減少を示す結果を要約する。表２バクテリア感染後の壊死度上記のデータは、少なくとも２つの形質転換体（Ａ２及びＣ８）はバクテリア感染により引き起こされるダメージに対して、有意に高められた耐性を持つことを示している。実施例７フェリチン過産生形質転換植物はボトリチス菌及びアルテルナリア菌の感染に対し高耐性を有した本発明者らは、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｌｔｅｒｎａｔａ及びＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａのような２つの菌類病原体に対する、実施例２によるトランスジェニック系の反応をテストした。葉を分離し及び、菌類を培養した寒天ブロックで接種した。表３に処理したコントロール及び形質転換植物の、壊死した葉範囲の大きさを要約する。表３形質転換植物に対する菌類病原体の効果上記のデータより、葉にフェリチンを過産生する形質転換タバコ植物−全長又はフェリチン遺伝子短縮型いずれも含む−は、コントロール植物に比較して有意に徴候の減少（程度は一定でないけれども）を示しているとの結論することが可能である。実施例８フェリチン過産生形質転換植物はタバコ壊死ウイルス（ＴＮＶ）感染に対し高耐性を有した植物のウイルス感染において、酸素の生成は病原性において必須の役割を果たす。従って本発明者らは、形質転換及び、コントロール（ＳＲ１）植物のタバコ壊死ウイルス（ＴＮＶ）感染に対する反応をテストした（表４）。表４ＴＮＶ感染後の形質転換タバコ植物における損傷範囲及び損傷数の減少表４に示すように、ＲＵＢＩＳＣＯ小サブユニットからのプロモーター制御下のアルファルファフェリチン遺伝子を持つ形質転換タバコ植物（Ｃ３、Ｃ８及びＡ２）は、損傷数に有意な減少を認めることが可能である。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター制御下のフェリチン遺伝子を発現させた形質転換系のうちで、短縮型フェリチン遺伝子を発現させた２つの系が、徴候の最も有意な減少を示したことは機能的重要性を有するかもしれない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号Ｐ９７００７６２ (32)優先日平成10年３月９日(1998．3．9) (33)優先権主張国ハンガリー（ＨＵ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者テレク，カーロイネーハンガリー国ハー―6753 セゲド―ターペー，オストロム・ウート 64 (72)発明者サス，ラースローハンガリー国ハー―6728 セゲド，フェルセーニューマース・ルッス・ウート 37630 (72)発明者バラース，バルナハンガリー国ハー―1055 ブダペスト，ストラール・ベーラ・ウート 16 (72)発明者キラーリ，ゾルターンハンガリー国ハー―1022 ブダペスト，ハンコーチ・イェネー・ウート 17

Claims

【特許請求の範囲】１．鉄結合性タンパク質を過産生することを特徴とする植物細胞。２．野生型の植物と比較して、酸化ストレスに対して高められた耐性を有することを特徴とする、請求項１に記載の植物細胞。３．鉄結合性タンパク質がフェリチンであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の植物細胞。４．鉄結合性タンパク質の発現をコードする核酸の導入により形質転換された、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の植物細胞。５．フェリチンの発現をコードする核酸の導入により形質転換された、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の植物細胞。６．鉄結合性タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を持つフェリチン、又はその機能的変異体であることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の植物細胞。７．鉄結合性タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を持つフェリチンと少なくとも５０％の相同性を持つことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の植物細胞。８．鉄結合性タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を持つフェリチンと少なくとも９０％の相同性を持つことを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の植物細胞。９．請求項１ないし８のいずれか１項に記載の細胞を含む、植物あるいは植物部分。１０．トランスジェニックであることを特徴とする請求項９に記載の植物又は植物部分。１１．７０時間、１０μＭパラコート処理により、葉における光合成反応の強度が１０％以上低下しない、請求項９あるいは１０に記載の植物。１２．処理によって強度が低下しないことを特徴とする、請求項１１に記載の植物。１３．フザリン酸処理、及び／又はウイルス、及び／又はバクテリア、及び／又は菌類起源の感染に対し高められた耐性を有することを特徴とする、植物あるいは植物部分。１４．鉄結合性タンパク質が栄養組織において異所的に発現することを特徴とする、請求項８ないし１２いずれか１項に記載の植物。１５．配列番号１の配列を持つアルファルファフェリチンをコードする核酸配列又はその機能的変異体の、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の植物細胞の調製あるいは、請求項８か１４のいずれか１項に記載の植物又は植物部分の調製のための使用。１６．配列番号１の配列を含む、あるいはその配列と少なくとも９０％の相同性を持つ、あるいはその配列に相補的な、分離し濃縮した、無細胞、及び／又は組換え型の核酸。１７．当該配列と少なくとも９５％の相同性、あるいはそれに相補的な配列を持つ、請求項１６に記載の核酸。１８．ｃＤＮＡである請求項１６あるいは１７に記載の核酸。１９．ＭｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａＬのフェリチンリーダー配列を含まない請求項１６ないし１８のいずれか１項に記載の核酸。