CN1671845A - 免疫原序列 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及编码负责产生土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)菌体抗原的酶的核酸及其作为疫苗或者在疫苗生产和诊断中的用途。

Description

免疫原序列
本发明涉及核酸序列、特别是编码产生土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)菌体抗原的酶的基因及其作为疫苗或者在疫苗生产和诊断中的用途。
土拉热弗朗西丝氏菌是一种小的革兰氏阴性球杆菌，它引起人兽互传的兔热病。根据伯捷氏系统细菌学手册，弗朗西丝氏菌属(Francisellas)包括两个种：土拉热弗朗西丝氏菌和新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)。然而，近来一些工作者已建议考虑新凶手弗朗西丝氏菌为土拉热弗朗西丝氏菌的亚种(Hollis DG等，J.Clin.Micro.27：1601-1608)。由于DNA水平的高度相关性，现在也将密切相关的细菌蜃楼耶尔森氏菌(Yersinia philomiragia)考虑为弗朗西丝氏菌属的一个成员。除了新凶手(novicida)外，还有几个被提议的土拉热弗朗西丝氏菌亚种；它们是：土拉热(tularensis)亚种、全北区(holarctica)亚种和中亚细亚(mediasiatica)亚种。以毒力、瓜氨酸酰脲酶活性和从甘油产酸为基础，可以鉴定出土拉热亚种和全北区亚种(Olsufjev NG等，(1959)J.Hyg.Epidemiol.Microbiol.Immunol.3：138-149)。主要在前苏联中亚共和国发现土拉热弗朗西丝氏菌中亚细亚亚种。这个亚种的菌株拥有瓜氨酸酰脲酶活性，并且能发酵甘油，但是毒力小于兔的土拉热弗朗西丝氏菌土拉热亚种菌株。
兔热病是发生在北半球的一种疾病；常常在欧洲、北美、亚洲、北俄罗斯和日本发现一些病例。啮齿动物被认为是所述细菌的主要储存者，蜱是主要的载体之一。
革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)是其外膜的主要成分。所述分子由3个区组成，脂质-A(嵌入外膜中并且具有种间保守结构)和两个多糖即核心寡糖(可以改变种间复杂性)和菌体抗原(是绝对的多态结构)(Kenne L等，(1983)Bacterial Polysaccharides The polysacharides.Academic Press，第287-362页)。认为细菌需要LPS分子以防止血清杀伤(Whitfield C等，(1997)Mol.Micro.23：629-638)和阳离子抗微生物肽(Groisman EA.(1994)Trends.Microbiol.2：444-449)。
从较少毒力的土拉热弗朗西丝氏菌全北区亚种菌株中分离的LPS的结构和免疫原性，已研究到一定程度(Dreisbach VC等，(2000)Infect.Immun 68：1988-1996)。用这种LPS免疫的动物可防止全北区亚种菌株攻击(Fulop MJ等，(1995)Vaccine 13：1220-1225)，但不能防止土拉热亚种菌株攻击(Fulop MJ等，(2001)Vaccine 19：4465-4472)。然而，源自全北区亚种菌株的LPS似乎比其它革兰氏阴性菌的LPS的毒性低，并且其菌体抗原含有稀有糖，这些糖在结构上与那些在铜绿假单胞菌06(Pseudomonas aeruginosa 06)和痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)7型中发现的糖相关。
没有报道从更毒的土拉热亚种菌株中分离出LPS。
当研究其它种的LPS结构时，常常观察到菌株间仅有的结构差异是菌体抗原的组成。因此，为了提供诊断试验的基础并且能重组制备菌体抗原以避免操作致病生物，阐明强毒亚种中LPS分子的菌体抗原部分的结构将是有益的。
然而，菌体抗原表达的遗传基础是复杂的；在大多数细菌中，产生完全菌体抗原所需的基因位于细菌染色体上的聚簇中。因此，鉴定和分离负责菌体抗原的基因并不简单。此外，因为难以用常规方法染色，所以从强毒株中鉴定和分离LPS就更加复杂。
本申请人现在已确定土拉热弗朗西丝氏菌土拉热亚种中菌体抗原产生的遗传基础。此外，他们已确定源自各种土拉热弗朗西丝氏菌菌株的LPS作为疫苗的功效。
根据本发明，提供一种编码系列酶或酶片段的核酸，其中，如果在细胞中一起表达，能产生能在给予所述核酸的动物体内产生免疫应答的免疫原性部分，所述应答是防止土拉热弗朗西丝氏菌感染，所述核酸编码至少一些SEQ ID NO 3-17的酶或其修饰物。
术语“修饰物”是指氨基酸序列，不同于其来源的碱基序列，所述序列中的一个或多个氨基酸被取代为其它的氨基酸。如果氨基酸被具有广义上相似特性的不同氨基酸取代，则氨基酸置换可看作“保守的”。非保守置换是指氨基酸被不同类型的氨基酸取代。广义上讲，几乎所有的非保守置换都可能改变多肽的生物学活性。适当修饰是与碱基序列至少有60％同一性，优选至少75％同一性，更优选至少90％同一性。
在这个实例中，同一性可以例如运用Lipman-Pearson算法，用Ktuple：2，空位罚分：4，空位长度罚分：12，标准PAM评分矩阵(Lipman，D.J.和Pearson，W.R.，Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches，Science，1985，第227卷，1435-1441)进行判断。
具体地讲，本发明包括编码SEQ ID NO 3-17的酶的核酸。
一个优选的核酸的实例包括SEQ ID NO 1或其变异体。特别是所述核酸是SEQ ID NO 1。
关于核酸序列的术语“其变异体”是指任何置换、变异、修饰、取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸或多核苷酸序列，条件是由该多核苷酸编码产生的蛋白质序列表现出与基础序列编码的蛋白质相似的特性。因此，该术语包括等位基因变异体、编码相似蛋白质但仅因为遗传密码简并性不同的简并变异体。它也包括与本发明的多核苷酸序列大致杂交的多核苷酸。优选这样的杂交发生在低严谨条件和高严谨条件，或者发生在低严谨条件和高严谨条件之间。一般情况下，低严谨条件可以定义为3×SSC、在约环境温度至约55℃，高严谨条件可以定义为0.1×SSC、在约65℃。SSC是0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠缓冲液的名称。3×SSC是三倍浓的SSC等等。
通常，变异体与本发明多核苷酸序列共有65％或65％以上的核苷酸，更通常70％，优选75％，甚至更优选80％或85％，以及特别优选是90％、95％、98％或99％或99％以上的同一性。
如本领域所理解的，变异体可包括经修饰的基础序列，以确保在具体生物体中增强和最优化密码子使用，其中所述序列需要在所需的生物体例如原核细胞如大肠杆菌(E.coli)中表达。这可包括修饰具体的核苷酸的内容，例如改变序列中存在的G和C的百分比，以匹配通常在靶生物体中高表达基因中出现的百分比。另外，SEQ ID NO1的具体变异体是合成变异体，工程化移除在通用表达宿主如大肠杆菌高表达基因中很少发现的密码子，同时，避免引入编码菌体抗原基因中很少发现的密码子。例如，在一切可能的情况下，氨基酸精氨酸(arg)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、甘氨酸(gly)和脯氨酸(pro)密码子改变为CGT或CGC(arg)，CTG、CTT或CTC(leu)，ATC或ATT(ile)，GGT或GGC(gly)，和CCG、CCA或CCT(pro)，从而消除稀有密码子。
如果为了测定同一性程度的目的而比较核酸序列，则程序如BESTFIT和GAP(两者均得自Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)软件包)。BESTFIT例如比较两条序列并产生最相似区段的最佳比对。GAP能够使序列沿着它们的全长进行比对并通过适当在任一序列中插入空位形成最佳比对。合适时，本发明上下文中如果讨论核酸序列的同一性，则所述比较是通过序列沿其全长进行序列比对来完成。
SEQ ID NO 1包含一系列编码许多在下文图5中和SEQ ID NO3-17中所示的酶的基因。优选任何SEQ ID NO 1的变异体编码SEQ IDNO 3-17的酶或这些酶的修饰物。
关于氨基酸序列中使用的术语“片段”，是指给定的具有如完全氨基酸序列相同活性的氨基酸序列的任何部分。片段适当包含源自基础序列的至少20个、优选至少50个连续氨基酸。
术语“片段”也用于核酸序列中。SEQ ID NO 1片段可应用于诊断中，并且这些构成本发明的又一方面。对于诊断目的，片段可以相当短，例如5-30个碱基，它可用作引物或探针。在下文中阐明可鉴定用于诊断目的的SEQ ID NO 1的适当片段的具体特征区域。用于治疗的片段通常期望较长，例如长600-17,000个碱基。
已鉴定土拉热弗朗西丝氏菌Schu 24菌株(土拉热亚种)基因组的一个区，该区包括SEQ ID NO 1并且负责表达一组构建多糖所必需的酶。如下文图6中的SEQ ID NO 41所示。这个序列包括许多基因，其中包括一系列编码如下文图5中的SEQ ID NO 3-20所示酶的基因。基因的推定功能通过与已知序列比较适用于这些基因，如表1所示。
                                   表1
 SEQ IDNO   土拉热弗朗西丝氏菌蛋白  基因产物大小(aa)     推定的功能
  234567891011121314151617181920   转座酶WbtAWbtBWbtCWbtDWbtEWbtFWzyWbtGWbtHWbtIWbtJWzxWbtKWbtLWbtM转座酶ManCManB   247578205263363436323409366628360241495286294348126468494     假拟蛋白转座酶糖差向异构酶半乳糖基转移酶糖基转移酶UDP-葡萄糖4-差向异构酶糖转移酶酶LPS生物合成脱氢酶C4-差向异构酶膜蛋白/菌体抗原聚合酶转移酶天冬酰胺合成酶糖氨基转氨酶/Perosamine合成酶甲酰基转移酶菌体抗原翻转酶糖基转移酶葡萄糖-1-磷酸胸苷酸转移酶dTDP-D-葡萄糖4，6-脱水酶dTDP-D-葡萄糖4，6-脱水酶转座酶甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶磷酸甘露糖变位酶
具体地讲，据信如SEQ ID NO 3-17所示的蛋白参与菌体抗原的生物合成。菌体抗原本身既可应用于诊断学中又可用作预防性或治疗性疫苗。
如果本发明的核酸在宿主细胞中一起表达，则它们将产生在动物(包括人)体内产生免疫应答的抗原，所述免疫应答可防止土拉热弗朗西丝氏菌感染。因此，它们可用于生产预防性或治疗性疫苗。
核酸可包括在载体如活病毒疫苗中，例如，腺病毒载体或牛痘，或包括在质粒中形成所谓的“裸DNA”疫苗，或优选包括在细菌载体如减毒沙门氏菌(Salmonella sp.)中。如本领域所理解的，在这种情况下，核酸将处于合适控制元件如启动子、信号序列、增强子等的控制之下。在这种情况下，核酸在给予所述疫苗的患者细胞内表达，或者就细菌载体而论，就在宿主细胞内表达。结果，产生一系列能在原位构建保护性菌体抗原的酶。
所述载体可与疫苗制剂中的药学上可接受的载体适当混合。如本领域已理解的，载体的性质取决于使用的载体类型。具体地讲，如果疫苗包含重组沙门氏菌，则它适合用于适于口服的组合物形式。
或者，所述核酸可包括在用于转化宿主细胞的表达载体中。合适的宿主细胞是原核细胞或真核细胞，但优选原核细胞如大肠杆菌。特别是所用核酸是已在具体的宿主细胞中优化表达的SEQ ID NO 1的合成变异体。然后，可在培养后从这些细胞中回收保护性菌体抗原。
因而，再一方面，提供一种预防性疫苗或治疗性疫苗的制备方法，所述方法包括周本发明的核酸转化宿主细胞，培养所述宿主细胞，然后从中回收产生针对土拉热弗朗西丝氏菌的保护性免疫应答的部分。
在这种方法中所用的表达载体和宿主细胞及其产物一起构成本发明的又一方面。
这类疫苗将适合于药用组合物的形式，如本领域所理解的，其中将所述抗原与药学上可接受的载体混合。
本发明的组合物可以为适合于口服使用、吸入给药(例如作为微细粉剂或液体气雾剂)、通过吹入法给药(例如作为微细粉剂)或胃肠外给药(例如作为静脉内、皮下、肌内或肌内给药的无菌水性或油性溶液剂或作为直肠给药的栓剂)的形式。
本发明的组合物可以通过使用本领域熟知的常规药用赋形剂的常规方法获得。
有关制剂的详情，读者可查阅Comprehensive Medicinal Chemistry第5卷25.2章(Corwin Hansch；编辑部主席)，Pergamon Press 1990。
与一种或多种赋形剂结合产生单一剂型的活性成分的量必定会根据待治疗宿主和具体的给药途径而变化。例如预期人用口服给药的制剂通常含有例如0.5mg至2g与适当的和常规量的赋形剂混合的活性剂，其中赋形剂占全部组合物的比例可不同，以重量计约5％至约98％。剂量单位形式通常含有约1mg至约500mg的活性成分。有关给药途径和给药方案的详情，读者可查阅Comprehensive MedicinalChemistry第5卷25.3章(Corwin Hansch；编辑部主席)，Pergamon Press1990。
本发明部分用于治疗或预防目的的剂量大小将会根据动物或患者的年龄和性别及给药途径，根据熟知的用药原则自然变化。
因而，再一方面，本发明提供土拉热弗朗西丝氏菌的重组菌体抗原，所述重组菌体抗原可从表达SEQ ID NO 3-17的蛋白或其修饰物的宿主细胞获得。
此外，本申请人所实现的菌体抗原序列提供这种可能性，这一序列可构成诊断试验的基础，以确定患者是否感染土拉热弗朗西丝氏菌。在此情况下，可以采集患者的血液样品或唾液样品等样品并且检测SEQ ID NO 1或其变异体的存在与否。
特效的检测方法是本领域熟知的，并且可包括扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)和/或其它使用例如与靶序列、特别是SEQ ID NO 1杂交的标记探针的检测方法。这种引物和探针构成本发明的又一方面。
通过选择独特的引物和探针，也可能区别土拉热弗朗西丝氏菌菌株间的感染。例如，本申请人发现，包含下文中陈述的SEQ ID NO21和SEQ ID NO 22以及SEQ ID NO 35和SEQ ID NO 36的引物将区别土拉热弗朗西丝氏菌土拉热亚种菌株和如下所述土拉热弗朗西丝氏菌全北区亚种。在前一种情况下，因为下游序列的差异而出现这种可能性，而在后一种情况下，因为侧翼转座酶序列的缺失差异而出现这种可能性。因此，使用基于这些区域的引物或探针的分析可用于确定任何具体菌株是土拉热弗朗西丝氏菌土拉热亚种还是另外的菌株。
为了发现土拉热亚种菌株的LPS是否与全北区亚种菌株的LPS具有相似的结构(和性质)，提取土拉热弗朗西丝氏菌Schu S4菌株(土拉热亚种)的LPS。
凝胶电泳后，从土拉热弗朗西丝氏菌Schu S4菌株提取的LPS显示特征性梯度图。然而，所述LPS难以染色并且为了显现菌体抗原的条带需要额外的氧化。这提示土拉热弗朗西丝氏菌Schu S4菌株的菌体抗原中的糖不是与在大多数其它细菌中发现的菌体抗原的糖相同的方式被氧化。
土拉热弗朗西丝氏菌Schu S4菌株的菌体抗原基因簇含有15个基因，其推定的功能以BLAST结果和菌体抗原中含有的糖的结构信息为基础来确定(参见上表1)。所述聚簇中的基因可能负责产生菌体抗原分子以及运送所述分子到细菌细胞外。
有两种主要的菌体抗原合成模式，菌体抗原聚合酶(wzy)依赖的和wzy独立的。在依赖wzy的系统中，认为聚合酶(wzy)、翻转酶(wzx)和链长决定簇(wzz)是细胞壁中使LPS分子聚合和输出的复合体的部分。在wzy独立的系统中，一组不同的蛋白参与LPS分子的转运和聚合。转运蛋白由ATP驱动并且由属于ABC-转运蛋白家族的wzt和wzm两种蛋白组成。
在土拉热弗朗西丝氏菌菌体抗原基因簇中，存在与wzy和wzx有高度同一性的蛋白，提示菌体抗原的转运和聚合是通过依赖wzy的途径。
对推定的菌体抗原翻转酶(Wzx)和聚合酶(Wzy)蛋白的TMHMM分析支持它们基于序列相似性的确定功能。预测的土拉热弗朗西丝氏菌蛋白跨膜螺旋数，Wzx和Wzy分别是14和11，与那些在其它细菌中预测的相似，其中已预测这些细胞质膜蛋白具有约10-12个跨膜螺旋。对于土拉热弗朗西丝氏菌Wzy蛋白，预测2个大周质结构域与弗氏志贺氏菌(Shigella Flexneri)Wzy蛋白的两个大周质结构域是一致的。
没有鉴定出可以编码Wzz同源物的基因，说明在土拉热弗朗西丝氏菌基因组中不存在这样的同源物。
基因wbtA至wbtL紧靠着或重叠提示这些基因作为一个操纵子转录。
下游大约0.5Kb是wbtM，其具有自己的推定启动子。第二个转座酶的下游是manC和manB，同样有它们推定的启动子并且或许不参与菌体抗原的生物合成，因为发现甘露糖既不是土拉热弗朗西丝氏菌菌体抗原结构部分，也不是其合成所需的中间产物。
这两个基因manC和manB可能曾经参与土拉热弗朗西丝氏菌先祖中菌体抗原的生物合成。邻接菌体抗原生物合成基因簇wbtA至wbtM的转座酶的存在，提示已同步获得这个或许置换祖先的多糖基因簇的聚簇。
菌体抗原基因簇似乎存在于所有筛选过的土拉热亚种和B菌株中。然而，在土拉热亚种和B菌株含有转座酶的区域的聚簇间至少有一处差异。用部分缺失的转座酶进行BLAST分析，已揭示在土拉热弗朗西丝氏菌Schu S4基因组中所述聚簇可能超过50个拷贝。所述土拉热弗朗西丝氏菌基因组中的插入序列源于肺炎链球菌(S.pneumonia)并且在基因组内随机拷贝是可能的。邻接插入序列的可读框在土拉热弗朗西丝氏菌基因组内没有显著同源性，提示这些基因对于这个含插入序列的基因座是不重要的。
在土拉热亚种菌株中，这种插入已变成缺失而仅留下转座酶片段和下游序列。土拉热亚种和全北区亚种聚簇间的总体相似性似乎说明所述插入发生在土拉热弗朗西丝氏菌中所述亚种分裂前。土拉热亚种转座酶的部分缺失可达到稳定该DNA区的结果，因为已发现这个酶是发生插入事件所必需的。
影响所述聚簇在土拉热亚种或者B菌株中的表达似乎是不可能的。其可能是在土拉热亚种菌株中，转座酶的部分基因由于基因组降低大小已丢失。然而，如果从不同的亚种扩增DNA，则跨越该区产生的PCR产物大小的总差异可用于诊断方法中。
本申请人已发现与在土拉热弗朗西丝氏菌Schu S4菌株中发现的相似的菌体抗原基因簇存在于土拉热弗朗西丝氏菌的其它菌株中。这包括全北区亚种菌株。因此，利用菌体抗原产生保护性免疫应答的疫苗有希望提供保护，以防止一些土拉热弗朗西丝氏菌强毒株的感染。
本申请人已证明源自土拉热弗朗西丝氏菌土拉热亚种菌株的LPS是保护性的。具体地讲，它似乎防止除土拉热弗朗西丝氏菌土拉热亚种以外的菌株的攻击，特别是防止土拉热弗朗西丝氏菌全北区亚种的攻击。考虑到上述报告的结果，提示土拉热弗朗西丝氏菌全北区亚种的LPS不能防止其它土拉热弗朗西丝氏菌的感染，所以这一发现是意想不到的。这样，如上所述的重组疫苗将特别有用。
因而，再一方面，本发明提供可从土拉热弗朗西丝氏菌土拉热亚种得到的LPS，将其用作防止土拉热弗朗西丝氏菌感染的疫苗。含有土拉热弗朗西丝氏菌土拉热亚种LPS的疫苗组合物也是新颖的并构成本发明的又一方面。这些将包含如上所述的药学上可接受的载体。
现在将通过实施例并参考附图，对本发明进行具体的描述：
图1：从大肠杆菌K325菌株(1.25μg，泳道1)和土拉热弗朗西丝氏菌Schu S4菌株(50μg，泳道2)分离的LPS的SDS-PAGE分析。
图2：土拉热弗朗西丝氏菌Schu S4菌株中菌体抗原基因簇的遗传组构。菌体抗原簇的G+C含量示于上图。
图3：土拉热弗朗西丝氏菌Schu S4菌株菌体抗原亚单位的示意结构和菌体抗原基因簇基因推定功能的确定。显示一个具有糖残基和所需糖苷键的菌体单位。
图4表示基因组区，即其编码图5所示的所有蛋白质的土拉热弗朗西丝氏菌基因组的核酸序列。
图5表示由SEQ ID NO 1编码的蛋白质的氨基酸序列以及许多侧翼基因序列。
图6表示编码菌体抗原产生必需的酶的核酸序列(SEQ ID NO1)。
实施例1
方法
细菌菌株和生长条件
用于本项研究的细菌菌株如表2所示，在37℃，BCGA琼脂上培养48小时。
            表2
种属和菌株   亚种
土拉热弗朗西丝氏菌Schu4土拉热弗朗西丝氏菌199土拉热弗朗西丝氏菌230土拉热弗朗西丝氏菌041 土拉热土拉热土拉热土拉热
土拉热弗朗西丝氏菌LVS土拉热弗朗西丝氏菌200土拉热弗朗西丝氏菌025土拉热弗朗西丝氏菌075土拉热弗朗西丝氏菌HN63土拉热弗朗西丝氏菌147   全北区全北区全北区全北区全北区中亚细亚
LPS纯化
用热苯酚和水抽提方法(Westphal O等，(1965).Methods inCarbohydrate Chemistry 5：83-91)，从土拉热弗朗西丝氏菌Schu S4菌株中纯化LPS。
凝胶电泳和银染色
根据Laemmli的方法(Laemmli UK，(1970).Nature 227：680-685)，使用12.5％分离胶和4.5％积层胶，进行甘氨酸凝胶电泳。每个样品10μl在Mini-protean II板系统(Biorad)中以100mV电泳大约2小时。根据Chart的方法(Chart H.(1994)LPS：Isolation andCharacterisation.载于：Raton B，Arbor A(主编)Methods in PracticalLaboratory Bacteriology.CRC Press，London，Tokyo，第11-20页)，对凝胶进行银染色。然而，氧化步骤需增加到10分钟。
核苷酸序列分析
编码菌体抗原生物合成聚簇的序列是从参与其它细菌的菌体抗原生物合成的已知蛋白质序列(得自GenBank)中提取和鉴定的，所述序列用于探测土拉热弗朗西丝氏菌Schu S4的部分基因组序列(PriorRG等，(2001)Journal of applied microbiology 91：614-620)，在http：//artedi.ebc.uu.se/Projects/Francisella/，用TBLASTN(Altschul SF.等，(1997)Nucleic acids research 25：3389-3402)得到。提取含有推定菌体抗原基因簇的毗连群并随后用注释工具Artemis(http：//www.sanger.ac.uk/Software/Artemis)进行分析。使得BLASTN、BLASTX和BLASTP的搜寻、GC含量和其它的在序列和预测蛋白质上进行的分析得以显现。
用TMHMM(Sonnhammer ELL等，(1998)，载于：Glasgow J，Littlejohn T等(主编)The sixth international conference on intelligentsystems for molecular biology.AAAI Press，Menlo Park，CA，第175-182页)分析由推定的菌体抗原翻转酶基因(wzx)和菌体抗原聚合酶基因(wzy)编码的蛋白质序列的跨膜螺旋。
推定的菌体抗原基因簇的PCR分析
按Karlsson等，2000(Micro.Comp.Genom.5：25-39)所描述的，用苯酚抽提制备土拉热弗朗西丝氏菌菌株DNA，如表1所示。用DNAstar程序PrimerSelect设计10对重叠的PCR引物，以扩增全部的推定菌体抗原基因簇的约2kb区段。虽然所有引物都在49℃成功应用，但设计的引物退火温度范围为42-59℃。
这些引物对的结构概述在表3中。
                               表3
    引物组   正向/反向            结构   SEQ ID NO
    1     正向反向 ATAATGAAATCAATCCACGAGCCAGCCAGTCAGTCCCACAG     2122
    2     正向反向 TGTCTTAGATATGGGGCAACCACAAATATCAAATCCTAACACATC     2324
    3     正向反向 TAGAAGCAGCTGCGATAGGTAGACTTAAATAAAAACTGAGGAAACA     2526
    4     正向反向 ATGGTATTTTAATCAAGTGTCTAGTATGCCCCAGAGT     2728
    5     正向反向 TGGTGCGACAATCAAGTTAAGAAGTTCCTCCTCAGTC     2930
    6     正向 AGAAATTAAGAGCAAAAGGAAAGT     31
    反向 ATCTCAAAGTCAAAATCAGTCTCT     32
    7     正向反向 TACGATATTGTCCTCTCCGATTAGTAGTTGCGACATATTGACCTG     3334
    8     正向反向 AGGCAGGTCAATATGTCGCAACTTTTCCGCAACACTTCAGCAACTT     3536
    9     正向反向 GCTATGGCCACTATCACGAGAGGTATACTTGCTTGCCCACTGCTTAG     3738
    10     正向反向 ACCGTAGTGAGCATTGGATTGTACTAGGGCCTCTGACCGTTCTC     3940
每一对引物与每一个DNA模板的PCR扩增在下列混合物中进行：1×PCR缓冲液(包括1.5mM MgCl2)，0.2mM脱氧核苷三磷酸(dNTP)，2.5mM正向引物，2.5mM反向引物，2.0μl模板DNA，0.5UTaq聚合酶和到20μl最终体积的过滤的无菌水。反应混合物在90℃保温1分钟，然后在90℃1分钟，49℃1分钟，72℃2分25秒循环共30次，最终在72℃保温10分钟。PCR产物在0.5％琼脂糖凝胶上，用溴化乙锭染色显现。PCR缓冲液、dNTP和聚合酶购自Roche。PCR引物由MWG-Biotech合成。
PCR产物克隆
将用引物对8，从Schu S4、HN63和LVS DNA扩增的PCR产物克隆到pGEM-T easy(Promega)中，供测序分析用。将连接的DNA转化到大肠杆菌JM109化学感受态细胞(Promega)中，推定的克隆既用菌落PCR又用限制性内切酶消化进行筛选。包括连接、转化、菌落PCR、限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳在内的所有DNA操作均按照Sambrook等，(1987)Molecular cloning：A laboratory manual.Cold Spring Harbor，New York)描述的方法进行。
根据生产商的使用说明书，用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)完成从琼脂糖凝胶中纯化PCR产物。
这三个构建体使用通用引物，用双脱氧核苷酸链终止法(Sanger F等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：5463-5467)，在Oswel上测序。比较每个序列并且用ARTEMIS软件包的BLAST(Altschul SF等，(1990)Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.215：403-410)功能在本地保留的GenBank数据库中搜寻同源性，以鉴定DNA差异区的功能。
菌体抗原分子的质谱法分析
结果
LPS纯化
采用热苯酚-水抽提方法，从2.2g冻干土拉热弗朗西丝氏菌SchuS4菌株中纯化LPS。这可获得7mg LPS，得率是0.3％。LPS在SDS-PAGE和银染色后难以显现。将氧化步骤从5分钟增加到10分钟，以显现梯状带(图1)。
土拉热弗朗西丝氏菌菌体抗原生物合成的基因簇
发现土拉热弗朗西丝氏菌菌体抗原生物合成基因簇的长度是17kb并且含有15个基因，推定为侧翼接有两个转座酶(图2)的基因，参与菌体抗原生物合成。可能的启动子位点鉴定为刚好在wbtA和wbtM基因的上游。manC和manB基因位于第二转座酶的下游，而可能的启动子正好在manC的上游。
图2也显示使用500个碱基窗口大小的聚簇的G+C含量图。所述基因组该区的全部G+C含量在31.27％，略低于该基因组大约33％的平均G+C含量。该图显示所述聚簇的中心部分，从wzy至wbtK，通常具甚至更低的G+C含量。
在相反链上manC的下游，坐落有转录终止因子rho和硫氧还蛋白基因。在大肠杆菌中，发现这两个基因都邻接肠细菌共同抗原-多糖生物合成基因簇的一端。
土拉热弗朗西丝氏菌的菌体抗原重复单位和参与菌体抗原生物合成基因的推定作用如图3所示，基于它们与其它LPS和糖生物合成基因的同源性，特别是表达相似菌体抗原重复结构的铜绿假单胞菌06血清型(Knirel YA等，(1985)Eur.J.Biochem.150：541-550)，确定了该基因产物的推定作用。
推测2-乙酰氨基-2，6-双脱氧-D-葡萄糖(QuiNAc)的生物合成涉及脱水酶WbtA和显示与尿苷二磷酸葡糖4-差向异构酶同源的WbtC。WbtA和WbtC共享与铜绿假单胞菌06菌株的WbpM和WbpV的同源性，认为两者都参与QuiNAc生物合成并且是06菌体抗原合成的要素。推测WbtE、WbtF和WbtH参与2-乙酰氨基-2-脱氧-D-半乳糖醛胺(GalNAcAN)的生物合成。WbtF显示与尿苷二磷酸葡糖4-差向异构酶有同源性，包括WbpP和VipB，而WbtE显示与WbpO和VipA有同源性，UDP-GalNAc脱氢酶分别参与铜绿假单胞菌和肠道沙门氏菌伤寒变种(Salmonella enterica var typhi)中2-乙酰氨基-2-脱氧-D-半乳糖醛酸(GalNAcA)的形成。WbtH同谷氨酰胺转酰胺酶产生有意义的排列，包括铜绿假单胞菌06血清型的WbpS，推测可能参与GalNAcAN酰胺基形成。第四种糖即4N-甲酰-奎诺糖胺(Qui4NFm)的生物合成最有可能涉及WbtI、WbtJ、WbtL和WbtM。序列同源性提示WbtM作为dTDP-D-葡萄糖4，6-脱水酶起作用时，WbtL可能与WbtM一起参与活化糖dTDP-D-葡萄糖的形成。预测WbtI参与Qui4NFm氨化，因为其显示与perosamine合成酶RfbE有同源性。最终，WbtJ可能负责添加显示与甲酰转移酶有显著同源性的N-甲酰基部分。
需要特殊的糖基转移酶形成菌体抗原重复的寡糖单位。四种糖基转移酶在土拉热弗朗西丝氏菌中每一种菌体抗原单位的合成中是必不可少的。基于同源性，推测WbtB介导将QuiNAc添加到磷酸十一萜醇(Und-P)上，以起始菌体抗原生物合成。WbtD和WbtG很可能是GalNAcAN转移酶，可能参与将两个连续的GalNAcAN残基添加到菌体抗原单位上。WbtD与铜绿假单胞菌06菌株的WbpU共享同源性，推测将2-甲酰胺基-2-脱氧-D-半乳糖醛胺(GalNFmAN)转移到QuiNAc上(Belanger M等，(1999).Microbiology 145：3505-3521)。WbtG与铜绿假单胞菌的WbpT同源，被认为参与将GalNAcA添加到GalNFmAN。WbtK可能是第四个糖基转移酶，其添加4，6-双脱氧-4-甲酰胺基-D-葡萄糖(QuiNA4Fm)，以完成四糖O单位。
Wzx和Wzy
一旦装配，菌体抗原重复单位就通过转运蛋白/翻转酶Wzx转运至内膜的周质面。然后，Wzy担当菌体抗原重复单位聚合酶。如果用TMHMM分析，土拉热弗朗西丝氏菌Wzx蛋白具有预测的14个跨膜螺旋，其两端位于膜的细胞质一侧。土拉热弗朗西丝氏菌Wzy蛋白具有预测的11个跨膜螺旋，预测的氨基末端在膜的细胞质一侧，羧基末端在间质一侧。另外，预测Wzy蛋白具有氨基酸142-178和氨基酸268-327的两个大的周质结构域。
与菌体抗原链长决定簇(wzz)同源的基因在当前的土拉热弗朗西丝氏菌Schu S4序列数据集中尚未鉴定出来。
菌体抗原基因簇的PCR分析
8个来自每个模板DNA的PCR产物(引物组2、3、4、5、6、7、9和10)，如果通过琼脂糖凝胶电泳观察，显示一样的大小。由于缺乏适当的该聚簇上游引发位点，覆盖基因簇起始位点的引物对1必须设计可扩增一个4.8Kb区，因为在所述土拉热弗朗西丝氏菌Schu S4基因组中存在发现多次的插入元件。该引物对1对于土拉热弗朗西丝氏菌Schu S4，产生对应大小的产物，但是如果用于全北区亚种LVS菌株，则没有产物产生。因此，该引物对可具体应用于需要区别土拉热弗朗西丝氏菌土拉热亚种和土拉热弗朗西丝氏菌全北区亚种的诊断中。在含有前者的DNA样品存在时，运用引物对1的PCR将产生在第二种情况下不存在的产物。
使用引物对8的PCR揭示土拉热亚种菌株和全北区亚种和中亚细亚亚种间的大小差异。如果与全北区亚种菌株(包括LVS)和中亚细亚亚种比较，则土拉热亚种菌株显示303个核苷酸缺失。对土拉热亚种Schu S4菌株的该区的克隆和序列分析，全北区亚种HN63和LVS菌株显示发生在Schu S4中推定转座酶起始部位的缺失与肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的ORF1 IS630-spn 1转座酶相似。
因此，引物对8也可具体用于区别土拉热弗朗西丝氏菌菌株。含DNA的样品在用这些引物进行PCR反应后，以大小为基础分离产物，例如在凝胶上分离，应可揭示它们间可区别的差异。
实施例2
保护效果
LPS纯化
利用上述实施例1中提及的热苯酚和水抽提方法，从土拉热弗朗西丝氏菌Schu S4菌株中或LVS菌株中纯化LPS。
LPS免疫和保护研究
通过用所得纯的LPS，经腹膜内途径免疫多组雌性BALB/c小鼠(每组6只小鼠)，测定土拉热弗朗西丝氏菌LVS菌株或Schu S4菌株LPS保护BALB/c小鼠免遭土拉热弗朗西丝氏菌感染的能力。在每次给药情况下，给予小鼠含50μg LPS的磷酸缓冲盐溶液(PBS)。小鼠接受三次免疫，每次间隔7天。
在最后一次免疫后21天，用土拉热弗朗西丝氏菌LVS(1×105cFU)经腹膜内攻击小鼠。所有的对照动物在攻击后全都死亡。已免疫从所述LVS菌株分离的LPS的小鼠获得保护免于死亡。已用SchuS4或LVS菌株的LPS免疫的小鼠显示并延长死亡时间。在攻击剂量10cfu时，用Schu S4 LPS免疫的动物比未免疫对照动物平均存活时间长64小时(有99％置信度)。

Claims (28)

1.一种编码一系列酶或酶片段的核酸，所述核酸当在细胞中一起表达时，能够在给予所述核酸的动物体内产生免疫原性部分，所述免疫原性部分能够产生免疫应答，所述应答可防止土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)感染，所述核酸至少编码SEQ ID NO 3-17的某些酶或其修饰物。
2.权利要求1的核酸，其中所述核酸编码SEQ ID NO 3-17的酶。
3.权利要求1或权利要求2的核酸，所述核酸包括SEQ ID NO 1或其变异体。
4.权利要求3的核酸，其中所述核酸是SEQ ID NO1。
5.前述权利要求中任一项的核酸，其中已优化用于细菌细胞中表达的密码子。
6.权利要求5的核酸，其中所述细菌细胞是大肠杆菌(E.coli)。
7.一种包括SEQ ID NO 1片段的核酸，其中所述核酸可用于检测样品中存在的SEQ ID NO 1。
8.权利要求7的核酸，其中所述核酸包括扩增引物。
9.权利要求8的核酸，其中所述核酸选自SEQ ID NO 21、SEQ IDNO 22、SEQ ID NO 35或SEQ ID NO 36。
10.一种活疫苗载体，所述活疫苗载体包含权利要求1-5中任一项的核酸。
11.权利要求10的活疫苗载体，所述活疫苗载体包括细菌载体。
12.权利要求11的活疫苗载体，其中所述细菌是沙门氏菌(Salmonella sp.)。
13.一种疫苗，所述疫苗包含权利要求10-12中任一项的活疫苗载体以及药学上可接受的载体。
14.一种制备预防性疫苗或治疗性疫苗的方法，所述方法包括用权利要求1-6中任一项的核酸转化宿主细胞，培养所述宿主细胞，然后从所述培养物中回收保护性免疫原性部分。
15.一种表达载体，所述载体包含权利要求1-6中任一项的核酸。
16.一种用权利要求15的载体转化的宿主细胞。
17.土拉热弗朗西丝氏菌的重组菌体抗原，所述重组菌体抗原可通过权利要求14的方法获得。
18.一种疫苗，所述疫苗包含权利要求17的重组菌体抗原以及药学上可接受的载体。
19.一种诊断土拉热弗朗西丝氏菌感染的方法，所述方法包括检测取自怀疑受感染患者的样品中的权利要求7的核酸序列。
20.一种区别土拉热弗朗西丝氏菌菌株的方法，所述方法包括选择对SEQ ID NO 1具有特异性而对除土拉热弗朗西丝氏菌土拉热亚种以外的亚种中的相似序列没有特异性的引物或探针，或者当用于分析其它种属时，产生可区别的产物，并利用所述引物或探针进行分析。
21.权利要求20的方法，其中使用聚合酶链式反应(PCR)和一对引物进行所述分析。
22.权利要求21的方法，其中所述引物对SEQ ID NO 1的起始区具有特异性。
23.权利要求22的方法，其中所述引物是SEQ ID NO 21和SEQID NO 22。
24.权利要求23的方法，其中所述引物对SEQ ID NO 1的末端转座酶编码区具有特异性。
25.权利要求24的方法，其中所述引物是SEQ ID NO 35和SEQID NO 36。
26.从土拉热弗朗西丝氏菌土拉热亚种获得的脂多糖(LPS)，所述脂多糖用作抵抗土拉热弗朗西丝氏菌感染的疫苗。
27.权利要求26的LPS，其中所述土拉热弗朗西丝氏菌土拉热亚种菌株是Schu4菌株。
28.一种药用组合物，所述药用组合物包含权利要求26或权利要求27的LPS以及药学上可接受的载体。
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RU (1) RU2004137800A (zh)
WO (1) WO2003102191A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109988227A (zh) * 2018-12-25 2019-07-09 南阳师范学院 线虫肠道共生菌bc7的功能蛋白及其应用

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040121311A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in livestock
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
GB0212666D0 (en) 2002-05-31 2002-07-10 Secr Defence Immunogenic sequences
US7172868B2 (en) * 2002-08-01 2007-02-06 The Regents Of The University Of California Nucleotide sequences specific to Francisella tularensis and methods for the detection of Francisella tularensis
JP2006516193A (ja) 2002-12-06 2006-06-29 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ヒトおよび動物における病原体の迅速な同定方法
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US7964343B2 (en) 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US20120122103A1 (en) 2003-09-11 2012-05-17 Rangarajan Sampath Compositions for use in identification of bacteria
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8163895B2 (en) 2003-12-05 2012-04-24 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of orthopoxviruses
US7666592B2 (en) 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
EP2458619B1 (en) 2004-05-24 2017-08-02 Ibis Biosciences, Inc. Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
EP1869180B1 (en) 2005-03-03 2013-02-20 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of polyoma viruses
WO2007014045A2 (en) 2005-07-21 2007-02-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants
GB2443591B (en) * 2005-09-07 2010-04-28 Secr Defence Adjuvanted vaccine
US8088582B2 (en) 2006-04-06 2012-01-03 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for the use in identification of fungi
EP2040744B1 (en) 2006-07-25 2016-03-09 The Secretary of State for Defence Live vaccine strains of francisella
WO2008143627A2 (en) 2006-09-14 2008-11-27 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
US20080124355A1 (en) 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment
WO2008104002A2 (en) 2007-02-23 2008-08-28 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic dna analysis
US9598724B2 (en) 2007-06-01 2017-03-21 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
US20110177515A1 (en) * 2008-05-30 2011-07-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of francisella
US8550694B2 (en) 2008-09-16 2013-10-08 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods
US8148163B2 (en) 2008-09-16 2012-04-03 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
EP2344893B1 (en) 2008-09-16 2014-10-15 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and methods
WO2010093943A1 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Ibis Biosciences, Inc. Ionization probe assemblies
US9719083B2 (en) 2009-03-08 2017-08-01 Ibis Biosciences, Inc. Bioagent detection methods
US9393564B2 (en) 2009-03-30 2016-07-19 Ibis Biosciences, Inc. Bioagent detection systems, devices, and methods
GB0906234D0 (en) 2009-04-14 2009-05-20 Secr Defence Vaccine
US9194877B2 (en) 2009-07-17 2015-11-24 Ibis Biosciences, Inc. Systems for bioagent indentification
US8950604B2 (en) 2009-07-17 2015-02-10 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
WO2011014811A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Ibis Biosciences, Inc. Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests
EP3098325A1 (en) 2009-08-06 2016-11-30 Ibis Biosciences, Inc. Non-mass determined base compositions for nucleic acid detection
WO2011047307A1 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Ibis Biosciences, Inc. Multiple displacement amplification
WO2011115840A2 (en) 2010-03-14 2011-09-22 Ibis Biosciences, Inc. Parasite detection via endosymbiont detection
MX346994B (es) 2010-10-12 2017-04-06 Monsanto Technology Llc Planta y semilla de soja correspondiente al evento transgénico mon87712 y métodos para su detección.
SG191124A1 (en) * 2010-12-15 2013-07-31 Kek High Energy Accelerator Protein production method
CA2923957C (en) 2013-01-18 2021-08-31 London School Of Hygiene And Tropical Medicine Glycosylation method
GB201301085D0 (en) 2013-01-22 2013-03-06 London School Hygiene & Tropical Medicine Glycoconjugate Vaccine
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US644804A (en) 1899-06-01 1900-03-06 Peter Francis Mccaffrey Acetylene-gas lamp.
US3148120A (en) * 1952-01-24 1964-09-08 Wander Ag Dr A Hot aqueous phenol extraction of gramnegative bacterial lipopolysaccharides
US4518310A (en) 1982-09-03 1985-05-21 Tech Development Inc. Apparatus for preventing overspeed of a turbine drive means
WO1985003521A1 (en) * 1984-02-01 1985-08-15 Enterovax Research Pty. Ltd. Bacterial strains
EP0250614A1 (en) 1986-06-23 1988-01-07 Serum Und Impfinstitut Und Institut Zur Erforschung Der Infektionskrankheiten Schweiz. DNA fragments encoding the chromosomal nucleotide sugar synthetases and glycosyl transferases
WO1988008430A1 (en) 1987-04-27 1988-11-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Or Peptide production by protein engineering
WO1992013871A1 (en) 1991-01-31 1992-08-20 Washington University Polypeptides and polynucleotides useful for the diagnosis and treatment of pathogenic neisseria
WO1993011791A1 (en) 1991-12-18 1993-06-24 The State Of Oregon Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Antigenic preparations that stimulate production of antibodies which bind to the pili of type iv piliated bacteria
DE4336530C1 (de) 1993-10-26 1995-04-13 Max Planck Gesellschaft Rekombinante PilC-Proteine, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
US5951987A (en) * 1995-08-22 1999-09-14 Her Majesty The Queen As Represented By The Minister Of National Defence Of Her Majesty'canadian Government Polysaccharide vaccine to enhance immunity against brucellosis
CA2175435A1 (en) * 1996-04-30 1997-10-31 Joseph Lam Proteins involved in the synthesis and assembly of o-antigen in pseudomonas aeruginosa
US6444210B1 (en) * 1996-07-03 2002-09-03 Her Majesty the Queen in right of Canada, as represented by the Minister of National Defence of Her Majesty′s Canadian Goverment Bacterial and synthetic polysaccharide immunomodulators that enhance general immunity
GB2321103A (en) 1997-01-11 1998-07-15 Secr Defence Poxvirus antigen detection and recombinant expression vector
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
EP0973865A2 (en) 1997-04-11 2000-01-26 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Attenuated, invasive vaccines against fish pathogens
WO1998050557A1 (en) * 1997-05-02 1998-11-12 University Of Guelph Proteins involved in the synthesis and assembly of core lipopolysaccharide of pseudomonas aeruginosa
CA2293826A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 Brigitte Gicquel Attenuated recombinant mycobacteria useful as immunogens or as vaccine components
US6444445B2 (en) 1998-01-22 2002-09-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Live vaccine against Brucellosis
FR2782721B1 (fr) 1998-09-01 2000-11-03 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux composes phosphohalohydrines, procede de fabrication et applications
ATE420657T1 (de) 1999-10-12 2009-01-15 Ca Nat Research Council Archaeosome als adjuvantien und träger für azelluläre impstoffe zur induktion einer zytotoxischen t-lymphozyten (ctl) immunantwort
CA2398756A1 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Eyal Raz Immunomodulatory polynucleotides in treatment of an infection by an intracellular pathogen
DE60137337D1 (de) 2000-02-11 2009-02-26 U S Army Medical Res Inst Of I Vorbeugende und therapeutsche monoklonale antikörper gegen vacciniavirusantigene
GB0021008D0 (en) 2000-08-26 2000-10-11 Secr Defence Protein and nucleic acid sequence
JP2004528018A (ja) 2000-12-21 2004-09-16 アメリカ合衆国 無毒性シュードモナス属外毒素ａ及びｉｖ型ピリン配列を含むキメラ・タンパク質
DE50212935D1 (de) 2001-07-20 2008-12-04 Bioagency Ag Organo-phosphorverbindungen zur aktivierung von gamma/delta-t-zellen
FR2833266B1 (fr) 2001-12-11 2004-10-22 Mayoly Spindler Lab Nouveaux derives phosphonates, leur procede de preparation, leur utilisation comme modulateurs de l'activite des lymphocytes tgamma9 delta2
JP2005538689A (ja) 2002-02-11 2005-12-22 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ワクシニアまたは天然痘に対する治療のためのヒト抗体
GB0212666D0 (en) 2002-05-31 2002-07-10 Secr Defence Immunogenic sequences
US20040013688A1 (en) 2002-07-03 2004-01-22 Cambridge Scientific, Inc. Vaccines to induce mucosal immunity
RU2240822C2 (ru) 2002-07-17 2004-11-27 Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации Способ получения противотуляремийной гипериммунной сыворотки и способ получения диагностикума эритроцитарного туляремийного иммуноглобулинового сухого
AU2003304107B2 (en) 2002-11-01 2008-05-15 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of preventing infections from bioterrorism agents with immunostimulatory CpG oligonucleotides
EP1670508B1 (en) 2003-02-28 2012-10-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions, methods and kits relating to poxvirus subunit vaccines
GB0307089D0 (en) 2003-03-27 2003-04-30 Secr Defence Live vaccine strain
WO2005021708A2 (en) 2003-05-16 2005-03-10 University Of Maryland Biotechnology Institute Bisphosphonates for prophylaxis and therapy against bioterrorism agents
WO2005049791A2 (en) * 2003-07-14 2005-06-02 The Uab Research Foundation Identification of reagents for the diagnosis and study of francisella
BRPI0417088A (pt) 2003-12-02 2007-03-13 Innate Pharma ativador de célula t gama delta, composição farmacêutica, uso do ativador de célula t gama delta, composição de vacina, métodos para preparar um composto, e para ativar uma célula t gama delta, célula t gama delta, e, uso da mesma
PL1697403T3 (pl) 2003-12-23 2010-09-30 Nationwide Childrens Hospital Inc Pilusy typu IV Haemophilus influenzae
US7592326B2 (en) 2004-03-15 2009-09-22 Karaolis David K R Method for stimulating the immune, inflammatory or neuroprotective response
JP2007534743A (ja) 2004-04-26 2007-11-29 イネイト・ファーマ アジュバント組成物およびその使用方法
WO2006060710A2 (en) 2004-12-02 2006-06-08 Becton, Dickinson And Company Vaccine formulations for intradermal delivery comprising adjuvants and antigenic agents
WO2006067635A2 (en) 2004-12-20 2006-06-29 Innate Pharma S.A. USE OF Ϝδ T LYMPHOCYTE ACTIVATORS AS VACCINE ADJUVANT
WO2006103568A2 (en) 2005-03-22 2006-10-05 Innate Pharma NEW CLASS OF Ϝδ T CELLS ACTIVATORS AND USE THEREOF
CA2502999A1 (en) 2005-04-20 2006-10-20 National Research Council Of Canada Mutant f. tularensis strain and uses thereof
GB0511722D0 (en) 2005-06-08 2005-07-13 Secr Defence Live and subunit vaccines
GB2443591B (en) 2005-09-07 2010-04-28 Secr Defence Adjuvanted vaccine
GB0519161D0 (en) 2005-09-20 2005-10-26 Secr Defence Adjuvanted vaccine
WO2007097789A1 (en) 2006-02-23 2007-08-30 Oregon Health & Science University Attenuated francisella and methods of use
EP2040744B1 (en) 2006-07-25 2016-03-09 The Secretary of State for Defence Live vaccine strains of francisella
GB2444903A (en) 2006-12-21 2008-06-25 Secr Defence Live Francisella vaccine, inactivated at gene FTT1564
GB2445028A (en) 2006-12-21 2008-06-25 Secr Defence Inactivated Francisella vaccine
WO2009131730A2 (en) 2008-01-31 2009-10-29 University Of Iowa Research Foundation IMMUNOGENIC COMPOSITIONS FOR ACTIVATING γδ T CELLS
EP2123285A1 (en) 2008-05-21 2009-11-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Nucleosidic phosphoantigens for use in VGAMMA9DELTA2 T cell-mediated therapy
US7588744B1 (en) 2008-12-08 2009-09-15 Layne Christensen Company Method of recovering phosphate for reuse as a fertilizer
GB0901411D0 (en) 2009-01-29 2009-03-11 Secr Defence Treatment
GB0906234D0 (en) 2009-04-14 2009-05-20 Secr Defence Vaccine

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109988227A (zh) * 2018-12-25 2019-07-09 南阳师范学院 线虫肠道共生菌bc7的功能蛋白及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
RU2004137800A (ru) 2005-10-27
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