CN103361297A - 处理样品中的靶材料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及处理样品中的靶材料的方法，具体地，使用包括弹性膜的微流控器件处理样品中的靶材料的有效方法。

Description

处理样品中的靶材料的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求在韩国知识产权局于2012年4月6日提交的韩国专利申请No.10-2012-0036243的权益，通过引用将其公开内容引入本文中。
技术领域
本公开内容涉及处理样品中的靶材料的有效方法。
背景技术
自从Manz提出了微全分析系统(μTAS)的概念以来，基于微流控技术(microfluidics)的生物分析已经作为用以集成复杂分析物制备和检测过程两者的有前景的手段出现。μTAS可提供与常规的实验室方法相比的许多优点，如易于操作、提高的检测灵敏度、低的成本和缩短的取得结果的时间。μTAS利用包含目标分析物的液体溶液和固体表面之间的相互作用，因为分析操作很大程度上依赖于基于表面的生物测定。通常，这些分析器件执行分析过程以分离待测定的靶材料，如来自患者样品的细胞和/或核酸。
用于实施这样的过程的最有名的方法是固相提取(固相萃取，solid phaseextraction，SPE)，其涉及在固体上捕获待分析的靶材料如细胞和/或核酸、洗去杂质、和洗脱所述靶材料。已存在在微器件上实施SPE的多种努力。
为了在固体上捕获细胞和/或核酸，采用具有大的表面积和高的表面积与容积比(surface-to-volume ratio，SVR)的微结构以提高生物分子捕获效率和能力。
具有大的表面积和高的SVR的SPE微结构大部分是微柱或填充珠的形式。
微柱可通过传统的微机电系统(MEMS)技术、深层干式刻蚀技术等以相对高的精度在微芯片上实现。然而，这些方法是昂贵的。
关于使用珠，填充珠已被用于毛细管中。然而，难以检验和核实紧密的填充程度，并且难以制造这样的珠紧密填充的毛细管。
更先进的方法涉及与珠一起使用溶胶-凝胶材料，或与珠一起使用有机多孔聚合物结构。
这些方法通常涉及使用玻璃、硅、聚合物等制造微腔，并使用珠填充微腔。然而，实现珠的紧密填充是困难的，且有机材料的使用使得整个制造过程复杂化且未能确保再现性。
发明内容
提供处理样品中的靶材料的有效方法。
额外的方面将在随后的描述中部分地阐明，和部分地将从所述描述明晰，或者可通过所提供的实施方式的实践获悉。
根据本公开内容的一个方面，处理样品中的靶材料的方法包括将样品引入到微流控器件(微流体器件，microfluidic device)的第一腔中，其中所述第一腔包含包括能与所述靶材料结合的材料的固体载体，以将所述靶材料结合到所述固体载体，其中所述微流控器件包括具有入口和出口的所述第一腔、与压力供应单元操作性地(operatively)连接的第二腔、以及设置在所述第一腔和所述第二腔之间并形成所述第一和第二腔的至少部分的壁的弹性膜，其中所述样品引入和后续操作中的至少一个在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时、或者在通过向所述第二腔施加负压力使所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的同时进行。
根据本公开的另一方面，处理样品中的靶材料的方法包括将所述样品引入到微流控器件的第一腔中，其中所述第一腔包含包括能与所述靶材料结合的材料的固体载体，以将所述靶材料结合到所述固体载体，其中所述微流控器件包括具有入口和出口的所述第一腔、与压力供应单元操作性地连接的第二腔、以及设置在所述第一腔和所述第二腔之间并且形成所述第一和第二腔的至少部分的壁的弹性膜，其中所述样品引入和后续操作中的至少一个在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时进行，所述靶材料是细胞，和所述能与所述靶材料结合的材料是具有约70度-约95度的水接触角的材料、或具有选自伯氨基、仲氨基、叔氨基和季(quaternary)氨基的至少一个氨基的材料，且所述样品引入在约3.0-约6.0的pH和约10mM-约500mM的盐浓度下进行，所述方法进一步包括：在由于向所述第二腔施加负压力而导致所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的同时，将细胞裂解液引入到所述第一腔中，从而使结合到所述固体载体的所述靶材料裂解以产生核酸，所述核酸然后结合到所述固体载体；在所述裂解操作之后，在由于向所述第二腔施加正压力而导致所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时，将洗涤溶液引入到所述第一腔中，从而除去未结合到所述固体载体的材料；和将洗脱液引入到所述第一腔中以将核酸从包含所述固体载体的所述第一腔释放。
根据本公开内容的另一方面，处理样品中的靶材料的方法包括：将所述样品引入到微流控器件的第一腔中，其中所述第一腔包含包括能与所述靶材料结合的材料的固体载体，以将所述靶材料结合到所述固体载体，其中所述微流控器件包括具有入口和出口的所述第一腔、与压力供应单元操作性地连接的第二腔、以及设置在所述第一腔和所述第二腔之间并形成所述第一和第二腔的至少部分的壁的弹性膜，其中所述靶材料是核酸，和所述样品引入在由于向所述第二腔施加正压力而导致所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时进行；在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时，将洗涤溶液引入到所述第一腔中，从而除去未结合到所述固体载体的材料；和将洗脱液引入到所述第一腔中以将核酸从所述固体载体释放。
根据本公开内容的另一方面，微流控器件包括具有入口和出口的第一腔；与压力供应单元操作性地连接的第二腔；以及设置在所述第一腔和所述第二腔之间并且形成所述第一和第二腔的至少部分的壁的弹性膜，其中所述第一腔包含能够结合到靶材料的材料。
附图说明
从结合附图考虑的实施方式的以下描述，这些和/或其它方面将变得明晰和更容易理解，其中：
图1和3-6是根据本公开内容的实施方式的微流控器件的横截面图；
图2是在其表面上具有捕获细胞或核酸的有机或无机层的珠的截面图；
图7和8说明根据本公开内容的实施方式的在核酸提取中使用的具有柔性壁的器件；
图9(a)-(e)是根据本公开内容的实施方式的通过使用图7和8的微流控器件处理样品中的靶材料的方法的示意图，所述方法涉及从自样品中捕获细胞到核酸洗脱的操作；
图10说明在研究聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜的偏移(偏转，deflection)对腔的珠填充率的影响时所使用的实验模型(a)和所述研究的结果(b)；
图11是根据各洗出液(eluate)级分的洗脱的DNA量(Ct)的图；和
图12是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)检测随初始细胞数(CFU/拭子(swab))的变化的图。
具体实施方式
现在将详细地介绍实施方式，其实例说明于附图中，其中相同的附图标记始终是指相同的元件。在这点上，所提供的实施方式可具有不同的形式并且不应解释为限于本文中所阐明的描述。因此，下面仅通过参考附图描述实施方式以解释本描述的方面。如本文中所使用的，术语“和/或”包括相关所列项目中的一个或多个的任何和所有组合。当在要素列表之前或之后时，表述例如“的至少一种”修饰整个要素列表且不修饰该列表的单独要素。
根据本公开内容的一方面，处理样品中的靶材料的方法包括将所述样品引入到微流控器件的第一腔中，其中所述第一腔包含包括能与所述靶材料结合的材料的固体载体，以将所述靶材料结合到所述固体载体。
所述微流控器件包括具有入口和出口的所述第一腔、与压力供应单元操作性地连接的第二腔、以及设置在所述第一腔和所述第二腔之间并且形成所述第一和第二腔的至少部分的壁的弹性膜。
所述样品引入和后续操作中的至少一个可在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时、或者在通过向所述第二腔施加负压力使所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的同时进行。所述至少一个操作可在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时、或者在通过向所述第二腔施加负压力使所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的同时以整体(整个，entire)操作进行。
所述样品引入可包括在所述出口开放或关闭的情况下经由所述入口将所述样品引入到所述第一腔中。经由具有开放的出口的所述第一腔的所述入口引入所述样品可通过使所述样品从所述入口连续地流动通过所述出口而实施。因此，所述样品引入和后续操作中的至少一个可通过使所述样品从所述腔的所述入口流动通过所述出口而实施。所述样品的流速可为约10μl/分钟-约500μl/分钟，和在一些实施方式中，可为约20μl/分钟-约500μl/分钟、约50μl/分钟-约500μl/分钟、约75μl/分钟-约500μl/分钟、约100μl/分钟-约500μl/分钟、约200μl/分钟-约500μl/分钟、约300μl/分钟-约500μl/分钟或约400μl/分钟-约500μl/分钟。将所述样品引入到所述第一腔中可在适合于所述靶材料结合到在所述固体载体中的所述材料的条件下进行。将所述样品引入到所述第一腔中可使用已知的方法，例如，通过向所述入口施加正压力和/或向所述出口施加负压力而进行。在引入所述样品后的后续操作可为洗涤、干燥和洗脱的至少一种。所述洗涤可为使所述固体载体与洗涤溶液接触以除去未结合到所述固体载体的材料。所述洗涤可在使得结合到所述固体载体的所述靶材料基本上不被除去的条件下进行。所述干燥可通过使气体例如空气从所述第一腔的入口流动到所述出口而进行以将所述固体载体干燥。所述洗脱可为使所述固体载体与洗脱液接触以将所述靶材料从所述固体载体分离。例如，所述洗脱可包括使所述固体载体与细胞洗脱液在适合于将细胞或生物材料从所述固体载体分离的条件下接触。
所述样品可为多种包括靶材料的材料中的任何材料。所述靶材料可为生物或非生物材料。所述生物材料可为得自病毒或活的有机体的材料。所述生物材料可为细胞或细胞成分。所述细胞可为真核细胞或原核细胞，例如，格兰氏阳性或革兰氏阴性菌细胞。所述生物细胞成分可为蛋白质、糖、脂质、核酸、或其组合。所述样品可为例如包含生物材料的样品，例如，血液、尿、粘膜拭子(swab)(例如，鼻拭子)、体液、组织、生物样品、或其组合。
结合到所述靶材料的所述材料可特异性地或非特异性地结合到所述靶材料。所述靶材料的特异性结合在广义上与配体和受体之间、抗原和抗体之间、酶和底物或抑制剂之间的关系等有关。当所述靶材料为非特异性结合细菌细胞时，所述能与所述靶材料结合的材料可为具有70度-约95度的水接触角的材料、或具有选自伯氨基、仲氨基、叔氨基和季氨基的至少一个氨基的材料。所述叔氨基可为排除酰胺基和氰基的多种叔氨基中的任何叔氨基。可利用将氨基硅烷部分固定而引入氨基。所述氨基硅烷部分可通过将氨基硅烷分子沉积在所述固体载体的表面上而获得。所述氨基硅烷分子可为由式(X1)(X2)(X3)Si(Y)表示的有机氨基硅烷分子，其中X1、X2和X3可各自独立地选自氢原子、烷氧基(-OR)和卤素原子，且X1、X2和X3的至少一个可为烷氧基。在所述烷氧基(-OR)中，R可为C1-C20烃基，例如，可为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基等。所述卤素原子可为氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)或砹(At)。Y可为具有至少一个氨基的有机部分，例如，可为氨基烷基或聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)基团。所述氨基烷基可包括C1-C20烷基。所述聚乙烯亚胺基团可由式-[CH2CH2NH]n-表示，其中n为2-100。所述烷氧基(-OR)可在含水条件中水解，产生羟基，所述羟基的至少一个可参与和在所述固体载体的表面和相邻的硅烷分子的表面上找到的-OH基团的缩合和消除反应。所述氨基硅烷分子可为例如3-氨基丙基三乙氧基硅烷(GAPS)、或聚乙烯亚胺三乙氧基硅烷例如N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷(EDA)和N1-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺(DETA)。可使用已知方法，例如，使用浸涂、旋涂、或化学气相沉积(CVD)将这些氨基硅烷分子涂覆在所述固体载体上。
如本文中所使用的，术语“季氨基”是指“季铵基”。如本文中所使用的，术语“氨基”涵盖了伯氨基、仲氨基、叔氨基和季铵基，除非另外说明。例如，术语“氨基硅烷”涵盖了含有伯氨基、仲氨基、叔氨基和/或季铵基的硅烷。
如本文中所使用的，所述水接触角可在Krüss滴形(drop-shape)分析系统(型号DSA10Mk2，Kruss，德国)上测量。将1.5μL去离子水的液滴置于所述样品上。将所述液滴通过电荷耦合器件(CCD)摄影机每0.2秒监测一次达10秒，并通过Drop-Shape Analysis(DSA)软件(DSA版本1.7，Kruss)进行分析。通过切线法将所述液滴的整个轮廓拟合成通常的二次曲线方程(conicsection equation)。在右侧和左侧两者处均确定角度。对于各个液滴计算平均值并对每个样品测量总共五个液滴。将所述五个液滴的角度的平均值作为所述接触角。
根据如上所述的方法，所述微流控器件包括具有入口和出口的第一腔、操作性地连接到压力供应单元的第二腔、以及设置在所述第一腔和所述第二腔之间并且形成所述第一和第二腔的至少部分的壁的弹性膜。所述第一腔和/或第二腔在未对所述第二腔施加正压力或负压力的情况下可具有约1μl-约500μl的容积，和在一些实施方式中，可具有约1μl-约500μl、约10μl-约500μl、约20μl-约500μl、约50μl-约500μl、约75μl-约500μl、约100μl-约500μl、约200μl-约500μl、约300μl-约500μl、约400μl-约500μl、约1μl-约400μl、约1μl-约300μl、约1μl-约200μl、约1μl-约100μl、约10μl-约100μl、约20μl-约100μl、约50μl-约100μl、或约75μl-约100μl的容积。
所述弹性膜可为可朝向所述第一腔和/或所述第二腔移动的和可保持在适当位置一段时间(例如，对于一个整体操作或多个整体操作)，或者可在向所述第二腔施加正压力或负压力时(例如，在重复地施加或顺序地施加正压力或负压力时，或者在正压力或负压力变化以导致所述膜振动时)振动。所述弹性膜可振动，而振动(oscillation)平衡点位于所述第一腔或所述第二腔中的位置。即，在其余(静止，resting)位置处的所述弹性膜可朝向所述第一腔或所述第二腔延伸。所述弹性膜可包括任何合适的材料，例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、特氟隆(Teflon)、有机硅、聚氨酯、聚苯乙烯、或其组合。所述弹性膜可具有适于可朝向所述第一腔和/或所述第二腔移动或者在向所述第二腔施加正压力或负压力时振动的厚度。所述弹性膜的厚度可根据所使用的弹性材料适当地选择。所述弹性膜可具有10GPa或更小的杨氏模量。所述弹性膜可具有10μm-约5000μm的厚度，和在一些实施方式中，可具有约10μm-约1000μm、约50μm-约1000μm、约100μm-约1000μm、约200μm-约1000μm、约300μm-约1000μm、约400μm-约1000μm、约500μm-约1000μm、约700μm-约1000μm、约10μm-约900μm、约50μm-约800μm、约100μm-约700μm、约200μm-约600μm、或约200μm-约500μm的厚度。
所述压力供应单元可为可向所述第二腔提供正压力或负压力的任何单元，例如气动泵。所述压力供应单元可以操作性地连接到用于向所述第二腔周期性地或非周期性地和连续地或非连续地供应正压力、负压力、或其组合的压力控制器。所述压力供应单元可向所述第二腔供应受控的压力，使得所述弹性膜可根据所述受控的压力延伸，例如，对于操作的整个期间。例如，如果施加正压力，所述弹性膜可朝向所述第一腔延伸，或者如果施加负压力，所述弹性膜可朝向所述第二腔延伸。如果顺次施加正压力和负压力的组合(或者如果重复地施加(例如，脉冲地产生(pulse))正压力或负压力，或者如果施加的压力的大小快速地变化)，所述弹性膜可与其中未向所述第二腔施加压力的静止(resting)位置或通过正压力或负压力的静态(static)施加而获得的延伸位置相比振动。所述振动可引发所述第一腔中的固体载体碰撞(collision)。该碰撞可导致结合到所述固体载体的所述靶材料被处理，例如被裂解，如果所述靶材料是细胞的话。所述碰撞还可促进溶液和所述固体载体之间的相互作用。所述弹性膜可在相对于所述静止位置朝向所述第一腔或所述第二腔延伸的同时发生振动，从而导致降低或增大的表面积与容积比(SVR)，所述SVR表示所述固体载体的表面积与所述第一腔的容积之比。
在上述处理样品中的靶材料的方法中，所述压力控制器可包括存储介质，所述存储介质存储在所述样品引入和后续操作的至少一个中，用于控制向所述第二腔施加正压力以使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸、或者向所述第二腔施加负压力以使所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的信号。例如，当所述样品包括细胞时，所述存储介质可存储在样品引入操作和洗涤操作中用于使得能够向所述第二腔施加正压力以使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的信号，和在细胞裂解(溶解，lysis)操作中用于使得能够向所述第二腔施加负压力以使所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的信号。
在一些实施方式中，当所述样品包括核酸、蛋白质或糖作为所述靶材料时，所述存储介质可存储在样品引入操作、洗涤操作和靶材料洗脱操作中用于使得能够向所述第二腔施加正压力以使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的信号。
所述存储介质可存储用于使得能够向所述第二腔施加正压力以使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸、或向所述第二腔施加负压力以使所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的信号，以及用于引发压力的变化使得所述弹性膜在朝向所述第一或第二腔室延伸的同时发生振动的信号。
因此，所述方法可进一步包括根据存储在所述存储介质中的压力控制信号控制所述第二腔的压力。控制所述第二腔的压力可通过微处理器进行，所述微处理器可以操作性地连接到所述存储介质。所述存储介质可为通过所述微处理器可读取的。
所述固体载体可足够坚硬以用作细胞裂解装置。所述坚硬的固体载体可由固体材料形成或者可用固体材料涂覆。措辞“足够坚硬”是指破坏细胞膜、细胞壁、病毒的包膜、或其组合以释放其内容物。所述载体可为磁性或非磁性固体载体。所述固体载体可作为任何形式的固体载体例如球、或者非球体(包括板)、或者由玻璃、金属和金属氧化物的至少一种形成的珠实现。所述金属氧化物可为如下之一：ZrO2、SiO2、Al2O3、Fe2O3、TiO2、及其混合物。所述混合物可为，例如，ZrO2和SiO2的混合物。所述金属固体载体可包括，例如，钢珠或不锈钢珠。
所述固体载体不限于微尺度尺寸，并且可具有任何尺寸，通过所述尺寸，通过上述器件的运行，所述样品可被处理，例如，细胞可被裂解。例如，所述固体载体的最大横截面宽度可为约10nm-约1000μm，和在一些实施方式中，可为约10nm-约500μm，和在一些另外的实施方式中，可为约100nm-约100μm，和在还一些另外的实施方式中，可为约1μm-约500μm。所述固体载体可为球形的、平面的、或多平面的。多个固体载体可设置在所述第一腔中。在所述第一腔中的所述固体载体的数量可为两个或更多个、10个或更多个、100个或更多个、1,000个或更多个、10,000个或更多个、100,000个或更多个、或108个或更多个。在一些另外的实施方式中，在所述第一腔中的所述固体载体的数量可为约1-108个，例如约10-108个、约100-108个、约1,000-108个、约104-108个、约105-108个、约106-108个、约107-108个、约10-107个、约100-107个、约1,000-107个、约104-107个、约105-107个、或约106-107个。所述固体载体可在所述第一腔的制造期间预先引入到所述第一腔中，以不从所述第一腔的入口或出口穿过。所述固体载体可具有大于1g/cm3的密度(D)，和在一些实施方式中，可为约1g/cm3-约20g/cm3。
所述第一腔的壁和所述固体载体的表面的至少一个可由能够结合到所述靶材料例如细胞或病毒的结合材料形成，和在一些实施方式中，可与这样的材料结合。所述结合材料可包括特异性地结合到所述细胞或病毒的材料。所述特异性结合材料可为抗体、抗原、底物、抑制剂、受体、配体、或其组合。所述结合材料可包括非特异性地结合到细胞、病毒、生物分子、或其组合的材料。生物分子可为蛋白质、核酸、糖、或其组合。所述非特异性结合材料可包括具有约70°-约95°的水接触角的疏水材料，和在一些实施方式中，可包括具有至少一个氨基的材料。所述具有至少一个氨基的材料可包括聚合物。或者，所述具有至少一个氨基的材料可包括聚乙烯亚胺(PEIM)。所述具有约70°-约95°的水接触角的疏水材料可为十八烷基二甲基(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)氯化铵(OTC)或十三氟四氢辛基三甲氧基硅烷(DFS)。具有所述结合材料的所述固体载体的表面或所述第一腔的壁在捕获或吸附细胞、病毒、生物分子、或其组合以分离它们方面可为有用的。所述固体载体可在所述第一腔内部，未结合到所述第一腔的壁。
在所述微流控器件中，所述第二腔可包括多个操作性地连接到所述压力供应单元的子腔(subchamber)，其中所述弹性膜可设置在所述第一腔和所述第二腔的所述子腔之间，并且可形成所述第一腔和所述第二腔的各子腔的至少部分的壁。
施加到所述第二腔的正压力可使所述弹性膜朝向所述第一腔移动，使得在所述第一腔的减小的容积下，在所述第一腔中的所述固体载体可保持具有恒定的表面积。即，所述固体载体可具有增大的所述固体载体的表面积与所述第一腔的容积之比(下文中称为“表面积与容积比(SVR)”)。上述方法可包括在所述入口和出口的至少一个是开放的时，向所述第二腔施加正压力以增大所述SVR。施加到所述第二腔的所述正压力可确定为导致0.05μm-1或更大的SVR，和在一些实施方式中，导致0.11μm-1或更大、0.12μm-1或更大、0.13μm-1或更大、0.14μm-1或更大、或者0.15μm-1或更大的SVR。在一些另外的实施方式中，施加到所述第二腔的所述正压力可确定为导致约0.05μm-1-约0.15μm-1、约0.11μm-1-0.15μm-1、约0.12μm-1-0.15μm-1、约0.13μm-1-0.15μm-1、约0.14μm-1-0.15μm-1、约0.10μm-1-0.14μm-1、约0.11μm-1-0.14μm-1、约0.12μm-1-0.14μm-1、或约0.13μm-1-0.14μm-1的SVR。施加到所述第二腔的负压力可使所述弹性膜朝向所述第二腔移动，使得在增大的容积下，在所述第一腔中的所述固体载体可保持具有恒定的表面积。即，所述固体载体可具有减小的所述固体载体的表面积与所述第一腔的容积之比(SVR)。上述方法可包括在所述入口和出口的至少一个是开放的时，向所述第二腔施加负压力，以减小所述SVR。施加到所述第二腔的正压力、负压力、或其组合可使所述弹性膜振动。取决于所述弹性膜的类型和厚度，可适当地选择所述正压力或负压力的水平。在一些实施方式中，如果所述弹性膜是具有约200μm-约300μm厚度的PDMS膜，所述正压力可为约10Pa-约300kPa，例如，约30Pa-300kPa、约50Pa-300kPa、约70Pa-300kPa、约80Pa-300kPa、约200Pa-300kPa、约10Pa-200kPa、约30Pa-150kPa、或约50Pa-100kPa。
在上述方法中，所述样品引入和后续操作中的至少一个可在向所述第二腔施加仅正压力的同时进行。即，各操作可在不除去所述正压力的情况下，例如，通过施加负压力进行。
在一些实施方式中，所述靶材料可为细胞，其中上述方法可进一步包括使所述弹性膜振动以使所述细胞裂解。所述细胞可为细菌细胞，其可为例如格兰氏阳性或革兰氏阴性细胞。所述振动可通过向所述第二腔施加正压力、负压力、或其组合而实现。
在一些实施方式中，所述弹性膜可以约0.001Hz-约100kHz的频率振动。在一些另外的实施方式中，所述弹性膜可以约0.01Hz-100kHz的频率、约0.1Hz-约100kHz的频率、约1Hz-约100kHz的频率、约5Hz-约100kHz的频率、或约10Hz-约100kHz的频率振动。可使用用于提供操作性地连接到所述入口和所述出口的至少一个的驱动力的装置进行加压以提供用于使流体流入和排出的驱动力。所述驱动力提供装置可为能够引起流体的运动的任何设备，和在一些实施方式中，可为能够向所述第二腔施加正压力或负压力的设备，例如泵。所述泵可为在微流控器件中可实施的微型泵。所述微型泵可为机械或非机械设备。机械微流量泵通常可包括致动器和运动部件，所述运动部件可为膜或阀瓣。所述机械微流量泵的驱动力可使用压电、静电、热-气动(thermo-pneumatic)、气动、或磁效应产生。非机械泵可通过电-流体力学、电渗透或超声波流动的产生来起作用。
在一些实施方式中，所述靶材料可为细胞，其中所述方法可进一步包括在引入所述样品后，在通过向所述第二腔施加负压力使得所述弹性膜朝向所述第二腔延伸(例如，以约0.05μm-1或更小的SVR)的同时，将细胞裂解液引入所述第一腔中，由此使结合到所述固体载体的所述靶材料裂解。所述细胞可为细菌细胞，所述细菌细胞可为，例如，格兰氏阳性或革兰氏阴性细胞。所述细胞裂解液的引入可在所述第一腔的出口被关闭时进行。在这点上，所述方法可进一步包括在引入所述样品后关闭所述入口。然而，由于在所述弹性膜朝向所述第二腔延伸时，存在用于阻挡所述细胞裂解液通过开放的出口排出的空间，因此，在所述出口未关闭的情况下引入所述细胞裂解液可为可能的。因此，根据本公开内容的实施方式，所述方法可包括在所述第一腔的出口未关闭时引入细胞裂解液。所述细胞裂解液可包括任何细胞裂解材料。例如，所述细胞裂解液可包括含有酶如溶菌酶的特异性细胞裂解材料、或非特异性细胞裂解材料如表面活性剂。所述非特异性细胞裂解材料的非限制性实例是NaOH溶液、KOH溶液、或其组合。所述细胞裂解液的引入可在所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的情况下，即，在所述第一腔具有比相对于静止位置低的SVR以降低由所述固体载体导致的流体阻力和促进对少量溶液的控制时进行。
在这点上，所述方法可进一步包括在引入所述细胞裂解液后，使所述弹性膜振动，以促进细胞裂解。所述振动可通过施加正压力、负压力、或其组合而引起。所述振动可引起所述第一腔中的所述固体载体中的固体载体碰撞。所述碰撞可促进结合到所述固体载体的所述靶材料的处理，例如，细胞裂解，如果所述靶材料为细胞的话。
在一些实施方式中，所述弹性膜可以约0.001Hz-约100kHz的频率振动。在一些另外的实施方式中，所述弹性膜可以约0.01Hz-约100kHz的频率、约0.1Hz-约100kHz的频率、约1Hz-约100kHz的频率、约5Hz-约100kHz的频率、或约10Hz-约100kHz的频率振动。所述加压可使用操作性地连接到所述入口和所述出口的至少一个的驱动力提供装置进行以提供用于使流体流入到所述第二腔和/或从所述第二腔排出的驱动力。所述驱动力提供装置可为能够引起流体的运动的任何设备，和在一些实施方式中，可为能够向所述第二腔施加正压力或负压力的设备，例如泵。所述泵可为在微流控器件中可实施的微型泵。所述微型泵可为机械或非机械设备。机械微流量泵通常可包括致动器和运动部件，所述运动部件可为膜或阀瓣。所述机械微流量泵的驱动力可使用压电、静电、热-气动、气动、或磁效应产生。非机械泵可通过电-流体力学、电渗透或超声波流动的产生来起作用。
在一些实施方式中，所述方法可进一步包括，在所述裂解操作之前，在使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的情况下，向所述第二腔施加正压力以将洗涤溶液引入到所述第一腔中，从而除去未结合到所述固体载体的材料。可使所述弹性膜在朝向所述第一腔延伸的同时发生振动。例如，在所述洗涤操作期间，在向所述第二腔施加正压力，使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时，可引起所述第二腔的压力的变化，从而使所述弹性膜振动以提高洗涤效率。此外，可调节振动频率以控制通过所述洗涤除去的材料的量和/或类型。即，可调节洗涤强度(stringency)。
在一些实施方式中，所述方法可进一步包括，在所述洗涤操作之后，在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时，使气体从所述第一腔的入口流动通过至所述出口，从而干燥所述固体载体。所述气体可为空气或氮气。
在一些实施方式中，所述能与所述靶材料结合的材料可为具有约70度-约95度的水接触角的材料，或具有选自伯氨基、仲氨基、叔氨基和季氨基的至少一个氨基的材料。所述材料可结合到细菌细胞、病毒、生物分子、或其组合。所述生物分子可为蛋白质、核酸、糖、或其组合。可在NaOH溶液中进行所述裂解操作。所述NaOH溶液的引入可使所述细胞裂解并从所述细胞释放核酸。之后，可收取所述NaOH溶液以获得包括经分离的核酸的溶液。
在一些实施方式中，所述方法可进一步包括在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时，将洗脱液引入到所述第一腔中，从而将核酸从包含所述固体载体的所述第一腔或从所述固体载体释放。所述核酸的释放可在其中可使核酸从所述固体载体分离的条件下进行。这样的条件可由本领域技术人员容易地选择。所述洗脱液的非限制性实例是生物化学缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水、水、盐水、Tris缓冲液、NaOH溶液、和KOH溶液。
根据本公开内容的另一方面，处理样品中的靶材料的方法包括：将所述样品引入到微流控器件的第一腔中，其中所述第一腔包含包括能与所述靶材料结合的材料的固体载体，以将所述靶材料结合到所述固体载体，其中所述微流控器件包括具有入口和出口的所述第一腔、与压力供应单元操作性地连接的第二腔、以及设置在所述第一腔和所述第二腔之间并且形成所述第一和第二腔的至少部分的壁的弹性膜，其中所述样品引入和后续操作中的至少一个在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时进行，所述靶材料是细胞，和所述能与所述靶材料结合的材料是具有约70度-约95度的水接触角的材料、或具有选自伯氨基、仲氨基、叔氨基和季氨基的至少一个氨基的材料，且所述样品引入在约3.0-约6.0的pH和约10mM-约500mM，例如，约10mM-约400mM、约10mM-约300mM、约10mM-约200mM、约10mM-约150mM、约10mM-约100mM、约10mM-约50mM、约30mM-约500mM、约30mM-约400mM、约30mM-约300mM、约30mM-约200mM、约30mM-约150mM、约30mM-约100mM、约30mM-约50mM的盐浓度下进行；在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时，将洗涤溶液引入到所述第一腔中，从而除去未结合到所述固体载体的材料；在通过向所述第二腔施加负压力使所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的同时，将细胞裂解液引入到所述第一腔中，从而使结合到所述固体载体的所述靶材料裂解以产生核酸，所述核酸然后结合到所述固体载体；和将洗脱液引入到所述第一腔中以将核酸从包含所述固体载体的所述第一腔或所述固体载体释放。所述引入洗脱液可在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时进行。
在一些实施方式中，处理样品中的靶材料的方法包括：将所述样品引入到微流控器件的第一腔中，其中所述第一腔包含包括能与所述靶材料结合的材料的固体载体，以将所述靶材料结合到所述固体载体，其中所述微流控器件包括具有入口和出口的所述第一腔、与压力供应单元操作性地连接的第二腔、以及设置在所述第一腔和所述第二腔之间并且形成所述第一和第二腔的至少部分的壁的弹性膜，其中所述靶材料是核酸，和所述样品引入在由于向所述第二腔施加正压力而导致所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时进行；在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时，将洗涤溶液引入到所述第一腔中，从而除去未结合到所述固体载体的材料；和将洗脱液引入到所述第一腔中以将核酸从所述固体载体释放。所述引入洗脱液可在由于向所述第二腔施加正压力而导致所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时进行。
在以上实施方式中，所述能与所述靶材料结合的材料可为能够结合到核酸的任何已知材料，其可特异性地或非特异性地结合到核酸。所述能够结合到核酸的材料的非限制性实例是金属氧化物、具有正电性官能团的材料、具有负电性官能团的材料、或具有正电性官能团和负电性官能团两者的材料。所述金属氧化物可包括如下之一：ZrO2、SiO2、Al2O3、Fe2O3、TiO2、或其混合物。所述正电性官能团可为伯氨基、仲氨基、叔氨基或季氨基。所述负电性官能团可为例如羧基。所述能够结合到核酸的材料可在如下中与核酸结合：离液盐(chaotropic salt)溶液、kosmotropic盐溶液、或缓冲液例如生物化学缓冲液，其包含能够促进与核酸的结合的材料例如聚乙二醇，从而优化所述结合反应。所述样品可包括细胞裂解物或裂解的病毒产物。
在一些实施方式中，所述洗涤溶液可选择性地除去未结合到所述固体载体的材料，且不显著地除去结合到所述固体载体的核酸。本领域技术人员可适当地选择所述洗涤溶液和洗涤条件。所述洗涤溶液或液体可包括例如水、盐水、或缓冲液例如PBS或Tris缓冲液。
在一些实施方式中，所述洗脱液可为水或能够将结合到所述固体载体的核酸释放的任何已知溶液，例如，缓冲液如PBS或Tris缓冲液。本领域技术人员可适当地选择所述洗脱液和洗脱条件。所述核酸的洗脱可根据其目的通过优化所述洗脱液的条件例如所用洗脱液的盐浓度、pH等进行调节。在本实施方式中，不描述与在之前的实施方式中描述的那些相同的要素以避免冗长。
图1是与上述处理样品中的靶材料的方法可相适应的根据本公开内容的实施方式的微流控器件20的截面图。参考图1，微流控器件20包括上部板21、下部板23和膜26。膜26设置在上部板21和下部板23之间。上部板21的空间区域(spatial region)形成第一腔22，和下部板23的空间区域形成第二腔24。第一和第二腔22和24被设置于其间的膜26分隔。换言之，第一腔22是由上部板21和26界定(delimit)的空间，和第二腔24是被下部板23和膜26界定的空间。
膜26可为柔性的或有弹性的。膜26可为聚合物膜如聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜。膜26可具有例如约1μm-约5mm的厚度。第一腔22可包含多个固体载体。图1的实施方式图解了多个用作固体载体的微粒28。由于第一腔22由膜26所界定，在第一腔22中的微粒28可接触膜26。微粒28可具有例如约1μm-约1,000μm的直径。在第一腔22中的微粒28的密度(D)可大于1g/cm3，和在一些实施方式中，可为约1g/cm3-约20g/cm3。每1μl液体介质可包括多于1个微粒，和在一些实施方式中，可存在约10、100、1000、10000、或109或更多个微粒/1μl液体介质。在第一腔中的微粒28可在数量上为约1-约108个/1μl液体介质，和在一些另外的实施方式中，可在数量上为约100-约106个/1μl液体介质。微粒28可包括玻璃珠。微粒28可为金属氧化物珠或金属珠。金属氧化物可包括如下之一：ZrO2、SiO2、Al2O3、Fe2O3、TiO2、及其混合物。所述混合物可为例如ZrO2和SiO2的混合物。金属珠可包括例如钢珠或不锈钢珠。如果微粒28具有玻璃或金属氧化物成分，可促进用于细胞或核酸捕获的表面改性。
第一腔22包括入口30和出口32。入口30和出口32可具有比微粒28的直径小的直径。包含待瓦解(disrupt)的细胞或待纯化的核酸的溶液通过入口30引入到第一腔22中。所得到的包括核酸等的细胞膜和/或壁的瓦解产物或经纯化的核酸通过出口32释放。入口30穿透上部板21的一个壁并连接到第一腔22的一侧。出口32穿透上部板21的另一个壁并连接到第一腔21的另一侧。
第二腔24可为包括向其中引入在膜26上周期性地或非周期性地加压的流体如空气的气动腔。将高压流体引入到第二腔24中以对膜26加压。当加压时，膜26可朝向第一腔22突出，降低第一腔22的比容积。另一方面，当提供负压力时，膜26可朝向第二腔24突出。第二腔24可具有端口34作为用于对第二腔24的内部进行加压或减压的流体的流入和流出通道。由于所述流体通过端口34周期性地或非周期性地引入到第二腔24中或从第二腔24释放，膜26可周期性地或非周期性地振动。膜26的振动可通过与微粒28的直接接触或经由第一腔22中的溶液最终对第一腔22中的微粒28周期性地或非周期性地加压。结果，引起微粒28移动、彼此碰撞或在运动期间与第一腔22的内壁碰撞。由于微粒28的运动，引入到第一腔22内部的细胞通过被剪切或被研磨而瓦解。此外，靶材料如细胞或生物分子与周围液体溶液的相互作用增强。可适当地控制通过向第二腔24供应所述流体或将所述流体释放到第二腔24外部的对第二腔24的加压或减压以导致膜26的范围为约0.001Hz-约100Hz的振动频率。
微粒28可在其表面上具有能够特异性地或非特异性地结合到靶材料的材料28A，例如，能够捕获细胞的材料，如图2中所示。例如，为了选择性地捕获特异性细胞，可在微粒28的表面上涂覆抗体、适体(aptamer)等。非特异性细胞可通过疏水或静电力的作用捕获。在一些实施方式中，能够结合到靶材料的材料28A可为具有约70度-约95度的水接触角的材料或具有选自伯氨基、仲氨基、叔氨基和季氨基的至少一个氨基的材料。
材料28A可使用有机硅烷以多种方式对微粒28的表面进行改性而获得。例如，可通过气相沉积、自组装涂覆、或其组合将有机硅烷涂覆在微粒28的表面上。
当微粒28的表面包括具有对特异性或非特异性细胞的亲和性的材料时，引入到第一腔22中的细胞可被微粒28捕获。在该状态中，膜26的振动可导致微粒28移动，并因此彼此碰撞或碰撞第一腔22的内壁。在该过程期间，被微粒28捕获的细胞可被瓦解。
在一些实施方式中，在将包含待瓦解的细胞的溶液供应到第一腔22中之后，可将具有增强的细胞裂解效果的物质供应到第一腔22中，之后细胞瓦解。所述物质可为细胞裂解液。所述细胞裂解液可包括例如NaOH、KOH、离液剂溶液、表面活性剂等。所述细胞裂解液可以不影响在细胞瓦解之后的后处理如聚合酶链式反应(PCR)的浓度使用，使得在细胞瓦解之后可立即进行PCR而不进行另外的纯化。如果所述物质以影响所述PCR的浓度使用，可进行另外的纯化。所述细胞裂解液也可在细胞瓦解之后供应以促进核酸的释放。
在一些实施方式中，在将包含待瓦解的细胞的溶液供应到第一腔22中之后，可进行细胞瓦解而不向第一腔22中另外地供应所述细胞裂解液。
图3说明图1的微流控器件20的替代形式。下文中仅描述与图1的微流控器件20的那些不同的部分。这也适用于其它图。
参考图3，入口30和出口32可具有比微粒28的直径大的直径。多个第一突出部分40可分布在入口30的内侧。所述多个第一突出部分40可遍及入口30的内侧均匀地分布。所述多个第一突出部分40可设置成在相反方向上突出。由于第一突出部分40，入口30的实质(substantial)直径或有效直径可小于微粒28的直径。多个第二突出部分42可分布在出口32的内侧。第二突出部分42的分布可与第一突出部分40的分布相同。由于第二突出部分42，出口32的实质直径或有效直径可小于微粒28的直径。第一突出部分40和第二突出部分42在形状上可相同或不同。代替设置第一和第二突出部分40和42，可将入口30和出口32形成为具有压花的(embossed)内侧。
图4说明图1的微流控器件20的另一替代形式。
参考图4，入口30的结构特征可与关于图3所描述的那些相同。可在出口32中设置过滤器44。过滤器44可为容许经瓦解的细胞的成分选择性地或非选择性地通过的多孔材料。入口30可具有比微粒28的直径小的直径，如图1中那样。所述多孔材料可为具有孔的膜过滤器且其可由聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、纤维、或其组合制造。
图5说明图1的微流控器件20的另一替代形式。
参考图5，可设置两个腔即第三腔24A和第四腔24B代替图1的第二腔24。第三腔24A和第四腔24B可被分隔壁48分隔。第三和第四腔24A和24B的作用可与图1的第二腔24的作用相同。第三腔24A可包括第一端口34A，和第四腔24B可包括第二端口34B。第一和第二端口34A和34B的作用可与第二腔24的端口34的作用相同。入口30和出口32的结构特征可与关于图3或图4所描述的那些相同。可向第一和第二端口34A和34B同时或顺序地施加压力以使限定第三腔24和第四腔24B的膜26的部分同时或顺序地振动。可向第一和第二端口34A和34B施加具有相同或不同相位(phase)的压力，以使在各个腔中的膜26以相同或不同的相位振动。例如，可向第一端口34A施加正压力，同时向第二端口34B施加负压力，以使在第三腔24A中的振动膜26和在第四腔24B中的振动膜26以相反的相位振动。
图6说明图1的微流控器件20的另一替代形式。
参考图6，可设置三个腔即第三-第五腔24A、24B和24C代替图1的第二腔24。第三-第五腔24A、24B和24C的作用可与图1的的第二腔24的作用相同。第三和第五腔24A和24C可被第一分隔壁48A分隔。第四和第五腔24B和24C可被第二分隔壁48B分隔。第三-第五腔24A、24B和24C可分别具有第一-第三端口34A、34B和34C。第一-第三端口34A、34B和34C的作用可与第二腔24的端口34的作用相同。尽管图6的实施方式说明将图1的第二腔24分成三个腔，但图1的第二腔24可被分成多于三个腔。可向第一-第三端口34A、34B和34C同时或顺序地施加压力以使限定各个腔的膜26同时或顺序地振动。可向第一-第三端口34A、34B和34C施加具有相同或不同相位的压力以使在各个腔中的膜26以相同或不同的相位振动。例如，可向第一和第三端口34A和34C施加正压力，同时向第二端口34B施加负压力，以使在第三和第五腔24A和24C中的膜26和在第四腔24B中的膜26以相反的相位振动。
图1和3-6中的第一和第二腔22和24的作用可被调换。即，第一和第二腔22和24的任一个可包含微粒28，和另一个腔可用作向其中引入用于加压的流体的腔。如果第二腔24用作向其中引入用于加压的流体的腔，第二腔24的端口34可连接到能够对第二腔24的内部进行加压或减压的压力控制器(未显示)。这也可适用于第三-第五腔24A、24B和24C。
使用上述处理样品中的靶材料的方法，可高效率地处理样品中的靶材料。所述靶材料的处理可包括所述靶材料的结合、洗涤和干燥、及其组合。当所述靶材料是细胞和/或生物材料时，所述处理可包括所述细胞的结合、洗涤、干燥和瓦解，以及所述生物材料的分离。根据本公开内容的上述实施方式，可通过利用弹性膜的偏移来控制填充有固体载体的腔的SVR，以增强所述固体载体的表面与所述样品中的靶材料的相互作用。
根据本公开内容的另一方面，微流控器件包括具有入口和出口的第一腔、与压力供应单元操作性地连接的第二腔、以及设置在所述第一腔和所述第二腔之间并且形成所述第一和第二腔的至少部分的壁的弹性膜，其中所述第一腔包含能够结合靶材料的材料。
除非另外具体说明，在此将不提供与以上关于在处理样品中的靶材料的方法中使用的微流控器件所描述的那些相同的部件的详细描述，以避免冗长。
所述微流控器件可为用于处理样品中的靶材料的器件。所述靶材料的处理可包括如下的至少一种：将所述靶材料引入到所述第一腔中，将所述靶材料结合到所述固体载体，洗涤所述固体载体，干燥所述固体载体，使所述弹性膜振动以搅动在所述第一腔中的所述固体载体，和将结合到所述固体载体的靶材料或存在于所述第一腔中的靶材料从所述第一腔排出。所述搅动可引起固体载体碰撞、或所述靶材料与所述固体载体的碰撞。
在所述微流控器件中，用于提供驱动力以使流体移动的压力供应单元可以操作性地连接到所述第一腔。所述微流控器件可包括流体连通地连接到所述第一腔的至少一个贮存器(reservoir)。所述贮液器可为如下的至少一种：洗涤溶液贮存器、洗脱液贮存器、或pH调节剂贮存器。
如本文中所使用的，术语“微流控器件”可意指包括至少一个具有数微米的最大横截面长度的通道(channel)或腔的器件。例如，所述微流控器件可包括至少一个具有约1μm-约1000μm的最大横截面长度的通道或腔。
在所述微流控器件中，所述入口和/或出口可设置在不具有显著的间隙的第一腔中，或者可通过用于流体连通的通道彼此连接。在未对所述第二腔施加正压力或负压力的情况下，所述第一腔和/或第二腔可具有约1μl-约500μl的容积，和在一些实施方式中，可具有约1μl-约500μl、约10μl-约500μl、约20μl-约500μl、约50μl-约500μl、约75μl-约500μl、约100μl-约500μl、约200μl-约500μl、约300μl-约500μl、约400μl-约500μl、约1μl-约400μl、约1μl-约300μl、约1μl-约200μl、约1μl-约100μl、约10μl-约100μl、约20μl-约100μl、约50μl-约100μl、或约75μl-约100μl的容积。
所述弹性膜可为可朝向所述第一腔和/或第二腔移动的，或者当向所述第二腔施加正压力或负压力时可振动。所述弹性膜可包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚丙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、特氟龙、或其组合。所述弹性膜可具有适合于可朝向所述第一腔和/或所述第二腔移动、或者当向所述第二腔施加正压力或负压力时发生振动的厚度。所述弹性膜的厚度可根据所使用的弹性材料适当地选择。所述弹性膜可具有约10μm-约5000μm的厚度，和在一些实施方式中，可具有约10μm-约1000μm、约50μm-约1000μm、约100μm-约1000μm、约200μm-约1000μm、约300μm-约1000μm、约400μm-约1000μm、约500μm-约1000μm、约700μm-约1000μm、约10μm-约900μm、约50μm-约800μm、约100μm-约700μm、约200μm-约600μm、或约200μm-约500μm的厚度。所述压力供应单元可为泵如气动泵。所述压力供应单元可连接到压力控制器以向所述第二腔周期性地或非周期性和连续地或非连续地供应正压力、负压力、或其组合。所述压力供应单元可向所述第二腔供应受控的压力，使得所述弹性膜可根据所述受控的压力延伸。例如，如果施加正压力，所述弹性膜可朝向所述第一腔延伸，或者如果施加负压力，所述弹性膜可朝向所述第二腔延伸。如果施加正压力和负压力的组合，所述弹性膜可相对于其中未向所述第二腔施加压力的静止位置振动。所述振动可引起所述第一腔中的固体载体之间的碰撞。该碰撞可导致结合到所述固体载体的所述靶材料被处理，例如被裂解，如果所述靶材料是细胞的话。所述碰撞还可促进溶液和所述固体载体之间的相互作用。所述弹性膜可在朝向所述第一腔或所述第二腔延伸的同时仍然振动。
在上述处理样品中的靶材料的方法中，所述压力控制器可包括存储介质，所述存储介质存储在所述样品引入和所述后续操作的至少一个中，用于控制向所述第二腔施加正压力以使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸、或者向所述第二腔施加负压力以使所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的信号。例如，当所述样品包括细胞时，所述存储介质可存储在样品引入操作和洗涤操作中用于使得能够向所述第二腔施加正压力以使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的信号、和在细胞裂解操作中用于使得能够向所述第二腔施加负压力以使所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的信号。
在一些实施方式中，当所述样品包括核酸、蛋白质、糖、或其组合作为所述靶材料时，所述存储介质可存储在样品引入操作、洗涤操作和靶材料洗脱操作中用于使得能够向所述第二腔施加正压力以使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的信号。
所述存储介质可存储用于使得能够向所述第二腔施加正压力以使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸、或向所述第二腔施加负压力以使所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的信号，以及用于引发压力的变化使得在所述弹性膜朝向所述第一或第二腔室延伸的同时所述弹性膜发生振动的信号。
因此，所述方法可进一步包括根据存储在所述存储介质中的压力控制信号调节所述第二腔的压力。调节所述第二腔的压力可通过微处理器进行，所述微处理器可以操作性地连接到所述存储介质。所述存储介质可为通过所述微处理器可读取的。
所述固体载体可足够坚硬以用作例如细胞裂解装置。所述坚硬的固体载体可由固体材料形成或者可用固体材料涂覆。所述载体可为磁性或非磁性固体载体。所述固体载体可作为由玻璃、金属和金属氧化物的至少一种形成的珠实现。所述金属氧化物可为如下之一：ZrO2、SiO2、Al2O3、Fe2O3、TiO2、及其混合物。所述混合物可为，例如，ZrO2和SiO2的混合物。所述金属珠可包括，例如，钢珠或不锈钢珠。
所述固体载体不限于微尺度尺寸，并且可具有任何尺寸，通过所述尺寸，通过上述器件的运行，所述样品可被处理，例如，细胞可被裂解。例如，所述固体载体的最大横截面宽度可为约10nm-约1000μm，和在一些实施方式中，可为约10nm-约500μm，和在一些另外的实施方式中，可为约100nm-约100μm，和在还一些另外的实施方式中，可为约1μm-约500μm。所述固体载体可为球形的、平面的、或多平面的。多个固体载体可设置在所述第一腔中。在所述第一腔中的所述固体载体的数量可为两个或更多个、10个或更多个、100个或更多个、1,000个或更多个、10,000个或更多个、100,000个或更多个、或108个或更多个。在一些另外的实施方式中，在所述第一腔中的所述固体载体的数量可为约1-108个，例如约10-108个、约100-108个、约1,000-108个、约104-108个、约105-108个、约106-108个、约107-108个、约10-107个、约100-107个、约1,000-107个、约104-107个、约105-107个、或约106-107个。所述固体载体可在所述第一腔的制造期间预先引入到所述第一腔中，以不从所述第一腔的入口或出口穿过。所述固体载体可具有大于1g/cm3的密度(D)，和在一些实施方式中，可为约1g/cm3-约20g/cm3。
所述第一腔的壁和所述固体载体的表面的至少一个可由能够结合到所述靶材料例如细胞、病毒、生物分子、或其组合的结合材料形成，和在一些实施方式中，可与这样的材料结合。结合到所述靶材料的所述材料可特异性地或非特异性地结合到所述靶材料。所述靶材料的特异性结合在广义上与配体和受体之间，例如，抗原和抗体、配体和受体、酶和底物或抑制剂等之间的关系有关。当所述靶材料为非特异性结合细菌细胞、或包括核酸的生物分子时，所述能与所述靶材料结合的材料可为具有70度-约95度的水接触角的材料、或具有选自伯氨基、仲氨基、叔氨基和季氨基的至少一个氨基的材料。所述叔氨基可为排除酰胺基和氰基的多种叔氨基中的任何叔氨基。可利用将氨基硅烷部分固定而引入氨基。所述氨基硅烷部分可通过将氨基硅烷分子沉积在所述固体载体的表面上而获得。所述氨基硅烷分子可为由式(X1)(X2)(X3)Si(Y)表示的有机氨基硅烷分子，其中X1、X2和X3可各自独立地选自氢原子、烷氧基(-OR)和卤素原子，且X1、X2和X3的至少一个可为烷氧基。在所述烷氧基(-OR)中，R可为C1-C20烃基，例如，可为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基等。所述卤素原子可为氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)或砹(At)。Y可为具有至少一个氨基的有机部分，例如，可为氨基烷基或聚乙烯亚胺基团。所述氨基烷基可包括C1-C20烷基。所述聚乙烯亚胺基团可由式-[CH2CH2NH]n-表示，其中n为2-100。所述烷氧基(-OR)可在含水条件中水解，产生羟基，所述羟基的至少一个可参与与在所述固体载体的表面和相邻的硅烷分子的表面上找到的-OH基团的缩合和消除反应。所述氨基硅烷分子可为例如3-氨基丙基三乙氧基硅烷(GAPS)、或聚乙烯亚胺三乙氧基硅烷例如N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷(EDA)和N1-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺(DETA)。可使用已知方法，例如，使用浸涂、旋涂、或化学气相沉积(CVD)将这些氨基硅烷分子涂覆在所述固体载体上。具有所述结合材料的所述固体载体的表面和/或所述第一腔的壁在捕获或吸附所述靶材料例如细胞、病毒、生物分子、或其组合以将其分离方面可为有用的。所述固体载体可在所述第一腔内部，未结合到所述第一腔的壁。
如本文中所使用的，所述水接触角可使用Krüss滴形分析系统(型号DSA10Mk2，Kruss，德国)测量。将1.5μL去离子水的液滴置于所述样品上。将所述液滴通过CCD摄影机每0.2秒监测一次达10秒，并通过使用Drop-ShapeAnalysis(DSA)软件(DSA版本1.7，Kruss)进行分析。通过切线法将所述液滴的整个轮廓拟合成通常的二次曲线方程。在右侧和左侧两者处均确定角度。对于各个液滴计算平均值并对每个样品测量总共五个液滴。将所述五个液滴的角度的平均值作为所述接触角。
在所述微流控器件中，所述第二腔可包括多个操作性地连接到所述压力供应单元的子腔，其中所述弹性膜可设置在所述第一腔和所述第二腔的所述子腔之间，并且可形成所述第一腔和所述第二腔的各子腔的至少部分的壁。
施加到所述第二腔的正压力可使所述弹性膜朝向所述第一腔移动，使得在减小的容积下，所述第一腔中的所述固体载体可保持具有恒定的表面积。即，所述固体载体可具有增大的所述固体载体的表面积与所述第一腔的容积之比(下文中称为“表面积与容积比(SVR)”)。在所述入口和出口的至少一个是开放的时，所述微流控器件可向所述第二腔施加正压力，以增大所述第一腔中的SVR。施加到所述第二腔的所述正压力可确定为导致0.05μm-1或更大的SVR，和在一些实施方式中，导致0.11μm-1或更大、0.12μm-1或更大、0.13μm-1或更大、0.14μm-1或更大、或者0.15μm-1或更大的SVR。在一些另外的实施方式中，施加到所述第二腔的所述正压力可确定为导致约0.05μm-1-约0.15μm-1、约0.11μm-1-0.15μm-1、约0.12μm-1-0.15μm-1、约0.13μm-1-0.15μm-1、约0.14μm-1-0.15μm-1、约0.10μm-1-0.14μm-1、约0.11μm-1-0.14μm-1、约0.12μm-1-0.14μm-1、或约0.13μm-1-0.14μm-1的SVR。施加到所述第二腔的负压力可使所述弹性膜朝向所述第二腔移动，使得在增大的容积下，所述第一腔中的所述固体载体可保持具有恒定的表面积。即，所述固体载体可具有减小的所述固体载体的表面积与所述第一腔的容积之比(SVR)。施加到所述第二腔的正压力、负压力、或其组合可使所述弹性膜振动。取决于所述弹性膜的类型和厚度，可适当地选择所述正压力或负压力的水平。在一些实施方式中，如果所述弹性膜是具有约200μm-约300μm厚度的PDMS膜，所述正压力可为约10kPa-约300kPa，例如，约30-300kPa、约50-300kPa、约70-300kPa、约100-300kPa、约200-300kPa、约10-200kPa、约30-150kPa、或约50-100kPa。
将参考以下实施例进一步详细地描述本发明。这些实施例仅用于说明性目的且并不意图限制本发明的范围。
1.材料和方法
在这些实施例中使用的材料和方法如下，除非另外说明。
(1)细胞和培养物
在以下实施例中使用的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株是具有登录号ATCC BAA-1717(MREJ ii型)、NCTC13395(MREJ v型)和JCSC3624(MREJ xii型)的MRSA。使这些MRSA菌株在50-mL胰胨豆胨培养液(trypticase soy broth，TSB)(Becton，可得自Dickinson and Company)中在37℃下生长整夜(overnight)，用1X PBS溶液(pH7.4)洗涤两次，然后悬浮至约0.2OD(光学密度)的合适浓度，其相当于约108CFU(菌落形成单位)/mL。
(2)微流控器件的制造、实验工具、和珠表面改性
(2.1)微流控器件的制造
将微流控器件制造成在两个玻璃芯片(chip)之间包括通常的弹性膜。将具有各个腔和各个通道的部分或全部的所述第一和第二玻璃芯片结合在一起，其间具有所述弹性膜，从而完成珠填充的微流控器件的制造。
在当前实施例中，通过用普通的光刻、蚀刻和湿式蚀刻过程在玻璃晶片中限定通道和腔而制造所述第一和第二玻璃芯片。在用piranha溶液清洁后，通过低压化学气相沉积(LPCVD)对6英寸玻璃晶片(硼硅酸盐，700μm厚)沉积500nm厚的多晶硅层。然后，进行图案化过程以使通过光刻胶膜曝光(expose)的所述沉积的多晶硅层的一部分暴露。通过干式刻蚀除去所述多晶硅层的所述经暴露的部分。之后，剥掉所述光刻胶膜，并用氢氟酸溶液(HF49(重量/重量)%)对所述经暴露的玻璃晶片进行湿式蚀刻以形成具有约100μm的深度和约100μm的宽度的通道。在用于形成所述通道的所述刻蚀过程中，形成约20μm的堰(weir)(突出部分)以约束珠。所述堰形成为起到阀座和珠捕集堰两者的作用。
然后，在除去所述多晶硅层后，涂覆干膜抗蚀剂(DFR)并将其图案化。然后，使用喷砂方法形成包括珠的腔(约15.5μl)和用于流体流入或流出的孔。随后，将所述玻璃晶片切成芯片形状的片，所述片然后使用等离子体进行清洗。将包括以上制造的容纳珠的腔的流体芯片(“第一玻璃芯片”)和包括起到气动泵作用的不包含珠的腔的气动芯片(“第二玻璃芯片”)永久性地结合，其中在所述第一和第二玻璃芯片之间的用等离子体活化的约250μm厚PDMS膜(可得自Rogers)作为中间层。作为整块柔性膜的所述PDMS膜用来控制流体流动并用作泵和阀以及用于通过气动振动引起珠之间的碰撞的致动器。
除非另外规定，否则将约15-16mg(数量为约2×105个)经表面改性的玻璃珠放入所述珠腔中，然后使用适合于PCR的(与PCR相容的，PCR-compatible)胶带(可得自Applied biosystems)封闭所述珠腔。使用聚碳酸酯板覆盖所附的胶带以防止所述胶带在操作例如脱氧核糖核酸(DNA)提取期间弯曲。所述经表面改性的玻璃珠可直接放入所述珠腔中。
所述PDMS膜的操作通过对所述气动腔施加正压力或负压力控制，所述气动腔具有连接到其的电磁阀(Solenoid valve)阵列(S070-5DC，可得自SMC)。所述阀连接到电动-气动调节器(electro-pneumatic-regulator)(ITV0030-3BL，可得自SMC)和LabVIEW软件(可得自National Instruments)。在各步骤中通过所述LabVIEW软件的界面使与流体转移(迁移，transfer)有关的阀的操作可见以监测核酸的提取。
图7和8说明在处理样品中的靶材料的方法中使用的根据本公开内容的实施方式的微流控器件。图7是其中通过PDMS膜的振动引起珠的碰撞的珠填充的微流控器件的横截面图。参考图7，具有突出部分40的入口30和具有突出部分42的出口32经由流体通道48和50分别连接到入口端口和出口端口。阀座44和46分别在限定入口30和出口32的上部板中形成。在下部板中形成气动腔24A和24D以分别与所述阀座44和46对应。珠填充的第一腔具有约15.5μL的容积和约6mm×约4mm×约0.75mm(最大长度×最小长度×深度)的尺寸。两个位移(行程，displacement)气动腔各自具有约3μL的总容积、和约6mm×约4mm×约0.2mm(最大长度×最小长度×深度)的尺寸。
图8是包括整块玻璃、PDMS和玻璃的3层微流控器件以及所述微流控器件的流体和气动部件的放大图。
(2.1)玻璃珠改性
在用piranha溶液洗涤和然后用去离子水洗涤之后，将具有约30μm-50μm直径的玻璃珠(可得自Polysciences,Inc..)过滤和真空干燥。
之后，制备在乙醇中的5%(v/v)三甲氧基甲硅烷基丙基改性的聚乙烯亚胺溶液(可得自Gelest,Inc.)作为珠表面改性溶液。将所述珠放入所述珠表面改性溶液中并在温和的混合下反应约2小时，然后过滤并用新鲜乙醇洗涤三次。将最后收取的玻璃珠在110℃烘箱中加热40分钟，以获得具有覆盖有聚乙烯亚胺(PEIM)的表面的玻璃珠。已知PEIM能够非特异性地结合到细胞，和因此覆盖有所述PEIM的玻璃珠可用来非特异性地分离细胞。
(3)使用拭子的细胞释放效率的测量
使用两种市售的拭子，即，植绒拭子(flocked swab)(Cat.No.553C，Copan)和纤维拭子(Cat.No.220099，BBLTM CultureSwabTM，BD)来测定细胞释放效率。
将已知浓度的MRSA悬浮液(1xPBS缓冲液，pH7.4)连续地稀释至约103CFU/mL的浓度。将来自其的100μl部分加入到在1.5mL微量离心管中的约900μl的PBS缓冲液中。将该溶液涂(smear)在Petrifilm(3M，USA)上作为初始MRSA细胞数。将拭子放入1mL MRSA悬浮液(约103CFU/ml，被吸收的液体的体积为约100μl)中，随后在1mL新鲜PBS缓冲液中涡旋约1分钟。将该包含释放的MRSA的溶液涂在Petrifilm上作为收取的MRSA细胞数。在三个不同的制造批次(manufacturing lots)中对于各拭子进行这些过程三次。将所得产物在约37℃温育约24小时，随后进行菌落计数。通过将所收取的细菌菌落总数除以初始细菌菌落数计算细胞释放效率。通过计算在使所述溶液通过所述珠填充的微流控器件之前和之后的菌落确定细胞捕获效率。
(4)从鼻拭子中的MRSA的DNA提取效率
在汇合(pool)阴性鼻拭子后，添加(spike)MRSA以制备MRSA阳性样品用于分析测试。使用干燥植绒拭子从健康志愿者的前鼻收集试样。将收集的拭子汇合在磷酸钠缓冲液(PBS)(50mM，pH3.0，Sigam-Aldrich)中，随后涡旋1分钟以模拟MRSA释放(阴性对照基质(matrix)；阴性鼻基质)。调节所述阴性对照基质的体积以每1mL包含1个拭子。使用已知浓度的MRSA悬浮液润湿其它的干燥拭子以获得模拟的阳性MRSA拭子。使拭子杆破碎，然后进行涡旋以将所吸附的MRSA释放到1mL所述阴性鼻基质中。
使所得MRSA阳性鼻拭子通过具有约3μm孔尺寸的IsoporeTM膜过滤器(可得自Millipore)。将1mL所述经过滤的MRSA阳性鼻拭子、用于洗涤的0.5mL Tris-EDTA缓冲液(10mM，pH8，Ambion)和用于细胞裂解的10μLNaOH溶液(0.02N，Sigma-Aldrich)预先分配到所述微流控器件的液体贮存器中。
通过进行压力驱动操作使所述液体溶液转移。通过预先试验确定操作液体压力。在通过向所述第二腔施加约150kPa的正压力使得所述PDMS膜朝所述第一腔加压的同时，使所述鼻拭子溶液在约50kPa下以约200μl/分钟的流速通过所述珠填充的第一腔。在初始样品装载之后，在使所述PDMS膜朝向所述第一腔延伸的同时，使洗涤溶液(Tris-EDTA缓冲液(10mM，pH8，Ambion))在约80kPa下以约500μL/分钟的流速流动以洗涤所述第一腔，和然后使氮气在约100kPa下流动以干燥约30秒。
为了裂解所捕获的细胞，在使所述PDMS膜(在约-150kPa)朝向所述第二腔移动的同时，注入6μLNaOH溶液，并关闭所述珠填充的第一腔的入口和出口附近的阀。
然后，将两个气动位移腔即所述第一腔和第二腔控制成具有不对称变化的压力，即，使得对于一个循环的前一半，向所述腔的一个施加约80kPa的正压力且向另一腔施加约-80kPa的负压力，和对于所述循环的后一半，使这些压力变得相反。使所述PDMS膜以约10Hz的频率振动约5分钟以引起细胞裂解。
在使所述PDMS膜在约150kPa的压力下朝向所述第一腔移动的同时，通过在约100kPa的液体压力下注入4μLNaOH溶液而洗脱包括DNA的裂解细胞产物。
在从引入所述液体样品到DNA洗脱的整个过程中所耗费的时间小于约20分钟。未进行另外的DNA纯化。为了测量所述微流控器件的分析灵敏度，对三种类型的具有至少七个复制物的MRSA菌株对每个浓度(10、20、100和200CFU/拭子)进行实验。根据使用PCR仪器确定的阳性应答(positive call)的数目(即，40的Ct截断值)，使用probit回归模型(MINITABTMRelease14.20)利用统计分析评价在95%置信区间的分析灵敏度。
图9是覆盖了从样品引入操作到DNA释放操作的整个过程的根据本公开内容的实施方式的处理样品中的靶材料的方法的示意图。在图9中，(a)说明引入包括细胞的样品以使所述细胞结合到珠，即，细胞捕获操作。可将所捕获的细胞洗涤和/或干燥(b)。接着，可将细胞裂解液引入到经洗涤的和/或经干燥的第一腔(c)中。(d)说明通过所述PDMS膜的非对称振动将引入的细胞裂解液和珠混合以使所述细胞裂解。(e)说明将DNA从包含所述裂解细胞产物的所述第一腔释放。在一些实施方式中，可省略所述洗涤、干燥和细胞裂解液引入操作中的至少一个。例如，在不进行所述洗涤、干燥和细胞裂解液引入操作的情况下，可通过所述PDMS膜的振动使结合到所述珠的细胞裂解。在一些另外的实施方式中，可省略所述洗涤、干燥或细胞裂解液引入操作。在图9中，为了简化而省略了图9的微流控器件的部分结构。
为了与实验组的Ct值进行比较，制备具有Ct值的阳性对照组。将在PBS缓冲液中的MRSA悬浮液以约13,200rpm离心约20分钟，并从其中除去上清液。使用桌上型珠磨仪器(table-top bead-beating instrument)(GENIE2，可得自Fisher Scientific)处理剩余的细胞团(cell pellet)。将30mg裸玻璃珠和约10μL细胞裂解液(0.02N，NaOH)加入到所述细胞团中，随后以全速进行剧烈涡旋约5分钟。在简单离心后，收取释放的DNA的溶液。为了精确比较，在两种方法中，将注入细胞的数量和洗出液体积控制为是相同的。
(5)通过实时PCR的DNA扩增
为了评价分析性能(analytical behavior)，使用LightCyclerTM480实时PCR系统(可得自Roche)进行实时聚合酶链式反应(PCR)试验。
为了鉴定MRSA，特异性地扩增了葡萄球菌染色体盒(SCCmec)的称作SCCmec Right Extremity Junction(MREJ)的靠近整合位点的连接区和orfX区的序列(sequences of junction regions of a staphylococcal chromosomal cassette(SCCmec)adjacent to an integration site called SCCmec Right ExtremityJunction(MREJ)and an orfX region were specifically amplified)。所使用的通过使用Primer3软件(Whitehead Institute/MT Centerfor Genome Research)设计的特异性引物组(primer set)如下：MREJ ii型(正向：SEQ ID No.1，和反向；SEQ ID No.2)，v型(正向；SEQ ID No.3，和反向；SEQ ID No.4)，和xii型(正向；SEQ ID No.5，和反向；SEQ ID No.6)。
制备PCR反应混合物以具有如下组成：0.4μM TaqMan探针(FAM-5'-agaGca Ttt Aag Att Atg cg(SEQ ID No.7)-3'-BHQ1，其中大写字母表示LNA碱基，Sigma)、1μM的各引物(Sigma)、1×LightCyclerTM480Probes master mix(Roche)和4μl提取DNA溶液。在预变性约10分钟后，如下进行热循环：在95℃下变性20分钟和在60℃下伸长40秒。
MREJ ii、v和xii型的PCR扩增产物分别为约91bp、96bp和89bp，其可通过电泳(Agilent2100Bioanalyzer，可得自Agilent Technologies)证实。
(6)PDMS膜偏移的模拟
为了研究PDMS膜的偏移对珠填充的影响，使用在图10(a)中说明的微流控器件的简单轴对称模型。图10说明对称微流控器件的左边部分。
在PDMS膜(26)的上边界施加均匀的气动压力负载(34)。将所述PDMS膜(26)的厚度固定为约250μm，而腔深度(22)从约10μm变化到约100μm。下部板(21)为玻璃。
该模型是使用CFD-ACE+(2009版，ESI Group，France)中的Stress andGrid Deformation模块以约10kPa的气动增量(increment)从0kPa到300kPa产生的。参考图10中的(b)，发现所述增量在初始条件(0-10kPa)中和在所述PDMS膜和玻璃之间的接触范围附近降低至约2kPa。当产生具有负的体积的元件(element)时，所述气动增量终结。使用标准的第一元件，节点(node)和元件的总数分别为3815和3649。参考图10中的(b)，10μm、30μm、50μm、75μm和100μm分别指的是腔深度。
用在所述模拟试验中的材料的特性如下：
PDMS：密度=970kg/m3，杨氏弹性模量=750kPa，
泊松比=0.5，
玻璃：密度=2520kg/m3，
杨氏弹性模量=80GPa，
泊松比=0.3。
实施例1：珠填充率和细胞捕获效率
在本实施例中，研究了PDMS膜的偏移对珠填充率的影响。
图10说明在研究所述PDMS膜的偏移对珠填充率的影响时使用的实验模型(a)，以及所述研究的结果(b)。该实验如在(6)中所描述的那样实施。在图10的(b)中，空置率(vacancy ratio)定义为未通过所述PDMS膜发生位移的腔的空隙体积除以所述腔的初始体积。参考图10中的(b)，当所述PDMS膜偏移而不接触所述玻璃时，空置率显著地降低。在所述PDMS膜和所述玻璃的接触之后，由于在所述PDMS膜的边缘部分处的逐渐偏移和在其中心部分处的局部压缩，空置率逐渐降低。当压力增大至高于100kPa时，空置率大部分小于10%。这些结果表明，由于所述PDMS膜的气动偏移，玻璃珠的大部分随意地紧密填充。
珠填充的程度可受膜条件和珠量的影响。因此，在本实施例中，测量和研究了膜条件和珠量对细胞捕获的影响。结果表明珠填充率对细胞捕获的影响。
表1是得自对膜条件和珠量对SVR(μm-1)和细胞捕获的影响的测量的结果的表。
[表1]
Figure BDA00002701394900291
表1中的结果是使用在磷酸钠(50mM，pH4.0)中的1mL MRSA(ATCCBAA-1717，106CFU/ml)获得的，其中对于各条件的测量进行三次。
参考表1，随着珠量从约16mg降低到约10mg(降低约38%)，总的珠表面积与珠量的减少成比例地降低。然而，当向上(即，朝向第一腔)加压时，SVR是不受珠量约束的恒量，即，约0.15μm-1。SVR是在如下假设下计算的：所述珠具有约40μm的均匀直径和约50%的紧密填充率。发现与所述PDMS膜处于静止状态时相比，当所述PDMS膜被向上加压时，细胞捕获效率和标准偏差更好。所述压力可为150kPa。
这些结果表明，珠紧密填充的气动引发有效地增大SVR，促进液体溶液和珠表面之间的相互作用，使得可改善靶材料的分析性能。在固相提取中，SVR是比表面积更重要的(更有意义的)变量。发现与珠量为约16mg且SVR为约0.11μm-1时相比，当珠量为约10mg且SVR为约0.15μm-1时，细胞捕获效率更高。
珠填充率的调节可通过控制在本公开内容的方法中使用的弹性膜的柔韧性(flexibility)、或通过控制珠量而实现。
实施例2：PDMS膜振动对DNA的小体积释放的影响
根据常规方法，如在色谱法分离中那样在固定相上进行固相DNA分离，和因此，从依赖于时间的洗脱液级分收取目标DNA。由于分离柱是固定的，在液体和固体载体之间的传质仅仅依赖于扩散。因此，难以释放小的洗出液体积(≤10μL)的在固相表面上的DNA以便以增大的浓度适当地用在后续检测过程例如PCR中。使用小的洗出液体积来增大每体积的目标复制物(copy)的数量以实现高的检测灵敏度。
因此，在本实施例中，研究了PDMS膜的振动对DNA的小体积释放的影响。特别地，为了捕获细胞，将1mL不同浓度的两种MRSA悬浮液(ATCCBAA-1717，103CFU/ml和105CFU/ml)各自引入到微流控器件的珠填充腔中。以与(4)中所描述的相同的方法进行细胞捕获过程(珠量16mg)。在该过程期间，通过在不丧失珠填充柱的固有特性的同时使PDMS膜振动而剧烈地搅动所述珠填充柱，即，由此甚至能够引起细胞壁的瓦解(图9中的(d))。为了促进用于使结合到珠表面的细胞裂解的6μLNaOH溶液的引入，将所述PDMS膜向下加压以使珠腔的空隙体积增大约3μL(图9中的(c))，随后进行所述PDMS膜的非对称振动以引起细胞壁的瓦解和将DNA从所述细胞或珠表面释放。
为了确定从捕获的细胞的DNA收取率，在收取首先用在所述PDMS膜的振动中的6μL液体级分后，使另外的各自为6μL的液体级分进一步连续地通过所述第一腔。使用实时PCR扩增评估在所述级分各自中的DNA量。
图11是相对于洗出液级分的DNA量(Ct)的图。参考图11，发现头两个级分具有比其它级分小约3Ct的Ct值。如果PCR效率为100%，在初始DNA模板复制物的数量方面的10倍差异可导致在Ct值方面的3.3的差异。因此，图11的结果表明，使用12μL洗脱液溶液，大部分的DNA(约90%)被从所述珠填充腔释放出来。因此，100倍的体积减少(即，由在最初阶段中使用的1mL鼻拭子样品获得的10μLDNA洗出液溶液)可导致DNA量的相当大的增加，这对于检测灵敏度可具有正面影响。参考图11，在样品(103CFU/ml)的第四级分中未检测到DNA。使用24μLNaOH溶液，通过离心和后续的桌上型珠磨瓦解获得了阳性对照(PTC)组。使用1μLDNA溶液作为PCR中的模板。对于每个条件进行三次实验。
实施例3：鼻拭子中的MRSA检测
在本实施例中，使用鼻拭子中的MRSA进行总DNA提取。所有的过程涉及涂拭(swabbing)、从拭子释放细胞、预过滤、和将样品装载到微流控器件的珠填充腔以用于DNA提取。作为初步实验的结果，发现与纤维型拭子相比，植绒型拭子具有更好的细胞释放效率和更少的产物之间的不同。由于该原因，在本实施例中使用植绒型拭子。
特别地，将添加MRSA的鼻拭子预过滤以防止所述微流控器件被大的杂质堵塞。测量通过所述预过滤导致的MRSA的损失为小于约10%(其通过菌落计数证实)。以不同浓度(104、103和102CFU/拭子)对MRSA成功地进行了从涂拭到实时PCR的所有过程。
图12是相对于MRSA的初始浓度的核酸分离结果的图。即，图12显示了相对于初始细胞计数(CFU/拭子)的拭子中的MRSA(NCTC13395)的检测结果。以与在上面的“材料和方法”部分中所描述的相同的方式进行DNA分离。使用总计10μLNaOH溶液来洗脱DNA，和使用4μL洗出液与阳性对照(PTC)组一起作为PCR中的模板。
在未添加MRSA的(non-MRSA-spiked)阴性鼻基质中未发现扩增产物。PTC组是由在PBS中的MRSA悬浮液在未从拭子释放和预过滤MRSA的情况下制备的。特别地，在所述MRSA悬浮液的离心后，使用10μL NaOH溶液进行桌上型珠磨瓦解以获得PTC组。当如在实验组中那样由鼻拭子制备PTC组时，PCR扩增被由使用小体积溶液(10μL)的离心和随手的细胞瓦解所导致的浓缩的杂质显著地抑制。
该结果表明，PCR抑制剂可通过在根据本公开内容的一个或多个实施方式的方法中使用的微流控器件中的细胞捕获和洗涤操作而除去，使得鼻拭子中的MRSA的检测可为成功的。
在本实施例中，使用不同浓度(10、20、100和200CFU/拭子)的三种类型的MRSA菌株(MREJ ii、v和xii型)，评估了分析灵敏度(即，检测极限)，其定义为与具有再现性的阴性对照组可区分开的拭子的最小CFU。
表2比较性地显示了所评估的在本公开内容的方法和其它方法之间的关于三种类型MRSA菌株的分析灵敏度。
表2
Figure BDA00002701394900321
在表2中，将拭子(阳性拭子)中的MRSA释放到缓冲溶液(磷酸钠，50mM)a或阴性鼻基体b中。
参考表2，关于所测试的三种类型的菌株的分析灵敏度在95%的置信区间下被评估为约47-61CFU/拭子。与其它商业上可得到的MRSA检测方法相比，使用上述微流控器件的根据本公开内容的一个或多个实施方式的方法导致了类似或更好的结果。这些性能通过在所述方法之间的分析物稀释率(ADR)的比较证实。
ADR表示残留在最终PCR产物中的分析物的量，即，每个应用反应的拭子的理论量。例如，在根据本公开内容的一个或多个实施方式的方法中，使用10μL洗脱液溶液处理1mL的1拭子，和在PCR中使用4μL的洗出液，使得获得0.4拭子/PCR的ADR，这可通过向所述微流控器件中引入弹性或柔性膜有效地实现。
ADR可用作生物测定中的理论分析物富集率的描述性指数。取决于所应用的分析方法(即，DNA提取和扩增)，可获得不同的分析结果。然而，在基本ADR方面的10倍至100倍(1-2个数量级)的差异可显著地影响分析灵敏度。该差异由如下的事实导致：要求使用传统的实验工具如离心机、桌上型珠磨机、移液管、加热组合单元(heat block)和管等的多个手动步骤的其它DNA制备方法使目标分析物稀释。充分利用微器件的内在微尺度尺寸连同其固相动力学性质得到这样的高ADR值。
应理解，本文中所描述的示例性实施方式应仅在描述性的意义上考虑，且不用于限制的目的。在各实施方式中的特征或方面的描述应典型地被认为可用于其它实施方式中的其它类似特征或方面。
序列表
参考所附的序列表描述本说明书。通过引用将所附的序列表全部并入本文中。
Figure IDA00002701395600011
Figure IDA00002701395600021

Claims (22)

1.处理样品中的靶材料的方法，所述方法包括将所述样品引入到微流控器件的第一腔中，其中所述第一腔包含包括能与所述靶材料结合的材料的固体载体，以将所述靶材料结合到所述固体载体，其中所述微流控器件包括具有入口和出口的所述第一腔、与压力供应单元操作性地连接的第二腔、以及设置在所述第一腔和所述第二腔之间并形成所述第一和第二腔的至少部分的壁的弹性膜，其中所述样品引入和后续操作中的至少一个在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时、或者在通过向所述第二腔施加负压力使所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的同时进行。
2.权利要求1的方法，其中所述后续操作包括洗涤、干燥和洗脱所述靶材料，且所述样品引入、所述洗涤、干燥和洗脱所述靶材料中的至少一个在由于向所述第二腔施加正压力而导致所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时进行。
3.权利要求1的方法，其中所述样品引入和所述后续操作中的至少一个通过使所述样品从所述腔的入口流动通过所述出口而实施。
4.权利要求3的方法，其中所述样品的流速为10μl/分钟-500μl/分钟。
5.权利要求1的方法，其中，当未向所述第二腔施加正压力或负压力时，所述第一腔具有1μl-100μl的容积。
6.权利要求1的方法，其中所述正压力被确定为导致0.05μm-1或更大的表面积与容积比(SVR)，所述SVR表示所述固体载体的表面积与所述第一腔的容积之比。
7.权利要求1的方法，其中所述靶材料是细胞，其中所述方法进一步包括：在引入所述样品后，在由于向所述第二腔施加负压力而导致所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的同时，将细胞裂解液引入到所述第一腔中，由此使结合到所述固体载体的所述靶材料裂解以产生核酸，所述核酸然后结合到所述固体载体。
8.权利要求7的方法，其中所述方法进一步包括在引入所述细胞裂解液后，使所述弹性膜振动，以促进细胞裂解。
9.权利要求8的方法，其中，在所述微流控器件中，所述第二腔包括多个连接到所述压力供应单元的子腔，其中所述弹性膜设置在所述第一腔和所述第二腔的所述子腔之间，并且形成所述第一腔和所述第二腔的各子腔的至少部分的壁。
10.权利要求7的方法，其中所述方法进一步包括，在所述裂解操作之前，在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的情况下，将洗涤溶液引入到所述第一腔中，从而除去未结合到所述固体载体的材料。
11.权利要求10的方法，其中所述方法进一步包括，在引入所述洗涤溶液后，在通过对所述第二腔加压使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时，使气体从所述第一腔的入口流动通过所述出口，从而干燥所述固体载体。
12.权利要求7的方法，其中所述能与所述靶材料结合的材料是具有70度-95度的水接触角的材料，或具有选自伯氨基、仲氨基、叔氨基和季氨基的至少一个氨基的材料。
13.权利要求7的方法，其中所述负压力被确定为导致小于0.05μm-1的表面积与容积比(SVR)，所述SVR表示所述固体载体的表面积与所述第一腔的容积之比。
14.权利要求12的方法，其中所述方法进一步包括在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时，将洗脱液引入到所述第一腔中，从而将核酸从包含所述固体载体的所述第一腔释放。
15.处理样品中的靶材料的方法，所述方法包括将所述样品引入到微流控器件的第一腔中，其中所述第一腔包含包括能与所述靶材料结合的材料的固体载体，以将所述靶材料结合到所述固体载体，其中所述微流控器件包括具有入口和出口的所述第一腔、与压力供应单元操作性地连接的第二腔、以及设置在所述第一腔和所述第二腔之间并且形成所述第一和第二腔的至少部分的壁的弹性膜，
其中所述样品引入和后续操作中的至少一个在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时进行，所述靶材料是细胞，和所述能与所述靶材料结合的材料是具有70度-95度的水接触角的材料、或具有选自伯氨基、仲氨基、叔氨基和季氨基的至少一个氨基的材料，且所述样品引入在3.0-6.0的pH和10mM-500mM的盐浓度下进行，其中所述方法进一步包括：
在由于向所述第二腔施加负压力而导致所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的同时，将细胞裂解液引入到所述第一腔中，从而使结合到所述固体载体的所述靶材料裂解以产生核酸，所述核酸然后结合到所述固体载体；
在所述裂解操作之后，在由于向所述第二腔施加正压力而导致所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时，将洗涤溶液引入到所述第一腔中，从而除去未结合到所述固体载体的材料；和
将洗脱液引入到所述第一腔中以将核酸从包含所述固体载体的所述第一腔释放。
16.处理样品中的靶材料的方法，所述方法包括：将所述样品引入到微流控器件的第一腔中，其中所述第一腔包含包括能与所述靶材料结合的材料的固体载体，以将所述靶材料结合到所述固体载体，其中所述微流控器件包括具有入口和出口的所述第一腔、与压力供应单元操作性地连接的第二腔、以及设置在所述第一腔和所述第二腔之间并形成所述第一和第二腔的至少部分的壁的弹性膜，其中所述靶材料是核酸，和所述样品引入在由于向所述第二腔施加正压力而导致所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时进行；
在通过向所述第二腔施加正压力使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的同时，将洗涤溶液引入到所述第一腔中，从而除去未结合到所述固体载体的材料；和
将洗脱液引入到所述第一腔中以将核酸从所述固体载体释放。
17.微流控器件，其包括：
具有入口和出口的第一腔；
与压力供应单元操作性地连接的第二腔；和
设置在所述第一腔和所述第二腔之间并且形成所述第一和第二腔的至少部分的壁的弹性膜，
其中所述第一腔包含固体载体，所述固体载体包括能够结合到靶材料的材料。
18.权利要求17的微流控器件，其中所述微流控器件进一步包括操作性地连接到所述第二腔的压力控制器，
其中所述压力控制器包括存储介质，所述存储介质存储在引入样品和后续操作的至少一个中，用于控制向所述第二腔施加正压力以使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸、或者向所述第二腔施加负压力以使所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的信号。
19.权利要求18的微流控器件，其中，当所述样品包括细胞时，所述存储介质存储在样品引入操作和洗涤溶液引入操作中用于使得能够向所述第二腔施加正压力以使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的信号、和在细胞裂解操作中用于使得能够向所述第二腔施加负压力以使所述弹性膜朝向所述第二腔延伸的信号。
20.权利要求18的微流控器件，其中，当所述样品包括核酸、蛋白质或糖作为所述靶材料时，所述存储介质存储在样品引入操作、洗涤溶液引入操作和靶材料洗脱操作中用于使得能够向所述第二腔施加正压力以使所述弹性膜朝向所述第一腔延伸的信号。
21.权利要求18的微流控器件，其中所述样品包括核酸、蛋白质、糖或其组合作为所述靶材料。
22.权利要求1的方法，其中所述样品包括核酸、蛋白质、糖或其组合作为所述靶材料。
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C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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