CN108753659B - 一株多菌灵降解菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株多菌灵降解菌及其应用，属微生物降解化学农药残留技术领域。多菌灵降解菌为杀线虫氨鞘醇杆菌(Sphingobacterium nematocida)M‑SX103菌株，M‑SX103菌株已于2014年9月18日保存在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号：CGMCC No.9689。M‑SX103菌株在制备用于降解烟草栽培中烟叶和植烟土壤多菌农药灵残留的菌剂中的应用。本发明的有益效果在于：利用M‑SX103菌株制备的菌剂，能高效降解烟草种植中的多菌灵农药残留，具有使用成本低、无残留、对人畜安全的特点。

Description

一株多菌灵降解菌及其应用
技术领域：
本发明涉及一株多菌灵降解菌及其应用，属微生物降解化学农药残留技术领域。
背景技术：
多菌灵属于苯并咪唑类杀菌剂中的主要农药品种，苯并咪唑类杀菌剂具有较强内吸性和高效、广谱、低毒等特点，对植物病原真菌有较强的杀菌作用，广泛应用于蔬菜、水果等多种作物的真菌性病害防治。在中国，虽然多菌灵未登记用于烟草病害的防治，但多菌灵是农业生产中常用的农药，在烟叶生产中也较广泛用于防治烟草叶、茎、根多种真菌病害,如炭疽病、赤星病和低黑头病等。同时，登记用于防治烟草根黑腐病的甲基硫菌灵在烟株内也可以转化为多菌灵，该农药在烟草上的使用也导致多菌灵在烟叶上残留(李义强等，2017)。国际烟草合作研究中心(CORESTA)和中国烟草总公司企业标准中，规定了多菌灵的残留限量为2mg/kg(CORESTA guidance No.1-2013)。近年来烟叶中多菌灵农药残留检出率较高，对烟叶质量安全带来一定风险。烟叶烘烤后干烟叶中生物酶活性丧失，同时储存过程对烟叶水分含量和环境湿度有较严格要求，烟叶内含物或外源物质代谢缓慢，导致多菌灵农药残留降解较慢，半衰期为224-365天(李义强等，2017)。所以，对于多菌灵农药残留的降解主要在田间烟株生长期内完成。利用红球菌属(Rhodococcus)、拉乌尔菌属(Raoultella)等属的微生物降解多菌灵的良好效果已有报道(许敬亮等,2006；王呈玉等，2012)。Sphingobacterium nematocida M-SX103菌株是本发明人等2012年报道的一细菌新物种(Liu et al.,2012)，本发明人在近期的研究中首次发现M-SX103菌株对多菌灵具有高效降解能力，降解烟叶上的多菌灵残留效果显著；而该微生物降解农药残留的特性及其在烟草种植中的应用未见公开报道。
主要参考文献
CORESTA guidance No.1-2013.The concept and implementation of CPAguidance residue 1evel[DB/OL](2016-07).http://www.coresta.org/Guides/Guide-No01-GRLs(4th-Issue-July2016).pdf.
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李义强,周杨全,徐金丽,等.2017.烟叶中多菌灵农药残留的降解规律和影响因素.中国烟草学报，doi:10.16472/j.chinatobacco.2016.346.
许敬亮,王志春,王堃，等.2006.多菌灵降解菌株djl-6-2的分离鉴定及降解特性.中国环境科学，2006,26(3):307-310.
王呈玉,李明石,曲迪,等.2012.一株新的多菌灵高效降解菌的筛选与降解特性分析.农业环境科学学报，31(3):563-569.
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种多菌灵降解菌及其应用。
本发明是这样实现的：
本发明人采用内生细菌传统分离方法，从采自云南省玉溪市的烤烟叶片中获得了一株杀线虫氨鞘醇杆菌(Sphingobacterium nematocida)M-SX103菌株，M-SX103菌株已于2014年9月18日保存在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号：CGMCC No.9689。
S.nematocida M-SX103菌株为革兰氏阴性菌，在LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，补水至1,000ml,pH 7.0)上，30℃下培养3天，菌落呈黄色，圆形，边缘凸起，细胞圆杆状，直径0.4-0.8μm，长1.0-1.5μm，孢子不游动，革兰氏阴性。该菌株在10-40℃的温度范围内生长，最适生长温度35℃；在pH 6.0-9.0的范围内可以生长，最适生长pH为7.0；能够在浓度为0-3％的NaCl(W/V)范围内生长。利用通用引物27f和1492r经PCR扩增M-SX103菌株的16S rRNA基因获得的序列在GeneBank公共数据库的序列号为JF731241，此序列是鉴定该菌株的分子特征依据。M-SX103菌株的主要脂肪酸是异式十五碳饱和脂肪酸，占57.7％，是鉴别该菌的化学特征依据。
本发明的M-SX103菌株在制备用于降解烟草栽培中烟叶和植烟土壤多菌农药灵残留的菌剂中的应用。
本发明的微生物菌剂，按微生物发酵常规方法及微生物菌剂制备常规方法制成。
本发明的有益效果在于：
1、利用M-SX103菌株制备的菌剂处理土壤，对多菌灵残留的降解率达60％；M-SX103菌剂与有机肥混合使用时对土壤多菌灵残留的降解效果最好，达70％以上；M-SX103菌剂喷施到烤烟成株期叶片上时，对多菌灵的降解率达80％以上。
2、利用M-SX103菌株制备的菌剂，能高效降解烟草种植中的多菌灵农药残留，具有使用成本低、无残留、对人畜安全的特点。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步的详述。实施例中的微生物菌剂，按微生物发酵常规方法及微生物菌剂制备常规方法制成。
1.本发明中M-SX103菌株的培养及菌剂制备
M-SX103菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到LB培养基斜面上，15℃或37℃下培养1天或5天后获得斜面种子，适宜的培养条件是35℃下培养2天。
M-SX103菌株液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的LB液体培养基中，在15℃或37℃、80rpm或250rpm条件下摇床培养2天或7天。最适培养条件为35℃，160rpm条件下培养3天。
M-SX103菌株发酵罐大量培养：将液体种子按1％(V/V)或5％(V/V)的比例接入发酵罐中的LB液体培养基中，在20升或1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度26℃或32℃，搅拌速度150rpm或200rpm，发酵时间70小时或96小时。
M-SX103可湿性粉剂的制备：经发酵罐培养获得的微生物菌体及其代谢物与适量的硅藻土混合后在65℃以下烘干或晾干至水分含量小于5％，粉碎后制成。需保证M-SX103菌株在菌剂中的活菌数含量在1×109个/克以上。
2.本发明菌剂对田间烟叶多菌灵残留的降解效果试验
2.1试验方法
试验场地：云南省烟草农业研究院的烤烟栽培试验基地进行，供试烟叶为在田间生长了60天的烟叶，品种为红花大金元。
多菌灵溶液的配制：称取20mg多菌灵标准品(纯度99％，Sigma公司)，用5ml丙酮溶解,加入2滴吐温-20作乳化剂，然后用去离子水定容至100ml，配制成200mg/L的悬液。
M-SX103可湿性粉剂：按本发明上述方法制备，M-SX103有效活菌数为3×109个/克。
试验处理：将多菌灵溶液用自来水稀释100倍，然后在田间随机喷雾30片烟叶，每片叶子喷雾30ml。喷雾6小时后烟叶上的水分已自然凤干，此时取M-SX103可湿性粉剂10g溶于450ml自来水中，随机喷雾上述用多菌灵处理过的烟叶15片，每片叶子喷雾30ml。用10g硅藻土溶于450ml自来水喷雾剩余的15片(30ml/片)作为对照。田间肥水管理按常规进行。喷雾后的0天、3天、6天分别取样一次用于多菌灵残留量的测定；取样时，用直径为2cm的打孔器在处理和对照叶片上各随机取样20片。
烟叶多菌灵含量测定：将烟叶在60℃下烘干至恒重，然后按文献(中国烟草总公司.YQ/T47.2-2015烟草及烟草制品多种农药残留量的测定:高效液相色谱-串联质谱联用法.北京:中国标准出版社,2015:1-15)进行样品处理和多菌灵含量测定，并按以下公式计算多久降解率。
多菌灵降解率(％)＝(C0-Ci)/C0×100％；式中：C0为刚喷雾时的多菌灵浓度，Ci为第i天测定的多菌灵浓度。
2.2试验结果
从表1的对照组能够看出，喷施到烟叶上的多菌灵在自然条件下降解率很低，第3天、6天时的降解率仅为3.25％和5.47％；而喷施M-SX103可湿性粉剂后多菌灵被快速降解，第3天、6天时的降解率分别高达86.62％和97.21％；扣除对照的自然降解率后，第3天的降解率为83.37％和91.74％；
表1 M-SX103可湿性粉剂对烟叶多菌灵的降解率
Figure BDA0001702335390000051
3.本发明菌剂对植烟土壤多菌灵残留的降解效果试验
3.1试验方法
试验场地：在云南省烟草农业研究院的烤烟栽培试验基地选取多菌灵残留量大的地块进行，供试烤烟品种为红花大金元。
多菌灵溶液的配制：称取20mg多菌灵标准品(纯度99％，Sigma公司)，用5ml丙酮溶解,加入2滴吐温-20作乳化剂，然后用去离子水定容至100ml，配制成200mg/L的悬液。
M-SX103可湿性粉剂：按本发明上述方法制备，M-SX103有效活菌数为3×109个/克。
实验处理：在整地时将M-SX103可湿性粉剂(用量：5公斤/亩)与适量的田间细土混匀后均匀撒施于土面上并喷施多菌灵溶液(50升/亩)，然后用旋耕机将土面上的M-SX103可湿性粉剂和多菌灵农药混入土壤中，移栽烟苗。以等量硅藻土替代M-SX103可湿性粉剂的处理最为对照。每个处理3个重复，每个重复的面积为30平方米；田间肥水管理按常规进行。分别在移栽烟苗时的0天，30天、60天各取样一次土样用于多菌灵含量测定。取样时按5点取样法从每个处理的3个重复中分别取5份土样(100克/份)，然后将土样混合，作为该处理的样品。
土壤多菌灵含量测定：将土样自然晾干，粉碎，过100目筛子，在60℃下烘干至恒重；然后按文献(中国烟草总公司.YQ/T47.2-2015烟草及烟草制品多种农药残留量的测定:高效液相色谱-串联质谱联用法.北京:中国标准出版社,2015:1-15)进行样品处理和多菌灵含量测定，并按以下公式计算多久降解率。
多菌灵降解率(％)＝(C0-Ci)/C0×100％；式中：C0为刚喷雾时的多菌灵浓度，Ci为第i天测定的多菌灵浓度。
3.2试验结果
从表2的对照组可以看出，土壤中的多菌灵在自然条件下也被降解，第3天、6天时的降解率分别为7.54％和14.81％；而施用M-SX103可湿性粉剂后促进了多菌灵的降解，第3天、6天时的降解率分别高达65.67％和78.92％；扣除对照的自然降解率后，第3天、6天时的降解率为58.13％和64.11％。
表2 M-SX103可湿性粉剂对植烟土壤多菌灵的降解率
Figure BDA0001702335390000061
4.本发明菌剂与有机肥混用对植烟土壤多菌灵残留的降解效果试验
4.1试验方法
试验场地：在云南省烟草农业研究院的烤烟栽培试验基地选取多菌灵残留量大的地块进行，供试烤烟品种为红花大金元。
多菌灵溶液的配制：称取20mg多菌灵标准品(纯度99％，Sigma公司)，用5ml丙酮溶解,加入2滴吐温-20作乳化剂，然后用去离子水定容至100ml，配制成200mg/L的悬液。
M-SX103可湿性粉剂：按本发明上述方法制备，M-SX103有效活菌数为3×109个/克。
有机肥：烟草专用有机肥(有机质55％，水分25％)，云南云叶化肥股份有限公司生产。
实验处理：在整地时将M-SX103可湿性粉剂(用量：5公斤/亩)与有机肥(500公斤/亩)混合均匀后均匀撒施于土面上并喷施多菌灵溶液(50升/亩)，然后用旋耕机将土面上的有机肥、M-SX103可湿性粉剂和多菌灵农药混入土壤中，移栽烟苗。以等量硅藻土替代M-SX103可湿性粉剂与等量有机肥混合的处理最为对照。每个处理3个重复，每个重复的面积为30平方米；田间肥水管理按常规进行。分别在移栽烟苗时的0天，30天、60天各取样一次土样用于多菌灵含量测定。取样时按5点取样法从每个处理的3个重复中分别取5份土样(100克/份)，然后将土样混合，作为该处理的样品。
土壤多菌灵含量测定：将土样自然晾干，粉碎，过100目筛子，在60℃下烘干至恒重；然后按文献(中国烟草总公司.YQ/T47.2-2015烟草及烟草制品多种农药残留量的测定:高效液相色谱-串联质谱联用法.北京:中国标准出版社,2015:1-15)进行样品处理和多菌灵含量测定，并按以下公式计算多久降解率。
多菌灵降解率(％)＝(C0-Ci)/C0×100％；式中：C0为刚喷雾时的多菌灵浓度，Ci为第i天测定的多菌灵浓度。
4.2试验结果
从表3的对照组可以看出，土壤中的多菌灵在自然条件下也被降解，第3天、6天时的降解率分别为10.31％和13.57％；而施用M-SX103可湿性粉剂后和有机肥后，土壤中多菌灵的降解率大大提高，第3天、6天时的降解率分别高达87.23％和93.17％；扣除对照的自然降解率后，第3天、6天时的降解率为76.92％和79.6％。与上一试验结果比较可以看出，M-SX103可湿性粉剂与有机肥配合使用对土壤多菌灵的降解效果优于M-SX103可湿性粉剂单独使用的效果。
表3 M-SX103可湿性粉剂与有机肥混用对植烟土壤多菌灵的降解率
Figure BDA0001702335390000071
实际应用部署明：利用M-SX103菌株制备的菌剂，不仅能高效降解烟草种植中的多菌灵农药残留，还具有使用成本低、无残留、对人畜安全的特点。

Claims (1)

1.一株保藏号为CGMCC No.9689的杀线虫氨鞘醇杆菌（Sphingobacterium nematocida）M-SX103菌株在制备用于降解烟草栽培中烟叶和植烟土壤多菌灵农药残留的菌剂中的应用。
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