CN104946549A - 利用酵母细胞制备登革病毒样颗粒及其在疫苗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了利用酵母细胞制备登革病毒样颗粒及其在疫苗的应用。其中，该酵母细胞表达第一蛋白质和第二蛋白质，其中，所述第一蛋白质具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；以及所述第二蛋白质具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明的酵母细胞能够有效表达仅含登革病毒的膜蛋白前体（prM）和壳蛋白（E）两个病毒结构蛋白的登革病毒样颗粒，且获得的登革病毒样颗粒只具备免疫原性，不具备感染原性，能够有效用于制备登革病毒疫苗。

Description

利用酵母细胞制备登革病毒样颗粒及其在疫苗中的应用

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体地，涉及利用酵母细胞制备登革病毒样颗粒及其在疫苗中的应用，更具体地，涉及酵母细胞、制备登革病毒样颗粒的方法、登革病毒样颗粒及疫苗。

背景技术

登革热是由登革病毒（Dengue virus,DEN）引起的急性传染病，以传播迅速，发病率高为主要特征，临床上表现为登革热（dengue fever,DF）和登革出血热/登革休克综合症（denguehemorrhagic fever/dengue shock syndrome,DHF/DSS），登革出血热/登革休克综合症(DHF/DSS)以高热、严重出血、休克和高病死率为主要临床表现。登革热广泛流行于全球热带及亚热带，包括亚洲、大洋州、美洲及非洲的100多个国家和地区，以东南亚和西太平洋地区的流行最为严重。近年来，由于全球气候变暖和国际人口大量流动等原因，目前，登革热已成为世界上分布最广、发病最多的虫媒病毒病。

登革病毒疫苗的研究已有70多年的历史，但迄今尚无有效的疫苗问世。究其原因，主要是与登革病毒的致病机制有关，特别是与登革出血热/登革休克综合症(DHF/DSS)的发病机制与抗体介导的免疫增强作用有关，即初次感染后产生的亚中和浓度的抗体或非中和抗体在二次感染时不仅没有免疫保护作用，反而会增强病毒的感染，引起严重的临床过程。因此认为，研发针对登革病毒四个血清型的多价疫苗，同时预防不同血清型登革病毒的感染，可能是研发登革病毒疫苗唯一有效的途径。人们进行着各种尝试，仅重组技术就有利用大肠杆菌、毕赤酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等各种系统，虽然也有获得病毒样颗粒的成功记录，例如，1997年新加坡国立大学研究小组曾报道用单细胞的毕赤酵母菌表达登革病毒样颗粒的研究，他们采用Pichia酵母系统表达登革热2型的病毒样颗粒，但需要甲醇诱导，无法取得大规模生产大量登革热2型的病毒样颗粒。中国也在做这方面的研究，但也未见到真正稳定高效的生产出理想的疫苗。

因而，制备登革病毒样颗粒的方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种无需甲醇诱导，可准确表达病毒结构蛋白（prM、E）、可工业化生产的制备登革病毒样颗粒的手段。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

登革病毒的核酸（结构示意图见图1）是单链的RNA，具有单一的可读框架，可翻译产生核蛋白（C）、膜蛋白前体（prM）、壳蛋白（E）等3种病毒的结构蛋白，和7种病毒的非结构蛋白（NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b，NS5）。其中登革病毒的颗粒是由C、prM、E所组成，而构成病毒颗粒的外壳则是由prM和E所组成。其中，E蛋白是引起病毒中和抗体的抗原，而中和抗体是阻断病毒感染的体液免疫的主要抗体。因此，E蛋白是登革病毒疫苗的主要和不可缺少的组分；prM是病毒的膜蛋白前体，它在E蛋白的成熟表达和构象方面发挥至关重要的作用；而病毒核蛋白C主要分布在病毒颗粒内部，一般认为，C与病毒的免疫以及与病毒prM、E的构象和功能无直接关系。酵母是真核细胞的表达系统。酵母细胞已经成功地表达和生产了包括乙肝疫苗在内的大量不同的生物活性物质。在登革病毒疫苗研究领域，1997年新加坡国立大学曾用单细胞的毕赤酵母表达了登革病毒2型所有的结构蛋白C、prM和E，并构建了病毒样颗粒。但是，由于毕赤酵母的生长需要甲醇诱导，增大了工业化生产中无菌操作的难度，使得这个系统在生产上有很多限制。

鉴于上述发现，根据登革病毒和酵母细胞的特点，发明人利用面包/啤酒酵母强有力的启动子、自我装配病毒颗粒的特殊功能和一定的表达后的修饰功能，表达和制备仅包含prM和E两种病毒结构蛋白的病毒样颗粒疫苗的独特设计。并构建了登革II型病毒样颗粒的重组质粒，成功地试表达了II型的登革病毒样颗粒。这是国际上首次使用酵母细胞表达仅有prM和E两个病毒结构基因的登革病毒样颗粒。

具体而言，在本发明的一个方面，本发明提供了一种酵母细胞。根据本发明的实施例，所述酵母细胞表达第一蛋白质和第二蛋白，其中，所述第一蛋白质具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；以及所述第二蛋白质具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。发明人发现，本发明的酵母细胞能够有效表达仅含登革病毒的膜蛋白前体（prM）和壳蛋白（E）两个病毒结构蛋白的登革病毒样颗粒，且获得的登革病毒样颗粒只具备免疫原性，不具备感染原性，能够有效用于制备登革病毒疫苗。

根据本发明的实施例，所述酵母细胞中包含第一核酸分子和第二核酸分子，其中，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；以及所述第二核酸分子具有如SEQID NO:4所示核苷酸序列的核酸分子。由此，本发明的酵母细胞能够准确表达登革病毒的膜蛋白前体（prM）和壳蛋白（E）。

根据本发明的实施例，所述酵母细胞为C13BYS86细胞。由此，不需要甲醇诱导，有利于大规模培养，进而，通过培养本发明的酵母细胞，能够大规模制备登革病毒样颗粒。

根据本发明的实施例，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子分别独立地以表达载体形式存在于所述酵母细胞中。

根据本发明的实施例，所述表达载体为PTG3828质粒。

根据本发明的实施例，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子共同存在于PTG3828质粒上。

在本发明的另一方面，本发明提供了一种制备登革病毒样颗粒的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：培养前面所述的酵母细胞，以便获得登革病毒样颗粒。发明人发现，利用本发明的该方法能够快速有效地制备仅含登革病毒的膜蛋白前体（prM）和壳蛋白（E）两个病毒结构蛋白的登革病毒样颗粒，且获得的登革病毒样颗粒只具备免疫原性，不具备感染原性，能够有效用于制备登革病毒疫苗，另外，该方法无需甲醇诱导、可工业化生产、有利于亚单位疫苗的产业化和纯化。

在本发明的再一方面，本发明提供了一种登革病毒样颗粒。根据本发明的实施例，所述登革病毒样颗粒是通过前面所述的方法而制备的。由此，本发明的登革病毒样颗粒仅含登革病毒的膜蛋白前体（prM）和壳蛋白（E）两个病毒结构蛋白，只具备免疫原性，不具备感染原性，能够有效用于制备登革病毒疫苗。

在本发明的再一方面，本发明提供了一种疫苗。根据本发明的实施例，该疫苗包含前面所述的登革病毒样颗粒。由此，本发明的疫苗能够有效预防登革热。

需要说明的是，本发明的酵母细胞、登革病毒样颗粒及其制备方法、以及疫苗是发明人成功的将两个独立的大片段病毒基因（D2prM和D2E基因）克隆进入面包/啤酒酵母系统，并在该酵母工程菌系统实现了病毒粒子自动装配和稳定表达。本发明的优势在于：利用最低成本的原料、合成最接近真实病毒形态和结构的登革病毒样颗粒、而且不需甲醇诱导即可大规模生产。而目前还未见利用面包/啤酒酵母成功表达登革病毒样颗粒的报道。

附图说明

图1显示了根据本发明的一个实施例，登革病毒基因的结构示意图；

图2显示了根据本发明的一个实施例，重组克隆载体PVD-D2prME的构建流程图；

图3显示了根据本发明的一个实施例，表达载体PTG-D2prME的构建流程图；

图4显示了根据本发明的一个实施例，5万倍放大的转染酵母细胞电子显微镜照片；以及

图5显示了根据本发明的一个实施例，8万倍放大的转染酵母细胞电子显微镜照片。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行，例如，可参照“分子克隆实验指南”（第三版）。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

在本发明的一个方面，本发明提供了一种酵母细胞。根据本发明的实施例，所述酵母细胞表达第一蛋白质和第二蛋白质，其中，所述第一蛋白质具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；以及所述第二蛋白质具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。发明人发现，本发明的酵母细胞能够有效表达仅含登革病毒的膜蛋白前体（prM）和壳蛋白（E）两个病毒结构蛋白的登革病毒样颗粒，且获得的登革病毒样颗粒只具备免疫原性，不具备感染原性，能够有效用于制备登革病毒疫苗。

根据本发明的实施例，所述酵母细胞中包含第一核酸分子和第二核酸分子，其中，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；以及所述第二核酸分子具有如SEQID NO:4所示核苷酸序列的核酸分子。由此，本发明的酵母细胞能够准确的表达登革病毒的膜蛋白前体（prM）和壳蛋白（E），通过培养本发明的酵母细胞，能够有效获得登革病毒样颗粒。

根据本发明的实施例，所述酵母细胞为C13BYS86细胞。由此，不需要甲醇诱导即可大规模培养，进而，通过培养本发明的酵母细胞，能够大规模制备登革病毒样颗粒。

根据本发明的实施例，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子分别独立地以表达载体形式存在于所述酵母细胞中。

根据本发明的实施例，所述表达载体为PTG3828质粒。

根据本发明的实施例，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子共同存在于PTG3828质粒上。

在本发明的另一方面，本发明提供了一种制备登革病毒样颗粒的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：培养前面所述的酵母细胞，以便获得登革病毒样颗粒。发明人发现，利用本发明的该方法能够快速有效地制备仅含登革病毒的膜蛋白前体（prM）和壳蛋白（E）两个病毒结构蛋白的登革病毒样颗粒，且获得的登革病毒样颗粒只具备免疫原性，不具备感染原性，能够有效用于制备登革病毒疫苗，另外，该方法无需甲醇诱导、可工业化生产、有利于亚单位疫苗的产业化和纯化。

在本发明的再一方面，本发明提供了一种登革病毒样颗粒。根据本发明的实施例，所述登革病毒样颗粒是通过前面所述的方法而制备的。由此，本发明的登革病毒样颗粒仅含登革病毒的膜蛋白前体（prM）和壳蛋白（E）两个病毒结构蛋白，只具备免疫原性，不具备感染原性，能够有效用于制备登革病毒疫苗。

在本发明的再一方面，本发明提供了一种疫苗。根据本发明的实施例，该疫苗包含前面所述的登革病毒样颗粒。由此，本发明的疫苗能够有效预防登革热。

实施例1：基因片段合成和克隆

根据酵母表达系统最嗜好的基因编码设计了登革II型膜蛋白前体（prM、498bp）和壳蛋白（E、1497bp）的酵母优化基因，并利用DNA化学合成仪合成prM和E结构蛋白的酵母优化基因，在合成上述基因时，在基因的N’末端和C’末端分别人工加入Hind III（AAGCTT）和BamH I（GGATCC）酶切位点作为目的基因的克隆位点，并在基因的C’末端上游人工插入两个人工突变位点TAA TAG，作为蛋白翻译的终止位点。其中，prM和E结构蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示：

FHLTTRNGEPHMIVSRQEKGKSLLFKTEDGVNMCTLMAMDLGELCEDTITYKCPFLRQNEPEDIDCWCNSTSTWVTYGTCTTTGEHRREKRSVALVPHVGMGLETRTETWMSSEGAWKHAQRIETWILRHPGFTIMAAILAYTIGTTHFQRALIFILLTAVAPSMT（SEQ ID NO：1）；

MRCIGISNRDFVEGVSGGSWVDIVLEHGSCVTTMAKNKPTLDFELIKTEAKQPATLRKYCIEAKLTNTTTDSRCPTQGEPSLNEEQDKRFVCKHSMVDRGWGNGCGLFGKGGIVTCAMFTCKKNMKGKVVQPENLEYTIVITPHSGEEHAVGNDTGKHGKEIKITPQSSITEAELTGYGTVTMECSPRTGLDFNEMVLLQMENKAWLVHRQWFLDLPLPWLPGADTQGSNWIQKETLVTFKNPHAKKQDVVVLGSQEGAMHTALTGATEIQMSSGNLLFTGHLKCRLRMDKLQLKGMSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRHVLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKGSSIGQMIETTMRGAKRMAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIYGAAFSGVSWTMKILIGVIITWIGMNSRSTSLSVSLVLVGVVTLYLGVMVQADSGC（SEQ ID NO：2）；

prM和E结构蛋白的酵母优化基因分别具有如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列：

TTT CAT TTG ACT ACT AGA AAT GGT GAA CCA CAT ATG ATT GTT TCT AGA CAAGAA AAA GGT AAA TCT TTG TTG TTT AAA ACT GAA GAT GGT GTT AAT ATG TGTACT TTG ATG GCT ATG GAT TTG GGT GAA TTG TGT GAA GAT ACT ATT ACT TAT AAATGT CCA TTT TTG AGA CAA AAT GAA CCA GAA GAT ATT GAT TGT TGG TGT AATTCT ACT TCT ACT TGG GTT ACT TAT GGT ACT TGT ACT ACT ACT GGT GAA CAT AGAAGA GAA AAA AGA TCT GTT GCT TTG GTT CCA CAT GTT GGT ATG GGT TTG GAAACT AGA ACT GAA ACT TGG ATG TCT TCT GAA GGT GCT TGG AAA CAT GCT CAAAGA ATT GAA ACT TGG ATT TTG AGA CAT CCA GGT TTT ACT ATT ATG GCT GCT ATTTTG GCT TAT ACT ATT GGT ACT ACT CAT TTT CAA AGA GCT TTG ATT TTT ATT TTGTTG ACT GCT GTT GCT CCA TCT ATG ACT  （SEQ ID NO：3）；

ATG AGA TGT ATT GGT ATT TCT AAT AGA GAT TTT GTT GAA GGT GTT TCT GGTGGT TCT TGG GTT GAT ATT GTT TTG GAA CAT GGT TCT TGT GTT ACT ACT ATG GCTAAA AAT AAA CCA ACT TTG GAT TTT GAA TTG ATT AAA ACT GAA GCT AAA CAACCA GCT ACT TTG AGA AAA TAT TGT ATT GAA GCT AAA TTG ACT AAT ACT ACTACT GAT TCT AGA TGT CCA ACT CAA GGT GAA CCA TCT TTG AAT GAA GAA CAAGAT AAA AGA TTT GTT TGT AAA CAT TCT ATG GTT GAT AGA GGT TGG GGT AATGGT TGT GGT TTG TTT GGT AAA GGT GGT ATT GTT ACT TGT GCT ATG TTT ACT TGTAAA AAA AAT ATG AAA GGT AAA GTT GTT CAA CCA GAA AAT TTG GAA TAT ACTATT GTT ATT ACT CCA CAT TCT GGT GAA GAA CAT GCT GTT GGT AAT GAT ACTGGT AAA CAT GGT AAA GAA ATT AAA ATT ACT CCA CAA TCT TCT ATT ACT GAAGCT GAA TTG ACT GGT TAT GGT ACT GTT ACT ATG GAA TGT TCT CCA AGA ACTGGT TTG GAT TTT AAT GAA ATG GTT TTG TTG CAA ATG GAA AAT AAA GCT TGGTTG GTT CAT AGA CAA TGG TTT TTG GAT TTG CCA TTG CCA TGG TTG CCA GGTGCT GAT ACT CAA GGT TCT AAT TGG ATT CAA AAA GAA ACT TTG GTT ACT TTTAAA AAT CCA CAT GCT AAA AAA CAA GAT GTT GTT GTT TTG GGT TCT CAA GAAGGT GCT ATG CAT ACT GCT TTG ACT GGT GCT ACT GAA ATT CAA ATG TCT TCTGGT AAT TTG TTG TTT ACT GGT CAT TTG AAA TGT AGA TTG AGA ATG GAT AAATTG CAA TTG AAA GGT ATG TCT TAT TCT ATG TGT ACT GGT AAA TTT AAA GTT GTTAAA GAA ATT GCT GAA ACT CAA CAT GGT ACT ATT GTT ATT AGA GTT CAA TATGAA GGT GAT GGT TCT CCA TGT AAA ATT CCA TTT GAA ATT ATG GAT TTG GAAAAA AGA CAT GTT TTG GGT AGA TTG ATT ACT GTT AAT CCA ATT GTT ACT GAAAAA GAT TCT CCA GTT AAT ATT GAA GCT GAA CCA CCA TTT GGT GAT TCT TAT ATTATT ATT GGT GTT GAA CCA GGT CAA TTG AAA TTG AAT TGG TTT AAA AAA GGTTCT TCT ATT GGT CAA ATG ATT GAA ACT ACT ATG AGA GGT GCT AAA AGA ATGGCT ATT TTG GGT GAT ACT GCT TGG GAT TTT GGT TCT TTG GGT GGT GTT TTT ACTTCT ATT GGT AAA GCT TTG CAT CAA GTT TTT GGT GCT ATT TAT GGT GCT GCT TTTTCT GGT GTT TCT TGG ACT ATG AAA ATT TTG ATT GGT GTT ATT ATT ACT TGG ATTGGT ATG AAT TCT AGA TCT ACT TCT TTG TCT GTT TCT TTG GTT TTG GTT GGT GTTGTT ACT TTG TAT TTG GGT GTT ATG GTT CAA GCT GAT TCT GGT TGT  （SEQ ID NO：4）。

实施例2：中间载体构建

将实施例1合成的登革病毒膜蛋白前体prM（498bp）酵母优化基因和壳蛋白E（1497bp）酵母优化基因克隆到克隆载体pVD5（即pVD-5）的克隆位点，具体如下：分别将步骤1合成的登革病毒膜蛋白前体prM（498bp）和壳蛋白E（1497bp）的酵母优化基因和克隆载体pVD5进行核酸限制性内切酶（Hind II/BamH I）酶切并线性化后，施行第一次连接反应，将连接产物转染Top10感受态细胞，利用氨苄霉素筛选菌落，并获得重组克隆载体PVD-D2prME。PVD-D2prME的构建流程图见图2。其中，关于酶切、克隆载体pVD5的线性化、目的基因与线性化克隆载体的酶连反应、转染Top10感受态细胞、重组菌落的抗生素抗性筛选和获得重组克隆载体PVD-D2prME等所有操作程序和方法均参照“分子克隆实验指南”（第三版）的相关试验方法。

实施例3：表达载体构建

首先，将实施例2获得的重组克隆载体PVD-D2prME利用核酸限制性内切酶（Sal I和BamH I）分别进行酶切和线性化，释放含有位于登革病毒样颗粒的基因上游的酵母阿尔法配对基因启动子（PMFαI）、登革病毒样颗粒的基因以及位于登革病毒样颗粒基因下游的两个表达终止位点（TAATAG）的核酸片段；同时，利用核酸限制性内切酶（Sal I和Bgl II）线性化处理表达载体PTG3828质粒。然后，将重组克隆载体PVD-D2prME释放的含有酵母阿尔法配对基因启动子（PMFαI）和登革病毒样颗粒的基因、以及位于登革病毒样颗粒基因下游的两个表达终止位点（TAATAG）的核酸片段，克隆到表达质粒PTG3828的Sal I和Bgl II的克隆位点之间，施行第二次连接酶的连接反应；并继而转染Top10感受态细胞，利用氨苄霉素筛选菌落，并获得重组克隆载体PTG3828，形成表达载体PTG-D2prME（其构建流程图见图3）。其中，关于酶切、表达载体PTG3828质粒的线性化、目的基因与线性化表达载体的酶连反应、转染Top10感受态细胞、重组菌落的抗生素抗性筛选和获得表达载体PTG-D2prME等所有操作程序和方法均参照“分子克隆实验指南”（第三版）的相关试验方法。

实施例4：酵母细胞的转染

将实施例3构建的表达载体PTG-D2prME和10mg鱼精DNA，与经LiCl处理制备的C13BYS86感受态细胞（Kunze I.et al.,Biochemica et Biophysica Acta(1999)1410:287-298）充分混匀，于28℃静置培育12小时，使用氨基酸缺陷型选择培养基（SD Medium从BIO101Systems公司购买）平板筛选重组酵母菌落。只有成功转化的C13BYS86细胞才能形成菌落。然后，继续使用氨基酸缺陷性选择培养基对筛选的阳性菌落进行三轮克隆和纯化。具体实验方法可参照分子克隆实验指南”（第三版）。

实施例5：转染酵母细胞发酵培养

将实施例4中获得的成功转化的转染酵母菌种震荡培养48小时，经20%葡萄糖溶液稀释后，以1%-3%的接种量，接种于优质小麦精粉，接种后通过缓慢搅拌，使得培养基氧气的分布均匀和充分，然后于发酵温度为30℃，相对湿度75％，发酵的PH值为4-6条件下，发酵24小时，发酵期间进行3次深层的温和搅拌以增加有氧发酵，发酵培养基中糖含量应控制在6%以下，以确保酵母菌在适宜的渗透压下高效繁殖。

实施例6：电子显微镜观察

利用电子显微镜对实施例5中发酵获得的转染酵母细胞进行观测确定：在转染细胞样本进行负染后，镜下观察可见大量的病毒样颗粒。

5万倍放大的转染酵母细胞电子显微镜照片如图4所示，由图4中可以看出：转染酵母细胞正在以出芽的方式进行有丝分裂，合成的病毒样颗粒被有序地分配在两个新生的酵母细胞中。新合成的登革病毒样颗粒形状与登革病毒的自然形态相同，其中，登革病毒的三维结构是“正二十面体”的自然结构，在一维平面照片上，登革病毒样颗粒形状呈现“正六面体”的形态。并且，登革病毒样颗粒随酵母细胞的分裂、繁殖而分布于新生的细胞中。

8万倍放大的转染酵母细胞电子显微镜照片如图5所示，由图5中可以看出转染酵母细胞浆内合成了大量的“正六面体”的病毒样颗粒，并带有病毒特征性的“晕圈”。进一步显示的病毒样颗粒的“颗粒”特征，还显示了病毒样颗粒在细胞浆和细胞质中的基本分布特征。

实施例7：酶联免疫反应的监测

利用登革II型单克隆抗体分别对转染酵母细胞的培养上清和细胞裂解产物进行ELISA检测证明，具体如下：

用0.1mol/L的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，每孔加100μL浓度为20ug/ml的纯化的重组登革II型病毒prME抗原，37℃孵育1h，再放入4℃冰箱过夜，弃去孔内液体，用PBST洗涤缓冲液洗三遍，每遍3min（以下简称洗涤）；每孔加含1.5%明胶的封闭液200μL，37℃温箱放置1h后，洗涤；每孔加入100μL稀释100倍的登革II型病毒的小鼠免疫血清，37℃温箱放置1h后，洗涤；每孔加入1∶1500HRP-羊抗鼠IgG100μL，37℃温箱放置1h后，洗涤，每孔加新鲜配制的TMB-H₂O₂底物液100μL，室温反应15min；每孔加终止液1mol/L硫酸50μL，15min内用酶标仪于波长450nm处测定OD值。结果表明，登革II型病毒的抗原只存在于转染细胞的裂解液中。

实施例8：免疫原性测定

A.免疫原制备：

将饱和液体培养的转染酵母细胞（30℃，72小时震荡培养）进行1分钟中低强度超声波裂解，10000rpm高速离心除细胞碎片，收集上清。62000rpm、4℃、16小时蔗糖密度梯度离心，分层收集上清液。利用登革病毒II型抗E蛋白单克隆抗体Anti-E87和HRP-羊抗鼠IgG的ELISA双抗体夹心法测试不同分层的收集组分。以ELISA测试中对登革病毒II型抗E蛋白单克隆抗体Anti-E87反应最强烈的抗原组分，确定为登革II型VLP（VLP即病毒样颗粒）样品。汇集VLP并40000rpm、4℃离心4小时后，收集沉淀，用生理盐水稀释成0.08mg/毫升浓度的登革VLP抗原。同时，利用相同程序制备非转染正常C13BYS86细胞裂解物的对照抗原。所有抗原均4℃冰箱保存备用。

B.种毒制备：

选择健康的3日龄以内的乳鼠，脑内直接接种经过细胞被动血凝测试，血凝效价达到1：16至1：32的细胞上清毒。接种后观察7天，收集明显发病（两后肢瘫痪拖地）的濒死期病鼠，直接解剖取脑组织。研磨后离心取上清（即种毒）分装并于-80摄氏度冻存。使用前利用6周龄健康雌鼠测定种毒对BALB/c小鼠的半数致死量。将种毒制备成1000个LD50/ml，既每毫升1000个半数致死量的溶液，于-80摄氏度冻存、备用。

C.BALB/c小鼠免疫：

免疫组别：选择3周龄雌性BALB/c小鼠40只，随机分为4组，每组10只。其中，第一组为生理盐水对照组，第二组为非转染酵母细胞（即非转染C13BYS86细胞）对照抗原，第三组为登革VLP无佐剂免疫组，第四组为登革VLP弗氏完全佐剂免疫组。

免疫程序：用生理盐水或弗氏完全佐剂、分别将非转染酵母细胞对照抗原和登革VLP抗原稀释至0.04mg/ml，于第1天对所有小鼠背部皮下进行多点免疫接种，每只小鼠抗原接种量为100ul；随后在第14天和第21天、以同样接种程序对实验小鼠、分别进行两次免疫加强。每次免疫前采血，末次免疫1周后再采血。

D.登革II型病毒抗体的检测：

采用间接ELISA测定登革II型病毒VLP对BALB/c小鼠的免疫效果应答。结果见表1。其中，每块板同时设包被缓冲液的空白对照孔（-）、正常小鼠血清的阴性对照孔M（-）和登革II型病毒高免血清的阳性对照孔M（+）。每份血清样品同时重复包被2个孔、测定时取平均值。以待测孔的OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍者，即P/N大于或等于2.1，判为阳性。其中，M1-M10为不同免疫分组，由10只BALB/c小鼠组成。

表1.抗登革病毒样颗粒疫苗血清抗体效价

表1数据显示：将缓冲液的空白对照孔（-）和正常小鼠血清的阴性对照孔M(-)的ELISA吸收值比较，吸收值基本无明显差异；但当登革VLP无佐剂组，登革VLP弗氏佐剂组与缓冲液的空白对照孔（-）和正常小鼠血清的阴性对照孔M(-)的ELISA吸收值比较，则差异非常显著，显示登革VLP免疫组的被免疫小鼠、产生了高效价的抗登革病毒E蛋白的抗体和在小鼠产生了有效免疫。

E.BALB/c小鼠攻毒程序：

对免疫小鼠脑内攻毒。方法：用16号注射针头在小鼠右眼上方旋转钻洞，接种0.1毫升1000LD50/ml的种毒，观察7天，记录所有正常、后肢麻癖、死亡的时间及个数，实验结果见表2。

表2.登革VLP对强毒攻击BALB/c小鼠的保护率

表2数据显示：生理盐水组和未转染酵母组的免疫小鼠在登革病毒强毒攻击试验中，全部死亡，未产生保护；而登革VLP无佐剂组和登革VLP弗氏佐剂组的被免疫BALB/c小鼠在登革病毒强毒攻击试验中，则分别获得90%和100%的保护率。证明登革VLP疫苗可有效保护动物免受登革病毒强毒的致死性攻击。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种酵母细胞，其特征在于，所述酵母细胞表达第一蛋白质和第二蛋白质，其中，所述第一蛋白质具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；以及所述第二蛋白质具有如SEQID NO:2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的酵母细胞，其特征在于，所述酵母细胞中包含第一核酸分子和第二核酸分子，其中，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；以及所述第二核酸分子具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的核酸分子。

3.根据权利要求1所述的酵母细胞，其特征在于，所述酵母细胞为面包酵母细胞。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的酵母细胞，其特征在于，所述酵母细胞为C13BYS86细胞。

5.根据权利要求2所述的酵母细胞，其特征在于，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子分别独立地以表达载体形式存在于所述酵母细胞中。

6.根据权利要求5所述的酵母细胞，其特征在于，所述表达载体为PTG3828质粒。

7.根据权利要求6所述的酵母细胞，其特征在于，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子共同存在于PTG3828质粒上。

8.一种制备登革病毒样颗粒的方法，其特征在于，包括：培养权利要求1～7任一项所述的酵母细胞，以便获得登革病毒样颗粒。

9.一种登革病毒样颗粒，其特征在于，所述登革病毒样颗粒是通过权利要求8所述的方法而制备的。

10.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求9所述的登革病毒样颗粒。