CN1145696C - 抗真菌蛋白 - Google Patents

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Abstract

为Rs-AFP2蛋白类似物并在其氨基酸序列中含有特定突变的抗真菌蛋白。该突变的蛋白具有增强的耐盐抗真菌活性。此蛋白用于抗农业中的真菌疾病、制药或防腐剂中。

Description

抗真菌蛋白
本发明涉及抗真菌蛋白、它们的制备及使用方法、以及编码该蛋白的DNA序列。
在本文中，抗真菌蛋白定义为具有抗真菌活性的蛋白或肽。活性包括一定范围的拮抗效应如部分抑制或死亡。
已从某些植物种类中分离出多种具有抗植物病原性真菌活性的抗真菌蛋白。以前我们描述了一类能从小萝卜和其它植物种类中分离的抗真菌蛋白。这些蛋白在下面的出版物中加以描述过，特别地在此引用供参考：1993年3月18日出版的国际专利申请公开号WO 93/05153；Terras FRG等，1992，生物化学杂志，267：15301-15309；Terras等.，FEBS通迅，1993，316：233-240；Terras等，1995，植物细胞，7：573-588。该类群包括源自莱菔( Raphanus  sativus)的Rs-AFP1(抗真菌蛋白1)、Rs-AFP2、Rs-AFP3和Rs-AFP4和同源蛋白如来自欧洲油菜( Brassica  napus)的Bn-AFP1和Bn-AFP2，来自芜青( Brasscia  rapa)的Br-AFP1和Br-AFP2，来自白芥( Sinapis  alba)的Sa-AFP1和Sa-AFP2，来自鼠耳芥( Arabidopsis  thaliana)的At-AFP1，来自光滑大丽花( Dahlia  merckii)的Dm-AMP1和Dm-AMP2，来自 Cnicus  benedictus的Cb-AMP1和Cb-AMP2，来自 Lathyrus cicera的Lc-AFP，来自蝶豆( Clitoria  ternatea)的Ct-AMP1和Ct-AMP2。这些蛋白特异性地抑制一定范围内的真菌并可用作农业上的杀菌剂或制药或防腐的目的。已有建议此类抗真菌蛋白应命名为植物防卫素(Terras F.R.G.等，植物细胞7 573-588)且这些蛋白具有一个含保守半胱氨酸与甘氨酸的类似基元(Broekaert等1995植物生理108 1353-1358)。
图1显示了蛋白Rs-AFP2和基本上同源的蛋白Rs-AFP1、Rs-AFP3、Rs-AFP4、Br-AFP1、Br-AFP2、Bn-AFP1、Bn-AFP2、Sa-AFP1、Sa-AFP2、及At-AFP1的氨基酸序列，这些蛋白为高度碱性并富含半胱氨酸的较小的5kDa多肽。图1对氨基酸残基的位置进行了编号：位于Rs-AFP3序列起始处的破折号(-)表示引入的用于最大限度对齐的间隔。显示的Br-AFP1、Br-AFP2、Bn-AFP1、Bn-AFP2、Sa-AFP1、Sa-AFP2及At-AFP1的序列不完全：仅显示了其N-末端的序列。Br-AFP2序列中的问号(？)表示为一个非标准氨基酸，其不是测序所得到的氨基酸且被认为是对标准氨基酸残基的翻译后修饰所致。
能够从小萝卜种子中分离的两种抗真菌蛋白同工型：Rs-AFP1和Rs-AFP2的主要结构仅在两个位置不同：Rs-AFP1中位置5的谷氨酸残基(E)在Rs-AFP2中为谷氨酰胺残基(Q)，并且Rs-AFP1中位置27的天冬酰胺残基(N)在Rs-AFP2中为精氨酸残基(R)所代替。结果，Rs-AFP2在生理性pH时具有更高的净正电荷(+2)。尽管两种Rs-AFP3在氨基酸序列水平上具有94％的一致性，对各种真菌来说Rs-AFP2较Rs-AFP1具有2到30倍更高的活性并显示出增强的耐盐性。蛋白Rs-AFP3与Rs-AFP4发现于局部真菌感染后的小萝卜叶子中。该诱导的叶蛋白与Rs-AFP1和Rs-AFP2同源并在体外产生类似的抗真菌活性。
编码Rs-AFP1的cDNA编码在成熟蛋白之前具有信号肽的前蛋白。cDNA序列显示于图2中。啤酒糖酵母可用作Rs-AFP2制备和分泌的载体(Vilas Alves等，FEBS通迅，1994，348：228-232)。当以N-末端融合到酵母交配因子α1(MFα1)前原序列(preprosequence)时，源于植物的“野生型”Rs-AFP2可通过酵母正确地加工和分泌。Rs-AFP2蛋白甚至在高达500μg/ml的浓度对酵母均无副作用。
我们现在提供新的强有力的基于Rs-AFP及相关的蛋白结构的抗真菌蛋白。
根据第一方面本发明提供了这样的一种抗真菌蛋白，其具有基本上与显示于图1中Rs-AFP2序列同源的氨基酸序列并含有至少一个下面的突变，包括位置9的碱性残基、位置39的碱性残基、位置5的疏水残基及位置16的疏水残基。
根据本发明第一方面优选的实施方案提供了这样的一种抗真菌蛋白，其具有基本上同源于显示于图1中Rs-AFP2序列的氨基酸序列并含有至少一个选自下面的突变，包括位置9的精氨酸残基、位置39的精氨酸残基、位置5的甲硫氨酸残基及位置16的甲硫氨酸残基。既具有至位置9精氨酸的突变又具有至位置39精氨酸突变的抗真菌蛋白可能是具有特别有活性的。
基本上同源于Rs-AFP2蛋白的蛋白包括显示于图1中的蛋白Rs-AFP1、Rs-AFP3、Rs-AFP4、Br-AFP1、Br-AFP2、Bn-AFP1、Bn-AFP2、Sa-AFP1、Sa-AFP2及At-AFP1。
这里使用的术语基本上同源意指那些具有与Rs-AFP2序列至少有40％的一致性，优选至少60％的一致性且最优选至少80％一致性的氨基酸序列的蛋白。
本发明进一步提供这样的抗菌肽，其包括与根据本发明抗真菌蛋白中一连串氨基酸残基相一致的至少6个氨基酸残基，所述的一连串残基包括至少突变残基中的一个残基。
特别地，提供了下面的抗真菌蛋白和其衍生的抗真菌肽：具有Rs-AFP1、Rs-AFP2、Rs-AFP3或Rs-AFP4的氨基酸序列并且其中的位置9甘氨酸残基由精氨酸残基所替代的蛋白；具有Rs-AFP1、Rs-AFP2或Rs-AFP3的氨基酸序列并且其中的位置39缬氨酸残基由精氨酸残基所替代的蛋白；
具有Rs-AFP4的氨基酸序列并且其中的位置39异亮氨酸残基由精氨酸残基所替代的蛋白；
具有Rs-AFP1、Rs-AFP2或Rs-AFP3氨基酸序列并且其中的位置9甘氨酸残基由精氨酸残基所替代且位置39的缬氨酸残基由精氨酸残基替代的蛋白；
具有Rs-AFP4的氨基酸序列且其中的位置9甘氨酸残基由精氨酸残基所替代且位置39的异亮氨酸残基由精氨酸残基所替代的蛋白；
具有Rs-AFP1、Rs-AFP3或Rs-AFP4的氨基酸序列且其中的位置5谷氨酸残基由甲硫氨酸残基所替代的蛋白；
具有Rs-AFP2的氨基酸序列且其中的位置5谷氨酰胺残基由甲硫氨酸残基所替代的蛋白；
具有Rs-AFP1、Rs-AFP2、Rs-AFP3或Rs-AFP4的氨基酸序列且其中的位置16甘氨酸残基由甲硫氨酸残基所替代的蛋白。
根据本发明的蛋白包括具有下面序列中其中一个序列的蛋白：
QKLCERPSRTWSGVCGNNNACKNQCINLEKARHGSCNYVFPAHKCICYFPC；
QKLCERPSGTWSGVCGNNNACKNQCINLEKARHGSCNYRFPAHKCICYFPC；
QKLCERPSRTWSGVCGNNNACKNQCINLEKARHGSCNYRFPAHKCICYEPC；QKLCMRPSGTWSGVCGNNNACKNQCINLEKARHGSCNYVFPAHKCICYFPC；QKLCERPSGTWSGVCMNNNACKNQCINLEKARHGSCNYVFPAHKCICYFPC；QKLCQRPSRTWSGVCGNNNACKNQCIRLEKARHGSCNYVFPAHKCICYFPC；QKLCQRPSGTWSGVCGNNNACKNQCIRLEKARHGSCNYRFPAHKCICYFPC；QKLCQRPSRTWSGVCGNNNACKNQCIRLEKARHGSCNYRFPAHKCICYFPC；QKLCMRPSGTWSGVCGNNNACKNQCIRLEKARHGSCNYVFPAHKCICYFPC；QKLCQRPSGTWSGVCMNNNACKNQCCIRLEKARHGSCNYVFPAHKCICYPC；KLCERSSRTWSGVCGNNNACKNQCIRLEGAQHGSCNYVFPAHKCICYFPC；KLCERSSGTWSGVCGNNNACKNQCIRLEGAQHGSCNYRFPAHKCICYFPC；KLCERSSRTWSGVCGNNNACKNQCIRLEGAQHGSCNYRFPAHKCICYFPC；KLCMRSSGTWSGVCGNNNACKNQCIRLEGAQHGSCNYVFPAHKCICYFPC；KLCERSSGTWSGVCMNNNACKNQCIRLEGAQHGSCNYVFPAHKCICYFPC；QKLCERSSRTWSGVCGNNNACKNQCINLEGARHGSCNYIFPYHRCICYFPC；QKLCERSSGTWSGVCGNNNACKNQCINLEGARHGSCNYRFPYHRCICYFPC；QKLCERSSRTWSGVCGNNNACKNQCINLEGARHGSCNYRFPYHRCICYFPC；QKLCMRSSGTWSGVCGNNNACKNQCINLEGARHGSCNYIFPYHRCICYFPC；QKLCERSSGTWSGVCMNNNACKNQCINLEGARHGSC NYIFPYHRCICYFPC.
编码植物来源的“野生型”Rs-AFP2前蛋白的cDNA克隆通过重组DNA方法加以改变从而允许在啤酒糖酵母中表达。该肽在酵母中表达为融合蛋白，在其N-末端带有酵母信息素交配因子α1前体的前原序列。这些序列使生物活性肽以正确的加工形式分泌。然后通过向编码区中导入设计好的或随机的改变，用酵母表达系统表达和特征描述Rs-AFP2蛋白的同工型。随后对这些同工型进行纯化并测试它们的抗真菌活性。
在位置5具有突变(谷氨酰胺至甲硫氨酸)的Rs-AFP2同工型和在位置16具有突变(甘氨酸至甲硫氨酸)的Rs-AFP2同工型具有增强的耐盐抗真菌活性。然而，发现两种另外的同工型拥有特别优越的抗真菌特性。具有位置9突变(甘氨酸至精氨酸)的Rs-AFP2同工型和具有位置39突变(缬氨酸至精氨酸)的Rs-AFP2同工型具有显著增强的抗真菌活性。此增强活性在高盐条件下较为突出。既具有位置9突变(甘氨酸至精氨酸)又具有位置39突变(缬氨酸至精氨酸)的Rs-AFP2同工型可以具有更大的耐盐性。
在盐浓度增加时维持其抗真菌活性的蛋白特别适于用作较高盐条件下的抗真菌剂。例如，此蛋白特别适于在有些生物包括植物中表达。植物组织中最丰富的二价阳离子为Ca2+和Mg2+。胞质溶胶中游离Ca2+的浓度很低(0.1至1μM)(Macklom，1984，植物细胞环境，7：407-413)，而游离Mg2+达到约1mM(Helper和Wyne，1982，植物生理年鉴，36：397-439)。植物液泡中的游离Ca2+约0.06至1mM并且质外体游离Ca2+在0.02与1.3mM之间(Harker和Venis，1991，植物细胞环境，14：525-530)。因此似乎相对较高的离子强度条件出现于所有的细胞区室中。然而，在许多情况，真菌感染导致细胞裂解且细胞内容物与环境的接触。因此难以预言植物细胞中表达的抗真菌蛋白将与入侵菌丝相互作用的确切离子条件。然而，其抗真菌活性对阳离子浓度较少敏感的蛋白特别适用于在植物细胞中的表达。
根据本发明的抗真菌蛋白可依照其已知的氨基酸序列通过用标准肽合成仪的化学合成加以制备，或在合适的生物中(例如，微生物或植物)通过重组DNA的表达加以制备。抗真菌蛋白用于杀菌剂且可用于农业或制药上。
对其一级结构的了解使能够用标准的肽合成仪通过化学合成制备抗真菌蛋白或其部分。
本发明进一步提供了编码根据本发明的抗真菌蛋白的DNA序列。根据已知的氨基酸序列可预言其DNA序列且编码该蛋白的DNA可用标准的核酸合成仪加以制备。或者，编码根据本发明蛋白的DNA可通过对编码显示于图1中蛋白的其中之一的DNA序列进行适当的定点诱变而制备。
编码抗真菌蛋白的DNA序列可与合适的调节序列(启动子、终止子、转运肽等)一起插入到DNA构建体或载体中。该DNA序列可置于同源或异源启动子的控制下，这些启动子可以是组成型或诱导型启动子(例如，通过环境条件、病原体存在、化学物质存在加以刺激)。转运肽对抗真菌蛋白可以是同源或异源性的并且将被选择成确保分泌至所需的细胞器或细胞外空间中。转运肽优选为与感兴趣的抗真菌蛋白自然连接的种类。
这种DNA构建体可克隆或转化入允许编码蛋白或该蛋白的活性部分表达的生物系统中。合适的生物系统包括微生物(例如，和大肠杆菌、假单胞菌的细菌和内生植物如木质棍状杆菌犬齿亚种( Clavibacter  xyli subsp.cynodontis(Cxc))；酵母；病毒；噬菌体；等)，培养细胞(如昆虫细胞、哺乳动物细胞)及植物。在有些情况，表达的蛋白可随后被提取和分离供使用。
根据本发明的抗真菌蛋白用于抵御植物中的真菌疾病。本发明进一步提供了防御真菌的方法，这其中将真菌暴露于根据本发明的抗真菌蛋白中。
为了制药应用，抗真菌蛋白可用作杀菌剂以治疗哺乳动物的感染(例如，抵御如假丝酵母属的酵母)。
根据本发明的抗真菌蛋白也可用作防腐剂<例如，用作食品添加剂>。
至于农业应用，抗真菌蛋白可用于提高植物生活期间或收获后作物保护期间的抗病性或疾病的耐受性。暴露于该蛋白的病原体受到抑制。抗真菌蛋白可根除已存在于植物中的病原体或可保护植护植物免受将来病原体的攻击。蛋白的根除效应是特别优越的。
暴露植物病原体于抗真菌蛋白中可用多种方式完成，例如：
(a)用标准的农业技术<如喷洒>，分离的蛋白可应用于植物部分或土壤或围绕植物根部的其它培养基或种植前的植物种子上。
该蛋白可从植物组织中提取或化学合成或从被遗传修饰以表达该蛋白的微生物中提取，此蛋白可以包括该蛋白与固体或液体稀释剂及任选各种佐剂如表面活性剂混合的组合物形式应用于植物或植物培养基。固体组合物可以是可扩散的粉末、微粒或晶粒的形式。
(b)包括被遗传修饰以表达抗真菌蛋白的微生物的组合物可应用于植物或植物生长的土壤中。
(c)被遗传修饰以表达抗真菌蛋白的内生植物可导入植物组织中(例如，通过种子处理方法)。
内生植物定义为具有与植物宿主形成非病原性内共生关系能力的微生物。内生植物增强的植物保护方法已在作物遗传国际公司的一系列专利申请(例如，国际申请公开号WO 90/13224，欧洲专利申请号EP.125468-B1，国际申请公开号WO 91/10363，国际申请公开号WO 87/03303)中描述过。内生植物可被遗传修饰以制备农业化学物质。国际专利申请公开号WO 94/16076(ZENECA有限公司)描述了被遗传修饰以表达植物来源抗真菌蛋白内生植物的使用。
(d)编码抗真菌蛋白的DNA可异入到植物基因组中从而使该蛋白在植物体内表达(DNA可以是cDNA、基因组DNA或用标准的核酸合成仪制备的DNA)。
植物细胞可根据多种已知的方法(农杆菌属Ti质粒、电穿孔、显微注射、微粒枪等)以重组DNA构建体加以转化。然后转化的细胞在适当的情况下可再生成新的核材料稳定地掺入其基因组中的完整植物。用这种方式既可获得转化的单子叶植物又可获得转化的双子叶植物。这些一级转化子的部分后代将遗传编码真菌蛋白的重组DNA。
本发明进一步提供了具有对真菌病原体增强抗性并含有表达根据本发明抗真菌蛋白重组DNA的植物。这种植物可用作标准植物育种杂交中的母本以产生具有增强真菌抗性的杂种和品系。
重组DNA是优选为异源性的且通过转化导入植物或其祖先中的DNA。重组DNA编码表达用于运输至病原体攻击位点(如叶子)的抗真菌蛋白。该DNA可编码有活性的抗真菌蛋白亚单位。
病原体可以是任何生长在植物上、植物体内或靠近植物的真菌。在本文中，增强的抗性定义为与野生型植物相比对真菌病原体具有增强的耐受性。抗性可以从对病原体效应耐受性的微小增加(其中的病原体被部分抑制)到完全抗性从而植物不受病原体存在的影响(其中的病原体被严重抑制或杀死)。对特定病原体抗性水平的增加或具有对更广谱的病原体抗性均可构成抗性的增强。植物转化或随后的杂交后筛选表现出增强抗性的转基因植物(或从此衍生的植物)。
抗真菌蛋白在转基因植物或其后代中表达部位中，真菌于植物中病原体的攻击位点暴露于蛋白。特别地，通过使用适当的基因调节序列，该蛋白可在其最有效的时间和地点在体内产生。例如，该蛋白可在一般不大量表达但抗病性重要的某些植物部分内(如叶子内)产生。
可制备的遗传修饰的实施包括大田作物、谷物、水果及蔬菜如：canola、向日葵、烟草、甜菜、棉花、大豆、玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、番茄、芒果、桃子、苹果、梨、草莓、橡胶、甜瓜、土豆、胡萝卜、莴苣、卷心菜、洋葱。
本发明现将只通过实施例，参照下面的附图加以描述，其中：
图1显示Rs-AFPs的氨基酸序列及相关蛋白。
图2显示编码Rs-AFP1 cDNA的核苷酸序列。
图3图示表达载体pMFprepro/RsAFP2和pMFpre/RsAFP2的构建。
图4显示植物来源的Rs-AFP2，和一系列酵母表达的Rs-AFP2(yRs-AFP2)同工型的氨基酸序列。
图5显示用诱变引物OWB41和M13反向引物的PCR扩增。
图6为Rs-AFP同工型对 F  culmorum的相对特异性抗真菌活性(1/IC50)图。
图7为在不同浓度CaCl2(图版A)和KCl(图版B)中由Rs-AFP2同工型导致的对大刀镰孢( F  culmorum)的生长抑制的百分数。
                     实施例1
用于酵母分泌Rs-AFP2的表达载体的构建。
按Vilas Alves等在FEBS通讯，1994，348：228-232中所述用下述方法可将啤酒糖酵母用作制备和分泌Rs-AFP2的载体。
质粒pFRG1为含有编码Rs-AFP1全长cDNA克隆的pBluescript IISK衍生物(国际专利申请公开号WO 93/05153)。通过PCR介导的定点诱变(Merino等1992，生物技术，12：508-510)导入两个突变从而使编码的蛋白为更高活性的同工型Rs-AFP2。遵从密码子使用的优先原则在啤酒糖酵母中导入第三个突变(用于成熟Rs-AFP2 Arg31的CGA至CGT)(Benretzen和Hall，1982，生物化学杂志，257：3026)。得到的质粒称为pBluescript/RsAFP2。
载体pMFpre/RsAFP2与pMFprepro/RsAFP2是基于酵母/大肠杆菌的穿梭载体pTG3828(Achstetter等，1992，基因，110：25-31)。pTG3828含有URA3-d选择标记，酵母2μ质粒的复制起点、原核ColEl的复制起点及pBR322的青霉素抗性标记。pTG3828也含有酵母磷酸甘油酸激酶(PGK)终止子，其前面接有具有多个独特限制性位点以利于插入表达区段(block)的多接头。
pMFpre/RsAFP2与pMFprepro/RsAFP2中的表达区段源自M13噬菌体衍生物M13TG5879(Reichhart等，1992，无脊椎动物繁殖与发育，21：15-24)，其中含有酵母MFα1基因的启动子，具有工程NheI位点的MFα1前序列(presequence)的编码区、及具有工程HindIII位点的MFα1原序列(pro-sequence)的编码区。用有义引物OWB63：5′TATCA GTCGACGCATGCTATTGATAAGATTTAAAGG(下划线为SalI位点，黑体为SphI位点)，在MFα1启动子5′末端紧邻SphI位点处引入了新的SalI位点，和M13反向引物作为反义引物通过PCR扩增M13TG5879的表达盒。将得到的PCR产物以SalI-BamHI消化并亚克隆入pBluescriptIISK中以得到pVD4。
质粒pBluescript/RsAFP2用作两轮独立PCR反应中扩增编码成熟Rs-AFP2序列的模板。在第一轮PCR反应中将有义引物OWB61：5′AAT AAGCTTGGACAAGAGACAGAAGTTGTGCCCAAAGG(下划线为HindIII位点)消化从而在成熟Rs-AFP2编码区的上游添加16个额外的核苷酸(编MFα1原序列的最后5个氨基酸)。HindIII位点允许在阅读框中克隆到pVD4的MFα1原序列区域HindIII位点Reichhart JM等，1991，无脊椎动物生殖与发育21：15-24)。反义引物OWB64：5′AA GGATCCCTATTAACAAGGAAAGTAGC(下划线为BamHI位点)导入了第二个终止密码子并在紧临Rs-AFP2编码区终止密码子下游导入了BamHI位点。在第二轮PCR反应中，相同的反义引物与有义引物OWB62：5′AAT GCTAGCTCAGAAGTTGTGCCAAAGG(下划线为NheI位点)结合使用，后者在成熟Rs-AFP2编码区的上游添加7个额外的核苷酸(编码MFα1前序列的最后2个氨基酸)，包括NheI位点(用于在阅读框中克隆入pVD4 MFα1前序列区域的NheI位点)。通过在第一轮或第二轮PCR扩增反应中获得的相应于成熟Rs-AFP2结构域的片段分别用HindIII-BamHI和NheI-BamHI消化，并分别导入pVD4的相应位点以得到载体pVD5和pVD6。将得到载体以SalI-BamHI消化以分离表达区段，然后将其亚克隆入SalI-BglII消化的pTG3828以分别得到载体pMFpre-RsAFP2及pMFprepro/RsAFP2。
图3图示了表达载体pMFprero/RsAFP2及pMFpre/RsAFP2的构建。该方法中的不同步骤为(1)用引物对成熟RsAFP2编码区进行PCR扩增以添加HindIII位点和部分的MFα1 pro区(5′位点)及BamHI位点(3′位点)；(2)用引物对成熟RsAFR2编码区进行PCR扩增以导入NheI和部分MFα1pro区域(5′位点)及BamHI(3′位点)；(3)将PCR产物亚克隆到HindIII-BamHI消化的pVD4；(4)将PCR产物亚克隆入NheI-BamHI消化的pVD4；(5)以SalI/BamHI消化得到的质粒并将插入子亚克隆aSalI-BglII消化的pTG3828。(图3中的简写：pre，RsAFP1cDNA的信号序列区域；preα，MFα1基因的信号序列区域；proα，MFα1基因的原肽区域；pMFα1，MFα1基因的启动子区域；tPGK，酵母磷酸甘油酸激酶基因的终止子区域)。
通过Elble所述的醋酸锂方法(1992，生物技术，13：18)将质粒pMFpre-RsAFP2、pMFprepro/RsAFP2及pTG3828转化入酵母(啤酒糖酵母)菌株c13-ABYS86中(基因型：αpra1-1，prb1-1，prc1-1，cps1-3，ura3-5，leu2-3，112，his-)。于缺乏尿嘧啶的基本选择SD培养基(Sherman，1991，酶学方法，194：3-21)上进行转化子的筛选。按Ward所述(1990，核酸研究，18：5319)通过PCR确证酵母菌落中质粒的存在。
                      实施例2
酵母表达的Rs-AFP2的纯化与分析
将以pTG3828、pMFprepro/RsAFP2或pMFpre/RsAFP2转化的酵母细胞培养于选择SD培养基上直至获得饱和的培养物。为了分析酵母细胞分泌蛋白的抗真菌活性，过滤(无菌0.22μm滤膜)酵母培养物上清并以无菌水进行系列稀释。将稀释样品(20μl)在微量滴定板小孔中孵育，其中具有80μl含有104个孢子/ml大刀镰孢( Fusarium  culmorum)的半强度土豆葡萄糖培养基(Difco)((half strength petato dextrose broth)(Difco))。
按BroeKaert等所述(1990，FEMS微生物学通讯，69：55-60)通过显微分光光度计监测真菌的生长。通过旋转沉降1ml饱和酵母培养物、于200μl水中悬浮细胞、在0.2g玻璃珠(425-600μm)存在下施转细胞而制备酵母细胞匀浆液，并通过离心(1min，10000xg)澄清匀浆液。仅在以pMFprepro/RsAFP2转化的酵母细胞的培养基中可检测到抗真菌活性，其中含有约2μg//ml的Rs-AFP2等价物。这些细胞匀浆液的活性、以及培养基和以pMFpre/RsAFP2(转化的酵母细胞匀浆液或以pTG3828转化酵母细胞匀浆液的活性均在检测极限以下(约0.2μg/ml Rs-AFP2的等价物)。因此，pMFprepro/RsAFP2似乎在酵母中介导Rs-AFP2的显著表达。
将100ml以pMFprepro/RsAFP2转化的酵母饱和培养液上清(培养于补充以0.5％w/v酪蛋白氨基酸的基本SD选择培养基)离心(4000rpm，10min)。且过滤(0.45μm)以去除酵母细胞及废物。向上清中加入Tris-HCl(pH9)至50mM的终浓度。将样品以2ml/min的流速上样至阴离子交换层析柱(Q-Sepharose Fast Flow，20ml柱床体积，发码西亚，在线连接(on-line connected)于一次性反相C8硅柱(Bond Elut)500mg固相，Varian，Harbor City，美国)。抗真菌活性没有保留于Q-Sepharose基质组结合于C8硅基质上。将C8硅柱以6ml 10％乙腈(v/v)的0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)溶液冲洗并随后以4ml30％乙腈(v/v的0.1％(v/v)TFA溶液洗脱。将后者的洗脱液于旋转真空浓缩器中干燥，重新溶解于0.5ml 15％(v/v)的含有0.1％(v/v)TFA的乙腈中，并装柱于连接到以含有0.1％(v/v)TFA的15％乙腈预平衡的Waters 600HPLC工作站(station)的反相C2/C18硅柱中(Pep-S，5μm小珠，0.4×25cm，发码西亚)。装柱后，以相同的缓冲液冲洗柱直到吸收达到背景水平。然后以15分钟线性梯度的15％至50％含有0.1％TFA乙腈以1ml/min流速洗脱柱，通过在线测量280nm处的吸收监测洗脱液中的蛋白。人工收集峰值级分，于旋转真空浓缩器中干燥以去除溶剂，并重新溶解于200μl的蒸馏水中。于液体生长抑制分析中测试20μl级分：将20μl样品孵育于微量滴定板小孔中，其中具有80μl含104个孢子/ml大刀镰孢的半强度土豆葡萄糖培养基(Difco)；按Broekart等所述(1990，FEMS微生物学通讯，69：55-60)通过显微分光光度计监测真菌的生长。
仅主峰(峰A，洗脱时间14.7分钟)与较小的峰(峰B，洗脱时间15.2分钟)与抗真菌活性共洗脱。峰B的洗脱时间与植物来源的Rs-AFP2的洗脱时间(15.2分钟)一致。
通过自动Edman降解RPC-纯化的峰值A而获得的氨基末端氨基酸序列揭示出51个氨基酸的序列，所有的氨基酸均与Rs-AFP2序列一致。该序列包括N-末端谷氨酰胺，已知其在植物来源的Rs-AFP2中通过环化而被封闭(blocked)(Terras等，1992，生物化学杂志，267：15301-15309)。在氨基酸序列分析中无任何杂质信号表明峰A部分是基本均一的。没能记录到RPC纯化的峰B材料的序列信号，可能是由于N-末端的封闭。为了切下可能的封闭谷氨酰胺残基，以焦谷氨酸(pyroglutamate)氨肽酶处理该蛋白部分，但在此情况也没有测到氨基酸序列，而相同的处理却成功地去封闭(deblocked)了植物来源的Rs-AFP2。由于峰B物质的不确定特征及其相对于峰A物质的较低的丰度，故峰B物质没有进一步分析。
RPC-纯化的峰A物质的特异性抗真菌活性及植物来源的Rs-AFP2的特异性抗真菌活性通过测量由该蛋白样品的系列稀释液所导致的对大刀镰孢的百分生长抑制加以测定。两种蛋白制品源自剂量反应曲线的IC50值(50％生长抑制所需的浓度)约3μg/ml。此外，由RPC-纯化的峰A物质所致的抑制类型与由植物来源的Rs-AFP2所致的抑制类型是一致的，表现为真菌菌丝特征性的形态弯曲，具体是在尖端处诱导出多重分枝。
这些结果表明以pMFprepro/Rs-AFP2转化的酵母细胞产生与植物来源Rs-AFP2具有相同生物学活性的蛋白。MFα1前原序列(preprosequence)的存在似乎对酵母中Rs-AFP2的表达是至关重要的。
                      实施例3
含有氨基酸突变的Rs-AFP2同工型的制备
为了制备具有单个氨基酸替代或缺失的Rs-AFP2同工型，通过PCR-定向诱变在编码成熟Rs-AFP2结构域的DNA编码区导入突变。
图4显示植物来源的野生型蛋白(Rs-AFP2)、酵母表达的Rs-AFP2(yRs-AFP2)、两色蜀黍( Sorghum  bicolor)α-淀粉酶抑制剂2(SIα2)和具有单个氨基酸替代或缺失的四个系列酵母表达Rs-AFP2同工型的氨基酸序列。Z代表焦谷氨酸残基。与Rs-AFP2中相应的残基一致的氨基酸用点表示而相对于Rs-AFP2序列的氨基酸缺失由破折号表示。
系列A中的yRs-AFP2同工型(图4)包括Rs-AFP2中一定范围的突变，其中的部分代表出现于SIα2中相应氨基酸的替代(Bloch和Richardson，1991，FEBS通讯，279：101-104)。SIα2是部分同源于Rs-AFP2但当按实施例2中所述分析时没有表现出抗真菌活性(与Rs-AFP2相反)的蛋白。系列B含有脯氨酸缺失。在系列C中，为了获得更为碱性的Rs-AFP2同工型，以碱性残基(精氨酸)替代特定的氨基酸。
按如下所述制备用于制备yRs-AFP/Q5M的载体、即制备在位置5具有一个氨基酸替代(谷胺酰胺至甲硫氨酸)的Rs-AFP2同工型的载体。载体pVD5(见实施例1)用作PCR扩增的模板，该扩增使用诱变引物WOB41和M13反向引物(5′AGGAAACAGCTATGACCATG)。图5说明了用诱变引物OWB41和M13反向引物的PCR扩增。将得到的PCR产物以 Hond III和 Bam HI消化并亚克隆入pVD4相应的位点中(见实施例1)。将得到载体以 SalI和 BamHI消化并亚克隆入 SalI- Bgl II消化的酵母转化载体pTG3828中(见实施例1)。
用于Rs-AFP2同工型而不是yRs-AFP2/Q5M制备的载体按如下构建。载体pVD5用作通过Merino等2步PCR方法(1992，生物技术，12：508-510)导入突变的模板，PCR诱变引物根据标准的分子生物学技术设计。例如，对于系列A和B同工型，第一步PCR反应用诱变引物(OWB42，OWB43，OWB44，OWB45，OWB77，OWB47，OWB48，OWB49或OWB50：见图5)和引物OWB35(5′GGAATAGCCGATGGAGATCT AGGAAAACAGCTATGACCATG，相应于M13反向引物的核苷酸被下划线)进行。得到的PCR产物用作第二轮PCR反应中的巨引物(megaprimer)并且5个扩增循环后加入引物OWB61(见实施例1)和OWB36(GGAATACCCGATCGAGATCTAGGA，相应于OWB35的头24个核苷酸)。按上述将第二轮PCR反应产物亚克隆入pVD4且随后亚克隆入pTG3828。所有亚克隆PCR产物的核苷酸序列通过核苷酸测序加以确证。将获得的pTG3828衍生物转化入酵母中且由转化的酵母菌株产生的RsAFP2同工型按实施例2中所述通过反相层析(RPC)加以纯化。所有的Rs-AFP2同工型与植物来源的野生型Rs-AFP2具有相同的电泳迁移率。
用G9R构建体或V39R构建体代替pVD5作为起始的PCR模板可在酵母中容易地制备既具有位置9突变(甘氨酸至精氨酸)又具有位置39突变(缬氨酸)的Rs-AFP2同工型。适当的诱变引物用于第二轮氨基酸改变。
                    实施例4
Rs-AFP2同工型的抗真菌活性
为了分析单个氨基酸替代或缺失对Rs-AFP2抗真菌活性的影响，测试酵母表达RPC纯化的Rs-AFP2同工型(见图4)的特异性抗真菌活性。RPC-纯化的Rs-AFP2同工型首先通过SDS-PAGE加以分析且制品的纯度估计为至少50％。
对于每种同工型，进行两次独立的纯化并且用大刀镰孢作为测试真菌于下面两种不同的培养基中对抗真菌活性检测两次：即称为SMF-的低离子强度培养基(Terras等，1992，生物化学杂志，267：15301-15309)和补充以1mM CaCl2和50mM KCl称为SMF+的相同培养基。测试培养基中盐的存在，特别是二价阳离子的存在降低了Rs-AFP2的比活性。纯化的种子及酵母表达的野生型Rs-AFP2用作分析中的对照。
初步测试结果列于表1中，其中显示了酵母表达的野生型Rs-AFP2(yRs-AFP2)和突变的yRs-AFP2同工型抗大刀镰孢的相对抗真菌比活性。相对比活性表示为突变体的比活性除以yRs-AFP2的比活性再乘以100。比活性表示为在该蛋白存在下孵育48小时后测得的对大刀镰孢IC50值的倒数。在培养基SMF-和SMF+中测定比活性。
                          表1
蛋白             培养基中相对比活性(％)
                 SMF-             SMF+
yRs-AFP2         100              100
SERIESA
yRs-AFP2/Q5M     100              100
yRs-AFP2/T10G    30               ＜16
yRs-AFP2/G16M    151              114
yRs-AFP2/A31W    15               ＜5
yRs-AFP2/Y38G    30               ＜4
yRs-AFP2/F40M    30               23
yRs-AFP2/K44Q    100              114
yRs-AFP2/Y48I    38               114
SERIES B
yRs-AFP2/P7-     8                17
yRs-AFP2/P41-    4                ＜10
SERIES C
yRs-AFP2/P7R     33               84
yRs-AFP2/G9R     116              285
yRs-AFP2/S12R    67               31
yRs-AFP2/I26R    76               82
yRs-AFP2/L28R    39               -
yRs-AFP2/N37R    100              80
yRs-AFP2/V39R    74               114
yRs-AFP2/A42R    44               26
yRs-AFP2/I46R    22               -
yRs-AFP2/F49R    18               22
可见某些突变导致抗真菌活性明显的降低而某些蛋白(显然Q5M和V39R)维持它们的抗真菌活性。然而，两个突变导致了抗真菌活性的增加。具有G16M突变的同工型在低盐(SMF-)中表现出增加的活性，尽管活性与高盐(SMF+)中没有如此显著性差异。在高盐(SMF+)中，突变的G9R活性高出yRs-AFP2约三倍，尽管在低盐(SMF-)中活性没有显著性差异。
表2显示了进一步比较测试Rs-AFP2同工型的结果，其中的实验进行三遍。在低盐(SMF-)和高盐(SMF+)培养基中培养72小时后检测IC50值。偏差以根据三次实验的平均值标准误(sem)表示。在SMF-中，培养基中没有加盐，大多数衍生物没有表现出抗真菌活性的降低或较小的降低，但在SMF+中，培养基中加入了盐，几种Rs-AFP2同工型的抗真菌活性有显著的下降。在SMF-(低盐培养基)中对抗真菌活性显然不具什么作用的替代包括G9R、V39R、Q5M及G16M。然而，在SMF+(高盐培养基中)这四种同工型(特别是G39R和V39R)表现出增加的抗真菌活性。
                              表2
       PROTEIN                SMF-             SMF+
                   IC50      sem      IC50   sem
yRs-AFP2           2.7        0.6      8.5     2.7
yRs-AFP2/Q5M       4.1        0.2      5.4     1.2
yRs-AFP2/T10G      11.0       4.2      ＞100
yRs-AFP2/W11S      16.0       5.7      ＞100
yRs-AFP2/G16M      2.2        0.3      5.0     0.9
yRs-AFP2/A31W      30.0       5.0      ＞100
yRs-AFP2/H33A      32.0       8.7      ＞100
yRs-AFP2/Y38G      42.0       17.0     ＞200
yRs-AFP2/F40M      16.0       6.7      54.0    13.0
yRs-AFP2/P41-      100.0      15.0     ＞200
yRs-AFP2/K44Q      3.6        0.4      36.0    9
yRs-AFP2/Y48I      9.3        1.0      11.0    2.0
yRs-AFP2/P7R       6.8        2.4      8.8     1.0
yRs-AFP2/G9R       3.0        0.5      3.3     0.6
yRs-AFP2/S12R      3.5        1.0      20.0    6.0
yRs-AFP2/I26R      7.2        0.8      9.6     3.7
yRs-AFP2/L28R      6.4        1.4      ＞100
yRs-AFP2/N37R      2.8        0.3      7.0     1.8
yRs-AFP2/V39R      4.0     0.2    3.2     0.3
yRs-AFP2/A42R      4.2     2.5    18.0    5∶2
yRs-AFP2/I46R      12.0    2.4    ＞40
yRs-AP2/F49R       22.0    4.8    23.0    3.0
图6为在培养基SMF+中测定的Rs-AFP同工型对大刀镰孢的相对抗真菌比活性图。Rs-AFP2的特异性抗真菌活性(1/IC50)设定为100。没有标明标准差的柱代表最大值；实际值可甚至更低。G9R和V39R同工型特别有活性，Q5M和G16M同工型也表现出增强的活性。
                     实施例5
Rs-AFP2/G9R及Rs-AFP2/V39R同工型：抗真菌活性的进一步测试
将同工型Rs-AFP2/G9R和Rs-AFP2/V39R进行进一步测试，因为与其它同工型比较，它们在SMF+中的抗真菌活性要比野生型Rs-AFP2约高出2倍。于具有逐渐增加Ca2+或K+浓度的SMF中检测它们的抗真菌活性并与植物来源的野生型Rs-AP2(分离自种子)及酵母纯化的Rs-AFP2的抗真菌活性进行比较。图7为在具有变化的CaCl2(图版A)和KCl(图版B)浓度由SMF所组成的培养基中由10μg/ml酵母纯化的Rs-AFP2(空心圆圈)、纯化种子的Rs-AFP2(实心圆圈)、Rs-AFP2/G9R(正方形)及Rs-AFP2/V39R(三角形)所导致的对大刀镰孢的百分生长抑制图。
如图7中所示，培养基中阳离子存在所致yRs-AFP2/G9R和yRs-AFP2/V39R抗真菌活性的降低要小于野生型Rs-AFP2活性的降低。在10μg/ml浓度时，G9R和V39R在5mM CaCl2存在时导致对大刀镰孢生长的完全抑制而在相同的条件下野生型Rs-AFP2基本上是无活性的。在10μg/ml时，只有当CaCl2浓度等于或低于1.25mM时野生型Rs-AFP2才有完全的抗大刀镰孢活性。同样地，野生型Rs-AFP2的活性在100mMKCl存在下显著地降低，而Rs-AFP2同工型G9R和V39R仍然完全抑制真菌的生长。
因此，G9R和V39R Rs-AFP2同工型在低离子强度培养基中没有显示出增加的活性，但与野生型Rs-AFP2相比它们的活性对阳离子存在更具有抗性。由于相对较高的离子强度条件出现于所有的细胞内小室中，故这种显示降低阳离子拮抗作用的Rs-AFP2同工型可用于植物转化中以获得抗病作物。既具有位置9突变(甘氨酸至精氨酸)又具有位置39突变(缬氨酸至精氨酸)的Rs-AFP2同工型yRs-AFP2/G9R/V39R与Rs-AFP2相比带有2个正的静电荷并预期较单个同工型G9R和V39R的平均值(even)显示出更高的具有增加耐盐性的抗真菌活性。
于不同离子强度：SMF-、加入1mM CaCl2和50mM KCl的SMF、和加入5mM CaCl2和50mM KCl的SMF三种培养基中根据一套7种不同植物病原性真菌也对G9R和V39R Rs-AFP2同工型的抗真菌活性进行了分析。测试的真菌为：甘蓝黑斑病链格孢( Alternaria  brassicicola)，豌豆壳二孢( Ascochyta  pisi)，灰色葡萄孢( Botrytis  cinerea)，大刀镰孢( Fusarium  culmorum)，嗜血球状丛赤壳菌( Nectria  haematococca)，甜菜茎点霉( Phoma  betae)和大丽花轮枝孢( Verticilillium  dahliae)。结果显示于表3中。除了大丽花轮枝孢和大刀镰孢的IC50值于培养后96小时测定外，所有的IC50值在培养后72小时记录。
表3中的数据显示Rs-AFP2同工型的相对强度可能依赖于测试有机体。G9R和V39R同工型抗甘蓝黑斑病链格孢、豌豆壳二孢和灰色葡萄孢的活性与Rs-AFP2相近，而Rs-AFP2似乎较甜菜茎点霉更具有活性。然而，对于三种真菌(大刀镰孢，嗜血球状丛赤壳菌和大丽花轮枝孢)同工型Rs-AFP2/G9R和Rs-AFP2/V39R较Rs-AFP2本身具有更高的活性，特别是在添加盐的SMF培养基中。例如，在加入1mM CaCl2和50mMKCl的SMF培养基中，Rs-AFP2/G9R较Rs-AF2具有约三倍更高的抗这三种真菌的活性而Rs-AFP2/V39R较Rs-AFP2具有约两倍更高的抗大刀镰孢活性和5倍更高的抗嗜血球状丛赤壳菌和大丽花轮枝孢活性。对于Rs-AFP2/V39R和Rs-AFP2/G9R较Rs-AFP2具有更高活性的这三种真菌属于相同的真菌科，即丛赤壳菌科(Nectriaceae)。
                                    表3
真菌        Rs-AFP2 SMF    V39R    1C50 VALUES(μG/ml)      SMF+5mM CaCl2/50mM Kcl
                    G9R            SMF+1mM CaCl2/50mM Kcl
                                   Rs-AFP2    G9R    V39R    Rs-AFP2    G9R     V39F
甘蓝黑斑病  3.2     2.6    2.5     ＞50       ＞50   50      ＞100      ＞100   ＞100
链格孢
豌豆壳二孢  1.9     1.6    2.0     ＞50       ＞50   ＞50    ＞100      ＞100   ＞100
灰色葡萄孢  1.8     1.9    1.6     ＞50       ＞50   ＞50    ＞100      ＞100   ＞100
大刀镰孢    2.1     2.2    2.2     4.6        1.5    2.3     22.0       7.2     7.0
嗜血球状丛  2.0     2.0    2.1     48.0       16.0   9.0     ＞100      100     62.0
赤壳菌
甜菜茎点霉  0.9     2.0    1.4     14.0       2.50   40.0    27.0       ＞100   70.0
大丽花轮枝孢1.0     0.5    0.4     11.0       4.0    2.3     50.0       17.0    6.0

Claims (14)

1.一种抗真菌蛋白，其具有与图1中所显示的Rs-AFP2的序列有至少80％一致性的氨基酸序列，并含有至少一个选自下组的突变：位置9的碱性残基、位置39的碱性残基、位置5的疏水残基及位置16的疏水残基。
2.权利要求1的抗真菌蛋白，其含有至少一个选自下组的突变：位置9的精氨酸残基、位置39的精氨酸残基、位置5的甲硫氨酸残基及位置16的甲硫氨酸残基。
3.权利要求2的抗真菌蛋白，其中所述的蛋白具有位置9的精氨酸突变和位置39的精氨酸突变。
4.编码权利要求1的抗真菌蛋白的DNA序列。
5.编码权利要求2或3的抗真菌蛋白的DNA序列。
6.含有权利要求4或5的DNA序列的载体。
7.含有权利要求6的载体的微生物。
8.一种制备含有权利要求6的载体的昆虫细胞或哺乳动物细胞的方法，所述方法包括用权利要求6的载体转化昆虫细胞或哺乳动物细胞。
9.一种生产对真菌病原体具有提高的抗性的植物的方法，所述方法包括：
a)用权利要求6的载体转化植物细胞；
b)将转化的细胞再生为对真菌病原体具有提高的抗性的完整植物。
10.一种抗真菌组合物，该组合物包含权利要求1的蛋白。
11.一种抗真菌组合物，该组合物包含权利要求2或3的蛋白。
12.一种对抗植物中的真菌或细菌的方法，该方法包括将所述真菌或细菌暴露于权利要求1的蛋白。
13.一种对抗植物中的真菌或细菌的方法，该方法包括将所述真菌或细菌暴露于权利要求2或3的蛋白。
14.一种对抗植物中的真菌或细菌的方法，该方法包括将所述真菌或细菌暴露于权利要求10或11的组合物。
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