CN112063543A - 一种产脲酶细菌及其在制备用于防治烟草根结线虫病的菌剂中的应用 - Google Patents

一种产脲酶细菌及其在制备用于防治烟草根结线虫病的菌剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产脲酶细菌及其在制备用于防治烟草根结线虫病的菌剂中的应用，属微生物肥料、微生物农药技术领域。本发明的一种产脲酶细菌，该菌株为产脲酶细菌；保藏名称为天洞不粘柄菌Asticcacaulis tiandongensis3.1105菌株；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2020年6月22日；保藏编号：CCTCC No:M 2020232。本发明利用3.1105菌株产生的脲酶催化尿素产生氨气而杀死线虫，利用3.1105菌株及尿素制备的菌剂能高效防治烟草根结线虫病，具有使用成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点。

Description

一种产脲酶细菌及其在制备用于防治烟草根结线虫病的菌剂 中的应用
技术领域
本发明涉及微生物农药技术领域，具体涉及一种产脲酶细菌及其在制备用于防治烟草根结线虫病的菌剂中的应用。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne spp.)是多种农作物的重要病原，在全球每年造成的经济损失在9年前已高达1570亿美元(Oka et al., 2009)。随着国家“两减”目标的提出，利用线虫天敌微生物研发的生物杀线剂，因其对人畜、环境的安全性一直被研究人员和市场寄予厚望。很多研究表明NH3对病原线虫具有很好的杀灭效果：Oka& Pivonia(2002)发现10种能释放NH3或NH4 +的肥料化合物对根结线虫(M.javanica)具有良好杀灭活性，NH4OH的杀线虫活性最高， NH4OH在500-1000kg N/ha用量下能降低根结线虫危害和提高番茄产量。通过提高土壤pH使(NH4)2SO4释放NH3而杀线虫(Oka et al., 2006)。熟石灰与鸡粪等有机物混合使用释放的NH3能有效控制根结线虫病害(Oka,2010)。石灰与NH4HCO3混合释放NH3、NH4 +熏蒸土壤能有效抑制植物寄生线虫(Sun et al.,2017)。然而，直接施用工业氨水耗时耗力、成本较高，加之氨水在运输、储存过程中的潜在风险，在农业种植中很难推广；因此，利用生物源NH3防治植物病原线虫备受关注。
脲酶(EC:3.5.1.5)专一性催化尿素水解成NH3和CO2(Dixon etal.,1975)。发明人在前期工作中报道了利用细菌脲酶催化尿素释放 NH3对根结线虫病有很好的防效(Fu etal.,2015)。天洞不粘柄菌 (Asticcacaulis tiandongensis)3.1105菌株是刚本发明人刚发表的一细菌新物种(Zhou et al.,2019)，在后续研究中，本发明人发现3.1105 菌株具有高产脲酶的特性，本发明利用3.1105菌株与尿素组合研制用于防控烟草根结线虫病的微生物菌剂。
目前，缺乏一株安全环保的产脲酶细菌及其在制备用于防治烟草根结线虫病的菌剂中的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之不足，本发明的目的是提供一株安全环保的产脲酶细菌及其在制备用于防治烟草根结线虫病的菌剂中的应用。
为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案的如下：本发明的一种产脲酶细菌，该菌株为产脲酶细菌；保藏名称为天洞不粘柄菌 Asticcacaulistiandongensis3.1105菌株；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2020年6 月22日；保藏编号：CCTCC No:M 2020232。
进一步地，所述的洞不粘柄菌3.1105菌株为革兰氏阴性好氧菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，30℃下培养2天，菌落直径1-4mm，淡黄色，光滑，圆形、稍凸起；细胞圆杆状，宽0.3-0.5μm，长0.7-1.5 μm，细胞具游动性。
进一步地，所述的菌株该菌株在10-40℃的温度范围内生长，最适生长温度30℃；在pH5.0-8.0的范围内生长良好，最适生长pH为 7.0；耐受NaCl的最高浓度为1％(W/V)。
本发明所述的产脲酶细菌制备的产脲酶细菌菌剂。
进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)权利要求1所述的产脲酶细菌的发酵培养物；
(b)权利要求1所述的产脲酶细菌细胞的超声裂解上清；
(c)权利要求1所述的产脲酶细菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的产脲酶细菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，30℃下培养2天后获得斜面种子；
(2)菌株液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，160rpm条件下摇床培养3天获得液体种子；
(3)菌株发酵罐大量培养：将液体种子按3％(V/V)的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在500升发酵罐中的培养条件控制在：温度30℃，搅拌速度150rpm，发酵时间60小时；
(4)菌株微生物菌剂的制备：经发酵罐培养获得的菌体及其代谢物300升，用离心机在8000-10000rpm下离心20min，去除上清液200升后将剩余物震荡悬浮，加入质量比为5％-30％的尿素及适量的硅藻土，充分混合后在65℃以下烘干至水分含量小于10％，粉碎后制成，制得产脲酶细菌菌剂。
进一步地，所述的产脲酶细菌菌剂中，尿素含量在5％到30％之间，洞不粘柄菌3.1105菌株的有效活菌数在3.0×109个/克以上。
本发明所述的产脲酶细菌菌株在制备用于防治烟草根结线虫病的菌剂中的应用。
有益效果：本发明利用3.1105菌株产生的脲酶催化尿素产生氨气而杀死线虫，利用3.1105菌株及尿素制备的菌剂能高效防治烟草根结线虫病，具有使用成本低、防效高、无残留、对人畜安全，安全环保的特点。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、利用3.1105菌株制备的微生物菌剂对烟草根结线虫病有很好的防治效果，防效在60％以上。
2、利用3.1105菌株制备的微生物菌剂具有使用成本低、无残留、对人畜安全的特点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详述。实施例中的微生物菌剂按微生物发酵常规和菌剂制备常规方法制成。
实施例1
本发明的一种产脲酶细菌，该菌株为产脲酶细菌；保藏名称为天洞不粘柄菌Asticcacaulis tiandongensis3.1105菌株；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2020年6月22日；保藏编号：CCTCC No:M2020232。
所述的洞不粘柄菌3.1105菌株为革兰氏阴性好氧菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，30℃下培养2天，菌落直径3mm，淡黄色，光滑，圆形、稍凸起；细胞圆杆状，宽0.4μm，长0.7μm，细胞具游动性。
所述的菌株该菌株在30℃的温度范围内生长，最适生长温度 30℃；在pH8.0时生长良好；耐受NaCl的最高浓度为1％(W/V)。
本发明所述的产脲酶细菌制备的产脲酶细菌菌剂。
其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的产脲酶细菌的发酵培养物；
(b)所述的产脲酶细菌细胞的超声裂解上清；
(c)所述的产脲酶细菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的产脲酶细菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，30℃下培养2天后获得斜面种子；
(2)菌株液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，160rpm条件下摇床培养3天获得液体种子；
(3)菌株发酵罐大量培养：将液体种子按3％(V/V)的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在500升发酵罐中的培养条件控制在：温度30℃，搅拌速度150rpm，发酵时间60小时；
(4)菌株微生物菌剂的制备：经发酵罐培养获得的菌体及其代谢物300升，用离心机在8000-10000rpm下离心20min，去除上清液200升后将剩余物震荡悬浮，加入质量比为5％-30％的尿素及适量的硅藻土，充分混合后在65℃以下烘干至水分含量小于10％，粉碎后制成，制得产脲酶细菌菌剂。
所述的产脲酶细菌菌剂中，尿素含量在5％到30％之间，洞不粘柄菌3.1105菌株的有效活菌数在3.0×109个/克以上。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：
所述的洞不粘柄菌3.1105菌株为革兰氏阴性好氧菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，30℃下培养2天，菌落直径1mm，淡黄色，光滑，圆形、稍凸起；细胞圆杆状，宽0.3μm，长1.5μm，细胞具游动性。
所述的菌株该菌株在10℃的温度范围内生长，最适生长温度 30℃；在pH5.0时生长良好；耐受NaCl的最高浓度为1％(W/V)。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：
所述的洞不粘柄菌3.1105菌株为革兰氏阴性好氧菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，30℃下培养2天，菌落直径4mm，淡黄色，光滑，圆形、稍凸起；细胞圆杆状，宽0.5μm，长1.2μm，细胞具游动性。
所述的菌株该菌株在40℃的温度范围内生长，最适生长温度 30℃；在pH7.0时生长良好，最适生长pH为7.0；耐受NaCl的最高浓度为1％(W/V)。
试验例1
1.3.1105菌株的脲酶活性测定
用常规LB平板活化3.1105菌株，并接种至LB培养液中37℃、黑暗、180rpm条件下震荡培养至OD＝0.5时测定细菌脲酶活性。在9 mL的1.11M的尿素溶液中加入1mL细菌悬浮液，在37℃、黑暗、 100rpm条件下反应2h，加入2M的KCl溶液40mL提取溶液铵离子，用靛酚兰法测定铵离子浓度，每个菌株的脲酶活性被独立重复测定3次。脲酶活性单位(U)定义为单位体积(mL)单位时间(min) 水解尿素的质量(mg)。以LB培养基为空白对照。
测定结果：对照LB培养基中的尿素含量为0，而3.1105菌株培养液中的脲酶含量为18.52U。
试验例2
本发明的3.1105菌株的培养及微生物菌剂制备
3.1105菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，30℃下培养2天后获得斜面种子。
3.1105菌株液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，160rpm条件下摇床培养3天获得液体种子。
3.1105菌株发酵罐大量培养：将液体种子按3％(V/V)的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在500升发酵罐中的培养条件控制在：温度30℃，搅拌速度150rpm，发酵时间60小时。
3.1105菌株微生物菌剂的制备：经发酵罐培养获得的菌体及其代谢物300升，用离心机在8000-10000rpm下离心20min，去除上清液200升后将剩余物震荡悬浮，加入质量比为5％-30％的尿素及适量的硅藻土，充分混合后在65℃以下烘干至水分含量小于10％，粉碎后制成。需保证3.1105菌株在菌剂中的活菌数含量在3.0×109个/克以上。
3.不同尿素含量的3.1105菌剂对烟草根结线虫卵和幼虫的杀灭效果试验
供试菌剂：按本发明上述方法分别制备尿素含量分别为5％、20％和30％的3.1105菌剂，各菌剂中3.1105菌株的细胞活菌数含量均为 3.5×109个/克。
生测试验：从云南省峨山县烟田中采集被根结线虫感染的烟株，取根瘤带回实验室，用解剖针从根瘤上挑取卵块，放置于纱网上，将载有卵块的纱网放于培养皿中，加自来水浸泡，之后放置在20℃的温箱中孵化5天，用漏斗过滤获得根结线虫二龄幼虫，将其浓度调整为约5000条/毫升。取一部分刚挑取的新鲜卵块放入1.5％的次氯酸钠溶液中浸泡3分钟以消解卵囊，8000rpm离心2分钟收集卵粒，将卵粒悬浮于自来水中，将浓度调整到约5000粒/毫升。
取上述3.1105菌剂，分别用自来水稀释500倍，各取2毫升于直径2厘米的塑料培养皿中，每皿中加入10微升幼虫悬液或卵悬液，以相同浓度的尿素溶液为对照。每处理3个重复，将各处理的培养皿放入28℃温箱中，于2天时测定线虫幼虫致死率，于7天时测定卵致死率。
幼虫死亡率(％)＝死亡线虫数÷计数线虫总数×100
幼虫校正死亡率(％)＝菌剂处理的幼虫死亡率-相应含量尿素溶液处理的线虫死亡率
卵孵化率(％)＝线虫幼虫数÷计数卵总数×100
卵校正孵化率(％)＝菌剂处理的孵化率-相应含量尿素溶液处理的孵化率
试验结果：从表1可以看出，尿素含量分别为5％、20％和30％的3.1105菌剂稀释500倍时，对烟草根结线虫幼虫的致死率分别为 86.41％、95.82％和91.35％，以含20％尿素的菌剂效果最好。尿素含量分别为5％、20％和30％的3.1105菌剂稀释500倍时，对烟草根结线虫卵的孵化率有显著的抑制效果，校正孵化率分别为17.64％、4.75％和8.97％，以含20％尿素的菌剂效果最好。不同尿素含量的 3.1105菌剂对烟草根结线虫卵和幼虫的杀灭效果如表1所示：
表1
Figure BDA0002593117070000081
试验例3
本发明的微生物菌剂防治烟草根结线虫病的温室试验
供试菌剂：按本发明上述方法分别制备尿素含量分别为5％、20％和30％的3.1105菌剂，各菌剂中3.1105菌株的细胞活菌数含量均为 3.5×109个/克。
盆栽试验：按上述方法制备烟草根结线虫幼虫。烤烟种子(品种：红花大金元)按常规方法漂浮育苗，待烟苗长至5-6片叶时移栽于直径15cm、装有500g土壤(沙土:腐殖土＝1:1)的花钵中，每钵一株。用自来水将菌剂稀释500倍，浇灌于烟株根围，100毫升/株。每处理3个重复，每重复5钵，以同等体积的自来水为对照；移栽2天后接种线虫悬液，10毫升/株。将所有花钵移入温度25-35℃、相对湿度55-50％的温室中，60天时拔出烟株，按以下标准进行根瘤分级并计算防效。根瘤分级按0-5级进行(Oka et al.,Pest Manag Sci.2012,68:268-275)，0级：无根瘤，1级：1-20％的根有根瘤，2级：21-40％的根有根瘤，3级：41–60％的根有根瘤，4级：61–80％的根有根瘤，5 级：81-100％的根有根瘤。病情指数及防效的计算公式如下(Wang et al.,2012,Phytopathology，102:267-271)：
病情指数(％)＝(n1×1+n2×2+n3×3+n4×4+n5×5)/(S×5)×100
n1-n5表示该根瘤级别的植株数量，S表示调查的植株总数。
防效(％)＝100(1-x/y)；x、y分别代表处理和对照的病情指数。
试验结果：尿素含量为5％、20％和30％的3.1105菌剂在稀释500 倍情况下对烟草根结线虫病的防效分别为61.57％、74.36％和79.28％。说明该菌剂可用于烟草根结线虫病的防治。不同尿素含量的3.1105 菌剂对烟草根结线虫病的温室防效如表2所示：
表2
Figure BDA0002593117070000091
4.本发明的微生物菌剂防治烟草根结线虫病的田间试验
供试菌剂：按本发明上述方法分别制备尿素含量分别为5％、20％和30％的3.1105菌剂，各菌剂中3.1105菌株的细胞活菌数含量均为 3.5×109个/克。
田间试验：验地点为云南省普洱市宁洱县烟草根结线虫病成年严重发生的烟田。烤烟(品种：红花大金元)按常规方法育苗和移栽 10天时，将上述菌剂稀释500倍，每株烟浇灌200于根部，以清水做对照。移栽45天时按上述方法再施菌剂一次。试验期间按常规进行肥水管理。移栽90天时拔出烟株，按上述方法进行根瘤分级、病情指数和防效计算
试验结果：尿素含量为5％、20％和30％的3.1105菌剂在稀释500 倍情况下对烟草根结线虫病的田间防效分别为60.84％、72.18％和 83.64％。说明该菌剂可用于烟草大田中烟草根结线虫病的防治。不同尿素含量的3.1105菌剂对烟草根结线虫病的田间防效如表3所示：
表3
Figure BDA0002593117070000101
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种产脲酶细菌，其特征在于：该菌株为产脲酶细菌；保藏名称为天洞不粘柄菌Asticcacaulis tiandongensis3.1105菌株；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2020年6月22日；保藏编号：CCTCC No:M2020232。
2.根据权利要求1所述的产脲酶细菌，其特征在于：所述的洞不粘柄菌3.1105菌株为革兰氏阴性好氧菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，30℃下培养2天，菌落直径1-4mm，淡黄色，光滑，圆形、稍凸起；细胞圆杆状，宽0.3-0.5μm，长0.7-1.5μm，细胞具游动性。
3.根据权利要求1所述的产脲酶细菌，其特征在于：所述的菌株该菌株在10-40℃的温度范围内生长，最适生长温度30℃；在pH5.0-8.0的范围内生长良好，最适生长pH为7.0；耐受NaCl的最高浓度为1％(W/V)。
4.权利要求1所述的产脲酶细菌制备的产脲酶细菌菌剂。
5.根据权利要求4所述的产脲酶细菌菌剂，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)权利要求1所述的产脲酶细菌的发酵培养物；
(b)权利要求1所述的产脲酶细菌细胞的超声裂解上清；
(c)权利要求1所述的产脲酶细菌细胞的超声裂解沉淀。
6.权利要求5所述的产脲酶细菌菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，30℃下培养2天后获得斜面种子；
(2)菌株液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，160rpm条件下摇床培养3天获得液体种子；
(3)菌株发酵罐大量培养：将液体种子按3％(V/V)的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在500升发酵罐中的培养条件控制在：温度30℃，搅拌速度150rpm，发酵时间60小时；
(4)菌株微生物菌剂的制备：经发酵罐培养获得的菌体及其代谢物300升，用离心机在8000-10000rpm下离心20min，去除上清液200升后将剩余物震荡悬浮，加入质量比为5％-30％的尿素及适量的硅藻土，充分混合后在65℃以下烘干至水分含量小于10％，粉碎后制成，制得产脲酶细菌菌剂。
7.根据权利要求6所述的产脲酶细菌菌剂的制备方法，其特征在于：所述的产脲酶细菌菌剂中，尿素含量在5％到30％之间，洞不粘柄菌3.1105菌株的有效活菌数在3.0×109个/克以上。
8.权利要求1至7任一项所述的产脲酶细菌菌株在制备用于防治烟草根结线虫病的菌剂中的应用。
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