CN109959679B - 一种用于3d肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器及制备方法 - Google Patents
一种用于3d肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器及制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109959679B CN109959679B CN201910176624.1A CN201910176624A CN109959679B CN 109959679 B CN109959679 B CN 109959679B CN 201910176624 A CN201910176624 A CN 201910176624A CN 109959679 B CN109959679 B CN 109959679B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- electrode
- gold
- cell
- vertical multi
- impedance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 46
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 43
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 43
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 20
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 claims description 12
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 11
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 7
- 239000010936 titanium Substances 0.000 claims description 7
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 claims description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 claims description 6
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 6
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000005530 etching Methods 0.000 claims description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 4
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 claims description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 3
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001755 magnetron sputter deposition Methods 0.000 claims description 3
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 claims description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims description 3
- 238000001259 photo etching Methods 0.000 claims description 3
- 229920002120 photoresistant polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000010301 surface-oxidation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 238000001039 wet etching Methods 0.000 claims description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000007711 solidification Methods 0.000 claims description 2
- 230000008023 solidification Effects 0.000 claims description 2
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 claims 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 claims 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 abstract description 9
- 230000005012 migration Effects 0.000 abstract description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- XOMKZKJEJBZBJJ-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloro-3-phenylbenzene Chemical compound ClC1=CC=CC(C=2C=CC=CC=2)=C1Cl XOMKZKJEJBZBJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 230000009876 antimalignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000009193 crawling Effects 0.000 description 1
- 210000000448 cultured tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003692 lymphatic flow Effects 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C23—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; CHEMICAL SURFACE TREATMENT; DIFFUSION TREATMENT OF METALLIC MATERIAL; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL
- C23C—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL BY DIFFUSION INTO THE SURFACE, BY CHEMICAL CONVERSION OR SUBSTITUTION; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL
- C23C14/00—Coating by vacuum evaporation, by sputtering or by ion implantation of the coating forming material
- C23C14/02—Pretreatment of the material to be coated
- C23C14/024—Deposition of sublayers, e.g. to promote adhesion of the coating
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C23—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; CHEMICAL SURFACE TREATMENT; DIFFUSION TREATMENT OF METALLIC MATERIAL; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL
- C23C—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL BY DIFFUSION INTO THE SURFACE, BY CHEMICAL CONVERSION OR SUBSTITUTION; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL
- C23C14/00—Coating by vacuum evaporation, by sputtering or by ion implantation of the coating forming material
- C23C14/06—Coating by vacuum evaporation, by sputtering or by ion implantation of the coating forming material characterised by the coating material
- C23C14/14—Metallic material, boron or silicon
- C23C14/16—Metallic material, boron or silicon on metallic substrates or on substrates of boron or silicon
- C23C14/165—Metallic material, boron or silicon on metallic substrates or on substrates of boron or silicon by cathodic sputtering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C23—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; CHEMICAL SURFACE TREATMENT; DIFFUSION TREATMENT OF METALLIC MATERIAL; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL
- C23C—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL BY DIFFUSION INTO THE SURFACE, BY CHEMICAL CONVERSION OR SUBSTITUTION; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL
- C23C14/00—Coating by vacuum evaporation, by sputtering or by ion implantation of the coating forming material
- C23C14/06—Coating by vacuum evaporation, by sputtering or by ion implantation of the coating forming material characterised by the coating material
- C23C14/14—Metallic material, boron or silicon
- C23C14/18—Metallic material, boron or silicon on other inorganic substrates
- C23C14/185—Metallic material, boron or silicon on other inorganic substrates by cathodic sputtering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C23—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; CHEMICAL SURFACE TREATMENT; DIFFUSION TREATMENT OF METALLIC MATERIAL; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL
- C23C—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL BY DIFFUSION INTO THE SURFACE, BY CHEMICAL CONVERSION OR SUBSTITUTION; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL
- C23C14/00—Coating by vacuum evaporation, by sputtering or by ion implantation of the coating forming material
- C23C14/22—Coating by vacuum evaporation, by sputtering or by ion implantation of the coating forming material characterised by the process of coating
- C23C14/34—Sputtering
- C23C14/35—Sputtering by application of a magnetic field, e.g. magnetron sputtering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C23—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; CHEMICAL SURFACE TREATMENT; DIFFUSION TREATMENT OF METALLIC MATERIAL; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL
- C23C—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL BY DIFFUSION INTO THE SURFACE, BY CHEMICAL CONVERSION OR SUBSTITUTION; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL
- C23C14/00—Coating by vacuum evaporation, by sputtering or by ion implantation of the coating forming material
- C23C14/58—After-treatment
- C23C14/5873—Removal of material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/02—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Metallurgy (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器及制备方法。本发明采用MEMS工艺加工垂直多电极阻抗芯片；对具有迁移能力的肿瘤细胞进行3D培养；将一对垂直多电极阻抗芯片插入至3D肿瘤细胞培养腔内；随着3D肿瘤细胞数目的变化，垂直多电极阻抗芯片所检测到阻抗值也会产生变化。肿瘤细胞的迁移特性会导致同一个培养腔内不同空间位置的肿瘤细胞数目随着时间产生变化，垂直多电极阻抗芯片可同时监测同一培养腔内16个不同位置的阻抗值，并根据阻抗值绘制3D细胞阻抗热点图，实现对3D肿瘤细胞迁移的实时监测。
Description
技术领域
本发明涉及细胞迁移检测技术，尤其涉及一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器及制备方法。
背景技术
细胞迁移也称为细胞爬行或细胞运动，是正常细胞的正常功能之一，是指细胞在感受到迁移信号之后产生的移动。肿瘤细胞的迁移属于肿瘤细胞的恶性行为，肿瘤细胞由其原发部位侵入淋巴管、血管或体腔部位，肿瘤细胞被血流、淋巴流带到另一部位或器官继续生长，形成与原发瘤同样类型的肿瘤。恶性肿瘤的转移特性给患者的诊断和治疗带来极大的危害，目前对于抗恶性肿瘤转移药物的研发需求十分巨大。传统2D细胞由于其培养环境与体内环境相去甚远，常丢失了其在生物体内的特性。为了提高基于细胞模型的药物筛选效率和准确性，越来越多的机构开始采取3D细胞进行药物筛选。而目前市场上只有监测2D细胞迁移的方法，如跨膜/Boyden小室、细胞划痕实验、细胞隔离迁移实验和微流体技术；缺乏针对3D细胞迁移有效监测的手段。因此在药物筛选领域，急需一种可以实时监测3D肿瘤细胞迁移的装置和方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器及制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器，该传感器以硅晶圆作为基底，在基底上依次覆盖SiO2层、钛层、金层，金层作为电极层，在金层上刻蚀出8行2列共16个金电极；传感器芯片与PCB板粘合，金电极通过引线连接金属盘，通过飞线将金属盘和PCB板的焊盘电气连接。
进一步地，所述基底的厚度为0.5mm，SiO2层的厚度为1μm，钛层的厚度为5nm，金层的厚度为200nm，金电极为边长1mm的正方形。
一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)选择厚度为0.5mm、直径为4英寸的硅晶圆作为基底，硅晶圆的晶向为100。
(2)采用热氧化技术对硅基底进行表面氧化，获得厚度为1μm的SiO2层。
(3)利用磁控溅射技术在SiO2层上先溅射一层5nm厚的钛层，然后溅射一层200nm厚的金层，用作电极层。
(4)采用正胶光刻技术刻出电极图形后，采用湿法刻蚀将非电极区域刻蚀掉，形成8行2列共16个金电极，每个金电极为边长1mm的正方形，此时得到垂直多电极阻抗传感器芯片；
(5)对传感器芯片进行划片，划片后采用环氧树脂将传感器芯片粘附于 PCB板上，采用飞线技术将电极引线引出的金属盘和PCB板上的焊盘电气连接。
(6)使用环氧树脂对飞线连接处进行金线保护。
(7)对金电极进行清洗，得到用于监测3D细胞迁移的垂直多电极阻抗传感器。
进一步地，所述步骤(7)中金电极的清洗方法具体如下：采用硫酸和双氧水溶液去除衬底材料上的有机物，氨水和双氧水溶液去除衬底材料上的非金属玷污，盐酸和双氧水溶液去除衬底材料上的金属玷污；最后采用双蒸水反复冲洗芯片表面，烘干后放置于紫外灯光照射下灭菌待用。
一种利用垂直多电极阻抗传感器进行3D肿瘤细胞迁移实时监测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)3D肿瘤细胞培养：将肿瘤细胞培养成3D球体细胞，并加入到48孔细胞培养板中。
(2)3D细胞迁移检测：将两片加工好的垂直多电极阻抗传感器插入48孔细胞培养板的待测孔中，保持两片传感器芯片垂直相对间隔1厘米立于培养孔底部，保持两片传感器芯片上的16个金电极对齐，左边传感器芯片上的金电极作为工作电极，右边传感器芯片上的金电极作为参比电极，连接阻抗分析仪进行阻抗值检测；当3D肿瘤细胞刚开始培养时，基本均匀分布在培养腔内，各个工作电极所检测到的阻抗值接近一致；随着时间的变化，3D肿瘤细胞开始迁移，培养孔顶端的细胞会向培养孔底端移动，底部金电极所测到的阻抗值与其它位置所测到阻抗值大小将产生差异，根据不同电极检测到的阻抗值，绘制3D细胞阻抗值热度图，监测3D肿瘤细胞迁移的运动轨迹。
进一步地，所述步骤(1)具体为：
(1.1)将肿瘤细胞(SW480)培养在25cm2的培养瓶中，细胞培养液采用 DMEM培养基，其中添加了体积分数为10％的胎牛血清、质量分数为1％的丙酮酸钠、质量分数为1％的非必需氨基酸、质量分数为1％的谷氨酰胺、质量分数为1％的P/S双抗；SW480细胞需要每天更换新鲜的培养基，待细胞的融合度达到80-90％，使用质量浓度0.25％的胰酶将SW480细胞消化，形成细胞密度为 1x107个/毫升的细胞悬液。
(1.2)加入预冷过的基质胶和培养基形成细胞密度为5×107个/毫升的细胞基质胶混合液。
(1.3)将400μL细胞基质胶混合液加入48孔细胞培养板中，放置在37℃的细胞培养箱中进行凝固；经过30分钟后，细胞基质胶混合液凝结成团，然后加入200μL的细胞培养基作营养支持。
本发明的有益效果是：本发明利用微纳加工技术加工了一种具有16个金电极的垂直阻抗传感器，用于实时监测3D肿瘤细胞的迁移。本发明构建的垂直多电极阻抗传感器可以实时长时高通量的监测3D细胞的迁移能力。
附图说明
图1为本发明金电极阵列的电极排布图；
图2为本发明垂直多电极阻抗传感器的结构图；
图3为本发明垂直多电极阻抗传感器的使用效果图；
图4为利用垂直多电极阻抗传感器所监测到的细胞迁移阻抗值图谱。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明作详细描述，但并不是限制本发明。
本发明利用垂直对电极检测3D细胞凝胶团的总阻抗，由于凝胶阻抗值基本不变，因此3D细胞凝胶团的总阻抗值主要由细胞数目和状态决定。基于此原理，我们设计了垂直多电极阻抗传感器用于检测细胞培养腔内不同空间位置分布的 3D肿瘤细胞阻抗值。随着时间的变化，3D肿瘤细胞会产生细胞迁移运动，不同位点的阻抗值相较初始时刻会有差异。我们根据不同电极检测到的阻抗值，绘制不同时间点的3D细胞迁移图谱，用以评价细胞迁移能力。
一种用于3D肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)垂直多电极阻抗传感器的加工：传感器的加工采用标准的MEMS工艺。传感器以厚度为0.5mm、直径为4英寸的硅晶圆作为基底，硅晶圆的晶向为100。采用热氧化技术对硅基底进行表面氧化，获得一层厚度为1微米的SiO2 层。利用磁控溅射技术在SiO2层上先溅射一层5nm厚的钛层，然后溅射一层 200nm厚的金层，用作电极层。采用正胶光刻技术刻出电极图形后，采用湿法刻蚀将非电极区域刻蚀掉。芯片电极图形如图1所示，一个芯片单元上共有8 行2列共16个金电极1，每个金电极为边长为1mm的正方形。划片后采用环氧树脂将芯片与PCB板进行粘合，然后使用飞线2一头将电极引线3引出的金属盘4和PCB板5上的焊盘进行电气连接。使用环氧树脂对飞线连接处进行金线保护，最终得到用于监测3D细胞迁移的垂直多电极阻抗传感器，如图2所示。
(2)金电极的清洗：采用硫酸和双氧水溶液去除衬底材料上的有机物，氨水和双氧水溶液去除衬底材料上的非金属玷污，盐酸和双氧水溶液去除衬底材料上的金属玷污。最后采用双蒸水反复冲洗芯片表面，烘干后放置于紫外灯光照射下灭菌待用。
一种利用垂直多电极阻抗传感器进行3D细胞迁移实时监测的方法，该方法包括以下步骤：
(1)3D肿瘤细胞培养，具体如下：人类结肠癌细胞(SW480)培养在25cm2的培养瓶中，细胞培养液采用了DMEM培养基，其中添加了体积分数为10％的胎牛血清、质量分数为1％的丙酮酸钠、质量分数为1％的非必需氨基酸、质量分数为1％的谷氨酰胺、质量分数为1％的P/S双抗；SW480细胞需要每天更换新鲜的培养基，待细胞的融合度达到80-90％，使用质量浓度0.25％的胰酶将 SW480细胞消化，形成细胞密度为1x107个/毫升的细胞悬液；加入预冷过的基质胶和培养基形成细胞密度为5×107个/毫升的细胞基质胶混合液。将400μL细胞基质胶混合液加入48孔细胞培养板中，放置在37℃的细胞培养箱中进行凝固。经过30分钟后，细胞基质胶混合液凝结成团，然后加入200μL的细胞培养基作营养支持。
(2)3D细胞迁移检测：将两片加工好的垂直多电极阻抗传感器插入步骤 (1)48孔细胞培养板的待测孔中，保持两片传感器芯片垂直相对间隔1厘米立于培养孔底部，保持两片传感器芯片上的16个金电极对齐，如图3所示。左边传感器芯片上的金电极作为工作电极，右边传感器芯片上的金电极作为参比电极，连接阻抗分析仪进行阻抗值检测。当3D肿瘤细胞刚开始培养时，基本均匀分布在培养腔内，各个工作电极所检测到的阻抗值是接近一致的。随着时间的变化，3D培养的肿瘤细胞开始迁移。培养孔顶端的细胞会向培养孔底端移动，底部金电极所测到的阻抗值与其它位置所测到阻抗值大小会产生差异。根据这一差异，我们通过Matlab软件绘制了0天和4天时的3D细胞阻抗值热度图。。如图4所示，该传感器可以较为直观地反映出3D细胞迁移的运动轨迹和迁移能力。
本技术领域的人员根据本发明所提供的文字描述、附图以及权利要求书能够很容易在不脱离权利要求书所限定的本发明的思想和范围条件下，可以做出多种变化和改动。凡是依据本发明的技术思想和实质对上述实施例进行的任何修改、等同变化，均属于本发明的权利要求所限定的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种利用垂直多电极阻抗传感器进行3D肿瘤细胞迁移实时监测的方法，其特征在于，所述垂直多电极阻抗传感器以硅晶圆作为基底，在基底上依次覆盖SiO2层、钛层、金层，金层作为电极层，在金层上刻蚀出8行2列共16个金电极；传感器芯片与PCB板粘合，金电极通过引线连接金属盘，通过飞线将金属盘和PCB板的焊盘电气连接；
利用垂直多电极阻抗传感器进行3D肿瘤细胞迁移实时监测的方法包括以下步骤：
（1）3D肿瘤细胞培养：将肿瘤细胞培养成3D球体细胞，并加入到48孔细胞培养板中；具体为：
（1.1）将肿瘤细胞培养在25cm2的培养瓶中，细胞培养液采用DMEM培养基，其中添加了体积分数为10%的胎牛血清、质量分数为1%的丙酮酸钠、质量分数为1%的非必需氨基酸、质量分数为1%的谷氨酰胺、质量分数为1%的P/S双抗；肿瘤细胞需要每天更换新鲜的培养基，待细胞的融合度达到80-90%，使用质量浓度0.25%的胰酶将肿瘤细胞消化，形成细胞密度为1x107个/毫升的细胞悬液；
（1.2）加入预冷过的基质胶和培养基形成细胞密度为5×107个/毫升的细胞基质胶混合液；
（1.3）将400μL细胞基质胶混合液加入48孔细胞培养板中，放置在37℃的细胞培养箱中进行凝固；经过30分钟后，细胞基质胶混合液凝结成团，然后加入200μL的细胞培养基作营养支持；
（2）3D细胞迁移检测：将两片加工好的垂直多电极阻抗传感器插入48孔细胞培养板的待测孔中，保持两片传感器芯片电极垂直相对间隔1厘米立于培养孔底部，保持两片传感器芯片上的16个金电极对齐，左边传感器芯片上的金电极作为工作电极，右边传感器芯片上的金电极作为参比电极，连接阻抗分析仪进行阻抗值检测；当3D肿瘤细胞刚开始培养时，基本均匀分布在培养腔内，各个工作金电极所检测到的阻抗值接近一致；随着时间的变化，3D肿瘤细胞开始迁移，培养孔顶端的细胞会向培养孔底端移动，底部金电极所测到的阻抗值与其它位置所测到阻抗值大小将产生差异，根据不同电极检测到的阻抗值，绘制3D细胞阻抗值热度图，监测3D肿瘤细胞迁移的运动轨迹。
2.根据权利要求1所述的一种利用垂直多电极阻抗传感器进行3D肿瘤细胞迁移实时监测的方法，其特征在于，所述基底的厚度为0.5mm，SiO2层的厚度为1μm，钛层的厚度为5nm，金层的厚度为200nm，金电极为边长1mm的正方形。
3.根据权利要求1所述的一种利用垂直多电极阻抗传感器进行3D肿瘤细胞迁移实时监测的方法，其特征在于，垂直多电极阻抗传感器的制备方法包括以下步骤：
（1）选择厚度为0.5mm、直径为4英寸的硅晶圆作为基底，硅晶圆的晶向为1 0 0；
（2）采用热氧化技术对硅基底进行表面氧化，获得厚度为1μm的SiO2层；
（3）利用磁控溅射技术在SiO2层上先溅射一层5nm厚的钛层，然后溅射一层200nm厚的金层，用作电极层；
（4）采用正胶光刻技术刻出电极图形后，采用湿法刻蚀将非电极区域刻蚀掉，形成8行2列共16个金电极，每个金电极为边长1mm的正方形，此时得到垂直多电极阻抗传感器芯片；
（5）对传感器芯片进行划片，划片后采用环氧树脂将传感器芯片粘附于PCB板上，采用飞线技术将电极引线引出的金属盘和PCB板上的焊盘电气连接；
（6）使用环氧树脂对飞线连接处进行金线保护；
（7）对金电极进行清洗，得到用于监测3D细胞迁移的垂直多电极阻抗传感器。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（7）中金电极的清洗方法具体如下：采用硫酸和双氧水溶液去除衬底材料上的有机物，氨水和双氧水溶液去除衬底材料上的非金属玷污，盐酸和双氧水溶液去除衬底材料上的金属玷污；最后采用双蒸水反复冲洗芯片表面，烘干后放置于紫外灯光照射下灭菌待用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910176624.1A CN109959679B (zh) | 2019-03-08 | 2019-03-08 | 一种用于3d肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910176624.1A CN109959679B (zh) | 2019-03-08 | 2019-03-08 | 一种用于3d肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器及制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109959679A CN109959679A (zh) | 2019-07-02 |
| CN109959679B true CN109959679B (zh) | 2020-06-05 |
Family
ID=67024163
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910176624.1A Active CN109959679B (zh) | 2019-03-08 | 2019-03-08 | 一种用于3d肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器及制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109959679B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022183370A1 (zh) * | 2021-03-02 | 2022-09-09 | 北京大学 | 一种基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法 |
| CN112986546B (zh) * | 2021-03-02 | 2022-10-18 | 北京大学 | 一种用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法 |
| CN113005170A (zh) * | 2021-03-02 | 2021-06-22 | 北京大学 | 一种基于细胞阻抗传感的抗肿瘤药物筛选的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN201110854Y (zh) * | 2007-10-29 | 2008-09-03 | 浙江大学 | 细胞电生理集成芯片 |
| CN102382758A (zh) * | 2011-10-14 | 2012-03-21 | 杭州电子科技大学 | 基于细胞打印和多参数传感阵列集成技术的三维细胞芯片 |
| CN102803944A (zh) * | 2009-04-10 | 2012-11-28 | 药物代谢动力公司 | 用于形成应用适体生物传感器的稳态环的方法和装置 |
| CN103140170A (zh) * | 2010-10-08 | 2013-06-05 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 具有对称分布的分析物敏感区域的电化学传感器 |
-
2019
- 2019-03-08 CN CN201910176624.1A patent/CN109959679B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN201110854Y (zh) * | 2007-10-29 | 2008-09-03 | 浙江大学 | 细胞电生理集成芯片 |
| CN102803944A (zh) * | 2009-04-10 | 2012-11-28 | 药物代谢动力公司 | 用于形成应用适体生物传感器的稳态环的方法和装置 |
| CN103140170A (zh) * | 2010-10-08 | 2013-06-05 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 具有对称分布的分析物敏感区域的电化学传感器 |
| CN102382758A (zh) * | 2011-10-14 | 2012-03-21 | 杭州电子科技大学 | 基于细胞打印和多参数传感阵列集成技术的三维细胞芯片 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 3D cell-based biosensor for cell viability and drug assessment by 3D electric cell/matrigel-substrate impedance sensing;Yuxiang Pan et.al;《Biosensors and Bioelectronics》;20181231;1-8 * |
| 细胞和分子传感器及其在海洋生物毒素检测中的应用研究，;邹玲;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20160815(第08期);21-23，66-68页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109959679A (zh) | 2019-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109959679B (zh) | 一种用于3d肿瘤细胞迁移实时监测的垂直多电极阻抗传感器及制备方法 | |
| CN101712925B (zh) | 检测单细胞和群细胞行为的多尺度集成细胞阻抗传感器 | |
| US6151519A (en) | Planar electrode | |
| CN104089996A (zh) | 一种使用声表面波谐振器的味细胞传感器及其制备方法 | |
| EP0823483A1 (en) | Method for measuring physicochemical properties of tissues or cells, method for examining chemicals, and apparatus therefor | |
| CN110187091B (zh) | 一种用于抗肿瘤药物筛选的高通量3d细胞阻抗传感器及检测方法 | |
| CN110527618A (zh) | 用于细菌生物膜抑制剂筛选的多功能微流控芯片及检测方法 | |
| CN101652657A (zh) | 一种自动定位与传感的微电极阵列 | |
| JP2829005B2 (ja) | マイクロチャンバープレート、これを利用した細胞検出方法、処理方法および装置ならびに細胞 | |
| CN107118938A (zh) | 流体增强介电泳单细胞排列与控制芯片及其制作方法 | |
| CN102680683A (zh) | 一种基于导电聚合物的牙周细菌阻抗免疫传感器 | |
| CN111272819B (zh) | 心肌细胞多元活性检测的叉指排布导电纳米管传感装置 | |
| KR20090099767A (ko) | 셀센서 및 이를 이용하여 세포의 상태를 실시간으로모니터링하는 방법 | |
| CN108982605A (zh) | 一种基于富铜离子材料标记的内毒素适配体传感器及其检测内毒素的方法 | |
| CN112986546B (zh) | 一种用于监测三维基质中群体细胞侵袭的阻抗传感方法 | |
| CN114636744A (zh) | 基于纳米多孔膜的微电极阵列芯片及高通量细胞内电信号连续监测系统 | |
| JP2949845B2 (ja) | 細胞電気活動計測用電極 | |
| CN110398528A (zh) | 一种基于液柵型igzo薄膜晶体管的抗结核类药物筛选装置及方法 | |
| WO2024066251A1 (zh) | 一种集成器官芯片及其制备方法 | |
| CN1554942A (zh) | 用于细胞胞外动作电位测量的单细胞传感器及其制备方法 | |
| TW202344837A (zh) | 微米孔微流體晶片系統及其量測細菌電性的用途 | |
| CN107703199A (zh) | 集传感器及发光器为一体的高度集成型生物芯片及方法 | |
| CN109628291A (zh) | 一种用于3d细胞活性及增殖能力实时监测的微腔阻抗传感器及制备方法 | |
| CN109541211A (zh) | 一种肿瘤标志物在纳米孔中的快速检测方法 | |
| CN113030215A (zh) | 一种用于3d心肌细胞胞外电位检测的高通量微腔电位传感器及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |