CN110791445B - 一种解淀粉芽孢杆菌及生物药肥 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌及生物药肥，一种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus sp.)的保藏编号为CGMCC No.15110。解淀粉芽孢杆菌用于制备生物药肥的应用。一种生物药肥，经发酵的有机肥98‑99.8份，解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂0.2‑2份。发明的优点是可以预防和控制植物病害，并提高植物的品质。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及生物药肥
技术领域
本发明属于微生物肥料与农药技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌及生物药肥。
背景技术
近年来，随着农业生产中化学肥料和农药的大量使用，造成了一系列的问题，如农田土质变坏，肥力下降，农作物品质降低，病虫害增多，食品和环境污染等。同时，随着苦参产品的大量开发，作为原材料的副产品，每年都会产生大量固体加工废物。这些残渣废物因含有较高的有机物质，是有机肥料的宝贵资源。但是，这些有机废物还含有各种有毒物质或元素(如重金属、病原体、抗生素和抗生素抗性基因等)，如果直接作为肥料用于农业用地或作为工业废物不加区分地丢弃，又会造成严重的环境污染。因此，对这些有机废物进行堆肥化处理之后，可以产生有价值的有机物质，并且作为土壤改良剂有利于改善土壤问题。大量研究表明，生物药肥不仅应用效果好，而且生产成本低，施用后能减少化肥用量和提高农产品质量，同时还可以降低病虫害的发生，对于发展绿色农业(生态农业)，生产安全、无公害绿色食品以及降低农民投入，保护环境等具有重要的意义。因此用于预防和控制植物病害，并提高植物的品质的生物药肥具有很广泛应用研究价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌及生物药肥，利用本发明的芽孢杆菌制成的药肥直接施于植物根部附近，即可达到控制病害的目的。对黄瓜枯萎病、小麦全蚀病的防治效果达80％以上，并对植物生长具有明显的促进作用，提高作物的品质。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
一种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus sp.)的保藏编号为CGMCCNo.15110。该菌株已于2017年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。
解淀粉芽孢杆菌用于制备生物药肥的应用，所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillussp.)的保藏编号为CGMCC No.15110。
一种生物药肥，经发酵的有机肥98-99.8份，解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂0.2-2份；解淀粉芽孢杆菌(Bacillus sp.)的保藏编号为CGMCC No.15110；
解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量份的物料组成：解淀粉芽孢杆菌发酵液27份，硅藻土62.9份；SDS 4份；CMC-Na 6份；荧光素钠0.1份；
解淀粉芽孢杆菌发酵液的具体制备步骤如下：
菌种活化：将解淀粉芽孢杆菌菌株接种于固体培养基上，于28～30℃培养24～36h；
种子液制备：挑取活化后的单菌落菌株转接于LB液体培养基中，在转速为160～180rpm，温度28～30℃，摇床上培养12～16h，作为种子液；
发酵培养：按照1％～3％(V/m)的接种量向发酵培养基中接入种子液，在转速为160～180rpm，温度28～30℃，摇床上培养36～48h，得到发酵液。
可选的，所述的固体培养基为NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，水1000mL，琼脂17g，pH7.2；
所述的发酵培养基为LB液体培养基，LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水1000mL，pH7.0；
各培养基灭菌条件为0.10～0.15MPa，121℃灭菌30min。
可选的，解淀粉芽孢杆菌发酵液27份与填料硅藻土62.9份混匀后，放入电热恒温鼓风干燥箱中烘干24h(30℃)，得到解淀粉芽孢杆菌粉剂；
SDS、CMC-Na 6和荧光素钠按配比混匀得到混合助剂；
解淀粉芽孢杆菌粉剂与混合助剂混匀并通过气流粉碎机粉碎，得到解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂。
一种生物药肥，在植物提取残渣中加入有机物料腐熟剂和高纤维降解菌进行发酵得到腐熟堆肥，在所述的腐熟堆肥中加入芽孢杆菌混合即得；
所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus sp.)的保藏编号为CGMCC No.15110。
可选的，所述的有机物料腐熟剂为嗜热侧孢霉菌(ACCC30346)，高纤维降解菌为白腐菌(ACCC 30942)；
嗜热侧孢霉菌(ACCC30346)和白腐菌(ACCC 30942)采用PDA培养，之后接种到PDB培养基中，于28℃，180r/min的摇床上培养，菌体含量达109CFU/ml，按照2％(V/m)的接种量加入植物提取残渣中。
可选的，所述解淀粉芽孢杆菌的有效数量不低于107CFU/g。
可选的，所述的植物提取物残渣为苦参残渣，在常温下，调节苦参残渣的水分含量为50％～60％，调整C/N比为25:1。
一种生物药肥，制备包括：
①在常温下，调节苦参残渣的水分含量为50％～60％，加入尿素调整C/N比为25:1；
②嗜热侧孢霉菌(ACCC30346)和白腐菌(ACCC 30942)采用PDA培养，之后接种到PDB(马铃薯葡萄糖肉汤)培养基中，于28℃，180r/min的摇床上培养7d左右，菌体含量达109CFU/ml，按照2％(V/m)的接种量加入苦参残渣中进行发酵，控制发酵的通气流速为3～5L/min，每周翻堆1次，发酵至堆体温度为常温得到腐熟堆肥；
③腐熟堆肥含水量小于30％时，对腐熟堆肥进行干燥粉碎，将解淀粉芽孢杆菌制成的解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂以0.2～2％的质量比加入到粉碎后的腐熟堆肥中，制成生物药肥；
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus sp.)的保藏编号为CGMCC No.15110。
利用本发明的芽孢杆菌制成的药肥直接施于植物根部附近，即可达到控制病害的目的。对黄瓜枯萎病、小麦全蚀病的防治效果达80％以上，并对植物生长具有明显的促进作用，提高作物的品质。
附图说明
图1基于16S rDNA序列分析的解淀粉芽孢杆菌B1408(Bacillus sp.)的系统发育树。
具体实施方式
本发明实质性特点可从下述实施例中得以体现，但这些实施例仅作为说明，而不是对本方面进行限制。
本发明所述的植物提取物残渣指的是：植物提取物(Plantsextract)是指以物理、化学和生物学等手段从以天然植物中提取的某种或某些具有特殊效果的物质，不改变其有效成分结构而形成的产品。其原料涵盖森林植物、草原植物、农业栽培植物和海洋植物等。其产品可分为生物碱、苷类、单宁、精油、树脂、毒性蛋白、酯类、酮类等多种类型的化合物，目前被广泛应用于植物药、食品添加剂、功能食品、日用化学品、植物源的农药和兽药等。而植物提取物残渣就是提取有效成分剩余的固体物。
苦参残渣指的是苦参在进行有效成分提取后剩余的固体物。
解淀粉芽孢杆菌B1408(Bacillus sp.)的保藏编号为CGMCC No.15110。该菌株已于2017年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。
实施例1解淀粉芽孢杆菌B1408的分离纯化
从中国陕西省杨凌土壤中，选择适当的地点，于5～20mm处采取土样，用稀释平板法从中分离细菌：
(1)制备土壤稀释液：准确称取10g土样置于250ml三角瓶中，加入100ml无菌水，摇床160rpm、30～37℃震荡30min。制成土壤悬浮液，按10倍梯度稀释至10-8。
(2)培养：将土壤稀释液加入冷却至40～50℃的灭菌的NA琼脂培养基，制成平板。于28-30℃培养。
(3)挑取单菌落：3～4天后，待平板上长出菌落后，根据形态挑取单菌落于15ml灭菌的LB培养基中，摇床160rpm、28-30℃震荡培养。
(4)纯化：采用平板划线分离法纯化。涂平板检验直至获得纯培养，命名为B1408。
实施例2解淀粉芽孢杆菌B1408菌株的鉴定
(1)生物学特性：
菌落呈圆形扁平且湿润有粘性，不透明，菌落乳白色。菌体杆状，直或接近直，大小为0.3-2.2×1.2-7.0μm，革兰氏染色反应紫色，为阳性。产生芽孢，鞭毛侧生。
(2)生理生化特征，见表1：
表1 B-1408生理生化特征
检测项目 结果 检测项目 结果 检测项目 结果
15℃生长 + 淀粉水解 + 明胶液化 +
50℃生长 + 苯丙氨酸脱氨酶 - V-P测定 +
9％NaCl生长 + 吲哚产生 - 甲基红 -
接触酶 + 氧化酶 - 纤维素分解 -
注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应
(3)分子生物学鉴定：
将B-1408菌株的16SrDNA扩增序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST分析，可知其与GenBank中100株芽孢杆菌属同源相似度都在99％以上，结合B1408菌株的形态特征、生理生化特征，确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，以16SrDNA序列为基础的B1408菌株系统发育树如图1所示。
实施例3解淀粉芽孢杆菌B1408可湿性粉剂的制备
由下列重量份组成：解淀粉芽孢杆菌发酵液27份，填料：硅藻土62.9份；润湿剂：SDS 4份；分散剂CMC-Na 6份；紫外保护剂：荧光素钠0.1份。具体步骤如下：
(1)解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备
a.菌种活化：将低温保存的解淀粉芽孢杆菌菌株接种于固体培养基上，于28-30℃培养24-36h；
b.种子液制备：挑取活化后的单菌落菌株转接于LB液体培养基中，在转速为160-180rpm，温度28-30℃，摇床上培养12-16h，作为种子液；
c.发酵培养：按照1％-3％(V/m)的接种量向发酵培养基中接入步骤b制备的种子液，在转速为160-180rpm，温度28-30℃，摇床上培养36-48h，得到发酵液。
其中所述的固体培养基为NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，水1000mL，琼脂17g，pH7.2；
其中所述的发酵培养基为LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水1000mL，pH7.0；
各培养基灭菌条件为0.10-0.15MPa，121℃灭菌30min。
(2)解淀粉芽孢杆菌粉剂的制备
将步骤c所述发酵液27份与填料硅藻土62.9份混匀后，放入电热恒温鼓风干燥箱中烘干24h(30℃)，得到解淀粉芽孢杆菌粉剂；
(3)解淀粉芽孢杆菌助剂的制备
将润湿剂：SDS 4份；分散剂：CMC-Na 6份；紫外保护剂：荧光素钠0.1份混匀得到解淀粉芽孢杆菌的助剂
(4)将步骤(2)与步骤(3)所得到的解淀粉芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并通过气流粉碎机粉碎，得到解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂。经检测其芽孢含量达1010cfu/g，悬浮率不低于70％，润湿时间不高于90s。
实施例4：一种生物药肥及其制备的方法
①在常温下，调节苦参残渣堆肥的水分含量为50％～60％之间，并加入尿素进行C/N比的调整，调整为25:1。
②将粗纤维降解菌腐熟剂和堆肥发酵菌(均购自广州市微元生物科技有限公司)按照厂家说明进行配制，并加入堆肥中。
③将嗜热侧孢霉菌(ACCC30346)和白腐菌(ACCC 30942)采用PDA培养，之后接种到PDB(马铃薯葡萄糖肉汤)培养基中，于28℃，180r/min的摇床上培养7d左右，菌体含量达109CFU/mL，按照2％(V/m)的接种量加入堆肥中。
④将上述混匀的物料装入发酵罐进行发酵，控制发酵罐的通气流速为3～5L/min，每周人工翻堆1次，对堆肥进行降温。
⑤堆肥发酵45天左右，堆体温度与环境温度接近，表明发酵完成。
⑥含水量小于30％时，对腐熟的堆肥进行干燥粉碎。
⑦将以上制得的解淀粉芽孢杆菌B1408可湿性粉剂以2％的量加入到粉碎后的堆肥中，制成生物药肥(即100g的生物药肥中含有2g的解淀粉芽孢杆菌B1408可湿性粉剂和98g的腐熟堆肥)。
实施例5：一种生物药肥及其制备的方法
本实施例与实施例4不同的是：
⑦将以上制得的解淀粉芽孢杆菌B1408可湿性粉剂以0.2％的量加入到粉碎后的堆肥中，制成生物药肥(即100g的生物药肥中含有0.2g的解淀粉芽孢杆菌B1408可湿性粉剂和98g的腐熟堆肥)。
实施例6：
将实施例4中的生物药肥用于陕西某地防治黄瓜枯萎病，具体实施过程和方法如下：该温室多年种植黄瓜，其黄瓜枯萎病发病严重时其发病率可达到80％以上。将黄瓜田划分为5块，每个处理的田间面积总共为3×6＝18m2；每个处理设3个重复，则每一重复面积为6m2；每个处理种植70棵黄瓜苗。每个处理小区间设置80cm过道行。在黄瓜种植前，整地作畦时，将以上生物药肥施入处理小区内，按10公斤/亩、20公斤/亩和30公斤/亩用量与土壤混合均匀。药剂处理采用灌根法，在黄瓜幼苗定植后7d，先疏松根际土壤，每株灌300mL药液。以清水处理为空白对照。在黄瓜幼苗移栽2个月左右，调查发病情况，计算发病率和防病效果。
黄瓜枯萎病的发病情况按标准划分为5级：0级为全株无病，不表现病害症状；1级全株有1/4以下叶片枯萎并且发病；2级全株有1/4至1/2叶片枯萎发病；3级全株有1/2以上叶片枯萎发病；4级植株因病枯死。
病情指数＝[∑(各级病株数×对应发病级数)/(调查总株数×最高调查发病级数)]×100
防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100
其效果见表2。
表2生物药肥对黄瓜枯萎病的防治效果
处理 病情指数(％) 防效(％)
10公斤/亩 17.8±1.5b 80.8±1.6c
20公斤/亩 14.7±1.1c 84.2±1.1b
30公斤/亩 10.6±1.2d 88.6±2.5a
80％多菌灵500倍液 9.2±1.9d 90.1±2.3a
清水对照 92.8±3.4a —
实施例7：
将实施例4中的生物药肥用于陕西某地防治小麦全蚀病，具体实施过程和方法如下：
采用人工撒播方式进行播种，在播种前将以上生物药肥按10公斤/亩、20公斤/亩和30公斤/亩用量与翻耕土壤混合均匀。药剂处理则是先将待播种子平摊在塑料袋中，将药液均匀喷洒在种子表面，反复混匀阴干后再次将药液喷洒在种子表面，直至药液全部混匀在待播种子中。待阴干后30分钟播种。以清水为空白对照。各处理组的面积均为600m2，试验田总面积为3000m2。采用五点取样法进行取样调查。每点取20株，共计100株。取样时注意深挖，以保证根部的完整。将麦苗根部泥土用轻缓的水流慢慢冲去，同样也是为了减少对根部的损害。待泥土冲净后用吸水纸将表面水珠吸干，之后对小麦的根部发病面积进行测量统计。计算病情指数和防病效果。
小麦全蚀的发病情况按标准划分为5级：0级:无病症；1级：发病面积占根系1％～5％；2级：发病面积占根系6％～20％；3级：发病面积占根系21％～40％；4级：发病面积占根系41％～60％；5级：发病面积占根系61％以上。
其效果见下表3。
表3生物药肥对小麦全蚀病的防治效果
处理 病情指数(％) 防效(％)
10公斤/亩 15.7±1.5b 82.6±1.5c
20公斤/亩 13.1±1.5c 85.5±1.5b
30公斤/亩 9.4±1.5d 89.6±1.5a
37％苯醚甲环唑800倍液 8.9±1.5d 90.1±1.5a
清水对照 90.1±1.5a —
实施例8：
将实施例4中的生物药肥用于陕西某地黄瓜生产，具体实施过程和方法如下：
试验在日光温室大棚中进行，温度18℃-28℃，相对湿度70％左右。试验设两个处理，每处理设3个小区重复，每个处理试验小区总面积为40m2，小区间设置80cm过道行，各小区随机排列。在早春茬黄瓜种植前，整地作畦时，将以上生物药肥施入处理小区内，按3kg/m2用量与土壤混合均匀，含水量约35％。对照处理不施加任何肥料，种植期间田间管理相同。
种植2个月后，每个处理随机选取12棵植株用直尺测量植株的株高，使用游标卡尺测量茎直径，果实鲜重直接称重，重复3次。可溶性糖含量采用蒽酮法测定，可溶性蛋白采用考马斯亮蓝比色法测定；维生素C含量采用钼蓝比色法测定。
试验结果如表4所示，施用生物药肥后，黄瓜植株的生长指标及品质显著高于对照组的。其中株高、茎粗和单株产量分别增加了35.2％、25.4％和67.9％；黄瓜果实的可溶性糖、可溶性蛋白及Vc含量，相较对照组分别增加了61.5％、39.1％和46.3％。表明该生物药肥对黄瓜具有促进生长和增产的效果及改善品质的作用。
表4生物药肥对黄瓜生长及品质的影响
Figure BDA0002251721860000081
注:*表示处理和对照间存在显著差异(p<0.05)。
由以上三表可见，该发明生物药肥集防病、促生为一体，不但能够抑制病害的发生，还具有提高农作物产量和品质的作用。
且通过实验证明，实施例5中的生物药肥在上述实验中的实验效果，均能达到集防病、促生为一体，不但能够抑制病害的发生，还具有提高农作物产量和品质的作用。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开的内容。

Claims (4)

1.一种生物药肥，其特征在于，经发酵的有机肥98-99.8份，解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂0.2-2份；所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus sp.）的保藏编号为CGMCC No. 15110；
解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量份的物料组成：解淀粉芽孢杆菌发酵液27份，硅藻土62.9份；SDS 4份；CMC-Na 6份；荧光素钠0.1份；
解淀粉芽孢杆菌发酵液的具体制备步骤如下：菌种活化：将解淀粉芽孢杆菌菌株接种于固体培养基上，于28～30℃培养24～36h；种子液制备：挑取活化后的单菌落菌株转接于LB液体培养基中，在转速为160～180rpm，温度28～30℃，摇床上培养12～16h，作为种子液；发酵培养：按照1%～3%(V / m)的接种量向发酵培养基中接入种子液，在转速为160～180rpm，温度28～30℃，摇床上培养36～48h，得到发酵液；
所述的经发酵的有机肥的制备包括：在植物提取残渣中加入有机物料腐熟剂和高纤维降解菌进行发酵得到腐熟堆肥，所述的有机物料腐熟剂为嗜热侧孢霉菌ACCC30346，高纤维降解菌为白腐菌ACCC30942；嗜热侧孢霉菌和白腐菌采用PDA 培养，之后接种到 PDB培养基中，于 28℃，180r/min 的摇床上培养，菌体含量达109 CFU/ml，按照 2% (V / m) 的接种量加入植物提取残渣中；所述解淀粉芽孢杆菌的有效数量不低于107CFU/g；所述的植物提取物残渣为苦参残渣，在常温下，调节苦参残渣的水分含量为50%～60%，调整C/N比为25:1。
2.根据权利要求1所述的生物药肥，其特征在于，所述的固体培养基为NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，水1000mL，琼脂17g，pH7.2；
所述的发酵培养基为LB液体培养基，LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水1000mL ，pH7.0；
各培养基灭菌条件为0.10～0.15MPa，121℃灭菌30min。
3.根据权利要求1或2所述的生物药肥，其特征在于，
解淀粉芽孢杆菌发酵液27份与填料硅藻土62.9份混匀后，放入电热恒温鼓风干燥箱中烘干24 h，得到解淀粉芽孢杆菌粉剂；
SDS 、CMC-Na 6和荧光素钠按配比混匀得到混合助剂；
解淀粉芽孢杆菌粉剂与混合助剂混匀并通过气流粉碎机粉碎，得到解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂。
4.一种生物药肥，其特征在于，制备包括：
①在常温下，调节苦参残渣的水分含量为50%～60%，加入尿素调整C/N比为25:1；
②嗜热侧孢霉菌ACCC30346和白腐菌ACCC30942采用PDA 培养，之后接种到 PDB培养基中，于 28 ℃， 180 r / min 的摇床上培养 7 d 左右，菌体含量达109 CFU/ml，按照 2%(V / m) 的接种量加入苦参残渣中进行发酵，控制发酵的通气流速为 3~5 L / min，每周翻堆 1 次，发酵至堆体温度为常温得到腐熟堆肥；
③腐熟堆肥含水量小于30％时，对腐熟堆肥进行干燥粉碎，将解淀粉芽孢杆菌制成的解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂以0.2～2%的质量比加入到粉碎后的腐熟堆肥中，制成生物药肥；
所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus sp.）的保藏编号为CGMCC No. 15110；
解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量份的物料组成：解淀粉芽孢杆菌发酵液27份，硅藻土62.9份；SDS 4份；CMC-Na 6份；荧光素钠0.1份；
解淀粉芽孢杆菌发酵液的具体制备步骤如下：菌种活化：将解淀粉芽孢杆菌菌株接种于固体培养基上，于28～30℃培养24～36h；种子液制备：挑取活化后的单菌落菌株转接于LB液体培养基中，在转速为160～180rpm，温度28～30℃，摇床上培养12～16h，作为种子液；发酵培养：按照1%～3%(V / m)的接种量向发酵培养基中接入种子液，在转速为160～180rpm，温度28～30℃，摇床上培养36～48h，得到发酵液。
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