CN101638434A

CN101638434A - 嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质及其基因序列和该拒食蛋白及其基因的用途

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Publication number: CN101638434A
Application number: CN200910157471A
Authority: CN
Inventors: 邱德文; 杨怀文; 杨秀芬; 曾洪梅; 张雨良; 袁京京; 毛建军; 尹富仕
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2008-07-30
Filing date: 2009-07-30
Publication date: 2010-02-03
Anticipated expiration: 2029-07-30
Also published as: CN101638434B

Abstract

一种嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质，其中，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明所述的嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质在制备抑制农作物害虫幼虫生长的药物中的应用。一种编码如本发明所述的嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质的基因，其中，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。本发明所述的嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质基因用于转基因植物的培育。本发明的优点为，该种蛋白质可以明显的抑制农作物害虫的幼虫的生长，浓度低起效快，而且对其发育成成虫的过程也产生影响，在农业生产上有广泛的应用前景。该蛋白质的基因可以作为目的基因导入植物，提高植物抗虫性，以改良植物品种。

Description

嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质及其基因序列和该拒食蛋白及其基因的用途

技术领域：

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种对农作物害虫有拒食作用的来自嗜线虫致病杆菌北京变种(Xenorhabdus nematophilus var.pekingensis)CB6菌株的蛋白质的氨基酸序列及编码该蛋白质的核苷酸序列。

背景技术：

致病杆菌属(Xenorhabdus)是存在于斯氏线虫属(Steinernema)的昆虫病原线虫肠道内的共生细菌，属革兰氏阴性菌。在自然条件下，共生菌与线虫共同作用，破坏寄主防御系统，最后杀死昆虫。在此过程中，共生菌能产生许多有应用潜力的代谢产物，如毒素蛋白质、抗生素、胞外酶等，因此从该类特异生境细菌中寻找具有新活性、新功能的有效物质已成为国内外科学家关注的热点。

目前，国内外已从嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophilus)中分离到多种昆虫毒蛋白质或毒素，如英国科学家Morgan等利用柯斯质粒对X.nematophilus PMFI296菌株基因组文库进行研究，克隆了5个杀虫蛋白质基因(xptA1，xptA2，xptB1，xptC1，xptD1)(Morgan et al.，Appl Environ Microb，67(5)，2062-9，2001)，基因功能研究表明，xptA1编码的蛋白质对欧洲粉蝶(Pieris brassicae)有杀虫活性，而xptA2编码的蛋白质对烟芽夜蛾(Heliothis virescens)有杀虫活性(Sergeant et al.，Appl Environ Microb，69(6)，3344-9，2003；)；国内中山大学崔龙等从X.nematophilus BP品系的粘粒文库中筛选到含有杀虫蛋白质基因的阳性克隆并研究了其功能(崔龙等，中山大学学报(自然科学版)，42(3)，47-50，2003；崔龙等，微生物学报，43(6)，747-52，2003)；广东省昆虫研究所韩日畴等在嗜线虫致病杆菌的细菌培养液中也发现了对小菜蛾有拒食作用的物质(专利号ZL01130078.7)。所有已公开发表的文献表明，嗜线虫致病杆菌产生的蛋白质对昆虫有毒杀作用，或产生的培养液对昆虫有拒食作用，但未发现能抑制农作物害虫幼虫生长的蛋白质，更没有明确这类蛋白质或其编码蛋白质的基因序列。

发明内容：

本发明的目的是提供一种抑制农作物害虫幼虫生长的嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质及其基因序列和该拒食蛋白及其基因的用途。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质，其中，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明所述的嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质在制备抑制农作物害虫幼虫生长药物中的应用。

本发明所述的嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质在制备抑制农作物害虫幼虫生长药物中的应用，其中，所述的农作物害虫幼虫为棉铃虫、小菜蛾、玉米螟和甜菜夜蛾。

一种编码本发明所述的嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质的基因，其中，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

本发明所述的嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质基因用于转基因植物的培育。

本发明所述的嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质基因用于转基因植物的培育，其中，所述的植物为烟草。

本发明的所述的嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质，是指来自人工培养的嗜线虫致病杆菌北京变种(Xenorhabdus nematophilus var.pekingensis)CB6菌株的培养液、培养液的上清液或菌体的蛋白质。该菌种已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，登记入册编号CGMCC No：1173，分类命名为：Xenorhabdus nematophilus var.pekingensis。

本发明的优点为，1、该种蛋白质可以明显的抑制农作物害虫幼虫的生长，浓度低起效快，而且对其发育成成虫的过程也产生影响，在农业生产上有广泛的应用前景。2、该蛋白质的基因可以作为目的基因导入植物，提高植物抗虫性，以改良植物品种。

具体实施方式：

下面通过具体实例进一步说明本发明特点。

实施例1嗜线虫致病杆菌的培养及发酵液的制备

将嗜线虫致病杆菌北京变种(Xenorhabdus nematophilus var.pekingensis)CB6菌株划线接种于NBTA【营养琼脂45g(北京奥博星生物技术有限责任公司)，溴百里香酚蓝0.025g(天津市科密欧化学试剂开发中心，分析纯)，氯化三苯四氮唑0.04g(美国Amresco，分析纯)，加去离子水至1L】平板，28℃培养48h，挑选蓝色单菌落接种于5mL盛有LB【胰化蛋白质胨10g(Oxoid)，酵母提取物5g(Oxoid)，氯化钠10g(北京化工厂，分析纯)，加去离子水至1L】液体培养基的试管中，28℃、180r/min振荡24h作为种子培养液；按1％比例将种子液接种于500mL的LB液体培养基中，相同条件下培养24～36h，得到CB6菌株的发酵液。

实施例2嗜线虫致病杆菌总蛋白质的提取及生物活性测定

取实施例1所得的嗜线虫致病杆菌北京变种CB6菌株的发酵液，在4℃、5000rpm条件下离心10分钟，收集菌体在冰浴下用超声波破碎仪(Sonics VCX500)破碎菌体细胞(振幅25％，破碎4s，间隔4s，破碎20min)，离心去除菌体碎片，取上清液，加入硫酸铵粉末，使所述上清液中硫酸铵终浓度为55％以沉淀目标蛋白质，4℃透析48h，最后将菌株的总蛋白质溶解到PBS缓冲液(pH7.0)中，蛋白质终浓度为50μg/mL。蛋白质含量用BCA^TM protein assaykit(Thermo Scientific)经GF-M2000型酶标仪(山东高密彩虹分析仪器有限公司)在波长590nm处测定。

总蛋白质生物活性测定：以棉铃虫[Helicoverpa armigera(Hubner)]初孵幼虫为试虫，以PBS缓冲液为对照，将蛋白质样品和人工饲料(玉米粉120g，黄豆粉60g，啤酒酵母54g，白糖30g，对羟基苯甲酸甲酯1.1g，山梨酸1.1g，6％醋酸24mL，10％甲醛10mL，18％KOH 10mL，抗坏血酸3.75g，琼脂10g，自来水700mL，多种维生素营养液10mL。)按1∶10的比例混合均匀，分装于24孔生测板中，每孔放1头幼虫，覆盖一层保鲜膜和两层纸巾，盖上盖。每批处理24头幼虫，置于(26±1)℃、14h光照的生化培养箱中。120h时称量活虫体重，并按以下公式计算生长抑制率。

生长抑制率(％)＝[(对照组幼虫平均体重-处理组幼虫平均体重)/对照组幼虫平均体重]×100

实验表明，50μg/mL总蛋白质对棉铃虫初孵幼虫的生长抑制率为95％。

实施例3拒食蛋白质的分离纯化及生物活性测定

使用AKTA explore 10(GE Healthcare)蛋白质纯化仪对所得的总蛋白质进行进一步纯化，样品首先通过DEAE Sepharose FF离子交换柱(GE Healthcare)，用NaCl进行梯度洗脱(0，15，30，45，60和100％)，获得到5个蛋白质洗脱峰，并按实施例2所述方法进行生物测定，结果表明，第二个蛋白质峰对棉铃虫初孵幼虫具有较强的抑制作用；该蛋白质峰再通过Butyl FF疏水层析柱(GE Healthcare)和Sephacryl S-200凝胶层析柱(GEHealthcare)进一步纯化，得到有活性的单一蛋白质峰，该单一蛋白质峰经5％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)(Sigma)检测为单一带，说明蛋白质纯度高。该蛋白质表观分子量为284kD(pI＝5.19)，在浓度范围为2-6μg/mL内对棉铃虫初孵幼虫的生长抑制率为85-95％。

蛋白质浓度	对棉铃虫的生长抑制率
蛋白质浓度	对棉铃虫的生长抑制率	2.0μg/mL	85％
4.0μg/mL	87％	2.0μg/mL	85％
4.0μg/mL	87％	6.0μg/mL	95％

以上结果说明，该纯化蛋白质对棉铃虫具有拒食活性，将此拒食蛋白质命名为XnAFP2(Xenorhabdus nematophilus antifeeding protein 2)。

以小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]3龄幼虫、玉米螟[Ostrinia furnacalis(Guenee)]3-4龄幼虫和甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hübner)]1龄幼虫为试虫，用上述同样方法测试XnAFP2纯化蛋白质的生物活性，结果表明，XnAFP2对以上3种试虫同样有拒食作用，数据如下。

XnAFP2对小菜蛾3龄幼虫生长的抑制率

XnAFP2浓度	生长抑制率
XnAFP2浓度	生长抑制率	8.0μg/mL	80％
10.0μg/mL	85％	8.0μg/mL	80％
10.0μg/mL	85％	12.0μg/mL	95％

XnAFP2对玉米螟3-4龄幼虫生长的抑制率

XnAFP2浓度	生长抑制率
XnAFP2浓度	生长抑制率	4.0μg/mL	80％
6.0μg/mL	85％	4.0μg/mL	80％
6.0μg/mL	85％	8.0μg/mL	95％

XnAFP2对甜菜夜蛾1龄幼虫生长的抑制率

XnAFP2浓度	生长抑制率
XnAFP2浓度	生长抑制率	2.0μg/mL	80％
4.0μg/mL	90％	2.0μg/mL	80％
4.0μg/mL	90％	8.0μg/mL	95％

实施例4XnAFP2对棉铃虫5龄幼虫的拒食作用

采用叶碟法测定蛋白质XnAFP2对棉铃虫的拒食作用：取洗净的小白菜叶片(4.0cm×4.0cm)，将其浸泡在蛋白质溶液中60秒，取出并晾干，将其放入培养皿中；对照叶片浸泡pH7.0的PBS缓冲液。分选择性拒食和非选择性拒食两种方法测定：

1.选择性测定：在每个培养皿中加入4片叶片，2片浸泡蛋白质的叶片(相对方向放置)和另2片对照叶片(相对方向放置)，然后往每个培养皿接入5龄棉铃虫1头。每处理设5个重复。12小时和24小时后分别测量叶蝶被取食的面积，计算选择性拒食率。

选择性拒食率(％)＝【(对照组取食面积-处理组取食面积)/(对照组取食面积+处理组取食面积)】×100

结果如下表。

*表中不同字母表示在ρ＜0.01水平时的差异显著性。

2.非选择性测定：在培养皿中加入1片浸泡蛋白质的小白菜叶片(6cm)，另1片同样大小的对照叶片放入另一培养皿中，然后往每个培养皿接入5龄棉铃虫1头。每处理设5个重复。测量实验12小时和24小时后叶片被取食的面积。计算非选择性拒食率。

非选择性拒食率(％)＝【(对照组取食面积-处理组取食面积)/对照组取食面积】×100

结果如下表。

*表中不同字母表示在ρ＜0.05水平时的差异显著性。

实验证明，无论是在选择性测定还是在非选择性测定中，XnAFP2蛋白质对棉铃虫都具有强烈的拒食作用。

实施例5XnAFP2对棉铃虫幼虫生长发育的影响

实施例4所述的XnAFP2对棉铃虫的拒食作用，导致幼虫不生长，甚至部分幼虫死亡；即使幼虫存活也表现发育不良，发育历期延长，难以化蛹；即使幼虫化蛹，其蛹多为畸形发育，蛹重偏低，难以羽化或成虫致畸展翅不良。

	幼虫死亡率(％)	平均发育历期(天)	化蛹率(％)	畸形发生率(％)
	幼虫死亡率(％)	平均发育历期(天)	化蛹率(％)	畸形发生率(％)	选择性测定实验组	30	10	41.2	60
非选择性测定实验组	35	14	20	80	选择性测定实验组	30	10	41.2	60
非选择性测定实验组	35	14	20	80	对照组	5	8	81.2	0

实施例6拒食蛋白质XnAFP2肽段序列的获得

纯化的XnAFP2蛋白质经变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测，切取蛋白质单带分别经10ng/μl测序级修饰胰蛋白质酶(Sequencing Grade Modified Trypsin，Promega)30℃、pH7.5酶解30min～1h，10ng/μl凝乳蛋白质酶(Sigma)37℃、pH8.0酶解2h，10ng/μl V8酶(Roche)25℃、pH7.5酶解2～12h后，采用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)(Autoflex II，Bruker)获得该蛋白质的多个肽段序列，总计近1000个氨基酸长度，这些序列和质谱库中Xenorhabdus nematophilus的序列相匹配，覆盖了其40％的序列。以下用黑体(下划线)表示的为一致的肽段序列：

1

ISPTR

51KNN RLLEARIFTR ANPQLSGAIR LGIERDSVSR

101EAK

RPDLADLTL

151 SQSNMDTEIS TLTLSNELLL EPITR

201

NPEVMGQA EGASLLAILA NISPELYNIL

251 TEEITEK

301LEAY KITRVKTDDY DKHVNYFDLM

351 YEGNNQFFIC ANFKISREFG ATLRKNSGTS GIVGSLSGPL VANTNFKSNY

401 LSNISDNEYR NGVKIYAYR

LNK

451 AIRSDNAQGIIND SVLTK

YALSF

501 DDAQVLNGSV INQYADDDSV SHFNRLFNTP PLKGK

551

SAL MRGLGINSGE LYQLGKLAGV LDTQNILTLS VPVISSLYRL

601 TLLARAHQLT VNELCMLYGF SPFNGKTTAS LSSGELSRLV IWLYQVTQWL

651 TEAEITTEAI WLLCTPEFSG NISPEISNLL NTLRPRISED MAQSSDR

701

YILLWTDNL RPGGLNIAGF MMLVLKETLS

751 DEETTQLVQF CHVMAQLSLS VQTLRLSEAE LSVLVISDFV VLGARSQPPD

801 NTILILCSHS TDSTSGLMGW EIPALTRWIC CAKQTLTGDR LGLRDGAGHQ

851 YGNAGHGSAG VNQLQCWQDI NPVLQWIHVA SALITMPSVI RTLVNIRYVT

901 ALNKAESNLP AWDKWQTLAE NMAAGLSTQQ AQTLADYTAE RLSSVLCNWF

951 LANIQPEGVS LHSRDDLYSY FLIDNQVSSA IKTTR

A

1001 LNRIEPNARA DVSTR

I

1051 GQTRMMDELL ENISQSQLSR DTVEEAFKTY LTRFETVADL K

1101

NVNISR

EWTK

1151

DAIRPV IFRER

F TLKLAFLR

1201

LAL AASGFQGEDT LLVFVYKTGV

1251 SYPDFGDNNK

YSQLK

1301

KASYRFA QDFEVPASLN MGSAIGDDSL TVMENGNIPQ ITSK

1351

NKQISAMKL TGVDGK

1401

TK

1451

TSDFKKCS YAVDGNNSQG FQIFSSYQSS

1501 GWLDIDTGIN NTDVKITVVA GSKTHTFTAS DHIASLPANS FDAMPYTFKP

1551 LEIDASSLAF TNNIAPLDIV FETKAKDGRV LGKIKQTLSV K

1601

1651

WFK

1701

LGVGYQ KITYDNTWES AFFYFDETK

1751

NIKKYKGFL NVSIATGYSA PMDFNSASAL

1801 YYWELFYYTP MMCFQRLLQE KQFDEATQWI NYVYNPAGYI VNGEIAPWIW

1851 NCRPLEETTS WNANPLDAID PDAVAQYDPT HYKVATFMRGDM

1901 AYRELTRDAL NEAKMWYVRA LELLGDEPED YGSQQWAAPS LSVAASHTVQ

1951 AAYQQDLTAL DNGEVATQPR

LRLFN

2001 LR

ALLPSM VQASQGGSAV LPGTLSLYR

2051

ARNL VAQLTQFGTS LLSMAEHDDA DELTTLLLQQ GMELATQSIR

2101 IQQRTVDEVD ADIAVLAESR RSAQNRLEKAMSLFD

2151 AAAGQSLAGQ ALSVAEGVAD LVPNVFGFAC GGSRWGAALR

2201

I SRSEAYRR

DNA DGEVK

IRR

2251

KFTNKGKLS AIYYQFFDLT

2301 QSFCLMAQEA LRR

GGAWNG TTAGLMAGET LLLNLAEMEK

2351 VWLERDERAL EVTR

LTQFL R

2401

LSNR

LSDL KIFSDYPESF GNTRQLK

2451

GCS AIALSHGVND SGQFMLDFND SRYLPFEGIS

2501 VNDSGSLTLS FPDATDRQKYTIRS

实施例7拒食蛋白质XnAFP2编码基因的克隆

根据质谱测序结果和密码子的简并性设计26对引物，经筛选试验最终选定引物XnAFP2-ES-P1：5’-CGGAATTCATGTATAGCACGGCTGTATTACTCA-3’和XnAFP2-ES-P2：5’-ACGTCGACTTAAGAACGAATGGTATAGCGGATA-3’，并以CB6菌株总DNA为模板，进行PCR(94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃8min，35cycles；72℃10min；4℃∝)，扩增出7591bp的DNA片段，其中包括7575bp的完整开放阅读框，将其命名为xnAFP2基因，该基因的顺序如SEQ ID NO：1所示。

实施例8转拒食蛋白质基因xnAFP2烟草的培育

设计拒食蛋白质基因xnAFP2的特异性引物，引入酶切位点和酶切保护碱基，正向引物：5’-CGGAATTCATGTATAGCACGGCTGTATTACTCA-3’(下划线为Eco RI的酶切序列)，反向引物：5’-ACGTCGACTTAAGAACGAATGGTATAGCGGATA-3’(下划线为Sal I的酶切序列)，扩增全长xnAFP2基因(94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃8min，35cycles；72℃10min)。先将xnAFP2基因目的片段克隆到pEASY-T1 simple载体，经Eco RI和Sal I酶切后，将xnAFP2片段克隆到pET28a载体的Eco RI/Sal I位点，再用Bam HI和Sal I将xnAFP2片段切下，克隆到pCAMBIA2300-35S-OCS载体的Bam HI/Sal I位点，得到用于转化的植物表达载体pCAMBIA2300-xnAFP2。通过冻融法将pCAMBIA2300-xnAFP2转化根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)菌株LBA4404。

以烟草(三生烟Nicotiana tobacum cv.Samsun NN)叶盘为外植体诱导愈伤组织用于根癌农杆菌LBA4404浸染，经共培养，分化，得到具卡那霉素(100μg/ml)抗性的转化子。通过PCR检测确认了阳性烟草转化子，用Southern杂交进一步证实了xnAFP2基因已整合到受体烟草基因组，用RT-PCR和Northern杂交验证了xnAFP2基因在烟草中的转录，用Western杂交证实了xnAFP2基因的表达。

生物活性测定：采用实施例4中非选择性方法测定转基因烟草对棉铃虫的拒食效果，并计算拒食率。

结果如下。

处理	取食面积(mm²)	拒食率(％)
处理	取食面积(mm²)	拒食率(％)	转基因烟草	489	51.6％
非转基因烟草	1012	-	转基因烟草	489	51.6％

序列表

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>嗜线虫致病杆菌拒食作用蛋白质及基因序列

<150>CN200810134596.9

<151>2008年7月30日

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>SEQ ID NO：1

<211>7575

<212>DNA

<213>嗜线虫致病杆菌北京变种(Xenorhabdus nematophilus var.pekingensis)CB6菌株

<400>1

ATGTATAGCA CGGCTGTATT ACTCAATAAA ATCAGTCCCA CTCGCGACGG TCAGACGATG 60

ACTCTTGCGG ATCTGCAATA TTTATCCTTC AGTGAACTGA GAAAAATCTT TGATGACCAG 120

CTCAGTTGGG GAGAGGCTCG CCATCTCTAT CATGAAACTA TAGAGCAGAA AAAAAATAAT 180

CGCTTGCTGG AAGCGCGTAT TTTTACCCGT GCCAACCCAC AATTATCCGG TGCTATCCGA 240

CTCGGTATTG AACGAGACAG CGTTTCACGC AGTTATGATG AAATGTTTGG TGCCCGTTCT 300

TCTTCCTTTG TGAAACCGGG TTCAGTGGCT TCCATGTTTT CACCGGCTGG CTATCTCACC 360

GAATTGTACC GTGAAGCGAA GGACTTACAT TTTTCAAGCT CTGCTTATCA TCTTGATAAT 420

CGCCGTCCGG ATCTGGCTGA TCTGACTCTG AGCCAGAGTA ATATGGATAC AGAAATTTCC 480

ACCCTGACAC TGTCTAACGA ACTGTTGCTG GAGCATATTA CCCGCAAGAC CGGAGGTGAT 540

TCGGACGCAT TGATGGAGAG CCTGTCAACT TACCGTCAGG CCATTGATAC CCCTTACCAT 600

CAGCCTTACG AGACTATCCG TCAGGTCATT ATGACCCATG ACAGTACACT GTCAGCGCTG 660

TCCCGTAATC CTGAGGTGAT GGGGCAGGCG GAAGGGGCTT CATTACTGGC GATTCTGGCC 720

AATATTTCTC CGGAGCTTTA TAACATTTTG ACCGAAGAGA TTACGGAAAA GAACGCTGAT 780

GCTTTATTTG CGCAAAACTT CAGTGAAAAT ATCACGCCCG AAAATTTCGC GTCACAATCA 840

TGGATAGCCA AGTATTATGG TCTTGAACTT TCTGAGGTGC AAAAATACCT CGGGATGTTG 900

CAGAATGGCT ATTCTGACAG CACCTCTGCT TATGTGGATA ATATCTCAAC GGGTTTAGTG 960

GTCAATAATG AAAGTAAACT CGAAGCTTAC AAAATAACAC GTGTAAAAAC AGATGATTAT 1020

GATAAAAATA TAAATTACTT TGATTTGATG TATGAAGGAA ATAATCAGTT CTTTATACGT 1080

GCTAATTTTA AGGTATCAAG AGAATTTGGG GCTACTCTTA GAAAAAACGC AGGGCCAAGT 1140

GGCATTGTCG GCAGCCTTTC CGGTCCTCTA ATAGCCAATA CGAATTTTAA AAGTAATTAT 1200

CTAAGTAACA TATCTGACTC TGAATACAAA AACGGTGTAA AGATATACGC CTATCGCTAT 1260

ACGTCTTCCA CCAGCGCCAC AAATCAGGGC GGCGGAATAT TCACTTTTGA GTCTTATCCC 1320

CTGACTATAT TTGCGCTCAA ACTGAATAAA GCCATTCGCT TGTGCCTGAC TAGCGGGCTT 1380

TCACCGAATG AACTGCAAAC TATCGTACGC AGTGACAATG CACAAGGCAT CATCAACGAC 1440

TCCGTTCTGA CCAAAGTTTT CTATACTCTG TTCTACAGTC ACCGTTATGC ACTGAGCTTT 1500

GATGATGCAC AGGTACTGAA CGGATCGGTC ATTAATCAAT ATGCCGACGA TGACAGTGTC 1560

AGTCATTTTA ACCGTCTCTT TAATACACCG CCGCTGAAAG GGAAAATCTT TGAAGCCGAC 1620

GGCAACACGG TCAGCATTGA TCCGGATGAA GAGCAATCTA CCTTTGCCCG TTCAGTCCTG 1680

ATGCGTGGTC TGGGGGTCAA CAGTGGTGAA CTGTATCAGT TAGGCAAACT GGCGGGTGTG 1740

CTGGACGCCC AAAATACCAT CACACTTTCT GTCTTCGTTA TCTCTTCACT GTATCGCCTC 1800

ACGTCACTGG CCCGTGTCCA TCAGCTGACG GTCAATGAAC TGTGTATGCT TTATGGTCTT 1860

TCGCCGTTCA ATGGCAAAAC AACGGCTTCT TTGTCTTCCG GGGAGTTGCC ACGGCTGGTT 1920

ATCTGGCTGT ATCAGGTGAC GCAGTGGCTG ACTGAGGCGG AAATCACCAC TGAAGCGATC 1980

TGGTTATTAT GTACGCCAGA GTTTAGCGGG AATATTTCAC CGGAAATCAG TAATCTGCTC 2040

AATAACCTCC GACCGAGTAT TAGTGAAGAT ATGGCACAGA GTCACAATCG GGAGCTGCAG 2100

GCTGAAATTC TCGCGCCGTT TATTGCTGCA ACGCTGCATC TGGCGTCACC GGATATGGCA 2160

CGGTATATCC TGTTGTGGAC CGATAACCTG CGGCCGGGTG GCTTAGATAT TGCCGGGTTT 2220

ATGACACTGG TATTGAAAGA GTCGTTAAAT GCCAATGAAA CCACCCAATT GGTACAATTC 2280

TGCCATGTGA TGGCACAGTT ATCGCTTTCC GTACAGACAC TGCGCCTCAG TGAAGCGGAG 2340

CTATCCGTGC TGGTCATCTC CGGATTCGCC GTGCTGGGGG CAAAAAATCA ACCTGCCGGA 2400

CAGCACAATA TTGATACGCT ATTCTCACTC TACCGATTCC ACCAGTGGAT TAATGGGCTG 2460

GGCAATCCCG GCTCTGACAC GCTGGATATG CTGCGCCAGC AGACACTCAC GGCCGACAGA 2520

CTGGCCTCCG TGATGGGGCT GGACATCAGT ATGGTAACGC AGGCCATGGT TTCCGCCGGC 2580

GTGAACCAGC TTCAGTGTTG GCAGGATATC AACACCGTGT TGCAGTGGAT AGATGTGGCA 2640

TCAGCACTGC ACACGATGCC GTCGGTTATC CGTACGCTGG TGAATATCCG TTACGTGACT 2700

GCATTAAACA AAGCCGAGTC GAATCTGCCT TCCTGGGATG AGTGGCAGAC ACTGGCAGAA 2760

AATATGGAAG CCGGACTCAG TACACAACAG GCTCAGACGC TGGCGGATTA TACCGCGGAG 2820

CGCCTGAGTA GCGTGCTGTG CAATTGGTTT CTGGCGAATA TCCAGCCAGA AGGGGTGTCC 2880

CTGCAAAGTC GGGATGACCT GTACAGCTAT TTCCTGATCG ATAATCAGGT TTCTTCTGCC 2940

GTGAAAACCA CTCGACTGGC AGAGGCGATT GCCGGTATTC AACTTTACAT CAACCGGGCG 3000

CTGAACCGGA TAGAGCCTAA TGCCCGTGCC GATGTGTCAA CCCGCCAGTT TTTTACCGAC 3060

TGGACGGTGA ATAACCGTTA CAACACCTGG GGCGGGGTGT CGCGGCTGGT TTATTATCCG 3120

GAAAACTACA TTGACCCAAC CCAGCGTATC GGGCAGACCC GGATGATGGA TGAACTGCTG 3180

GAAAATATCA GCCAGAGTAA ACTTAGCCGG GACACAGTGG AGGATGCCTT TAAAACTTAC 3240

CTGACCCGCT TTGAAACCGT GGCGGATCTG AAAGTAGTCA GTGCCTATCA CGACAACGTC 3300

AACAGTAACA CCGGGCTAAC CTGGTTTATC GGCCAAACGC GGGAGAACCT GCCGGAGTAC 3360

TACTGGCGTA ACGTGGATAT ATCACGGATG CTGGCGGGTA AACTGGCCGC CAATGCCTGG 3420

AAAGAGTGGA CGAAGATTGA TACGGCGGTT AATTCCTACA AGGATGCAAT ACGTCCGGTC 3480

ATATTCAGGG AACGCTTGCA CCTTATATGG GTAGAGAAAG ATGAAGTGGC GGAAAACGGC 3540

ACTAACCCAG TGAAAACCTA TGACCGTTTT ACCCTGAAAC TGGCGTTTTT GCGTCATGAT 3600

GGCAGTTGGA GTGCCCCTTG GTCTTACGAT ATCACAACGC AGGTGGAGGC GGTCACTGAC 3660

AAAAAACCTG ACACTGAACG GCTGGCGCTG GCCGCATCCG GCTTTCAGGG CGAGGACACT 3720

CTGCTGGTGT TTGTCTACAA AACCGGGAAG AGTTACTCGG ATTTTGGCGG CAGCAATAAA 3780

AATGTGGCAG GCATGACCAT TTACGGCGAT GGCTCCTTGA AAAAGATGGA GAACACAGCA 3840

CTAAGCCGCT ACAGCCAACT GAAAAATACC TTTGATGTCA TTAATCCTCA AGACAACGAC 3900

TTGGTAAGAA AGGCCAGCTA TCGTTTCTCG CAGGATTTTG AAGTACCTGC CTCGTTGAAT 3960

ATGGGTTTTG CCATCGGTGA TTATAGTCTG ACGGTGATGG AAAACGGGAA TATTCCGCAG 4020

ATAACCGGTA AATACTCCAG CGATAACCTT GCTATTACGC TACATAACGC CGCTTTTACT 4080

GTCAGATATG ATGGTGGTGG CAATGTCATC AGAAACAAAC AAATCAGCGC CATGAAACTT 4140

ACTGGTGTAG ACGGAAAATC ACAATACGGC AATGCATTTA TTATAGCAAA TACCCTTAAG 4200

CATTATGGTG GTTACTCTGA TCTTGGCGGG CCAATTGCCG TTTATAATAA GACGAAAAAC 4260

TATATTGCAT CAGTACAAGA TCGTCTTTAC AACCCAGACT ATAGAAGGCG TTTGATTCTG 4320

ACACCGGTTG AAAATAATTA TTATGCCAAA TTGTTCGAGT TTCCATTTTC TCCAAACACT 4380

ATCCGAAATA CAGTTTTCAA GGTTGGCAGC AATAGAACCA GTGAGTTTAA AAAATGTAAT 4440

TATGCTGAGG ATGGTAATAA TGATGCTGGC TTCCAGGTAT TTAGTTCTTA TCAATCATCC 4500

GGCTGGCTGG ATATTGATAC AGGCATTAAC AATACCGATA TCAAAATTAC GGTGATGGCT 4560

GGCAGTAAAA CCCACACCTT TACGGCCAGT GACCATATTG CTTCCTTGCC GGCAAACAGT 4620

TTTGATGCTA TGCCGTACAC CTTTAAGCCA CTGGAAATCG ATGCTTCATC GTTGTCCTTT 4680

ACCAATAATA TTGCTCCGCT GGATATCGTT TTTGAGACCA AAGCCAAAGA CGGGCGAGTG 4740

CTGGGTAAAA TCAAGCAAAC ATTATCAGTG AAACGGGTAA ATTATAATCC GGAAGATATT 4800

CTGCTTCTGC GTGAAACTCA TTCTGGTGCC CAATATATGC AGCTCGGGGT GTATCGCATT 4860

CGTCTGAATA CCCTGCTGGC CTCCCAACTG GTATCCAGAG CAAACACGGG CATTGATACT 4920

ATCCTGACTA TGGAAACCCA GCAGCTGCCT GAGCCTCAAT TGGGTAAAGG TTTCTATGCT 4980

ACTTTCACCC TGCCACCTTA CAATTCCGCG ACACATGGCA CCAGCCGGGC ATTCCAGCTC 5040

AACCTCAAAC ATGTGGTTGA TGATAAAGTA CATGCTATTC GCTCAGGGCT GCTGCAGGAT 5100

ACTGAATTTG CTGTTCGTCT CTTTATTCCC CTGGATGATA CACCACTTCA TGATGAATAT 5160

ATTGCTAAGG TGTTTTTAAC CACCCAGAAG AACAGAAATG ACGTTCCAAA TGTCGGTGCT 5220

CACTTTAAAT ATGATAAGAG TAATAACAAT AGAATCGTTA TCAATGATGA TATTTCGGAT 5280

ATCAGTATGT TCGCTGGTAT ACAAATACAT AACGGCGAAA CTACCGAACC ACTGGATTTC 5340

AACAGCGCCT GTGCATTGTA TTACTGGGAA CTGTTCTACT ACACCCCGAT GATGTGCTTC 5400

CAGCGTCTGC TACAGGAAAA ACAATTCGAC GAAGCCACAC AATGGATAAA CTACGTCTAT 5460

AATCCCGCCG GCTATATCGT TAACGGAGAA ATCGCCCCCT GGATCTGGAA CTGCCGGCCG 5520

CTGGAAGAGA CCACCTCCTG GAATGCCAAT CCGTTGGATG CCATTGATCC GGATGCCGTC 5580

GCACAATATG ACCCGACACA CTATAAAGTT GCCACCTTTA TGCGCCTGTT GGATCAACTT 5640

ATTCTGCGCG GCGATATGGC CTATCGCGAA CTGACCCGCG ATGCGTTGAA TGAAGCCAAG 5700

ATGTGGTATG TGCGTGCTTT GGAATTGCTG GGTGATGAGC CGGAGGATTA CGGCAGCCAA 5760

CAGTGGGCCG CACCGTCTCT TTCCGTGGCG GCCAGCCACA CTGTGCAGGC GGCCTATCAG 5820

CAGGACCTTA CGGCGCTAGA CAACGGAGAG GTTGCCACTC AGCCCCGCAC CGCTAACTCG 5880

TTGGTGGGTT TGTTCCTGCC GGAATATAAC CCGGCACTCA CCGATTACTG GCAAACCCTG 5940

CGTTTGCGCC TGTTTAACCT GCGCCATAAT CTTTCCATTG ACGGACAGCC GTTATCGCTG 6000

GCGATTTACG CCGAGCCTAC CGATCCGAAA GCGCTGCTCA CCAGTATGGT ACAGGCCTCT 6060

CAGGGCGGTA GTGCAGTGCT GCCCGGCACA TTGTCGTTAT ACCGCTTCCC GGTGATGCTG 6120

GAGCGGACCC GCAATCTGGT AGCGCAGTTA ACCCAGTTCG GCACCTCTCT GCTCAGTATG 6180

GCAGAGCATG ATGATGCCGA TGAACTCACC ACGCTGCTAC TACAGCAGGG TATGGAACTG 6240

GCGACACAGA GCATCCGTAT TCAGCAACGA ACTGTCGATG CAGTGGATGC TGATATTGCT 6300

GTATTGGCAG AGAGCCGCCG CAGTGCACAA AATCGTCTGG AAAAATACCA GCAGCTGTAT 6360

GACGAGGATA TCAACCACGG AGAACAGCGG GCAATGTCAC TGCTTGATGC AGCGGCAGGT 6420

CAGTCTCTGG CCGGGCAGGT GCTTTCAATA GCGGAAGGGG TGGCCGATTT AGTGCCAAAC 6480

GTGTTCGGTT TAGCTTGTGG CGGCAGTCGT TGGGGGGCAG CACTGCGTGC TTCCGCCTCC 6540

GTGATGTCGC TTTCTGCCAC AGCTTCCCAA TATTCCGCAG ACAAAATCAG CCGTTCGGAA 6600

GCCTACCGCC GCCGCCGTCA GGAGTGGGAA ATTCAGCGTG ATAATGCTGA CGGTGAAGTC 6660

AAACAAATGG ATGCCCAGCT GGAAAGCCTG AAAATACGCC GCGAAGCAGC ACAGATGCAG 6720

GTGGAATATC AGGAGACCCA GCAGGCCCAT ACTCAGGCTC AGTTAGAGCT GTTACAGCGT 6780

AAATTCACAA ACAAAGCGCT TTACAGTTGG ATGCGCGGCA AGCTGAGTGC TATCTATTAC 6840

CAGTTCTTTG ACCTGACCCA GTCCTTCTGC CTGATGGCAC AGGAAGCGCT GCGCCGCGAG 6900

CTGACCGACA ACGGTGTTAC CTTTATCCGG GGTGGGGCCT GGAACGGTAC GACTGCGGGT 6960

TTGATGGCGG GTGAAACGTT GCTGCTGAAT CTGGCAGAAA TGGAAAAAGT CTGGCTGGAG 7020

CGTGATGAGC GGGCACTGGA AGTGACCCGT ACCGTCTCGT TGGCACAGTT CTATCAGGCC 7080

TTATCATCAG ACAACTTTAA TCTGACCGAA AAACTCACGC AATTCCTGCG TGAAGGGAAA 7140

GGCAACGTAG GAGCTTCCGG CAATGAATTA AAACTCAGTA ACCGTCAGAT AGAAGCCTCA 7200

GTGCGATTGT CTGATTTGAA AATTTTCAGC GACTACCCCG AAAGCCTTGG CAATACCCGT 7260

CAGTTGAAAC AGGTGAGTGT CACCTTGCCG GCGCTGGTTG GTCCGTATGA AGATATCCGG 7320

GCGGTGCTGA ATTACGGCGG CAGCATCGTC ATGCCCCGCG GTTGCAGTGC CATTGCCCTC 7380

TCCCACGGCG TGAATGACAG TGGTCAATTT ATGCTGGATT TCAACGATTC CCGTTATCTG 7440

CCGTTTGAAG GTATTTCCGT GAATGACAGC GGTAGCCTGA CGTTGAGTTT CCTGGATGCG 7500

ACTGATCGAC AGAAAGCGCT GCTGGAGAGC CTGAGCGATA TCATTCTGCA TATCCGCTAT 7560

ACCATTCGTT CTTAA 7575

<210>SEQ ID NO：2

<211>2524

<212>PRT

<400>2

Met Tyr Ser Thr Ala Val Leu Leu Asn Lys Ile Ser Pro Thr Arg Asp

1 5 10 15

Gly Gln Thr Met Thr Leu Ala Asp Leu Gln Tyr Leu Ser Phe Ser Glu

20 25 30

Leu Arg Lys Ile Phe Asp Asp Gln Leu Ser Trp Gly Glu Ala Arg His

35 40 45

Leu Tyr His Glu Thr Ile Glu Gln Lys Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu

50 55 60

Ala Arg Ile Phe Thr Arg Ala Asn Pro Gln Leu Ser Gly Ala Ile Arg

65 70 75 80

Leu Gly Ile Glu Arg Asp Ser Val Ser Arg Ser Tyr Asp Glu Met Phe

85 90 95

Gly Ala Arg Ser Ser Ser Phe Val Lys Pro Gly Ser Val Ala Ser Met

100 105 110

Phe Ser Pro Ala Gly Tyr Leu Thr Glu Leu Tyr Arg Glu Ala Lys Asp

115 120 125

Leu His Phe Ser Ser Ser Ala Tyr His Leu Asp Asn Arg Arg Pro Asp

130 135 140

Leu Ala Asp Leu Thr Leu Ser Gln Ser Asn Met Asp Thr Glu Ile Ser

145 150 155 160

Thr Leu Thr Leu Ser Asn Glu Leu Leu Leu Glu His Ile Thr Arg Lys

165 170 175

Thr Gly Gly Asp Ser Asp Ala Leu Met Glu Ser Leu Ser Thr Tyr Arg

180 185 190

Gln Ala Ile Asp Thr Pro Tyr His Gln Pro Tyr Glu Thr Ile Arg Gln

195 200 205

Val Ile Met Thr His Asp Ser Thr Leu Ser Ala Leu Ser Arg Asn Pro

210 215 220

Glu Val Met Gly Gln Ala Glu Gly Ala Ser Leu Leu Ala Ile Leu Ala

225 230 235 240

Asn Ile Ser Pro Glu Leu Tyr Asn Ile Leu Thr Glu Glu Ile Thr Glu

245 250 255

Lys Asn Ala Asp Ala Leu Phe Ala Gln Asn Phe Ser Glu Asn Ile Thr

260 265 270

Pro Glu Asn Phe Ala Ser Gln Ser Trp Ile Ala Lys Tyr Tyr Gly Leu

275 280 285

Glu Leu Ser Glu Val Gln Lys Tyr Leu Gly Met Leu Gln Asn Gly Tyr

290 295 300

Ser Asp Ser Thr Ser Ala Tyr Val Asp Asn Ile Ser Thr Gly Leu Val

305 310 315 320

Val Asn Asn Glu Ser Lys Leu Glu Ala Tyr Lys Ile Thr Arg Val Lys

325 330 335

Thr Asp Asp Tyr Asp Lys Asn Ile Asn Tyr Phe Asp Leu Met Tyr Glu

340 345 350

Gly Asn Asn Gln Phe Phe Ile Arg Ala Asn Phe Lys Val Ser Arg Glu

355 360 365

Phe Gly Ala Thr Leu Arg Lys Asn Ala Gly Pro Ser Gly Ile Val Gly

370 375 380

Ser Leu Ser Gly Pro Leu Ile Ala Asn Thr Asn Phe Lys Ser Asn Tyr

385 390 395 400

Leu Ser Asn Ile Ser Asp Ser Glu Tyr Lys Asn Gly Val Lys Ile Tyr

405 410 415

Ala Tyr Arg Tyr Thr Ser Ser Thr Ser Ala Thr Asn Gln Gly Gly Gly

420 425 430

Ile Phe Thr Phe Glu Ser Tyr Pro Leu Thr Ile Phe Ala Leu Lys Leu

435 440 445

Asn Lys Ala Ile Arg Leu Cys Leu Thr Ser Gly Leu Ser Pro Asn Glu

450 455 460

Leu Gln Thr Ile Val Arg Ser Asp Asn Ala Gln Gly Ile Ile Asn Asp

465 470 475 480

Ser Val Leu Thr Lys Val Phe Tyr Thr Leu Phe Tyr Ser His Arg Tyr

485 490 495

Ala Leu Ser Phe Asp Asp Ala Gln Val Leu Asn Gly Ser Val Ile Asn

500 505 510

Gln Tyr Ala Asp Asp Asp Ser Val Ser His Phe Asn Arg Leu Phe Asn

515 520 525

Thr Pro Pro Leu Lys Gly Lys Ile Phe Glu Ala Asp Gly Asn Thr Val

530 535 540

Ser Ile Asp Pro Asp Glu Glu Gln Ser Thr Phe Ala Arg Ser Val Leu

545 550 555 560

Met Arg Gly Leu Gly Val Asn Ser Gly Glu Leu Tyr Gln Leu Gly Lys

565 570 575

Leu Ala Gly Val Leu Asp Ala Gln Asn Thr Ile Thr Leu Ser Val Phe

580 585 590

Val Ile Ser Ser Leu Tyr Arg Leu Thr Ser Leu Ala Arg Val His Gln

595 600 605

Leu Thr Val Asn Glu Leu Cys Met Leu Tyr Gly Leu Ser Pro Phe Asn

610 615 620

Gly Lys Thr Thr Ala Ser Leu Ser Ser Gly Glu Leu Pro Arg Leu Val

625 630 635 640

Ile Trp Leu Tyr Gln Val Thr Gln Trp Leu Thr Glu Ala Glu Ile Thr

645 650 655

Thr Glu Ala Ile Trp Leu Leu Cys Thr Pro Glu Phe Ser Gly Asn Ile

660 665 670

Ser Pro Glu Ile Ser Asn Leu Leu Asn Asn Leu Arg Pro Ser Ile Ser

675 680 685

Glu Asp Met Ala Gln Ser His Asn Arg Glu Leu Gln Ala Glu Ile Leu

690 695 700

Ala Pro Phe Ile Ala Ala Thr Leu His Leu Ala Ser Pro Asp Met Ala

705 710 715 720

Arg Tyr Ile Leu Leu Trp Thr Asp Asn Leu Arg Pro Gly Gly Leu Asp

725 730 735

Ile Ala Gly Phe Met Thr Leu Val Leu Lys Glu Ser Leu Asn Ala Asn

740 745 750

Glu Thr Thr Gln Leu Val Gln Phe Cys His Val Met Ala Gln Leu Ser

755 760 765

Leu Ser Val Gln Thr Leu Arg Leu Ser Glu Ala Glu Leu Ser Val Leu

770 775 780

Val Ile Ser Gly Phe Ala Val Leu Gly Ala Lys Asn Gln Pro Ala Gly

785 790 795 800

Gln His Asn Ile Asp Thr Leu Phe Ser Leu Tyr Arg Phe His Gln Trp

805 810 815

Ile Asn Gly Leu Gly Asn Pro Gly Ser Asp Thr Leu Asp Met Leu Arg

820 825 830

Gln Gln Thr Leu Thr Ala Asp Arg Leu Ala Ser Val Met Gly Leu Asp

835 840 845

Ile Ser Met Val Thr Gln Ala Met Val Ser Ala Gly Val Asn Gln Leu

850 855 860

Gln Cys Trp Gln Asp Ile Asn Thr Val Leu Gln Trp Ile Asp Val Ala

865 870 875 880

Ser Ala Leu His Thr Met Pro Ser Val Ile Arg Thr Leu Val Asn Ile

885 890 895

Arg Tyr Val Thr Ala Leu Asn Lys Ala Glu Ser Asn Leu Pro Ser Trp

900 905 910

Asp Glu Trp Gln Thr Leu Ala Glu Asn Met Glu Ala Gly Leu Ser Thr

915 920 925

Gln Gln Ala Gln Thr Leu Ala Asp Tyr Thr Ala Glu Arg Leu Ser Ser

930 935 940

Val Leu Cys Asn Trp Phe Leu Ala Asn Ile Gln Pro Glu Gly Val Ser

945 950 955 960

Leu Gln Ser Arg Asp Asp Leu Tyr Ser Tyr Phe Leu Ile Asp Asn Gln

965 970 975

Val Ser Ser Ala Val Lys Thr Thr Arg Leu Ala Glu Ala Ile Ala Gly

980 985 990

Ile Gln Leu Tyr Ile Asn Arg Ala Leu Asn Arg Ile Glu Pro Asn Ala

995 1000 1005

Arg Ala Asp Val Ser Thr Arg Gln Phe Phe Thr Asp Trp Thr Val Asn

1010 1015 1020

Asn Arg Tyr Asn Thr Trp Gly Gly Val Ser Arg Leu Val Tyr Tyr Pro

1025 1030 1035 1040

Glu Asn Tyr Ile Asp Pro Thr Gln Arg Ile Gly Gln Thr Arg Met Met

1045 1050 1055

Asp Glu Leu Leu Glu Asn Ile Ser Gln Ser Lys Leu Ser Arg Asp Thr

1060 1065 1070

Val Glu Asp Ala Phe Lys Thr Tyr Leu Thr Arg Phe Glu Thr Val Ala

1075 1080 1085

Asp Leu Lys Val Val Ser Ala Tyr His Asp Asn Val Asn Ser Asn Thr

1090 1095 1100

Gly Leu Thr Trp Phe Ile Gly Gln Thr Arg Glu Asn Leu Pro Glu Tyr

1105 1110 1115 1120

Tyr Trp Arg Asn Val Asp Ile Ser Arg Met Leu Ala Gly Lys Leu Ala

1125 1130 1135

Ala Asn Ala Trp Lys Glu Trp Thr Lys Ile Asp Thr Ala Val Asn Ser

1140 1145 1150

Tyr Lys Asp Ala Ile Arg Pro Val Ile Phe Arg Glu Arg Leu His Leu

1155 1160 1165

Ile Trp Val Glu Lys Asp Glu Val Ala Glu Asn Gly Thr Asn Pro Val

1170 1175 1180

Lys Thr Tyr Asp Arg Phe Thr Leu Lys Leu Ala Phe Leu Arg His Asp

1185 1190 1195 1200

Gly Ser Trp Ser Ala Pro Trp Ser Tyr Asp Ile Thr Thr Gln Val Glu

1205 1210 1215

Ala Val Thr Asp Lys Lys Pro Asp Thr Glu Arg Leu Ala Leu Ala Ala

1220 1225 1230

Ser Gly Phe Gln Gly Glu Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Tyr Lys Thr

1235 1240 1245

Gly Lys Ser Tyr Ser Asp Phe Gly Gly Ser Asn Lys Asn Val Ala Gly

1250 1255 1260

Met Thr Ile Tyr Gly Asp Gly Ser Leu Lys Lys Met Glu Asn Thr Ala

1265 1270 1275 1280

Leu Ser Arg Tyr Ser Gln Leu Lys Asn Thr Phe Asp Val Ile Asn Pro

1285 1290 1295

Gln Asp Asn Asp Leu Val Arg Lys Ala Ser Tyr Arg Phe Ser Gln Asp

1300 1305 1310

Phe Glu Val Pro Ala Ser Leu Asn Met Gly Phe Ala Ile Gly Asp Tyr

1315 1320 1325

Ser Leu Thr Val Met Glu Asn Gly Asn Ile Pro Gln Ile Thr Gly Lys

1330 1335 1340

Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Ala Ile Thr Leu His Asn Ala Ala Phe Thr

1345 1350 1355 1360

Val Arg Tyr Asp Gly Gly Gly Asn Val Ile Arg Asn Lys Gln Ile Ser

1365 1370 1375

Ala Met Lys Leu Thr Gly Val Asp Gly Lys Ser Gln Tyr Gly Asn Ala

1380 1385 1390

Phe Ile Ile Ala Asn Thr Leu Lys His Tyr Gly Gly Tyr Ser Asp Leu

1395 1400 1405

Gly Gly Pro Ile Ala Val Tyr Asn Lys Thr Lys Asn Tyr Ile Ala Ser

1410 1415 1420

Val Gln Asp Arg Leu Tyr Asn Pro Asp Tyr Arg Arg Arg Leu Ile Leu

1425 1430 1435 1440

Thr Pro Val Glu Asn Asn Tyr Tyr Ala Lys Leu Phe Glu Phe Pro Phe

1445 1450 1455

Ser Pro Asn Thr Ile Arg Asn Thr Val Phe Lys Val Gly Ser Asn Arg

1460 1465 1470

Thr Ser Glu Phe Lys Lys Cys Asn Tyr Ala Glu Asp Gly Asn Asn Asp

1475 1480 1485

Ala Gly Phe Gln Val Phe Ser Ser Tyr Gln Ser Ser Gly Trp Leu Asp

1490 1495 1500

Ile Asp Thr Gly Ile Asn Asn Thr Asp Ile Lys Ile Thr Val Met Ala

1505 1510 1515 1520

Gly Ser Lys Thr His Thr Phe Thr Ala Ser Asp His Ile Ala Ser Leu

1525 1530 1535

Pro Ala Asn Ser Phe Asp Ala Met Pro Tyr Thr Phe Lys Pro Leu Glu

1540 1545 1550

Ile Asp Ala Ser Ser Leu Ser Phe Thr Asn Asn Ile Ala Pro Leu Asp

1555 1560 1565

Ile Val Phe Glu Thr Lys Ala Lys Asp Gly Arg Val Leu Gly Lys Ile

1570 1575 1580

Lys Gln Thr Leu Ser Val Lys Arg Val Asn Tyr Asn Pro Glu Asp Ile

1585 1590 1595 1600

Leu Leu Leu Arg Glu Thr His Ser Gly Ala Gln Tyr Met Gln Leu Gly

1605 1610 1615

Val Tyr Arg Ile Arg Leu Asn Thr Leu Leu Ala Ser Gln Leu Val Ser

1620 1625 1630

Arg Ala Asn Thr Gly Ile Asp Thr Ile Leu Thr Met Glu Thr Gln Gln

1635 1640 1645

Leu Pro Glu Pro Gln Leu Gly Lys Gly Phe Tyr Ala Thr Phe Thr Leu

1650 1655 1660

Pro Pro Tyr Asn Ser Ala Thr His Gly Thr Ser Arg Ala Phe Gln Leu

1665 1670 1675 1680

Asn Leu Lys His Val Val Asp Asp Lys Val His Ala Ile Arg Ser Gly

1685 1690 1695

Leu Leu Gln Asp Thr Glu Phe Ala Val Arg Leu Phe Ile Pro Leu Asp

1700 1705 1710

Asp Thr Pro Leu His Asp Glu Tyr Ile Ala Lys Val Phe Leu Thr Thr

1715 1720 1725

Gln Lys Asn Arg Asn Asp Val Pro Asn Val Gly Ala His Phe Lys Tyr

1730 1735 1740

Asp Lys Ser Asn Asn Asn Arg Ile Val Ile Asn Asp Asp Ile Ser Asp

1745 1750 1755 1760

Ile Ser Met Phe Ala Gly Ile Gln Ile His Asn Gly Glu Thr Thr Glu

1765 1770 1775

Pro Leu Asp Phe Asn Ser Ala Cys Ala Leu Tyr Tyr Trp Glu Leu Phe

1780 1785 1790

Tyr Tyr Thr Pro Met Met Cys Phe Gln Arg Leu Leu Gln Glu Lys Gln

1795 1800 1805

Phe Asp Glu Ala Thr Gln Trp Ile Asn Tyr Val Tyr Asn Pro Ala Gly

1810 1815 1820

Tyr Ile Val Asn Gly Glu Ile Ala Pro Trp Ile Trp Asn Cys Arg Pro

1825 1830 1835 1840

Leu Glu Glu Thr Thr Ser Trp Asn Ala Asn Pro Leu Asp Ala Ile Asp

1845 1850 1855

Pro Asp Ala Val Ala Gln Tyr Asp Pro Thr His Tyr Lys Val Ala Thr

1860 1865 1870

Phe Met Arg Leu Leu Asp Gln Leu Ile Leu Arg Gly Asp Met Ala Tyr

1875 1880 1885

Arg Glu Leu Thr Arg Asp Ala Leu Asn Glu Ala Lys Met Trp Tyr Val

1890 1895 1900

Arg Ala Leu Glu Leu Leu Gly Asp Glu Pro Glu Asp Tyr Gly Ser Gln

1905 1910 1915 1920

Gln Trp Ala Ala Pro Ser Leu Ser Val Ala Ala Ser His Thr Val Gln

1925 1930 1935

Ala Ala Tyr Gln Gln Asp Leu Thr Ala Leu Asp Asn Gly Glu Val Ala

1940 1945 1950

Thr Gln Pro Arg Thr Ala Asn Ser Leu Val Gly Leu Phe Leu Pro Glu

1955 1960 1965

Tyr Asn Pro Ala Leu Thr Asp Tyr Trp Gln Thr Leu Arg Leu Arg Leu

1970 1975 1980

Phe Asn Leu Arg His Asn Leu Ser Ile Asp Gly Gln Pro Leu Ser Leu

1985 1990 1995 2000

Ala Ile Tyr Ala Glu Pro Thr Asp Pro Lys Ala Leu Leu Thr Ser Met

2005 2010 2015

Val Gln Ala Ser Gln Gly Gly Ser Ala Val Leu Pro Gly Thr Leu Ser

2020 2025 2030

Leu Tyr Arg Phe Pro Val Met Leu Glu Arg Thr Arg Asn Leu Val Ala

2035 2040 2045

Gln Leu Thr Gln Phe Gly Thr Ser Leu Leu Ser Met Ala Glu His Asp

2050 2055 2060

Asp Ala Asp Glu Leu Thr Thr Leu Leu Leu Gln Gln Gly Met Glu Leu

2065 2070 2075 2080

Ala Thr Gln Ser Ile Arg Ile Gln Gln Arg Thr Val Asp Ala Val Asp

2085 2090 2095

Ala Asp Ile Ala Val Leu Ala Glu Ser Arg Arg Ser Ala Gln Asn Arg

2100 2105 2110

Leu Glu Lys Tyr Gln Gln Leu Tyr Asp Glu Asp Ile Asn His Gly Glu

2115 2120 2125

Gln Arg Ala Met Ser Leu Leu Asp Ala Ala Ala Gly Gln Ser Leu Ala

2130 2135 2140

Gly Gln Val Leu Ser Ile Ala Glu Gly Val Ala Asp Leu Val Pro Asn

2145 2150 2155 2160

Val Phe Gly Leu Ala Cys Gly Gly Ser Arg Trp Gly Ala Ala Leu Arg

2165 2170 2175

Ala Ser Ala Ser Val Met Ser Leu Ser Ala Thr Ala Ser Gln Tyr Ser

2180 2185 2190

Ala Asp Lys Ile Ser Arg Ser Glu Ala Tyr Arg Arg Arg Arg Gln Glu

2195 2200 2205

Trp Glu Ile Gln Arg Asp Asn Ala Asp Gly Glu Val Lys Gln Met Asp

2210 2215 2220

Ala Gln Leu Glu Ser Leu Lys Ile Arg Arg Glu Ala Ala Gln Met Gln

2225 2230 2235 2240

Val Glu Tyr Gln Glu Thr Gln Gln Ala His Thr Gln Ala Gln Leu Glu

2245 2250 2255

Leu Leu Gln Arg Lys Phe Thr Asn Lys Ala Leu Tyr Ser Trp Met Arg

2260 2265 2270

Gly Lys Leu Ser Ala Ile Tyr Tyr Gln Phe Phe Asp Leu Thr Gln Ser

2275 2280 2285

Phe Cys Leu Met Ala Gln Glu Ala Leu Arg Arg Glu Leu Thr Asp Asn

2290 2295 2300

Gly Val Thr Phe Ile Arg Gly Gly Ala Trp Asn Gly Thr Thr Ala Gly

2305 2310 2315 2320

Leu Met Ala Gly Glu Thr Leu Leu Leu Asn Leu Ala Glu Met Glu Lys

2325 2330 2335

Val Trp Leu Glu Arg Asp Glu Arg Ala Leu Glu Val Thr Arg Thr Val

2340 2345 2350

Ser Leu Ala Gln Phe Tyr Gln Ala Leu Ser Ser Asp Asn Phe Asn Leu

2355 2360 2365

Thr Glu Lys Leu Thr Gln Phe Leu Arg Glu Gly Lys Gly Asn Val Gly

2370 2375 2380

Ala Ser Gly Asn Glu Leu Lys Leu Ser Asn Arg Gln Ile Glu Ala Ser

2385 2390 2395 2400

Val Arg Leu Ser Asp Leu Lys Ile Phe Ser Asp Tyr Pro Glu Ser Leu

2405 2410 2415

Gly Asn Thr Arg Gln Leu Lys Gln Val Ser Val Thr Leu Pro Ala Leu

2420 2425 2430

Val Gly Pro Tyr Glu Asp Ile Arg Ala Val Leu Asn Tyr Gly Gly Ser

2435 2440 2445

Ile Val Met Pro Arg Gly Cys Ser Ala Ile Ala Leu Ser His Gly Val

2450 2455 2460

Asn Asp Ser Gly Gln Phe Met Leu Asp Phe Asn Asp Ser Arg Tyr Leu

2465 2470 2475 2480

Pro Phe Glu Gly Ile Ser Val Asn Asp Ser Gly Ser Leu Thr Leu Ser

2485 2490 2495

Phe Leu Asp Ala Thr Asp Arg Gln Lys Ala Leu Leu Glu Ser Leu Ser

2500 2505 2510

Asp Ile Ile Leu His Ile Arg Tyr Thr Ile Arg Ser ***

2515 2520

Claims

1.一种嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质在制备抑制农作物害虫幼虫生长的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质在制备抑制农作物害虫幼虫生长的药物中的应用，其特征在于，所述的农作物害虫幼虫为棉铃虫、小菜蛾、玉米螟和甜菜夜蛾。

4.一种编码如权利要求1所述的嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

5.根据权利要求4所述的嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质基因用于转基因植物的培育。

6.根据权利要求5所述的嗜线虫致病杆菌拒食蛋白质基因用于转基因植物的培育，其特征在于，所述的植物为烟草。