GR1009425B - Μικρο-νανοδομημενη με πλασμα πολυμερικη μικρορευστονικη διαταξη για καθαρισμο νουκλεϊκων οξεων - Google Patents
Μικρο-νανοδομημενη με πλασμα πολυμερικη μικρορευστονικη διαταξη για καθαρισμο νουκλεϊκων οξεων Download PDFInfo
- Publication number
- GR1009425B GR1009425B GR20150100398A GR20150100398A GR1009425B GR 1009425 B GR1009425 B GR 1009425B GR 20150100398 A GR20150100398 A GR 20150100398A GR 20150100398 A GR20150100398 A GR 20150100398A GR 1009425 B GR1009425 B GR 1009425B
- Authority
- GR
- Greece
- Prior art keywords
- dna
- microelastic
- mosaic
- micro
- plasma
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title abstract description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title abstract description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title abstract description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 64
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 30
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 18
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 15
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 15
- -1 or olefinic Chemical group 0.000 claims description 14
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 14
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 13
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 claims description 13
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 6
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 229920000089 Cyclic olefin copolymer Polymers 0.000 claims description 5
- 238000002032 lab-on-a-chip Methods 0.000 claims description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 5
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 4
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 claims description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 4
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 4
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 claims description 4
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 claims description 4
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 3
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims description 3
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims description 3
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052593 corundum Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 claims description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims description 2
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910001845 yogo sapphire Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 8
- 238000005530 etching Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 110
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 110
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 12
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 11
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 9
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 7
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 238000001020 plasma etching Methods 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 229920005573 silicon-containing polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000001459 lithography Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 3
- 238000004260 weight control Methods 0.000 description 3
- HXMVNCMPQGPRLN-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyputrescine Chemical compound NCCC(O)CN HXMVNCMPQGPRLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 230000005686 electrostatic field Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 2
- 238000003475 lamination Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009832 plasma treatment Methods 0.000 description 2
- 229920000098 polyolefin Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007788 roughening Methods 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- LFQCEHFDDXELDD-UHFFFAOYSA-N tetramethyl orthosilicate Chemical compound CO[Si](OC)(OC)OC LFQCEHFDDXELDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 2
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 208000003443 Unconsciousness Diseases 0.000 description 1
- 229920006397 acrylic thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 239000007772 electrode material Substances 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000003891 environmental analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004186 food analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 238000009616 inductively coupled plasma Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000001746 injection moulding Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000003754 machining Methods 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000012543 microbiological analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 238000004377 microelectronic Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- NHBRUUFBSBSTHM-UHFFFAOYSA-N n'-[2-(3-trimethoxysilylpropylamino)ethyl]ethane-1,2-diamine Chemical compound CO[Si](OC)(OC)CCCNCCNCCN NHBRUUFBSBSTHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002102 nanobead Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 150000001282 organosilanes Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000002186 photoactivation Effects 0.000 description 1
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000011833 salt mixture Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002470 solid-phase micro-extraction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N tert-butyl prop-2-enoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)C=C ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
- B01F33/00—Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
- B01F25/00—Flow mixers; Mixers for falling materials, e.g. solid particles
- B01F25/40—Static mixers
- B01F25/42—Static mixers in which the mixing is affected by moving the components jointly in changing directions, e.g. in tubes provided with baffles or obstructions
- B01F25/43—Mixing tubes, e.g. wherein the material is moved in a radial or partly reversed direction
- B01F25/433—Mixing tubes wherein the shape of the tube influences the mixing, e.g. mixing tubes with varying cross-section or provided with inwardly extending profiles
- B01F25/4331—Mixers with bended, curved, coiled, wounded mixing tubes or comprising elements for bending the flow
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
- B01F33/00—Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
- B01F33/30—Micromixers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
- B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
- B29C59/00—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor
- B29C59/14—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor by plasma treatment
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
- B01F2215/00—Auxiliary or complementary information in relation with mixing
- B01F2215/04—Technical information in relation with mixing
- B01F2215/0413—Numerical information
- B01F2215/0418—Geometrical information
- B01F2215/0431—Numerical size values, e.g. diameter of a hole or conduit, area, volume, length, width, or ratios thereof
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/06—Fluid handling related problems
- B01L2200/0631—Purification arrangements, e.g. solid phase extraction [SPE]
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/06—Fluid handling related problems
- B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
- B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
- B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
- B01L2300/0819—Microarrays; Biochips
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
- B01L2300/0883—Serpentine channels
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0896—Nanoscaled
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/16—Surface properties and coatings
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Fluid Mechanics (AREA)
- Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
- Treatments Of Macromolecular Shaped Articles (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Προετοιμασία και χρήση πολυμερικών μικρορευστονικών διατάξεων για καθαρισμό νουκλεϊνικών οξέων. Η μικρορευστονική διάταξη αποτελείται από μια τυχαία εκτραχυσμένη πολυμερική επιφάνεια κατασκευασμένη με εγχάραξη αέριου πλάσματος. Το σχέδιο της μικρορευστονικής διάταξης περικλείει την ανάμιξη των δειγμάτων μέσα στο μικρορευστονικό, που μαζί με την τραχύτητα καθιστούν την μικρορευστονική διάταξη κατάλληλη για συστήματα Μικροεργαστηρίου Ψηφίδας (LOC) για εξαγωγή και καθαρισμό νουκλεϊνικών οξέων στην ψηφίδα.
Description
Μικρο-νανοδομημένη με πλάσμα πολυμερική μικρορευστονική διάταξη για καθαρισμό νουκλεΐκών οξέων
Πεδίο της εφεύρεσης
Η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται με το πεδίο του καθαρισμού δεσοξυριβονουκλεϊνικού οξέος (DNA) σε φορητά και μιας χρήσης, σμικρυμένα πολυμερικά μικροεργαστήρια ψηφίδας (LOC).
Υπόβαθρο της εφεύρεσης
Ο καθαρισμός DNA είναι μια θεμελιώδης διαδικασία που παραδοσιακά γίνεται στο εργαστήριο πριν από άλλες διαδικασίες και είναι μεγάλης σημασίας για την βιομηχανία τροφίμων, την ιατρική, τη σήμανση ή και όπου η συλλογή DNA χωρίς προσμίξεις, μετά την λύση των κυττάρων και πριν την ανάλυση DNA, κρίνεται ως απαραίτητο βήμα. Οι συμβατικές εργαστηριακές τεχνικές (J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition), 2001, 1-2100) περιλαμβάνουν συνήθως χρήση οργανικών διαλυτών, όπως π.χ. απομόνωση με φαινόλη/χλωροφόρμιο, καθαρισμός με σφαιρίδια όπως σωματίδια διοξειδίου του πυριτίου ή μαγνητικά σωματίδια [US publication number US5705628(A) or US5898071(A), PCT publication number: W01996009379(A1)] ή καθαρισμός με στήλες φυγοκέντρησης [US publication number US20080300397 (Al), PCT publication number: W02008150826(A1)], ανάλογα με την προέλευση του δείγματος, τον τύπο του DNA και τον σκοπό του καθαρισμού.
Με την έλευση της μικρο-νανοτεχνολογίας, οι αναλυτικές διεργασίες εργαστηρίου σμικρύνονται σε μικροψηφίδες εξαιτίας πολλών πλεονεκτημάτων, όπως μειωμένος πειραματικός χρόνος, μικρότεροι όγκοι δειγμάτων και αντιδραστηρίων, χαμηλή επικινδυνότητα μόλυνσης, αυτοματισμός, χαμηλό κόστος και συμβατότητα με τις περαιτέρω διεργασίες. Όταν το DNA δεν είναι επαρκώς καθαρισμένο από κύτταρα ή σύνθετα δείγματα, οι κατάντη διεργασίες π.χ. η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) μπορεί να ανασταλούν δραστικά (I. G. Wilson, Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63, 3741-3751) και η ευαισθησία της ανάλυσης DNA μειώνεται. Για όλους τους παραπάνω λόγους, μια μικρορευστονική ψηφίδα καθαρισμού DNA κρίνεται υψηλής σπουδαιότητας.
Αρκετά πρόσφατα άρθρα επισκοπήσεων (S. J. Reinholt, et al., Angewandte Chemie International Edition, 2014, 53, 13988-14001, J. Wen, et al., Analytical Chemistry, 2008, 80, 6472-6479, C. W. Price, et al., Lab on a Chip, 2009, 9, 2484-2494) έχουν ταξινομήσει και κατηγοριοποιήσει τις τεχνικές καθαρισμού DNA σε μικρορευστονικές ψηφίδες. Πιο συγκεκριμένα, οι Reinholt et al. κατηγοριοποιούν τις τεχνικές καθαρισμού DNA σε ψηφίδα ως εξής: 1) τεχνικές βασισμένες στην πυρίτια που περιλαμβάνουν συσκευασμένα σφαιρίδια πυριτίας, πλέγματα περιέχοντα σφαιρίδια πυριτίας, μικροδομές πυριτίας ή μεβράνες/μονόλιθους πυριτίας (C. J. Easley, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006, 103, 19272-19277, M. D. Kulinski, et al., Biomedical Microdevices, 2009, 11, 671-678, M. C. Breadmore, et al., Analytical Chemistry, 2003, 75, 1880-1886), 2) τεχνικές παραμαγνητικών σφαιριδίων που περιλαμβάνουν επίστρωση πυριτίας, εναλλασσόμενα φορτία, επίστρωση με ολιγοδεοξυθυμιδίνη (oligo-dT) ή επίστρωση με ειδική αλληλουχία νουκλεϊνικών οξέων (Β. Rittich, et al., Journal of Separation Science, 2013, 36, 2472-2485), 3) τεχνικές ειδικών τροποποιήσεων επιφάνειας, που περιλαμβάνουν ολιγονουκλεοτίδια σε πολυμερικές επιφάνειες, επικαλυμμένα σφαιρίδια με χιτοζάνη, μεμβράνες οξειδίου του αλουμινίου, φωτοενεργοποιημένες πολυανθρακικές επιφάνειες (PPC) ή επικαλυμμένες επιφάνειες με αμίνες (Τ. Nakagawa, et al., Journal of Biotechnology, 2005, 116, 1 OSIll, W. Cao, et al., Analytical Chemistry, 2006, 78, 7222-7228, J. Kim, et al., Lab on a Chip - Miniaturisation for Chemistry and Biology, 2008, 8, 1516-1523) και 4) τεχνικές υγρής φάσης που περιλαμβάνουν τεχνικές ηλεκτροφόρησης ή τεχνικές οργανικού διαλύτη (A. Persat, et al., Analytical Chemistry, 2009, 81, 9507-9511). Οι τεχνικές υγρής φάσης απαιτούν ηλεκτρικό πεδίο, πρόσθετη απομάκρυνση δείγματος με πιπέττα ή ασφαλή χειρισμό επικίνδυνων διαλυτών π.χ. φαινόλη/χλωροφόρμιο, και γι’ αυτό δεν μπορούν να ενταχθούν σε ολοκλήρωση σε μικρορευστονικό μικροεργαστήριο.
Οι τεχνικές που συνήθως χρησιμοποιούνται για τον καθαρισμό του DNA σε ψηφίδα βασίζονται ως επί το πλείστον στην εκχύλιση στερεάς φάσης σε μικροψηφίδα, γνωστή και ως μικροεκχύλιση στερεάς φάσης. Η εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) ορίζεται ως μία διαδικασία καθαρισμού δείγματος, όπου διαλυτές ουσίες, διαλυμένες ή αιωρούμενες σε ένα υγρό (γνωστό ως κινητή φάση), περνούν μέσα / πάνω από ένα στερεό (γνωστό ως στερεά φάση) και διαχωρίζονται- ο διαχωρισμός βασίζεται στην διαφορετική συγγένεια των διαλυμένων/αιωρουμένων ουσιών σε σχέση με τη στερεά φάση. Η στερεά φάση αφορά την στερεά επιφάνεια μέσα στην μικροψηφίδα ή το στερεό υπόστρωμα που είναι ενσωματωμένο μέσα στην μικροψηφίδα και περιλαμβάνει σφαιρίδια, μονόλιθους, μεμβράνες και κατάλληλες επιφάνειες ψηφίδας ή ειδικά τροποποιημένες επιφάνειας ψηφίδας. Η εκχύλιση στερεάς φάσης αποτελείται από τρία στάδια: 1) Πρόσδεση του DNA στη στερεά φάση, 2) Έκπλυση με ένα κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα για απομάκρυνση προσμίξεων/μολυντών και 3) Συλλογή του DNA (J. Μ. Walker, et al., Molecular Biomethods Handbook: Second Edition, 2008, 1-1124). Ο καθαρισμός του DNA σε ψηφίδα εξαρτάται από τις αλληλεπιδράσεις των νουκλεϊνικών οξέων με διάφορες δραστικές ομάδες όπως ΝΗΧ, SOx, AlyOxκαι COOH, που προϋπάρχουν στη στερεά φάση, όπως στο γυαλί, στην πυρίτια, στο οξείδιο του αλουμινίου, ή δημιουργούνται πάνω στην επιφάνεια της στερεός φάσης μετά από τροποποίηση του υλικού της στερεάς φάσης με διάφορες τεχνικές, όπως φωτοενεργοποίηση ή υγρή χημεία. Η υγρή χημεία περιλαμβάνει επίστρωση ή χάραξη (grafting) της επιφάνειας με οργανικά ή ανόργανα αντιδραστήρια (π.χ. ολιγονουκλεοτίδια), ή με υλικά με εναλλασσόμενα φορτία (π.χ. πολυαιθυλενιμίνη και χιτοζάνη), ή με οργανοσιλάνια (π.χ. 3-αμινοπροπυλοτριαιθοξυσιλάνιο (APTES), 3-[2-(2-αμινοαιθυλαμινο)-αιθυλαμινο]-προπυλτριμεθοξυσιλάνιο (ΑΕΕΑ) και τετραμεθοξυσιλάνιο (TMOS)) (S. J. Reinholt, et al., Angewandte Chemie International Edition, 2014, 53, 13988-14001, J. Wen, et al., Analytical Chemistry, 2008, 80, 6472-6479, C. W. Price, et al., Lab on a Chip, 2009, 9, 2484-2494). Όσον αφορά τις πολυμερικές επιφάνειες ως στερεά φάση, υπάρχουν αρκετές επιφανειακές τροποποιήσεις που μπορούν να γίνουν έτσι ώστε τα βιομόρια να ακινητοποιηθούν στις επιφάνειες (J. Μ. Goddard, et al., Progress in Polymer Science, 2007, 32, 698-725). Μακράν η πιο δοκιμασμένη αναστρέψιμη ακινητοποίηση στερεάς φάσης για καθαρισμό DNA είναι η εκχύλιση που βασίζεται στην πυρίτια, κυρίως με σφαιρίδια βασισμένα στην πυρίτια που μπορεί να είναι ή όχι μαγνητικά.
Υπάρχουν πολλοί περιορισμοί στις μεθόδους που χρησιμοποιούνται ήδη για καθαρισμό DNA σε ψηφίδα: α) περιορισμένη δυνατότητα κατασκευής για κατασκευή ψηφίδας σε μεγάλη κλίμακα (π.χ. μακρές διαδικασίες κατασκευής), β) υψηλό κατασκευαστικό ή λειτουργικό κόστος, γ) δυσκολία στον χειρισμό πρωτοκόλλων, (π.χ. χειρισμός σφαιριδίων) ή απαίτηση μεγάλων όγκων δειγμάτων, δ) περιορισμένος χρόνος ζωής ορισμένων δραστικών ομάδων που χρειάζονται για τον καθαρισμό DNA. ε) Σήμερα, η απόδοση και η χωρητικότητα των ψηφίδων είναι συνήθως χαμηλές ιδίως για την περίπτωση της εξαγωγής DNA από σύνθετα συστήματα (S. J. Reinholt, et al., Angewandte Chemie International Edition, 2014, 53, 13988-14001, J. Wen, et al., Analytical Chemistry, 2008, 80, 6472-6479). στ) Οι περισσότερες ψηφίδες δεν μπορούν να καθαρίσουν το DNA από μικρό αριθμό κυττάρων και γι’ αυτό δεν μπορούν να διενεργήσουν ανάλυση μοναδιαίου κυττάρου, και η) σχεδόν όλες οι ψηφίδες δεν έχουν μεγάλο δυναμικό εύρος καθαρισμού DNA που να στοχεύει από χαμηλό σε υψηλό επίπεδο κυτταρικών αριθμών. Πράγματι, σχετικά με τα στ) και η), μόνο ένας περιορισμένος αριθμός ψηφίδων, κάνοντας χρήση παραμαγνητικών σωματιδίων, έχουν πετύχει μέχρι στιγμής χαμηλό όριο ανίχνευσης στοχεύοντας μερικά κύτταρα. Για παράδειγμα, οι Kashkary et al. στόχευσαν την εξαγωγή DNA από 62-1500 κύτταρα (L. Kashkary, et al., Analytica Chimica Acta, 2012, 750, 127-131), με μια απόδοση που ήταν υψηλότερη για 62 κύτταρα, αλλά που μειωνόταν δραματικά για περισσότερα από 100 κύτταρα, θ) Προς το παρόν, τα σχέδια των ψηφίδων δεν μπορούν να πετύχουν ανάμιξη των αντιδραστηρίων και του δείγματος DNA, και απαιτούν προανάμιξη πριν από την έγχυση στη μικρορευστονική διάταξη (Μ. A. Witek, et al., Nucleic Acids Research, 2006, 34, e74, A. Bhattacharyya, et al., Analytical Chemistry, 2006, 78, 788-792, L. A. Legendre, et al., Analytical Chemistry, 2006, 78, 1444-1451). Ωστόσο, η ανάμιξη των κατάλληλων ρυθμιστικών διαλυμάτων κατακρήμνισης/δέσμευσης στη στερεά φάση και του δείγματος DNA δεν είναι εύκολη στους μικρορευστονικούς μορφότυπους, όπου δύο υγρά τείνουν να κινούνται παράλληλα χωρίς να αναμιγνύονται. Αναμιγνύονται μόνο όταν οι γεωμετρίες της ψηφίδας αλλάζουν γρήγορα, όπως συμβαίνει σε έναν μικροαναμίκτη (Ο. Geschke, et al., Microsystem Engineering of Lab-on-a-Chip Devices, 2004, 1-258). Ως εκ τούτου, ο σχεδιασμός μιας ψηφίδας πρέπει να περιλαμβάνει έναν αναμίκτη, εάν η προανάμιξη δεν αποτελεί επιλογή, ι) Οι περισσότερες από τις σύγχρονες μικρορευστονικές ψηφίδες καθαρισμού DNA δεν επιδέχονται ολοκλήρωση σε ένα πλήρες μικροεργαστήριο ψηφίδας που θα χρησιμεύει ως μικροεργαστήριο διάγνωσης σημείου ενδιαφέροντος ή τροφίμων ή μικροβιολογίας.
Αυτό που λείπει, επομένως, είναι μια πολυμερική ψηφίδα για καθαρισμό DNA με το κατάλληλο σχέδιο για ανάμιξη, που να είναι ολοκληρώσιμο και να κατασκευάζεται από χαμηλού κόστους τεχνολογία επιδεκτική σε παραγωγή μεγάλης κλίμακας. Επiπροσθέτως, θα ήταν επιθυμητό η ψηφίδα να φέρει μεγάλη επιφάνεια και μεγάλο αριθμό δραστικών ομάδων για να έχει ικανότητα μεγάλου εύρους καθαρισμού δηλ. όπως καθαρισμός DNA από 1 έως τουλάχιστον 10<8>κύτταρα (αντίστοιχα με 0,005pg έως 500ng Salmonella DNA με μοριακό βάρος 4857 kbp (I. Hein, et al., Journal of Microbiological Methods, 2006, 66, 538-547)).
Ανάμεσα στις διάφορες χημείες που χρησιμοποιούνται για εκχύλιση DNA στερεάς φάσης, η χημεία που βασίζεται στα COOH είναι ευκολότερη στην εφαρμογή σε πολυμερικά υποστρώματα. Η συγκεκριμένη προσέγγιση προτάθηκε από την ομάδα του Soper, που χρησιμοποίησε ακτινοβόληση Πολυανθρακικού (PC) υποστρώματος με UV για 30min για να δημιουργήσει ομάδες COOH πάνω στο πολυμερές και να τις χρησιμοποιήσει για καθαρισμό DNA (Υ. Xu, et al., Analytical Chemistry, 2003, 75, 2975-2984, Μ. A. Witek, et al., Nucleic Acids Research, 2006, 34, e74, D. S. W. Park, et al., Biomedical Microdevices, 2008, 10, 21-33, M. A. Witek, et al., Analytical Chemistry, 2008, 80, 3483-3491). Ωστόσο, η μέθοδος είναι αργή, η πυκνότητα των ομάδων COOH είναι χαμηλή, και ο αριθμός τους μειώνεται με την πάροδο του χρόνου, ένα φαινόμενο γνωστό ως γήρανση. Μια σύγκριση μεταξύ της ακτινοβολίας UV και της κατεργασίας με πλάσμα του πολυστυρενίου υποδηλώνει ένα υψηλότερο επίπεδο οξείδωσης και περισσότερες ομάδες καρβονυλίου/καρβοξυλίου στην κατεργασμένη με πλάσμα επιφάνεια από την ακτινοβολημένη με UV επιφάνεια (D. Zhang, et al., Langmuir, 2000, 16, 4528-4532). Οι Tsougeni et al έχουν πρόσφατα προτείνει μια μέθοδο μικρο-νανούφανσης με πλάσμα που περιέχει οξυγόνο, που δημιουργεί μια μεγάλη επιφάνεια και μεγάλη πυκνότητα ομάδων COOH στην επιφάνειά τους, που δείχνει πολύ μικρή φθορά με την πάροδο του χρόνου δηλ. πρακτικά περιορισμένη γήρανση (Κ. Tsougeni, et al., Langmuir, 2009, 25, 11748-11759).
Περίληψη της εφεύρεσης
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει μια μικρορευστονική ψηφίδα ικανή για ανάμιξη των ρυθμιστικών διαλυμάτων για τον καθαρισμό DNA με τα δείγματα στο εσωτερικό του μικροκαναλιού, ενώ ταυτόχρονα καθαρίζει το DNA μέσω εκχύλισης στερεάς φάσης. Η μικροψηφίδα κατασκευάζεται με μια τεχνολογία που βασίζεται στην τυχαία εκτράχυνση με πλάσμα (μικρο-νανοΰφανση), δημιουργώντας την ίδια στιγμή μεγάλη πυκνότητα καρβοξυλομάδων, οι οποίες είναι σταθερές με την πάροδο του χρόνου. Η μικρορευστονική ψηφίδα μπορεί να απομονώσει DNA με υψηλή απόδοση και ανάκτηση, στο εύρος του DNA από 1-10<8>κύτταρα, από διάφορα δείγματα όπως ανθρώπινο γενωμικό DNA (hgDNA), κυτταρικό βακτηριακό DNA και άλλων τύπων κυττάρων DNA.
Σύντομη περιγραφή των σχεδίων
Το Σχήμα 1 παρουσιάζει (α) ένα σχηματικό περίγραμμα του σχεδίου της μικρορευστανικής ψηφίδας, (β) ένα σχηματικό της ζιγκ-ζακγ κυψελίδας σχήματος V του μικροκαναλιού και (γ) μια κεκλιμένη εικόνα Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης (SEM) της μικρο-νανοϋφασμένης επιφάνειας στο εσωτερικό της μικροψηφίδας σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση.
Το σχήμα 2 παρουσιάζει: (α) το πείραμα του καθαρισμού βακτηριακού DNA από 500ng DNA (αντίστοιχα με περίπου 10<8>κύτταρα) ως σήμα απορρόφησης UV στα 260nm του ρευστού που εξέρχεται από τη μικρορευστονική ψηφίδα συναρτήσει του χρόνου και (β) την απόδοση καθαρισμού του συναρτήσει ολόκληρου του εκλουσθέντος όγκου των λυμάτων.
Το σχήμα 3 παρουσιάζει το πείραμα καθαρισμού ανθρώπινου γενωμικού DNA (hgDNA) από 200ng προ-καθαρισμένο hgDNA (μοριακού βάρους 50-250kb) ως σήμα απορρόφησης UV στα 260nm του ρευστού που εξέρχεται της μικρορευστονικής ψηφίδας συναρτήσει του χρόνου.
Το σχήμα 4 παρουσιάζει την δυνατότητα της ψηφίδας να καθαρίζει πολύ μικρές ποσότητες DNA που αντιστοιχούν σε 10 και 100 βακτηριακά κύτταρα μέσω εικόνας γέλης μετά από ηλεκτροφόρηση του εκτός ψηφίδας ενισχυμένου DNA.
Το σχήμα 5 παρουσιάζει την ικανότητα της ψηφίδας για ολοκλήρωση σε ένα μικροεργαστήριο ψηφίδας, και για καθαρισμό χαμηλών συγκεντρώσεων DNA που αντιστοιχούν σε 5, 50 και 500 βακτηριακά κύτταρα: (α) μια εικόνα γέλης μετά από ηλεκτροφόρηση από εκτός ψηφίδας ενισχυμένο DNA προερχόμενο από 50 και 5 κύτταρα Salmonella μετά από ολοκλήρωση μιας μικροψηφίδας δέσμευσης και λύσης βακτηριακών κυττάρων και της μικροψηφίδας καθαρισμού DNA και (β) μια εικόνα γέλης μετά από ηλεκτροφόρηση από ενισχυμένο σε μικροψηφίδα DNA προερχόμενο από 500 κύτταρα μετά από ολοκλήρωση μιας μικροψηφίδας δέσμευσης και λύσης βακτηριακών κυττάρων, της μικροψηφίδας καθαρισμού DNA και μιας μικροψηφίδας ισοθερμικής, εξαρτώμενης από ελικάση ενίσχυσης (HDA).
Το σχήμα 6 παρουσιάζει την επίδοση (α) μιας θερμικά σταθεροποιημένης μικροψηφίδας (4 μήνες μετά την κατασκευή) και (β) μιας πρόσφατα κατασκευασμένης μικροψηφίδας (μετά από πλάσμα οξυγόνου) ως σήμα απορρόφησης UV συναρτήσει του χρόνου.
Λεπτομερής περιγραφή της εφεύρεσης
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει μια μικρορευστονική ψηφίδα που περιλαμβάνει μια πολυμερική επιφάνεια, η οποία προσφέρει μια οικονομική λύση για συστήματα σημείου ενδιαφέροντος. Ο όρος «πολυμερική επιφάνεια» δηλώνει μια επιφάνεια που είναι είτε πολυμερές είτε οποιοδήποτε άλλο υλικό το οποίο είναι επικαλυμμένο με ένα πολυμερικό υμένιο. Σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, ο όρος «πολυμερές» σημαίνει ένα υλικό που αποτελείται από πολλές υπομονάδες (μονομερή) τα οποία αποτελούνται από άνθρακα, οξυγόνο και υδρογόνο, ενώ σε κάποιες περιπτώσεις μπορεί να είναι παρόν και πυρίτιο.
Κατά προτίμηση, το πολυμερές της παρούσας εφεύρεσης ανήκει στην ομάδα των πολυμερών ή συμπολυμερών που αποτελούνται από ακρυλικό, ή ολοεφίνη, ή φαινολικά μονομερή, σιλικόνες ή μονομερή περιέχοντα πυρίτιο. Κατά μεγαλύτερη προτίμηση, το οργανικό πολυμερές επιλέγεται από την ομάδα που αποτελείται από πολυ(μεθακρυλικό μεθυλεστέρα) (ΡΜΜΑ), πολυ(διαιθεροκετόνη) (PEEK), συμπολυμερές κυκλοολεφίνης (COC), πολυμερές κυκλοολεφίνης (COP), πολυ(τερεφθαλικό αιθυλενεστέρα) (ΡΕΤ), πολυστυρένιο (PS), και πολυανθρακικό (PC). Κατά ακόμα μεγαλύτερη προτίμηση, τα οργανικά πολυμερή είναι πολυ(μεθακρυλικός μεθυλεστέρας) (ΡΜΜΑ). Η τεχνολογία που παρουσιάζεται εδώ μπορεί να εφαρμοστεί σε πολυμερή περιέχοντα πυρίτιο όπως ORMOCOMP®, διασταυρωμένο πολυδιμεθυλοσιλοξάνιο (PDMS), και ακρυλικά συμπολυμερές-PDMS, αν και η χημεία για τον καθαρισμό DNA μπορεί να βασιστεί στην περίπτωση αυτή όχι στα COOH αλλά στις ομάδες SiOx.
Το πολυμερές χρησιμοποιείται κατά προτίμηση υπό την μορφή πλακιδίων, ή φύλλων, ή υμενίων επικαλυμμένων με περιστροφή σε επίπεδες επιφάνειες (όπως δισκία πυριτίου, μέταλλο, ή γυάλινα υποστρώματα), ή χοτευμένο σε καλούπια.
Η μικρορευστονική ψηφίδα της παρούσας εφεύρεσης αποτελείται από έναν παθητικό μικροαναμίκτη. Ο όρος «παθητικός μικροαναμίκτης» σημαίνει ένα μικρορευστονικό κανάλι που έχει την ικανότητα ανάμιξης ρευστών χωρίς την απαίτηση εξωτερικής ενέργειας πέραν από την ενέργεια που απαιτείται για την άντληση των ρευστών. Κατά προτίμηση το σχήμα του παθητικού μικροαναμίκτη ανήκει σε κανάλια σχήματος Υ ή Τ με πολλαπλές εισόδους ή κανάλια με μια -κατάλληλα εναλλασσόμενη- εγκάρσια διατομή ή κανάλια με μικροσκοπικές τρισδιάστατες γεωμετρίες εσωτερικά ως εμπόδια (κολώνες) ή αυλάκια (grooves) ή κανάλια με γεωμετρίες διαχωρισμού και επανένωσης (split and merge) ή κανάλια με γεωμετρία ζιγκ-ζαγκ ή έναν συνδυασμό των παραπάνω. Κατά μεγαλύτερη προτίμηση, το σχέδιο του μικροαναμίκτη επιλέγεται ώστε να συνδυάσει τα πλεονεκτήματα ενός καναλιού σχήματος Τ με την γεωμετρία ζιγκ-ζαγκ όπως εξηγείται στο V. Ε. Papadopoulos, et al., Microelectronic Engineering, 2014, 124, 42-46. Κατά ακόμα μεγαλύτερη προτίμηση, ο μικροαναμίκτης είναι ένα κανάλι σχήματος Τ με γεωμετρία ζιγκ-ζαγκ με γωνία μεταξύ των ζιγκ-ζαγκ που κυμαίνεται από 40-75°, με δύο εισόδους με πλάτος καναλιού που κυμαίνεται από 50-300 μτη, και επανενώνεται σε ένα κεντρικό κανάλι πλάτους 100-600 pm αντίστοιχα, με κολώνες ή χωρίς κολώνες εσωτερικά του κεντρικού καναλιού και με ένα μήκος που συνίσταται από 20-400 ζιγκ-ζαγκ. Το σχήμα 1 (α) δείχνει σχηματικό περίγραμμα του μικροαναμίκτη που έχει δύο εισόδους με πλάτος καναλιού 200 pm, που συγχωνεύονται σε ένα κεντρικό κανάλι 400 pm με γεωμετρία ζιγκ-ζαγκ, με μήκος 30cm, βάθος 30 pm και γωνία μεταξύ των ζιγκ-ζαγκ 60°. Σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, το «ζιγκζαγκ» ορίζεται σα μια κυψελίδα του καναλιού σχήματος V (όχι σχήματος W). Ένα σχηματικό της ζιγκ-ζαγκ κυψελίδας σχήματος V φαίνεται στο Σχήμα 1 (β). Αυτή η γεωμετρία προωθεί την ανάμιξη και επιτρέπει υψηλούς ρυθμούς ροής εξαιτίας των χαμηλότερων πτώσεων πίεσης κατά μήκος στο μικροκανάλι.
Τα μικρορευστονικά κανάλια κατασκευάζονται με οποιαδήποτε γνωστή μέθοδο όπως χύτευση με έγχυση, θερμή αποτύπωση, λιθογραφία, λιθογραφία που ακολουθείται από εγχάραξη με πλάσμα, κλπ. Μετά την κατασκευή και πριν τη σφράγιση, τα μικρορευστονικά κανάλια μικρο-νανοϋφαίνονται με πλάσμα.
Η «μικρο-νανοΰφανση» ορίζεται ως μια κατεργασία εκτράχυνσης της επιφάνειας, όπου η τραχύτητα φαίνεται σα μια υφή επιφάνειας που αποτελείται από τυχαία, μικρό και νανοκλίμακας, τραχιά στοιχεία. Πιο συγκεκριμένα η μικρο-νανοΰφανση με πλάσμα επηρρεάζεται από μια κατεργασία εγχάραξης με πλάσμα με ταυτόχρονη εκτράχυνση της επιφάνειας. Μια τυπική μικρο-νανοΰφασμένη επιφάνεια με πλάσμα φαίνεται στο Σχ. 1γ.
Η μικρο-νανοΰφανση διενεργείται χρησιμοποιώντας πλάσμα που περιέχει οξυγόνο ή φθόριο, έτσι ώστε να αυξήσει την ενεργή επιφάνειά τους κατά έναν παράγοντα τουλάχιστον 3 και να δημιουργήσει κατάλληλες χημικές ομάδες. Αν τα μικρορευστονικά κανάλια κατασκευαστούν με λιθογραφία ακολουθουμένη από εγχάραξη με πλάσμα, η μικρό- νανοΰφανση με πλάσμα μπορεί να συνδυαστεί με την εγχάραξη με πλάσμα σε ένα βήμα. Το Σχήμα 1 (γ) απεικονίζει μια κεκλιμένη εικόνα Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης (SEM) της μικρο-νανοϋφασμένης επιφάνειας στο εσωτερικό της μικροψηφίδας της παρούσας εφεύρεσης που δείχνει την μεγάλη ενεργή επιφάνεια. Η κατεργασία της μικρο-νανοΰφανσης με πλάσμα έχει περιγράφει σε προηγούμενες εφευρέσεις (Greek patent Application number: 20050100473, PCT publication number: W02007031799) και (Greek patent Application number: 20080100404, PCT publication number: W02009150479).
Οι επιφάνειες στην παρούσα εφεύρεση εγχαράσσονται και ταυτόχρονα μικρονανοϋφαίνονται με πλάσμα που περιέχει οξυγόνο ή πλάσμα που περιέχει SF6για πολυμερή περιέχοντα πυρίτιο. Τυπικά αέρια είναι το Οξυγόνο (συμπεριλαμβανομένου μίγματα Οξυγόνο με αδρανή αέρια ή με άζωτο) ή SF6(συμπεριλαμβανομένου άλλα (χέρια περιέχοντα Φθόριο) για πολυμερή περιέχοντα 7τυρίτιο. Για πολυμερή που περιέχουν πυρίτιο το πλάσμα οξυγόνου ακολουθεί την μικρο-νανοΰφανση με SF6. Η μικρο-νανοΰφανση του οργανικού πολυμερούς ή των επιφανειών πολυμερούς περιέχοντος πυρίτια μπορεί να πραγματοποιείται με χρήση ενός αντιδραστήρα υψηλής πυκνότητας τύπου-Helicon ή ενός επαγωγικώς συζευγμένου αντιδραστήρα πλάσματος, ή ενός εγχαράκτη ενεργών ιόντων ή άλλων αντιδραστήρων πλάσματος.
Σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, η μικρο-νανοΰφανση πρέπει να διεξάγεται υπό συνθήκες ανισοτροπικής εγχάραξης παρουσία παρεμποδιστών εγχάραξης προερχόμενων από την ιονοβολή από τα τοιχώματα ή τα ηλεκτρόδια του αντιδραστήρα πλάσματος. Τυπικές πιέσεις λειτουργίας 0,4-7 Pa και κατά προτίμηση 0,5-2 Pa, τυπική ισχύ πλάσματος 100-3000 W και κατά προτίμηση 1500-3000W, και τυπική τάση πόλωσης η οποία κυμαίνεται από - 50 - -300 V. Για τους αντιδραστήρες ενεργών ιόντων χαμηλής πυκνότητας οι συνθήκες πίεσης κυμαίνονται από 5-100 mT, και η ισχύς πλάσματος από 100-1000 W. Τυπικά υλικά ηλεκτροδίου ή διηλεκτρικά τοιχώματα περιλαμβάνουν αλουμίνα, χαλαζία, ή άλλα μεταλλικά υλικά ή υλικά οξειδίου του μετάλλου.
Η εγχάραξη με Πλάσμα τροποποιεί χημικά την επιφάνεια της παρούσας εφεύρεσης δηλ. δημιουργεί δραστικές ομάδες στην επιφάνεια της παρούσας εφεύρεσης όπως καρβοξυλικές/καρβονυλικές ομάδες στις επιφάνειες οργανικού πολυμερούς και ομάδες σαν την πυρίτια (SiOx) στην περίπτωση επιφανειών πολυμερούς περιέχοντος πυρίτιο, δημιουργώντας κατ’ αυτόν τον τρόπο την δραστικότητα της επιφάνειας.
Σύμφωνα με μια επιθυμητή εφαρμογή, μετά την κατεργασία με το πλάσμα και πριν από τη σφράγιση της μικροψηφίδας το πολυμερές υπόκειται σε ανόπτηση σε μία θερμοκρασία χαμηλότερη από τη θερμοκρασία υαλώδους μεταπτώσεως Tgτου πολυμερούς, κατά προτίμηση 5 έως 40 βαθμούς κάτω από το Tg, και κατά μεγαλύτερη προτίμηση 10 βαθμούς κάτω από το Tg για 10-120 min, με σκοπό την ταχεία γήρανση της χημικής δραστικότητας, η οποία είναι σταθερή για μήνες. Αυτό το προαιρετικό βήμα αυξάνει τον χρόνο ζωής της διάταξης.
Στην παρούσα εφεύρεση η μικροψηφίδα με τις ενσωματωμένες μικρο-νανοϋφασμένες επιφάνειες οι οποίες φέρουν δραστικές ομάδες όπως περιγράφονται παραπάνω διευκολύνουν την εκχύλιση στερεάς φάσης του DNA.
Στην παρούσα εφεύρεση λαμβάνει χώρα καθαρισμός DNA στην μικροψηφίδα υπό συνεχή ροή. Το δείγμα που περιέχει DNA, το οποίο μπορεί να προέρχεται από διάφορες πηγές, όπως κυτταρολύμματα από αίμα, τρόφιμα, νερό περιβαλλοντικά δείγματα, βακτήρια ή οποιαδήποτε άλλο διάλυμα που περιέχει DNA, εισάγεται μέσω της μιας εισόδου της μικροψηφίδας. Την ίδια στιγμή εισάγεται μέσω της άλλης εισόδου ένα ρυθμιστικό διάλυμα κατακρήμνισης/δέσμευσης όπως διάλυμα πολυαιθυλενογλυκόλης, διάλυμα αιθανόλης, χαοτροπικό ή μη-χαοτροπικό διάλυμα άλατος ή μίγματα αυτών. Εξαιτίας του σχεδίου του μικροαναμίκτη, επιμελής ανάμιξη λαμβάνει χώρα μεταξύ τους και το DNA ακινητοποιείται στις δραστικές ομάδες που δημιουργούνται από το πλάσμα δηλ ομάδες -COOH ή ομάδες -Si-O- πάνω στην επιφάνεια της μικροψηφίδας. Ένα «υλικό εκχύλισης στερεάς φάσης» ορίζεται σαν ένα υλικό που φέρει δραστικές ομάδες, οι οποίες είναι υπεύθυνες για την αλληλεπίδραση διαλυτής ουσίας-στερεού και τον καθαρισμός του δείγματος κατά την εκχύλιση στερεάς φάσης. Για τον καθαρισμό DNA, το υλικό εκχύλισης στερεάς φάσης (που φέρει για παράδειγμα δραστικές ομάδες COOH ή -Si-O- που δημιουργούνται από το πλάσμα) αλληλεπιδρά με το DNA και προκαλεί την κατακρήμνισή του. Εκτός από τις ομάδες COOH και -Si-O- (π.χ. SiO2) που δημιουργούνται από το πλάσμα, μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιοδήποτε άλλο υλικό εκχύλισης στερεάς φάσης π.χ. TiO2, ZrO2, Αl2O3, ή άλλα οξείδια των μετάλλων, ή αμίνες (π.χ. με χρήση APTES ή ΑΕΕΑ). Αυτά τα υλικά εκχύλισης στερεάς φάσης μπορούν να εναποτεθούν σαν ένα πολύ λεπτό στρώμα πάνω στην μικρονανοϋφασμένη τοπογραφία αξιοποιώντας τη μεγάλη ενεργή επιφάνεια της διάταξης. Ως εκ τούτου, μπορούν να υπάρχουν πάνω στη μικρο-νανοϋφασμένη επιφάνεια διάφορα υλικά εκχύλισης στερεάς φάσης. Τα πρωτόκολλα για τον καθαρισμό DNA πρέπει να προσαρμοστούν στην δραστικότητα που εναποτίθεται στην μικρονανοϋφασμένη επιφάνεια.
Σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, ο όρος ρυθμιστικό διάλυμα «κατακρήμνισης/δέσμευσης» είναι ένα διάλυμα που προκαλεί ή ενισχύει την ακινητοποίηση του DNA στη μικρο-νανοϋφασμένη επιφάνεια εξαιτίας των διάφορων αλληλεπιδράσεων με το DNA, όπως κατακρήμνιση, δεσμοί υδρογόνου ή άλλες ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, ή ρΗ-επαγόμενη δέσμευση στην επιφάνεια.
Μετά από ένα ενδιάμεσο στάδιο έκπλυσης με ρυθμιστικά διαλύματα για την απομάκρυνση όποιων προσμίξεων όπως κυτταρικά υπολείμματα και πρωτεΐνες, η έκλουση του DNA, δηλ. η απομόνωση και η συλλογή του, πραγματοποιείται με νερό ή ρυθμιστικό διάλυμα συμβατό με την PCR.
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει μικρο-νανοϋφασμένες με πλάσμα μικρορευστονικές ψηφίδες για καθαρισμό DNA που μπορούν να εφαρμοστούν στην ανάλυση τροφίμων, τη μικροβιολογική ανάλυση, την περιβαλλοντική ανάλυση, την ανάλυση στην ιατρική/κλινική, την διαγνωστική και την εγκληματολογία. Πιο συγκεκριμένα, μπορούν να εφαρμοστούν στην ανίχνευση παθογόνων στα τρόφιμα, όπως για Salmonella, ή Bacillus cereus ή την ανίχνευση άλλων παθογόνων στα τρόφιμα ή την ανίχνευση παθογόνων στο αίμα ή σε άλλα ανθρώπινα δείγματα, ή σε άλλα περιβαλλοντικά δείγματα, συμπεριλαμβανομένου δείγματα υδάτων.
Τα πλεονεκτήματα της παρούσας εφεύρεσης περιλαμβάνουν απλότητα, ταχύτητα και σταθερότητα των επιφανειών στο εσωτερικό της παρούσας εφεύρεσης με την πάροδο του χρόνου, σε σύγκριση με άλλα πρωτόκολλα καθαρισμού που οι επιφάνειες πρέπει να χρησιμοποιηθούν γρήγορα μετά την τροποποίηση της επιφάνειας, επειδή είναι επιρρεπείς στην αποικοδόμηση από τον αέρα.
Η παρούσα εφεύρεση παρουσιάζει μεγάλη δέσμευση και ανάκτηση DNA δηλ. μεγάλη ικανότητα δέσμευσης και υψηλή απόδοση για τον καθαρισμό δειγμάτων που περιέχουν DNA κατά προτίμηση βακτηριακό DNA ή ανθρώπινο γενωμικό DNA (hgDNA) ή κατά μεγαλύτερη προτίμηση DNA σαλμονέλας (Salmonella DNA).
Επιπλέον, η παρούσα εφεύρεση παρέχει καθαρισμό DNA από κυτταρολύματα που αντιστοιχούν σε λίγα μόνο κύτταρα και φέρει την ικανότητα ανάλυσης μοναδιαίου κυττάρου. Επομένως, η ψηφίδα έχει ένα μεγάλο δυναμικό εύρος από τουλάχιστον 1-10<8>κύτταρα που αντιστοιχούν σε 0,005pg έως τουλάχιστον 500ng.
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει μια έτοιμη προς χρήση μονάδα ή μια μονάδα επιδεκτική σε ολοκλήρωση σε μικροεργαστήρια ψηφίδας.
Επιπροσθέτους, η παρούσα εφεύρεση επιτρέπει μειωμένους πειραματικούς χρόνους επιτρέποντας υψηλούς ρυθμούς ροής για κάθε μικροκανάλι (π.χ. Ιθμΐ/min).
Τέλος, η παρούσα εφεύρεση μπορεί να χρησιμοποιηθεί με άλλα νουκλεϊνικά οξέα πέραν του DNA όπως το ρινονουκλεϊνικό οξύ (RNA) καθώς και το πεπτιδονουκλεϊνικό οξύ, το οποίο είναι ένα τεχνητά συντεθειμένο πολυμερές, ή θραύσματα αυτών.
Παραδείγματα
Παράδειγμα 1: Καθαρισμός μεγάλης ποσότητας DNA σαλμονέλας σε μια μικρονανοΰφασμενη με πλάσμα πολυμερική μικροψηφίδα
Α) Κατασκευή Μικρορευστονικής Ψηφίδας.
Αρχικά, πλακίδια ΡΜΜΑ πάχους 2mm επικαλύπτονται με περιστροφή με το φωτοπολυμερές αρνητικού τόνου ORMOCOMP® (Microresist) και ψήνονται στους 80 °C για 4 min. Δεύτερον, το παχύ στρώμα του φωτοπολυμερούς εκτέθηκε μέσω μια φωτομάσκας (που φέρει το σχέδιο του Σχ. 1 α, β) χρησιμοποιώντας μια πηγή φωτός UV ευρυζωνικής έκθεσης στα 365 nm. Αυτά τα λιθογραφημένα φύλλα ΡΜΜΑ μικρονανοϋφάνθηκαν σε πλάσμα O2σε έναν αντιδραστήρα Πλάσματος τύπου-Helicon με αθωράκιστα ηλεκτροστατικά πεδία (MET system, Adixen). Οι ανισοτροπικές συνθήκες κατεργασίας πλάσματος οξυγόνου περιλαμβάνουν: ισχύ πηγής 1900 W, πίεση 0,75 Pa, ροή οξυγόνου 100sccm, τάση πόλωσης -100V bias, και θερμοκρασία δείγματος κατά την εγχάραξη -20°C, καταλήγοντας σε έναν ρυθμό εγχάραξης ~ 990 nm/min για ΡΜΜΑ. Χρησιμοποιήθηκε εγχάραξη με πλάσμα οξυγόνου για να μικρονανοϋφάνει επιφάνειες ΡΜΜΑ, για να δημιουργήσει υποστρώματα με αυξημένη ενεργή επιφάνεια για ακινητοποίηση DNA. Η τελική μικροψηφίδα σφραγίστηκε με μια ταινία πολυολεφίνης για ελασματοποίηση (3 Μ Advanced Polyolefin Microplate Sealing Tape 9795 from 3M Co.) με μια συσκευή ελασματοποίησης στους 75°C.
Β) Καθαρισμός DNA
Το πρωτόκολλο καθαρισμού DNA που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από τρία βασικά στάδια: α) Ακινητοποίηση του DNA, β) Στάδιο έκπλυσης με αιθανόλη και γ) Έκλουση με νερό. Αρχικά, έγινε έγχυση ενός μικρού όγκου προ-καθαρισμένου DNA σαλμονέλας 500ng στην ψηφίδα μέσω της μιας εισόδου, το οποίο ακολουθήθηκε από ένα διάλυμα που περιέχει 5% πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG), 0,4Μ NaCl και 70% αιθανόλη (EtOH) σα ρυθμιστικό διάλυμα κατακρήμνισης/δέσμευσης, ενώ την ίδια στιγμή το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα κατακρήμνισης/δέσμευσης εισάγεται μέσω της άλλης εισόδου. Στη συνέχεια έγινε έγχυση 85% αιθανόλης μέσω και των δύο εισόδων της ψηφίδας έτσι ώστε οι προσμίξεις να απομακρυνθούν. Μετά, νερό εισήχθηκε μέσω και των δύο εισόδων έτσι ώστε να αντιστραφεί η ακινητοποίηση του DNA και να εκλουστεί.
Η μικροψηφίδα συνδέθηκε σε ένα φασματοφωτόμετρο UV (UV-sensitive Peltier διάταξη ανίχνευσης από τη θ-metrisis) (www.θ-metrisis.gr) ως εξής: ένας σωλήνας από PEEK με εξωτερική διάμετρο (OD) 360 μm συνδέεται από την έξοδο της ψηφίδας σε κυψελίδα μvol SMA-Z-Flow cell (FIAlab Instruments) και το σήμα της απορρόφησης UV από το μονοπάτι 2,5mm καταγράφεται από το φασματοφωτόμετρο. Ως τελευταίο βήμα, κλάσματα DNA συλλέχθηκαν σε σωλήνες eppendorf και η απορρόφηση μετρήθηκε μέσω της συσκευής NanoDrop 1000. Μετά από επεξεργασία των δεδομένων υπολογίστηκε η ανάκτηση DNA σαλμονέλας και ως εκ τούτου, η απόδοση της ψηφίδας.
Το Σχήμα 2 (α) δείχνει το πρωτόκολλο του καθαρισμού DNA σαλμονέλας και πως αυτό καταγράφηκε από τον φασματοφωτόμετρο στα 260nm. Πιο συγκεκριμένα, το σήμα της απορρόφησης UV στα 260nm του ρευστού που εξέρχεται της μικρορευστονικής ψηφίδας παρακολουθείται ως προς τον χρόνο δείχνοντας το πρωτόκολλο καθαρισμού DNA εντός ψηφίδας. Τα δείγματα αφορούσαν προκαθορισμένο DNA σαλμονέλας (500ng), το οποίο εισερχόταν με ρυθμό ροής 5 μl/min. Επίσης, η απόδοση της ανάκτησης μετά από τον καθαρισμό DNA παριστάνεται στο Σχήμα 2 (β) ως προς τον συνολικό εκλουόμενου όγκου τον κλασμάτων από την ψηφίδα, δείχνοντας ότι είναι -100% για όγκο πάνω από 40 μl.
Παρόμοια αποτελέσματα αποκτήθηκαν με ψηφίδες πολυμερούς κυκλοολεφίνης (COP).
Παράδειγμα 2: Καθαρισμός μεγάλης ποσότητας ανθρώπινου γενωμικού DNA (hgDNA) σε μια μικρο-νανοϋφασμένη με πλάσμα μικροψηφίδα από ΡΜΜΑ Οι επιφάνειες ΡΜΜΑ των μικροψηφίδων μικρο-νανοϋφάνθηκαν όπως περιγράφεται στο παράδειγμα 1 και το πρωτόκολλο καθαρισμού DNA που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από τρία βασικά στάδια: α) Ακινητοποίηση DNA, β) Στάδιο Έκπλυσης με Αιθανόλη και γ) Έκλουση με Νερό. Αρχικά, έγινε έγχυση ενός μικρού όγκου προκαθαρισμένου ανθρώπινου γενωμικού DNA 200ng στην ψηφίδα μέσω της μιας εισόδου, το οποίο ακολουθήθηκε από ένα διάλυμα που περιέχει 3% PEG, 0,4Μ NaCl και 70% αιθανόλη σα ρυθμιστικό διάλυμα κατακρήμνισης/δέσμευσης, ενώ την ίδια στιγμή το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα κατακρήμνισης/δέσμευσης εισάγεται μέσω της άλλης εισόδου. Μετά έγινε έγχυση 85% αιθανόλης μέσω και των δύο εισόδων της ψηφίδας έτσι ώστε οι προσμίξεις να απομακρυνθούν. Σαν τελευταίο στάδιο, νερό εισήχθηκε μέσω και των δύο εισόδων έτσι ώστε να αντιστραφεί η ακινητοποίηση του DNA και να εκλουστεί.
Η μικροψηφίδα συνδέθηκε σε ένα φασματοφωτόμετρο UV (UV-sensitive Peltier διάταξη ανίχνευσης από τη θ-metrisis) (www.θ-metrisis.gr) ως εξής: ένας σωλήνας από πυρίτια με εξωτερική διάμετρο (OD) 360 μm και με εσωτερική διάμετρο (ID) 200 μm ευθυγραμμίζεται από την έξοδο της ψηφίδας μεταξύ δύο οπτικών ινών διαμέτρου 200 μm και το σήμα της απορρόφησης UV από το μονοπάτι των 200 μm καταγράφεται από το φασματοφωτόμετρο.
Το Σχήμα 3 δείχνει το σήμα της απορρόφησης UV του εκλουόμενου ανθρώπινου γενωμικού DNA, το οποίο καταγράφηκε από το φασματοφωτόμετρο στα 260 nm. Το σήμα απορρόφησης στα 260 nm του ρευστού που εξέρχεται της μικρορευστονικής ψηφίδας παρακολουθείται ως προς τον χρόνο, δείχνοντας το πρωτόκολλο καθαρισμού προ-καθαρισμένου ανθρώπινου γενωμικού DNA (200ng), το οποίο εισέρχεται με ρυθμό ροής 1 μl/min.
Παράδειγμα 3: Καθαρισμός μικρής ποσότητας DNA σαλμονέλας (που αντιστοιχούν σε 10-100 κύτταρα) σε μια μικρο-νανοΰφασμένη με πλάσμα πολυμερική μικροψηφίδα
Οι πολυμερικές επιφάνειες των μικροψηφίδων μικρο-νανοϋφάνθηκαν όπως περιγράφεται στο παράδειγμα 1 και το πρωτόκολλο καθαρισμού DNA που ακολουθήθηκε αποτελείται από τρία βασικά στάδια: α) Ακινητοποίηση DNA, β) Στάδιο Έκπλυσης με Αιθανόλη και γ) Έκλουση με Νερό. Αρχικά, έγινε έγχυση κυτταρολύματος σαλμονέλας διαφόρων συγκεντρώσεων που αντιστοιχούν σε 10-100 κύτταρα στην ψηφίδα μέσω της μιας εισόδου, ενώ την ίδια στιγμή ένα διάλυμα που περιέχει 5% PEG, 0,4Μ NaCl και 70% αιθανόλη εισήχθηκε μέσω της άλλης εισόδου ως ρυθμιστικό διάλυμα κατακρήμνισης/δέσμευσης. Στη συνέχεια έγινε έγχυση 85% διαλύματος αιθανόλης μέσω και των δύο εισόδων της ψηφίδας έτσι ώστε να απομακρυνθούν οι προσμίξεις. Μετά, νερό εισήχθηκε μέσω και των δύο εισόδων έτσι ώστε να αντιστραφεί η ακινητοποίηση του DNA και να εκλουστεί. Σαν τελευταίο βήμα κλάσματα DNA συλλέχθηκαν σε σωλήνες eppendorf και αξιολογήθηκαν μέσω PCR και ηλεκτροφόρηση γέλης εκτός ψηφίδας.
Το Σχήμα 4 δείχνει μια εικόνα γέλης μετά από ηλεκτροφόρηση για καθαρισμό DNA από κλάσματα κυτταρολύματος σαλμονέλας που αντιστοιχούν σε 100 και 10 κύτταρα μετά από PCR. Οι λωρίδες σ’ αυτό το σχήμα αντιπροσωπεύουν: τον μάρτυρα μοριακών βαρών (1)<'>το συγκεντρωμένο κυτταρόλυμα με κυτταρικά υπολείμματα (2)<'>το συλλεγμένο δείγμα που εκλούστηκε από την ψηφίδα από κυτταρόλυμα που αντιστοιχεί σε 10 κύτταρα (3) και το συλλεγμένο δείγμα που εκλούστηκε από την ψηφίδα από κυτταρόλυμα που αντιστοιχεί σε 100 κύτταρα (4) και ο μάρτυρας (5) (τη συλλογή των κλασμάτων από την ψηφίδα ακολούθησε PCR για 30 κύκλους μέσω ενός θερμοκυκλοποιητή, χρησιμοποιώντας 1 μl από κάθε κλάσμα σε όλες τις περιπτώσεις).
Η ζώνη είναι πιο φωτεινή για την γέλη που έγινε μετά τον καθαρισμό DNA για κυτταρολύματα από 10 και 100 κύτταρα, από ό,τι η ζώνη του αρχικού μη καθαρισμένου κυτταρολύματος, υποδεικνύοντας επιτυχή απομάκρυνση των μολυντών και καθαρισμό DNA.
Παράδειγμα 4: Ολοκλήρωση της μικροψηφίδας καθαρισμού DNA με άλλες μικρορευστονικές μονάδες
Οι πολυμερικές επιφάνειες των μικροψηφίδων μικρο-νανοϋφάνθηκαν όπως περιγράφεται στο παράδειγμα 1 και χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα μικροσυριγγώναντλιών και μικροβαλβίδων (LabSmith, Inc) για την εισαγωγή των δείγματος/ρυθμιστικών διαλυμάτων και για τη σύνδεση των διαφορετικών μικρορευστονικών στοιχείων μαζί.
Μια μικρορευστονική διάταξη για δέσμευση και λύση κυττάρων ήταν συνδεδεμένη μέσω μιας βαλβίδας με ένα σωλήνα από PEEK με εξωτερική διάμετρο (OD) 360 μm στην πρώτη είσοδο της μονάδας καθαρισμού DNA, ενώ στην έξοδο ήταν συνδεδεμένη με ένα σωλήνα από PEEK με εξωτερική διάμετρο (OD) 360 μm σε έναν σωλήνα eppendorf μέσω μιας βαλβίδας μια ισοθερμική μικρορευστονική διάταξη. Η δεύτερη είσοδος στη μονάδα καθαρισμού DNA ήταν κατευθείαν συνδεδεμένη σε μια μικροσύριγγα-αντλία για να διευκολύνει την εισαγωγή των ρυθμιστικών διαλυμάτων μέσα στην ψηφίδα.
Βακτήρια με διάφορες συγκεντρώσεις εισήχθησαν μέσα στη μονάδα δέσμευσης (εισαγωγή 100 μl). Μετά από διαδοχικές εκπλύσεις με 10 mM PBS, pH 7,4 για να απομακρυνθούν τα μη δεσμευμένα κύτταρα (όγκος 75 μl), διενεργήθηκε λύση κυττάρων στη μικροψηφίδα κάνοντας χρήση μιας θερμής πλάκας στους 93 °C για 10 min. Η έκλουση του κυτταρολύματος με PBS έγινε με 10 μl/min (ο συνολικός όγκος που συλλέχθηκε από τα κλάσματα της ψηφίδας ήταν 200 μl), τα πρώτα 50 μl απορρίφθηκαν και τα επόμενα 50 μl του κυτταρολύματος εγχύθηκαν μέσα στη μονάδα καθαρισμού DNA. Την ίδια στιγμή έλαβε χώρα έγχυση του ρυθμιστικού διαλύματος κατακρήμνισης/δέσμευσης που περιέχει 5% PEG, 0,4Μ NaCl και 70% αιθανόλη (επίσης 50 μl σε όγκο) με τον ίδιο ρυθμό ροής. Μετά από διαδοχική έκπλυση με αιθανόλη (85%), η έκλουση του DNA πραγματοποιήθηκε με νερό. Μετά την έκλουση κλάσματα DNA είτε συλλέχτηκαν και αξιολογήθηκαν με PCR εκτός ψηφίδας και ηλεκτροφόρηση γέλης, ή το εκλουθέν DNA εισήχθηκε στη μικρορευστονική ψηφίδα ενίσχυσης εξαρτώμενη από την ελικάση (HDA), όπου η ισοθερμική ενίσχυση έλαβε χώρα για 1 ,5 h στους 65 °C. Τα κλάσματα DNA που συλλέχτηκαν αξιολογήθηκαν μέσω ηλεκτροφόρησης γέλης.
Το Σχήμα 5 δείχνει αποτελέσματα της γέλης μετά από ηλεκτροφόρηση από την ολοκλήρωση δύο ή τριών μικροψηφίδων μαζί: Πιο συγκεκριμένα το Σχήμα 5 (α) δείχνει μια εικόνα γέλης μετά από ηλεκτροφόρηση μετά από καθαρισμό DNA από 50 και 5 κύτταρα σαλμονέλας (τη συλλογή των κλασμάτων από την ψηφίδα ακολούθησε PCR για 40 κύκλους μέσω ενός θερμοκυκλοποιητή, χρησιμοποιώντας 1 μl από κάθε κλάσμα σε όλες τις περιπτώσεις). Εδώ ολοκληρώσαμε σε σειρά τη μικροψηφίδα δέσμευσης και λύσης κυττάρων βακτηρίων σαλμονέλας και τη μικροψηφίδα καθαρισμού DNA. Οι λωρίδες στο σχήμα αυτό αντιπροσωπεύουν: τον μάρτυρα μοριακών βαρών (1)' το συλλεγμένο δείγμα που εκλούστηκε μετά από τις δύο μικροψηφίδες σε σειρά για 50 κύτταρα σαλμονέλας (2)<'>και το συλλεγμένο δείγμα που εκλούστηκε μετά από τις δύο μικροψηφίδες σε σειρά για 5 κύτταρα σαλμονέλας (3). Το Σχήμα 5 (β) δείχνει μια εικόνα γέλης μετά από ηλεκτροφόρηση μετά από την ψηφίδα ισοθερμικής ενίσχυσης εξαρτώμενη από την ελικάση (HDA) για 500 κύτταρα σαλμονέλας για 1,5 h στους 65 °C. Εδώ ολοκληρώσαμε τη μικροψηφίδα δέσμευσης και λύσης κυττάρων βακτηρίων σαλμονέλας με τη μικροψηφίδα καθαρισμού DNA και τη μικροψηφίδα ενίσχυσης HDA. Οι λωρίδες στο σχήμα αντιπροσωπεύουν: τον μάρτυρα μοριακών βαρών (1)' και το δείγμα που εκλούστηκε μετά από τις τρεις μικροψηφίδες σε σειρά, από το προϊόν της HDA για 500 κύτταρα σαλμονέλας (2). Όπως φαίνεται στα Σχήματα 5 (α-β) η μικροψηφίδα καθαρισμού DNA παρουσίασε επατυχή ολοκλήρωση με άλλα μικρορευστονικά στοιχεία, καθώς και ικανότητα να καθαρίσει DNA μέχρι και από 5 κύτταρα.
Παράδειγμα 5: Καθαρισμός DNA σαλμονέλας σε μια μικρο-νανοϋφασμένη με πλάσμα μικροψηφίδα από PDMS
Α) Κατασκευή Μικρορευστονικής Ψηφίδας.
Αρχικά, δισκίδια πυριτίου επικαλύφθηκαν με περιστροφή με τη φωτοευαίσθητη ουσία SU-8 2035 (Microchem), που μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αρνητικού τόνου φωτοευαίσθητη ουσία. Δεύτερον, το στρώμα της φωτοευαίσθητης ουσίας εκτέθηκε μέσω μια φωτομάσκας, χρησιμοποιώντας μια πηγή φωτός UV ευρυζωνικής έκθεσης στα 365 nm, δημιουργώντας έτσι μια μήτρα. Μετά αναμίχτηκαν μια βάση προπολυμερούς με τον αντίστοιχο διασταυρωτή του PDMS (Dow Coming, SylgardTM 184) και το τελικό διάλυμα χυτεύτηκε πάνω από τη μήτρα για την αναπαραγωγή του αντίστροφου της μήτρας πάνω στο PDMS και ψήθηκε στους 100 °C για 1 h. Το ελαστομερές υπόστρωμα, που παράχθηκε με αυτόν τον τρόπο, αποκολλήθηκε εύκολα από τη μήτρα. Τα φιλμ PDMS κατεργάστηκαν σε πλάσμα SF6που παράχθηκε σε έναν αντιδραστήρα πλάσματος τύπου-Helicon με αθωράκιστα τα ηλεκτροστατικά πεδία (MET system, Adixen). Στη συνέχεια, οι ψηφίδες PDMS κατεργάστηκαν σε πλάσμα οξυγόνου για 1min για να δημιουργηθεί η δραστικότητα SiO2.Οι συνθήκες ήταν παρόμοιες με αυτές που περιγράφονται στο παράδειγμα 1. Τελικά οι μικροψηφίδες σφραγίστηκαν με ένα κάλυμμα από ελαστομερές PDMS.
Β) Καθαρισμός DNA
Το πρωτόκολλο καθαρισμού DNA που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από τρία βασικά στάδια: α) Ακινητοποίηση του DNA, β) Στάδιο έκπλυσης με αιθανόλη και γ) Έκλουση με νερό. Αρχικά, η μικροψηφίδα προετοιμάστηκε με την εισαγωγή μέσα και από τις δύο εισόδους της ψηφίδας ενός ρυθμιστικού διαλύματος από διάλυμα χαοτροπικού άλατος GuSCN σα ρυθμιστικό διάλυμα κατακρήμνισης/δέσμευσης. Μετά έγινε έγχυση ενός μικρού όγκου προ-καθαρισμένου DNA σαλμονέλας 500ng στην ψηφίδα μέσω της μιας εισόδου, ενώ την ίδια στιγμή ένα ρυθμιστικό διάλυμα χαοτροπικού άλατος GuSCN εισάγεται μέσω της άλλης εισόδου. Στη συνέχεια έγινε έγχυση 70% αιθανόλης μέσω και των δύο εισόδων της ψηφίδας έτσι ώστε να απομακρυνθούν οι προσμίξεις. Σαν τελευταίο βήμα, νερό εισήχθηκε μέσω και των δύο εισόδων έτσι ώστε να αντιστραφεί η ακινητοποίηση του DNA και να εκλουστεί.
Παράδειγμα 6: Καθαρισμός DNA σαλμονέλας σε φρέσκες και θερμικά σταθεροποιημένες μικρο-νανοΰφασμένες με πλάσμα πολυμερικές μικροψηφίδες Οι επιφάνειες από ΡΜΜΑ των μικροψηφίδων μικρο-νανοϋφάνθηκαν όπως περιγράφεται στο παράδειγμα 1 και σταθεροποιήθηκαν με ανόπτηση στους 110 °C για 30 min. Οι σταθεροποιημένες οργανικές πολυμερικές μικροψηφίδες χρησιμοποιήθηκαν μετά από 4 μήνες με το πρωτόκολλο καθαρισμού DNA σαλμονέλας που περιγράφεται στο παράδειγμα 1 και συγκρίθηκαν με φρέσκες κατασκευασμένες μικροψηφίδες.
Το Σχήμα 6 δείχνει το σήμα απορρόφησης UV στα 260 nm (σχετική στα 340 nm) του εκλουόμενου DNA σαλμονέλας (500ng) ως προς τον χρόνο για (α) μια θερμικά σταθεροποιημένη μικροψηφίδα στους 110°C για 30 min και (β) μια φρέσκια κατασκευασμένη μικροψηφίδα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6 οι σταθεροποιημένες μικροψηφίδες παρουσιάζουν τα ίδια αποτελέσματα δηλ. απορρόφηση και ως εκ τούτου απόδοση, με τις φρέσκες κατασκευασμένες ψηφίδες όταν ακολουθείται το ίδιο πρωτόκολλο καθαρισμού DNA. Επομένως, οι θερμικά σταθεροποιημένες μικροψηφίδες παρέχουν σταθερότητα στην πάροδο του χρόνου δηλ. μεγάλο χρόνο ζωής, και μπορούν να χρησιμοποιηθούν και μετά από μακρά χρονική περίοδο χρόνου.
Claims (9)
1. Μια μικρορευστονική ψηφίδα που περιλαμβάνει μια πολυμερική επιφάνεια και έναν παθητικό μικροαναμίκτη, όπου η πολυμερική επιφάνεια είναι μικρο-νανοϋφασμένη με πλάσμα που περιέχει οξυγόνο κάτω από ανισοτροπικές συνθήκες εγχάραξης, παρουσία παρεμποδιστών εγχάραξης προερχόμενων από την ιονοβολή από τα τοιχώματα ή τα ηλεκτρόδια του αντιδραστήρα πλάσματος.
2. Μια μικρορευστονική ψηφίδα σύμφωνα με την αξίωση 1, όπου η μικρορευστονική ψηφίδα μετά την μικρο-νανοΰφανση με πλάσμα υποβάλλεται σε ένα βήμα θερμικής ανόπτησης με θέρμανση για 10-120 min σε θερμοκρασία 5 έως 40 °C χαμηλότερη από τη θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης του πολυμερούς της πολύ μερικής επιφάνειας.
3. Μια μικρορευστονική ψηφίδα σύμφωνα με τις αξιώσεις 1 ή 2, όπου η μικρονανοΰφανση με πλάσμα που περιέχει οξυγόνο έπεται της μικρο-νανοΰφανσης με πλάσμα που περιέχει φθόριο.
4. Μια μικρορευστονική ψηφίδα σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις προηγούμενες αξιώσεις, όπου το πολυμερές της πολυμερικής επιφάνειας επιλέγεται από την ομάδα που αποτελείται από πολυμερή ή συμπολυμερή που περιέχουν ακρυλικά, ή ολεφινικά, ή φαινολικά μονομερή, σιλικόνες ή μονομερή που περιέχουν πυρίτιο.
5. Μια μικρορευστονική ψηφίδα σύμφωνα με την αξίωση 4, όπου το πολυμερές της πολυμερικής επιφάνειας επιλέγεται από την ομάδα που αποτελείται από πολυ(μεθακρυλικό μεθυλεστέρα) (ΡΜΜΑ), πολυ(διαιθεροκετόνη) (PEEK), συμπολυμερές κυκλοολεφίνης (COC), πολυμερές κυκλοολεφίνης (COP), πολυ(τερεφθαλικό αιθυλενεστέρα) (ΡΕΤ), πολυστυρένιο (PS), πολυανθρακικό (PC).
6. Μια μικρορευστονική ψηφίδα σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις προηγούμενες αξιώσεις, όπου μετά τη μικρο-νανοΰφανση με το πλάσμα που περιέχει οξυγόνο, ένα στρώμα από υλικό εκχύλισης στερεάς κατάστασης εναποτίθεται πάνω στην πολυμερική επιφάνεια, με το υλικό της εκχύλισης στερεάς κατάστασης να επιλέγεται από την ομάδα που αποτελείται από SiO2, TiO2, ΖrO2, Αl2O3, άλλο οξείδιο του μετάλλου, αμίνη.
7. Χρήση μιας μικρορευστονικής ψηφίδας σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1-6 για καθαρισμό DNA.
8. Χρήση μιας μικρορευστονικής ψηφίδας σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1-6 για βακτηριακή ανάλυση από δείγμα που ελήφθη από ζωντανό οργανισμό, από δείγμα τροφίμων ή περιβαλλοντικό δείγμα.
9. Ένα σύστημα μικροεργαστηρίου σε ψηφίδα (lab-on-a-chip) που περιλαμβάνει μια μικρορευστονική ψηφίδα σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 1-6.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20150100398A GR1009425B (el) | 2015-09-09 | 2015-09-09 | Μικρο-νανοδομημενη με πλασμα πολυμερικη μικρορευστονικη διαταξη για καθαρισμο νουκλεϊκων οξεων |
| EP16386017.4A EP3141298B1 (en) | 2015-09-09 | 2016-09-08 | Polymeric microfluidic device for nucleic acid purification fabricated via plasma micro-nanotexturing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20150100398A GR1009425B (el) | 2015-09-09 | 2015-09-09 | Μικρο-νανοδομημενη με πλασμα πολυμερικη μικρορευστονικη διαταξη για καθαρισμο νουκλεϊκων οξεων |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| GR20150100398A GR20150100398A (el) | 2017-05-15 |
| GR1009425B true GR1009425B (el) | 2019-01-15 |
Family
ID=55538282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| GR20150100398A GR1009425B (el) | 2015-09-09 | 2015-09-09 | Μικρο-νανοδομημενη με πλασμα πολυμερικη μικρορευστονικη διαταξη για καθαρισμο νουκλεϊκων οξεων |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3141298B1 (el) |
| GR (1) | GR1009425B (el) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR20190100415A (el) * | 2019-09-25 | 2021-04-16 | Nanoplasmas Private Company | Διαγνωστικη μικρορευστονικη διαταξη για την αναλυση της παρουσιας βακτηριων σε υγρα ή στερεες επιφανειες |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111389472B (zh) * | 2020-03-23 | 2021-08-17 | 南京工业职业技术学院 | 一种电纺直写多层微流控芯片制备装置及制备方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5705628A (en) | 1994-09-20 | 1998-01-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | DNA purification and isolation using magnetic particles |
| EP1893739A2 (en) * | 2005-06-10 | 2008-03-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | Recirculating microfluidic device and methods of use |
| GR1006890B (el) | 2005-09-16 | 2010-07-19 | Ευαγγελος Γογγολιδης | Μεθοδος για την κατασκευη επιφανειων μεγαλου επιφανειακου λογου και μεγαλου λογου ασυμμετριας σε υποστρωματα. |
| WO2008150826A1 (en) | 2007-05-31 | 2008-12-11 | Ge Healthcare Uk Limited | Modified spin column for simple and rapid plasmid dna extraction |
| GR1006618B (el) | 2008-06-13 | 2009-12-03 | Εθνικο Κεντρο Ερευνας Φυσικων Επιστημων (Εκεφε) "Δημοκριτος" | Μεθοδος για την κατασκευη περιοδικων δομων σε πολυμερη με διεργασιες πλασματος |
| KR101355994B1 (ko) * | 2011-11-22 | 2014-01-29 | 한국과학기술원 | 병원체 검출용 마이크로디바이스 |
| GR1009056B (el) * | 2014-03-12 | 2017-06-23 | Εθνικο Κεντρο Ερευνας Φυσικων Επιστημων (Εκεφε) "Δημοκριτος" | Νανοδομημενα με ηλεκτρικες εκκενωσεις πλασματος υποστρωματα για επιλεκτικο εμπλουτισμο καρκινικων κυτταρων |
-
2015
- 2015-09-09 GR GR20150100398A patent/GR1009425B/el active IP Right Grant
-
2016
- 2016-09-08 EP EP16386017.4A patent/EP3141298B1/en active Active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR20190100415A (el) * | 2019-09-25 | 2021-04-16 | Nanoplasmas Private Company | Διαγνωστικη μικρορευστονικη διαταξη για την αναλυση της παρουσιας βακτηριων σε υγρα ή στερεες επιφανειες |
| GR1010186B (el) * | 2019-09-25 | 2022-03-02 | Nanoplasmas Private Company, | Διαγνωστικη ψηφιδα για την αναλυση της παρουσιας βακτηριων σε ενα δειγμα |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3141298A1 (en) | 2017-03-15 |
| GR20150100398A (el) | 2017-05-15 |
| EP3141298B1 (en) | 2020-08-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nagai et al. | Development of a microchamber array for picoliter PCR | |
| Kim et al. | Fabrication and characterization of a PDMS–glass hybrid continuous-flow PCR chip | |
| McCalla et al. | Microfluidic reactors for diagnostics applications | |
| US9709469B2 (en) | Valveless microfluidic device | |
| Waters et al. | Microchip device for cell lysis, multiplex PCR amplification, and electrophoretic sizing | |
| Wen et al. | Purification of nucleic acids in microfluidic devices | |
| Chang et al. | Nucleic acid amplification using microfluidic systems | |
| Cao et al. | Chitosan as a polymer for pH-induced DNA capture in a totally aqueous system | |
| Wu et al. | Integrated glass microdevice for nucleic acid purification, loop-mediated isothermal amplification, and online detection | |
| Kastania et al. | Plasma micro-nanotextured polymeric micromixer for DNA purification with high efficiency and dynamic range | |
| Witek et al. | 96-well polycarbonate-based microfluidic titer plate for high-throughput purification of DNA and RNA | |
| US20120077260A1 (en) | Reservoir-buffered mixers and remote valve switching for microfluidic devices | |
| Tsougeni et al. | A modular integrated lab-on-a-chip platform for fast and highly efficient sample preparation for foodborne pathogen screening | |
| KR20050088476A (ko) | 병원균 검출과 분석을 위한 방법과 기구 | |
| WO2010019969A1 (en) | Device for rapid identification of nucleic acids for binding to specific chemical targets | |
| WO2006085948A2 (en) | Real-time pcr detection of microorganisms using an integrated microfluidics platform | |
| US20220297128A1 (en) | Single cell whole genome amplification via micropillar arrays under flow conditions | |
| Thaitrong et al. | Integrated capillary electrophoresis microsystem for multiplex analysis of human respiratory viruses | |
| Choi et al. | All-in-one pumpless portable genetic analysis microsystem for rapid naked-eye detection | |
| US20130130364A1 (en) | Microdevice for pathogen detection | |
| Xu et al. | Air bubble resistant and disposable microPCR chip with a portable and programmable device for forensic test | |
| EP3141298B1 (en) | Polymeric microfluidic device for nucleic acid purification fabricated via plasma micro-nanotexturing | |
| Olsen et al. | Integrated microfluidic selex using free solution electrokinetics | |
| GR20190100415A (el) | Διαγνωστικη μικρορευστονικη διαταξη για την αναλυση της παρουσιας βακτηριων σε υγρα ή στερεες επιφανειες | |
| Lee et al. | 3D Porous sol–gel matrix incorporated microdevice for effective large volume cell sample pretreatment |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PG | Patent granted |
Effective date: 20190404 |