CN111154671A - 一种生防菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生防菌及其应用，本发明的一种生防菌，该菌株为生防菌；保藏名称为洞穴水杆菌Aquabacter cavernae Sn‑9‑2T菌株；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是湖北省武汉市洪山区八一路；保藏日期：2019年8月8日；保藏编号：CCTCC No:M 2019582。本发明的微生物菌体及其代谢产物，能与农药常规吸附载体和助剂混合制成Sn‑9‑2T菌剂。本发明利用Sn‑9‑2T菌株制备的菌剂，能高效防治三七、西洋参和当归根结线虫病，具有使用成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点。

Description

一种生防菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，尤其是涉及一种生防菌及其应用。
背景技术
云南道地药材主要有三七、当归、云附子、重楼等。2017年云南省中药材种植面积747万亩，农业产值348.9亿元；其中，三七的种植面积80余万亩，农业产值高达120亿元，位居云南省中药材产值首位(杨馨 等，2019)。根结线虫病早在10年前已成为三七种植的主要病害(杨沛文 等，2008)；近年来，根结线虫病在云南的三七、当归、云附子、黄精等10多种药材上扩展蔓延迅速、泛滥成灾、常常造成毁灭性危害。
三七等中药材一般直接入药，严格杜绝农残。灭线磷、涕灭威、呋喃丹等高毒高残化学杀线剂在中药材栽培中被禁用；阿维菌素几乎成为防治中药材根结线虫病的唯一可用药剂。随着线虫对阿维菌素抗药性的增强(Melissa et al., 2018)，长期依靠阿维菌素显然不能解决中药材根结线虫病的防控难题。在"减农药、减化肥"政策指引下，开发高效生物杀线剂已经成为“云药”产业可持续发展的迫切需求之一。
继利用捕食线虫真菌(Arthrobotrys robusta)开发的全球首个商品化线虫生防制剂(Royal 300)问世后，利用淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum，商品名：BioactWG，PL Gold)、厚垣孢普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia， KlamiC、线虫必克)登记的杀线剂已在国内外用于植物线虫病的防治。食线虫细菌致死线虫的毒力因子主要包括伴胞晶体蛋白(Cry)、侵染性酶、毒性小分子代谢物、活性挥发物等(Colagiero et al.,2017)。利用生防菌Bacillus firmus(商品名：BioNem、VoTiVo)、Pasteuria penetrans(Econem)、Burkholderia cepacia (Deny、BlueCircle)、Paenobacillus macerans&B.amyloliquefaciens(BioYield)、 Bacillus spp.mixture(Biostart)开发的杀线剂已在不同国家登记和应用(Priyank etal.,2019)。
目前，缺乏一种防治中药材根结线虫病的生防菌及其应用。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种防治中药材根结线虫病的生防菌及其应用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种生防菌，该菌株为生防菌；保藏名称为洞穴水杆菌Aquabacter cavernae Sn-9-2T菌株；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是湖北省武汉市洪山区八一路；保藏日期：2019年8月8日；保藏编号：CCTCCNo:M2019582。
进一步地，所述Sn-9-2T菌株为革兰氏阴性菌，在R2A培养基上，32℃下培养3天，菌落圆形，淡黄色，证件稍凸起，菌落直径1-2mm；细胞圆杆状，宽0.6-0.8μm，长1.3-2.0μm。
进一步地，所述的R2A培养基包括酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，K2HPO4 0.3g，MgSO4 0.024g，丙酮酸钠0.3g，重蒸水1000.0ml，琼脂15.0g，pH7.2。
更进一步地，所述的菌株在15-40℃的温度范围内生长，最适生长温度为 30℃；在pH5.0-9.0的范围内可以生长，最适生长pH为7.0-8.0；在R2A培养基上耐受NaCl的最高浓度为1％(W/V)。
本发明所述的生防菌制备的生防菌菌剂。
进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的生防菌的发酵培养物；
(b)所得生防菌细胞的超声裂解上清；
(c)所得生防菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明制备所述生防菌菌剂的方法，包括如下步骤：
(1)Sn-9-2T菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到R2A培养基斜面上， 30℃下培养3天后获得斜面种子；
(2)Sn-9-2T菌株液体种子培养：将斜面种子接种到装有R2A液体培养基的三角瓶中，30℃，200rpm条件下摇床培养3天获得液体种子；
(3)Sn-9-2T菌株发酵罐大量培养：将液体种子按5％(V/V)的比例接入发酵罐中的R2A液体培养基中，在500升发酵罐中的培养条件控制在：温度 30℃，搅拌速度150rpm，发酵时间72小时；
(4)Sn-9-2T菌剂制备：经发酵罐培养获得的Sn-9-2T菌体及其代谢物与适量的硅藻土混合后在50℃以下烘干或晾干至水分含量小于7％，粉碎后制成；需保证Sn-9-2T菌株在菌剂中的活菌数含量在5×109个/克以上，制得生防菌剂。
本发明所述的生防菌Sn-9-2T菌株在制备用于防治中药材根结线虫病的菌剂中的应用。
有益效果：本发明利用Sn-9-2T菌株制备的菌剂，能高效防治三七、西洋参和当归根结线虫病，具有使用成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)利用Sn-9-2T菌株制备的菌剂对中药材根结线虫病的防效可达68％以上。利用Sn-9-2T菌株制备的菌剂，能高效防治中药材根结线虫病，保障有机药材的安全生产。
(2)本发明的微生物菌体及其代谢产物，能与农药常规吸附载体和助剂混合制成Sn-9-2T菌剂。
(3)洞穴水杆菌(Aquabacter cavernae)Sn-9-2T菌株是本发明人2019年报道的一细菌新物种(Duo et al.,2019)。本发明人在近期的研究中首次发现 Sn-9-2T菌株对根结线虫二龄幼虫有较强的活性，该细菌利用该菌株制备的菌剂对三七根结线虫、西洋参根结线虫、当归根结线虫的防效在68％以上，具备良好的应用前景；而该细菌的杀线虫活性及其在根结线虫病中的应用未见报道。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
本发明的一种生防菌，该菌株为生防菌；保藏名称为洞穴水杆菌Aquabactercavernae Sn-9-2T菌株；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是湖北省武汉市洪山区八一路；保藏日期：2019年8月8日；保藏编号：CCTCC No:M 2019582。
所述Sn-9-2T菌株为革兰氏阴性菌，在R2A培养基上，32℃下培养3天，菌落圆形，淡黄色，证件稍凸起，菌落直径1-2mm；细胞圆杆状，宽0.6-0.8μm，长1.3-2.0μm。
所述的R2A培养基包括酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，K2HPO4 0.3g，MgSO4 0.024g，丙酮酸钠0.3 g，重蒸水1000.0ml，琼脂15.0g，pH7.2。
所述的菌株在15-40℃的温度范围内生长，最适生长温度为30℃；在pH 5.0-9.0的范围内可以生长，最适生长pH为7.0-8.0；在R2A培养基上耐受NaCl 的最高浓度为1％(W/V)。
本发明所述的生防菌制备的生防菌菌剂。其活性成分为如下(a)(b)(c) 中的至少一种：
(a)所述的生防菌的发酵培养物；
(b)所得生防菌细胞的超声裂解上清；
(c)所得生防菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明制备所述生防菌菌剂的方法，包括如下步骤：
(1)Sn-9-2T菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到R2A培养基斜面上， 30℃下培养3天后获得斜面种子；
(2)Sn-9-2T菌株液体种子培养：将斜面种子接种到装有R2A液体培养基的三角瓶中，30℃，200rpm条件下摇床培养3天获得液体种子；
(3)Sn-9-2T菌株发酵罐大量培养：将液体种子按5％(V/V)的比例接入发酵罐中的R2A液体培养基中，在500升发酵罐中的培养条件控制在：温度30℃，搅拌速度150rpm，发酵时间72小时；
(4)Sn-9-2T菌剂制备：经发酵罐培养获得的Sn-9-2T菌体及其代谢物与适量的硅藻土混合后在50℃以下烘干或晾干至水分含量小于7％，粉碎后制成；需保证Sn-9-2T菌株在菌剂中的活菌数含量在5×109个/克以上，制得生防菌剂。
本发明所述的生防菌Sn-9-2T菌株在制备用于防治中药材根结线虫病的菌剂中的应用。
实施例1
下面结合实施例对本发明作进一步的详述。实施例中的微生物菌剂，按微生物发酵常规方法及微生物菌剂制备常规方法制成。
1.本发明中Sn-9-2T菌株的培养及菌剂制备
Sn-9-2T菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到R2A培养基斜面上，30℃下培养3天后获得斜面种子。
Sn-9-2T菌株液体种子培养：将斜面种子接种到装有R2A液体培养基的三角瓶中，30℃，200rpm条件下摇床培养3天获得液体种子。
Sn-9-2T菌株发酵罐大量培养：将液体种子按5％(V/V)的比例接入发酵罐中的R2A液体培养基中，在500升发酵罐中的培养条件控制在：温度30℃，搅拌速度150rpm，发酵时间72小时。
Sn-9-2T菌剂制备：经发酵罐培养获得的Sn-9-2T菌体及其代谢物与适量的硅藻土混合后在50℃以下烘干或晾干至水分含量小于7％，粉碎后制成。需保证Sn-9-2T菌株在菌剂中的活菌数含量在5×109个/克以上。
2.Sn-9-2T菌剂防治三七根结线虫病的田间试验
试验地点：云南省砚山县三七研究院试验基地。
试验药材：三七。
供试药剂：Sn-9-2T菌剂，活菌数含量为5×109个/克，按本发明上述方法制备；10％噻唑膦颗粒剂，山东省联合农药工业有限公司生产。
试验方法：共设如下三个处理，每处理3个重复，每重复10平方米。
处理1：Sn-9-2T菌剂5公斤/亩。整地时，将菌剂均匀撒施于土面上，并用翻耕机将其混入土壤中，然后按常规方法移栽一年生三七苗。
处理2：10％噻唑膦颗粒剂2公斤/亩。整地时，将颗粒剂均匀撒施于土面上，并用翻耕机将其混入土壤中，然后按常规方法移栽一年生三七苗。
处理3：不施用任何杀线虫药剂的空白对照，按常规方法移栽一年生三七苗。
调查和统计方法：移栽180天后每处理随机取100株，对三七植株的根瘤进行病级定级(0级：无根瘤；1级：1-20％的根系有根瘤；2级：21-40％的根系有根瘤；3级：41-60％的根系有根瘤；4级：61-80％的根系有根瘤；5级：81-100％的根系有根瘤)，并按以下公式计算病情指数和防效：
病情指数(％)＝(n1×1+n2×2+n3×3+n4×4+n5×5)/(S×5)×100,n1-n5分别代表根瘤病级指数1-5级相应的植株总数，S代表调查的植株总数。
防效(％)＝100(1-x/y)，x、y分别代表处理和空白对照的病情指数。
试验结果：表1显示每亩施用5公斤Sn-9-2T菌剂对三七根结线虫病的防效高达72.5％，与每亩施用2公斤10％噻唑膦颗粒剂的防效相当(73.8％)。Sn-9-2T菌剂对三七根结线虫病的防效如表1所示：
表1
Figure RE-GDA0002432551760000061
3.Sn-9-2T菌剂防治西洋参根结线虫病的田间试验
试验地点：山东省文登县西洋参种植基地。
试验药材：西洋参。
供试药剂：Sn-9-2T菌剂，活菌数含量为5×109个/克，按本发明上述方法制备；10％噻唑膦颗粒剂，山东省联合农药工业有限公司生产。
试验方法：共设如下三个处理，每处理3个重复，每重复10平方米。
处理1：Sn-9-2T菌剂5公斤/亩。整地时，将菌剂均匀撒施于土面上，并用翻耕机将其混入土壤中，然后按常规方法移栽一年生西洋参苗。
处理2：10％噻唑膦颗粒剂2公斤/亩。整地时，将颗粒剂均匀撒施于土面上，并用翻耕机将其混入土壤中，然后按常规方法移栽一年生西洋参苗。
处理3：不施用任何杀线虫药剂的空白对照，按常规方法移栽一年生西洋参苗。
调查和统计方法：移栽180天后每处理随机取100株，对西洋参植株的根瘤进行病级定级(0级：无根瘤；1级：1-20％的根系有根瘤；2级：21-40％的根系有根瘤；3级：41-60％的根系有根瘤；4级：61-80％的根系有根瘤；5级： 81-100％的根系有根瘤)，并按以下公式计算病情指数和防效：
病情指数(％)＝(n1×1+n2×2+n3×3+n4×4+n5×5)/(S×5)×100,n1-n5分别代表根瘤病级指数1-5级相应的植株总数，S代表调查的植株总数。
防效(％)＝100(1-x/y)，x、y分别代表处理和空白对照的病情指数。
试验结果：表2显示每亩施用5公斤Sn-9-2T菌剂对西洋参根结线虫病的防效高达76.4％，略高于每亩施用2公斤10％噻唑膦颗粒剂的防效(72.7％)。 Sn-9-2T菌剂对西洋参根结线虫病的防效如表2所示：
表2
Figure RE-GDA0002432551760000071
4.Sn-9-2T菌剂防治当归根结线虫病的田间试验
试验地点：云南省寻甸县当归种植基地。
试验药材：当归。
供试药剂：Sn-9-2T菌剂，活菌数含量为5×109个/克，按本发明上述方法制备；10％噻唑膦颗粒剂，山东省联合农药工业有限公司生产。
试验方法：共设如下三个处理，每处理3个重复，每重复10平方米。
处理1：Sn-9-2T菌剂5公斤/亩。整地时，将菌剂均匀撒施于土面上，并用翻耕机将其混入土壤中，然后按常规方法播种当归种子。
处理2：10％噻唑膦颗粒剂2公斤/亩。整地时，将颗粒剂均匀撒施于土面上，并用翻耕机将其混入土壤中，然后按常规方法播种当归种子。
处理3：不施用任何杀线虫药剂的空白对照，按常规方法播种当归种子。
调查和统计方法：播种180天后每处理随机取100株，对当归植株的根瘤进行病级定级(0级：无根瘤；1级：1-20％的根系有根瘤；2级：21-40％的根系有根瘤；3级：41-60％的根系有根瘤；4级：61-80％的根系有根瘤；5级：81-100％的根系有根瘤)，并按以下公式计算病情指数和防效：
病情指数(％)＝(n1×1+n2×2+n3×3+n4×4+n5×5)/(S×5)×100,n1-n5分别代表根瘤病级指数1-5级相应的植株总数，S代表调查的植株总数。
防效(％)＝100(1-x/y)，x、y分别代表处理和空白对照的病情指数。
试验结果：表3显示每亩施用5公斤Sn-9-2T菌剂对当归根结线虫病的防效高达70.48％，略低于每亩施用2公斤10％噻唑膦颗粒剂的防效相当(76.2％)。Sn-9-2T菌剂对当归根结线虫病的防效如表3所示：
表3
Figure RE-GDA0002432551760000081
实际应用表明：利用Sn-9-2T菌株制备的菌剂，不仅能高效防治三七、西洋参和当归的根结线虫病，还具有使用成本低、无残留、对人畜安全的特点。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (8)

1.一种生防菌，其特征在于：该菌株为生防菌；保藏名称为洞穴水杆菌Aquabactercavernae Sn-9-2T菌株；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是湖北省武汉市洪山区八一路；保藏日期：2019年8月8日；保藏编号：CCTCC No:M 2019582。
2.根据权利要求1所述的生防菌，其特征在于：所述Sn-9-2T菌株为革兰氏阴性菌，在R2A培养基上，32℃下培养3天，菌落圆形，淡黄色，证件稍凸起，菌落直径1-2mm；细胞圆杆状，宽0.6-0.8μm，长1.3-2.0μm。
3.根据权利要求1所述的生防菌，其特征在于：所述的R2A培养基包括酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，K2HPO40.3g，MgSO40.024g，丙酮酸钠0.3g，重蒸水1000.0ml，琼脂15.0g，pH 7.2。
4.根据权利要求1所述的生防菌，其特征在于：所述的菌株在15-40℃的温度范围内生长，最适生长温度为30℃；在pH 5.0-9.0的范围内可以生长，最适生长pH为7.0-8.0；在R2A培养基上耐受NaCl的最高浓度为1％(W/V)。
5.根据权利要求1所述的生防菌制备的生防菌菌剂。
6.根据权利要求1所述的生防菌菌剂，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)权利要求1所述的生防菌的发酵培养物；
(b)权利要求1所得生防菌细胞的超声裂解上清；
(c)权利要求1所得生防菌细胞的超声裂解沉淀。
7.制备权利要求6所述生防菌菌剂的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)Sn-9-2T菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到R2A培养基斜面上，30℃下培养3天后获得斜面种子；
(2)Sn-9-2T菌株液体种子培养：将斜面种子接种到装有R2A液体培养基的三角瓶中，30℃，200rpm条件下摇床培养3天获得液体种子；
(3)Sn-9-2T菌株发酵罐大量培养：将液体种子按5％(V/V)的比例接入发酵罐中的R2A液体培养基中，在500升发酵罐中的培养条件控制在：温度30℃，搅拌速度150rpm，发酵时间72小时；
(4)Sn-9-2T菌剂制备：经发酵罐培养获得的Sn-9-2T菌体及其代谢物与适量的硅藻土混合后在50℃以下烘干或晾干至水分含量小于7％，粉碎后制成；需保证Sn-9-2T菌株在菌剂中的活菌数含量在5×109个/克以上，制得生防菌Sn-9-2T菌剂。
8.权利要求1至7任一项所述的生防菌Sn-9-2T菌株在制备用于防治中药材根结线虫病的菌剂中的应用。
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