GR1010186B - Διαγνωστικη ψηφιδα για την αναλυση της παρουσιας βακτηριων σε ενα δειγμα - Google Patents

Διαγνωστικη ψηφιδα για την αναλυση της παρουσιας βακτηριων σε ενα δειγμα Download PDF

Info

Publication number
GR1010186B
GR1010186B GR20190100415A GR20190100415A GR1010186B GR 1010186 B GR1010186 B GR 1010186B GR 20190100415 A GR20190100415 A GR 20190100415A GR 20190100415 A GR20190100415 A GR 20190100415A GR 1010186 B GR1010186 B GR 1010186B
Authority
GR
Greece
Prior art keywords
bacteria
sample
mosaic
microfluidic
detection
Prior art date
Application number
GR20190100415A
Other languages
English (en)
Other versions
GR20190100415A (el
Inventor
Αθηνα Στυλιανου Καστανια
Αικατερινη Κωνσταντινου Τσουγενη
Γεωργια Δημητριου Καπρου
Κοσμας Νικολαου Ελληνας
Αγγελικη Δημητριου Τσερεπη
Ευαγγελος Μιχαηλ Γογγολιδης
Χρηστος-Μορτις Λουκας
Original Assignee
Nanoplasmas Private Company,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanoplasmas Private Company, filed Critical Nanoplasmas Private Company,
Priority to GR20190100415A priority Critical patent/GR1010186B/el
Priority to EP20386048.1A priority patent/EP3798320A1/en
Publication of GR20190100415A publication Critical patent/GR20190100415A/el
Publication of GR1010186B publication Critical patent/GR1010186B/el

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6846—Common amplification features
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56922—Campylobacter
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56938—Staphylococcus
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/10—Integrating sample preparation and analysis in single entity, e.g. lab-on-a-chip concept
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/06—Valves, specific forms thereof
    • B01L2400/0688—Valves, specific forms thereof surface tension valves, capillary stop, capillary break
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B05—SPRAYING OR ATOMISING IN GENERAL; APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D—PROCESSES FOR APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D1/00—Processes for applying liquids or other fluent materials
    • B05D1/62—Plasma-deposition of organic layers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B05—SPRAYING OR ATOMISING IN GENERAL; APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D—PROCESSES FOR APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D5/00—Processes for applying liquids or other fluent materials to surfaces to obtain special surface effects, finishes or structures
    • B05D5/08—Processes for applying liquids or other fluent materials to surfaces to obtain special surface effects, finishes or structures to obtain an anti-friction or anti-adhesive surface
    • B05D5/083—Processes for applying liquids or other fluent materials to surfaces to obtain special surface effects, finishes or structures to obtain an anti-friction or anti-adhesive surface involving the use of fluoropolymers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/205—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Campylobacter (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/245—Escherichia (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/25—Shigella (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/255—Salmonella (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/28—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Vibrionaceae (F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/32—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Bacillus (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/33—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Clostridium (G)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Μία μικρορευστομηχανική διάταξη για τη δέσμευση των βακτηρίων και την υπερταχεία και με υψηλή ευαισθησία ανάλυση της παρουσίας βακτηρίων σε ένα υγρό δείγμα. Η ανάλυση βασίζεται στη δέσμευση και λύση ζώντων βακτηρίων σε λυοφιλοποιημένες και ενεργοποιημένες με αντισώματα ψηφίδες, στην ενίσχυση του DNA και στην οπτική ανίχνευση.

Description

Διαγνωστική ψηφίδα για την ανάλυση της παρουσίας βακτηρίων σε ένα δείγμα
Το πεδίο της εφεύρεσης
Η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται με την ανάπτυξη μικρορευστομηχανικών διατάξεων, με τις οποίες επιτυγχάνεται δέσμευση βακτηρίων καθώς και υπερταχεία και ευαίσθητη ανίχνευσή τους σε δείγματα. Αυτές οι συσκευές διαγνωστικού μικροεργαστηρίου σε ψηφίδα μπορεί να είναι επωφελείς και εφαρμόσιμες σε αναλύσεις ιατρικών και περιβαλλοντικών δειγμάτων καθώς και σε αναλύσεις τροφίμων.
Προϋπάρχουσα γνώση και υπόβαθρο της εφεύρεσης
Ο διαγνωστικός έλεγχος είναι ένας ταχέως εξελισσόμενος τομέας που επικεντρώνεται στην πρόγνωση, την πρόβλεψη και την πρόληψη ασθενειών, λοιμώξεων ή άλλων κινδύνων για την υγεία. Παρά το γεγονός ότι οι εργαστηριακές εξετάσεις αντιπροσωπεύουν το 3% των συνολικών δαπανών για υγειονομική περίθαλψη, επηρεάζουν περισσότερο από το 70% των ιατρικών αποφάσεων παγκοσμίως. Οι περισσότερες προσπάθειες έρευνας και εμπορευματοποίησης μέχρι σήμερα, έχουν επικεντρωθεί στον τομέα της ιατρικής / υγείας. Ωστόσο, τα τρόφιμα και το νερό είναι αποτελούν επίσης κρίσιμους τομείς που απαιτούν διάγνωση, καθώς παγκοσμίως εμφανίζονται όλο και περισσότερες ασθένειες και σοβαρές δηλητηριάσεις που σχετίζονται με τα τρόφιμα. Το νερό θεωρείται ως «τρόφιμο» σύμφωνα με τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 178/2002 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου για τον καθορισμό των γενικών αρχών και απαιτήσεων της νομοθεσίας για τα τρόφιμα. Οι λοιμώξεις που προκαλούνται από τρόφιμα και νερό οφείλονται κυρίως στην παρουσία βακτηρίων. Πράγματι, περισσότερο από το 90% των περιπτώσεων τροφικής δηλητηρίασης προκαλούνται από 13 βακτήρια, συμπεριλαμβανομένων των: Clostridium Perfringens, Staphylococcus Aureus, Vibrio spp. (μεταξύ των οποίων V. cholerae and V. parahaemolyticus), B. cereus, Salmonella spp., Clostridium Botulinum, Shigella spp., τοξικογενής E. coli (ETEC and EHEC), και συγκεκριμένα είδη Campylobacter, Yersinia, Listeria, and Aeromonas. Τα βακτήρια αυτά απαντώνται συνήθως σε πολλά ωμά τρόφιμα και ακόμα και μικρός αριθμός των βακτηρίων μπορεί να προκαλέσει ασθένεια. Επιπλέον, πρακτικά ο ίδιος κατάλογος βακτηρίων παρουσιάζει ενδιαφέρον και στην ιατρική, όπου συχνά αναλύονται δείγματα ούρων και αίματος, προκειμένου να ελέγχεται η παρουσία τέτοιων βακτηρίων και να συνταγογραφείται η κατάλληλη θεραπεία με αντιβιοτικά. Η ανάγκη για γρήγορη ανίχνευση εντοπίζεται επίσης στα σωματικά υγρά με σκοπό να συνταγογραφούνται αντιβιοτικά ειδικά για το εκάστοτε βακτήριο, αντί για αντιβιοτικά γενικής χρήσης.
Ένα παράδειγμα που καταδεικνύει την αναγκαιότητα της γρήγορης και ακριβούς ανίχνευσης βακτηρίων, αποτελεί η λεγιονέλλα (Legionella), η οποία πρόσφατα αναδείχθηκε από την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας (http ://ecdc . europa. eu/en/datatools/Page s/ho me . aspx : http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs285/en/) ως ο υψηλότερος κίνδυνος για την υγεία από όλους τους υδατογενείς παθογόνους οργανισμούς στην Ευρωπαϊκή Ένωση και πολλά κρούσματα αναφέρονται ανά τον κόσμο κάθε χρόνο. Η Legionella εντοπίζεται σε μία πληθώρα συστημάτων, μεταξύ των οποίων συμπεριλαμβάνονται συστήματα ζεστού και κρύου νερού (τόσο μεγάλα συστήματα που εξυπηρετούν δημόσια κτίρια και μικρά συστήματα στα σπίτια των ανθρώπων), πύργοι ψύξης και ορισμένες μορφές συστημάτων κλιματισμού, πλοία, αεροπλάνα και τρένα, σιντριβάνια, τρόφιμα, υδρομασάζ, ακόμη και πλυντήρια αυτοκινήτων (A. Edagawa, et al., Journal of Applied Microbiology, 2008, 105, 2104-2114). Η μόλυνση προκαλείται κατά την εισπνοή αέρα, ο οποίος περιέχει σταγονίδια νερού μολυσμένα με βακτήρια και μπορεί να προκαλέσει μέχρι και θάνατο σε περίπου 15-20% των περιπτώσεων. Υπό τις κατάλληλες συνθήκες, τα βακτήρια Legionella μπορούν να διπλασιαστούν σε αριθμό κάθε 90 λεπτά, γεγονός που υποδηλώνει ότι ένας πολύ χαμηλός αριθμός βακτηρίων μπορεί να αυξηθεί κατά χιλιάδες φορές σε μία ή δύο ημέρες (Ν. Ishizaki, et al., Microbiology and Immunology, 2016, 60, 203-208). Προκειμένου να αποφευχθούν οι εκδηλώσεις κρουσμάτων και οι θάνατοι, το Ευρωπαϊκό Κέντρο Πρόληψης και Ελέγχου Νοσημάτων συνιστά να εφαρμόζονται τακτικοί έλεγχοι και λαμβάνονται κατάλληλα μέτρα σε ανθρωπογενή συστήματα ύδρευσης, για την πρόληψη κρουσμάτων της νόσου των λεγεωνάριων σε κέντρα αναψυχής, χώρους τουριστικών καταλυμάτων, νοσοκομεία, εγκαταστάσεις χρόνιας υγειονομικής περίθαλψης ή και σε άλλους πολυσύχναστους χώρους. Μέχρι σήμερα, με τις πρότυπες μεθόδους ανάλυσης (συμβατική καλλιέργεια βακτηρίων, όπως το ISO 11731 για την Legionella) για τα περισσότερα βακτήρια (π.χ. Salmonella, Campylobacter και Legionella) απαιτούνται αρκετές ημέρες (~ 3, 7 και 12 αντίστοιχα) για την εξαγωγή θετικών ή αρνητικών αποτελέσματα σε πιθανώς μολυσμένα δείγματα (Μ. Steinert, et al., Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63, 2047-2053). Αυτή η μεγάλη καθυστέρηση μεταξύ της δειγματοληψίας και της απάντησης και κατ’επέκταση η αραιή δειγματοληψία δεν επιτρέπει την έγκαιρη ανάληψη δράσης για την πρόληψη κρουσμάτων που οφείλονται σε παθογόνους παράγοντες σε εγκαταστάσεις δημόσιου ενδιαφέροντος.
Τις τελευταίες δεκαετίες γίνονται προσπάθειες ανάπτυξης ταχύτερων μεθόδων οι οποίες θα παρέχουν πιο αποτελεσματική διάγνωση παθογόνων παραγόντων στο νερό (J. Mairhofer, et al., Sensors, 2009, 9, 4804-4823). Παρ 'όλα αυτά, δύο από τα πιο δύσκολα ζητήματα, μεταξύ των οποίων 1) ο περιορισμός της προετοιμασίας του δείγματος/ προσυγκέντρωσης και 2) η ευαισθησία των μεθόδων ανίχνευσης παρέμειναν άλυτα. Επομένως, απαιτούνται απλές, γρήγορες, ακριβείς, φθηνές, φορητές και εύχρηστες μέθοδοι για ανίχνευση παθογόνων παραγόντων σε δείγματα νερού, σε πραγματικό χρόνο, κατόπιν αιτήσεως. Αυτό απαιτεί περαιτέρω πρόοδο και προσαρμογή των νέων επαναστατικών τεχνολογιών στην εύκολη και ταχεία διάγνωση των υδατογενών παθογόνων, κάτι το οποίο πέτυχε η παρούσα εφεύρεση να καλύψει.
Η ανάπτυξη της μικρο/νανοτεχνολογίας και ιδιαίτερα των μικρορευστομηχανικών διατάξεων καθώς και των μικροεργαστηρίων σε ψηφίδα (labon-chip) συνεπάγεται πολλά πλεονεκτήματα όπως η μείωση του χρόνου της ανάλυσης, η μείωση του όγκου των δειγμάτων και αντιδραστηρίων, ο χαμηλός κίνδυνος μόλυνσης, η αυτοματοποίηση, το χαμηλό κόστος και η συμβατότητα με τις downstream διεργασίες (Κ. Kant, et al., Biotechnology Advances, 2018, 36, 4, 1003-1024). H τεχνολογία των μικροεργαστηρίων σε ψηφίδα παρέχει τη δυνατότητα ολοκληρωμένης ανάλυσης του δείγματος σε μία ψηφίδα: από την προετοιμασία του δείγματος μέχρι το τελικό προϊόν (σε περιπτώσεις σύνθεση ή καθαρισμού προϊόντων) ή την τελική ανίχνευση (σε περιπτώσεις ανάλυσης προϊόντων). Τα τελευταία χρόνια, εντατικές μελέτες σχετικές με μικρορευστομηχανικά συστήματα έχουν οδηγήσεις στην ανάπτυξη πολύ σημαντικών εργαλείων για διαγνωστικούς σκοπούς. Αυτή η πρόοδος οφείλεται στα πλεονεκτήματα που σχετίζονται με τη σμίκρυνση των συσκευών, όπως είναι η αυξημένη ευαισθησία και εξειδίκευση, ο αυτοματισμός, η φορητότητα, η ευελιξία στο σχεδίασμά, η πολλαπλή και παράλληλη ανίχνευση δειγμάτων, η μείωση χειρισμού επικίνδυνων υλικών και η εξοικονόμηση χρόνου και κόστους (S. Kumar, et al., Biotechnology Journal, 2013, 8, 1267-1279; K.F. Lei, Journal of Laboratory Automation 2012, 17, 330-47; S. Tasoglu, et al., Chemical Society Reviews, 2013, 42, 5788-808). Επιπρόσθετα, όλες οι αναλυτικές διεργασίες, όπως η προετοιμασία του δείγματος, ο διαχωρισμός, οι χημικές αντιδράσεις και η ποσοτικοποίηση σε πραγματικό χρόνο μπορούν να ενσωματωθούν σε μία μικρορευστομηχανική διάταξη για επιτόπιες αναλύσεις (R. Wang, et al., Analytica Chimica Acta, 2015, 853, 710-717).
Στη βιβλιογραφία αναφέρεται πληθώρα μικρορευστομηχανικών διατάξεων οι οποίες έχουν αναπτυχθεί για διαγνωστικούς σκοπούς, με χρήση διαφόρων τεχνικών (C. Duarte, et al., Biomedical Microdevices, 2013, 15, 821-830; K.F. Lei, Journal of Laboratory Automation, 2012, 17, 330-47; J. Mairhofer, et al., Sensors (Switzerland), 2009, 9, 4804-4823; S. Tasoglu, et al., Chemical Society Reviews, 2013, 42, 5788-808; M. Kim, et al., Biosensors and Bioelectronics, 2015, 74, 1011-1015; M. Jimenez, et al., Journal of Microbiological Methods, 2016, 126, 8-11; N. Yamaguchi, et al., Scientific Reports, 2017, 7, 3092; G. Huang, et al., Scientific Reports, 2017, 7: 6441). Ωστόσο, η ανάπτυξη μεθόδων στηριζόμενων σε μικρορευστομηχανικές διατάξεις για την ανίχνευση παθογόνων βακτηρίων σε νερό ή άλλα υγρά (Helen Bridle, Brian Miller, Marc P.Y. Desmulliez, Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring: A review, Water Research, 55, 2014, 256-271) αντιμετωπίζει πολλές προκλήσεις λόγω των περιορισμών που σχετίζονται με την ενσωμάτωση διαφόρων κρίσιμων σταδίων, όπως η προεπεξεργασία δειγμάτων, οι διαδικασίες ανίχνευσης και η ανίχνευση σε μία ενιαία μικρορευστομηχανική ψηφίδα (Τ.-Η. Kim, et al., Analytical Chemistry, 2014, 86, 3841-3848). Επιπλέον, η απαίτηση μικρού όγκου δείγματος στα κανάλια των μικρορευστομηχανικών διατάξεων μπορεί να προκαλέσει ορισμένα εμπόδια όσον αφορά την επιθυμητή ευαισθησία, την επιλεκτικότητα και τη σταθερότητα των μικρορευστομηχανικών αισθητήρων.
Ανάμεσα στις διαφορετικές ισοθερμικές τεχνικές ενίσχυσης του DNA, η LAMP ξεχωρίζει λόγω της γρήγορης ενίσχυσης, της απλής λειτουργίας της, της ευρωστίας (robustness) καθώς και της υψηλής ευαισθησίας και ειδικότητας (Μ. Parida, et al., Reviews in medical virology, 2008, 18, 407-421). H LAMP παρουσιάζει μεγαλύτερη εξειδίκευση από την PCR, καθώς στη LAMP χρησιμοποιούνται τέσσερις έως έξι διαφορετικοί εκκινητές, οι οποίοι προσδένονται σε διαφορετικά σημεία του κλώνου εκμαγείου (Ρ. Craw, et al., Lab Chip, 2012, 12, 2469-2486). Κατά τη LAMP η ενίσχυση του DNA πραγματοποιείται σε θερμοκρασίες μεταξύ 60-66°C μέσω μόχλευσης της Bst πολυμεράσης με υψηλή δραστικότητα μετατόπισης κλώνου (Τ. Notomi, et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28, E63; N. A. Tanner, et al., Current protocols in molecular biology, 2014, 105, Unit 15.14).
Λόγω της ανάπτυξης διαφόρων συσκευών μικροεργαστηρίου σε ψηφίδα (Ρ. J. Asiello, et al., Lab Chip, 2011, 11, 1420-1430; L. Zanoli, et al., Biosensors, 2013, 3, 18; D.M. Tourlousse, et al., Biomedical Microdevices, 2012, 14, 769-778; X. Fang, et al., Analytical Chemistry, 2010, 82, 3002-3006; C. H. Wang, et al., Lab Chip, 2011, 11, 1521-1531), κατασκευάστηκαν διαγνωστικές πλατφόρμες, οι οποίες βασίζονται σε νουκλεϊκά οξέα, πολλές από τις οποίες είναι εμπορικά διαθέσιμες (Eicken Chemicals, SAS Loopamp Realtime, Turbidimeter LA-320C, http ://www .uib. no/med/a vd/ii/nyhetsbrev/2010/15/T urbidimeter.pdf) ; Eiken Chemicals, LA-500, http://loopamp.eiken.co.jp/e/products/la500/img/02.pdf); Meridianbio science, Meridian illumipro-10™, http://www.meridianbioscience.eom/Content/Assets/Files/2.l%20%20C.%20diffieile %20Products/illumigene%20C.%20dificile/illumigene%20technology%20page/illum igene product folder.pdf); SMART, Smart-DART™ 8-Well V.3.0 http://diagenetix.com/smart-dart-platform/); Optigene, Genie II., http://www.optigene.co.uk/instruments/instrument-genie-ii/); Optigene, Genie III., http://www.optigene.co.uk/instruments/instrument-genie-iii/); QIAGEN, ESEQuant Tube Scanner, http://www. qiagen.com/resources/download. asp ?id=3bf98195-8fe6-4bll-aadfb2499a920461&lang=en). Η ανίχνευση στις πλατφόρμες αυτές γίνεται κυρίως μέσω φθορισμού ή θολοσιμετρίας, το κόστος ανάλυσης κυμαίνεται στα 2 - 80 $ ανά ανάλυση, ενώ το κόστος ανάγνωσης ποικίλει από 2500 έως 25000 $. Σημαντικά χαρακτηριστικά των μεθόδων είναι ο χρόνος ανίχνευσης, το όριο ανίχνευσης (LOD), το εύρος ανίχνευσης και η εξειδίκευση. Το όριο ανίχνευσης κυμαίνεται από 10<2>-10<5>CFU/mL και ο χρόνος ανίχνευσης από 20 λεπτά έως 6 ώρες (Υ. Sun, et al., Lab Chip, 2015, 15, 1898-1904; W. B. Valderrama, et al., Critical reviews in food science and nutrition, 2016, 56, 1519-1531; Y. Wang, et al., Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2016, 15, 183-205; J. Y. Yoon, et al., Sensors (Basel), 2012, 12, 10713-10741). Οι περισσότερες μέθοδοι που διατίθενται σήμερα βασίζονται κυρίως στην καλλιέργεια των βακτηρίων και προσφέρονται ως υπηρεσίες που παρέχουν το σετ δειγματοληψίας, ενώ τα αποτελέσματα είναι διαθέσιμα μετά από μερικές ημέρες. Οι ολιγάριθμες εμπορικά διαθέσιμες συσκευασίες (Industrial Test Systems, Inc., AquaVial Water Test Kit For Bacteria- Single Pack aqua safe) χαρακτηρίζονται από όρια ανίχνευσης, τα οποία δεν επαρκούν για παράδειγμα για την ανίχνευση της Legionella σύμφωνα με τα όρια που θα οριστούν από την καινούρια νομοθεσία ((< 100cfu/ 100ml), EU directive: Brussels, 1.2.2018, Proposal for a DIRECTIVE OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL on the quality of water intended for human consumption (recast)). Η εμπορικά διαθέσιμη συσκευασία της Lovibond (Lovibond® Hydrosense Legionella Field Test Kit) βασίζεται στην ανοσοανάλυση και είναι διαθέσιμη από τη Novatech International (http://www.novatech-usa.com/Products/).
Η ομάδα μας παρουσίασε πρόσφατα δύο φορητά πρωτότυπα μικρο-νανοβιοσυστήματα με δύο διαφορετικές διαμορφώσεις ψηφίδων για εξαιρετικά γρήγορη ανάλυση παθογόνων μικροοργανισμών στα τρόφιμα, στοχεύοντας στην αντιμετώπιση κρουσμάτων ασθενειών που σχετίζονται με τα τρόφιμα (G. Papadakis, et al., Biosensors and Bioelectronics, 2018, 111, 52-58). Στο πρώτο μικροεργαστήριο σε ψηφίδα πραγματοποιήθηκε ανοσοχημική δέσμευση σε μαγνητικά σφαιρίδια και τα περισσότερα βήματα της ανάλυσης εκτελέστηκαν χειροκίνητικα εκτός της ψηφίδας, ενώ στο δεύτερο μικροεργαστήριο σε ψηφίδα όλα τα βήματα κατεργασίας του δέιγματος πραγματοποιήθηκαν στην ψηφίδα, συμπεριλαμβανομένων α) τη δέσμευση των βακτηρίων, β) τη λύση των βακτηρίων, γ) την ενίσχυση του DNA και δ) την ανίχνευση τεσσάρων διαφορετικών βακτηρίων μέσω ακουστικού αισθητήρα. Σε μια πρόσφατη δημοσίευση, επιδείξαμε επίσης μια ολοκληρωμένη πλατφόρμα μικροεργαστηρίου σε ψηφίδα, όπου πραγματοποιείται δέσμευση βακτηρίων, θερμική λύση, καθαρισμός DNA, ισοθερμική ενίσχυση DNA (HDA) και ανίχνευση των βακτηρίων εκτός της ψηφίδας, μετά τη συλλογή διαδοχικών εκλουόμενων εκροών DNA χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής για την εκτέλεση της προετοιμασίας του δείγματος σε λιγότερο από 86 λεπτά (Κ. Tsougeni, et al., Sensors and Actuators B: Chemical, 2019, 288, 171-179).
Σε όλες τις μικρορευστομηχανικές διατάξεις, μία μικρορευστομηχανική συσκευή για την κατεργασία του δείγματος συνδέεται σε μία περιοχή ανίχνευσης ή έναν αισθητήρα τοποθετημένο σε διαφορετική περιοχή στο ίδιο υπόστρωμα ή ετερογενώς ενσωματωμένη σε ένα διαφορετικό υπόστρωμα. Υπάρχουν πολλές μέθοδοι ανίχνευσης και αισθητήρες, όπως ηλεκτροχημικοί αισθητήρες, αισθητήρες χωρητικότητας και αγωγιμότητας καθώς και διάφοροι οπτικοί αισθητήρες, στους οποίους η ανίχνευση γίνεται μέσω φθορισμού και μέτρησης θολότητας ή και χρωματικά βάσει της αλλαγής της απορρόφησης του φωτός. Οι μέθοδοι που στηρίζονται σε χρωματική αλλαγή είναι εύχρηστες και συχνά η αλλαγή αυτή μπορεί να παρατηρηθεί με γυμνό μάτι. Συνήθως, οι μέθοδοι αυτές στηρίζονται στην ενίσχυση του φθορισμού μέσω νανοσωματιδίων προκειμένου η αλλαγή να είναι ορατή με γυμνό μάτι (L. Zheng, et al., Biosensors and Bioelectronics, 2019, 124-125, 143-149). Σπανίως, χρησιμοποιείται απλή χρωματική αλλαγή, η οποία βασίζεται στην οπτική απορρόφηση, ωστόσο στην περίπτωση αυτή απαιτείται μια σημαντική οπτική διαδρομή (χιλιοστά), η οποία δεν είναι εύκολη στη χρήση απευθείας σε μία μικρορευστομηχανική ψηφίδα που έχει βάθος δεκάδες έως μερικές εκατοντάδες μπι. Ως εκ τούτου, τυπικά, τα δείγματα κατευθύνονται σε κάποιο τύπο φρεατίου ή μεγάλου μικροαντιδραστήρα, όπου το βάθος είναι αρκετό ώστε να επιτρέπεται η οπτική παρατήρηση (Κ. Kadimisetty, et al., Biosensors and Bioelectronics, 2018, 109, 156-163; A. Sayad, et al., Biosensors and Bioelectronics, 2018, 100, 96-104). Συνεπώς, τα μικρορευστομηχανικά συστήματα κατεργασίας δειγμάτων δεν χρησιμοποιούνται για ανίχνευση μέσω απορρόφησης και αλλαγής χρώματος.
Σύνοψη της εφεύρεσης
Η παρούσα εφεύρεση παρουσιάζει μία διαγνωστική μικρορευστομηχανική ψηφίδα για ανάλυση νερού και άλλων υγρών ή στερεών επιφανειών, με την οποία επιτυγχάνεται εξαιρετικά γρήγορη, ευαίσθητη, εξαιρετικά ειδική και ακριβής ανίχνευση βακτηρίων. Η παρούσα εφεύρεση επιδεικνύει ανταγωνιστικά πλεονεκτήματα, όπως η χαμηλή κατανάλωση αντιδραστηρίων, το χαμηλό κόστος, η δυνατότητα μεταφοράς και διαθεσιμότητας, η δυνατότητα διάκρισης ζωντανών και νεκρών παθογόνων παραγόντων, η αλλαγή χρώματος, η αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου και η συμμόρφωση με την ισχύουσα νομοθεσία. Το διαγνωστικό μικροεργαστήριο σε ψηφίδα έχει την ικανότητα ανίχνευσης, ημιποσοτικοποίησης και διάκρισης διαφόρων βακτηρίων, μεταξύ των οποίων και διάφοροι ορότυποι του βακτηρίου Legionella spp. και βρίσκει εφαρμογή στην ανίχνευση βακτηρίων τα οποία εντοπίζονται στο νερό, σε υγρά και σε στερεές επιφάνειες.
Σύντομη περιγραφή των σχημάτων
Στην εικόνα 1 περιγράφεται σχηματικά η διαδικασία κατασκευής της διαγνωστικής μικρορευστομηχανικής ψηφίδας για την ανάλυση νερού, υγρών ή στερεών επιφανειών.
Στην εικόνα 2 (α, β) το απλό πρωτόκολλο δύο σταδίων για την ανίχνευση παθογόνων, όπως η Legionella, σε νερό, (α) σύντομο φιλτράρισμα (5 min) εκτός ψηφίδας για τη συγκέντρωση του δείγματος, ξεκινώντας από 200 mL τεχνητά μολυσμένου νερού, και (β) δέσμευση των βακτηρίων στην ψηφίδα, λύση των βακτηρίων, ενίσχυση του DNA και παρατήρηση χρωματικής αλλαγής. Η διαγνωστική ψηφίδα αποτελείται από 2 μικροκανάλια, ένα αρνητικό (δεν υπάρχουν κύτταρα ή DNA κατά τη LAMP) και ένα θετικό.
Στην εικόνα 3 απεικονίζεται (α) φωτογραφία πηχτής αγαρόζης διαφορετικών συγκεντρώσεων ενισχυμένων με χρωματική LAMP βακτηρίων L. Pneumophila και (β) ο λόγος της απορρόφησης Α430/Α560 για διαφορετικές συγκεντρώσεις βακτηρίων μετά την ενίσχυση στην ψηφίδα με χρωματική LAMP.
Η εικόνα 4 απεικονίζει το λόγο της απορρόφησης Α430/Α560 των δειγμάτων για διαφορετικά βάθη από 100 pm έως 500 μm ο οποίος είναι ανάλογος με την πτώση του pH που προκύπτει από την παραγωγή πρωτονίων καθώς εξελίσσεται η ενίσχυση LAMP.
Η εικόνα 5 απεικονίζει (α) δεδομένα που καταδεικνύουν την αποτελεσματικότητα δέσμευσης πέντε διαφορετικών βατκηρίων (E-coli, Salmonella, Listeria, Β. Cereus, L. Pneumophilla) στην ψηφίδα, κατόπιν απευθείας έγχυσης του δείγματος μετά την προσυγκέντρωση. (β) εικόνα ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αμπλικονίων DNA 1000 κυττάρων μετά από 30 min LAMP στους 65°C στην ψηφίδα.
Παρατηρούνται πανομοιότυπες επιδόσεις λύσης και ενίσχυσης σε ψηφίδα και εξοπλισμό σε πάγκο.
Στην εικόνα 6 απεικονίζεται (α) η αποτελεσματικότητα δέσμευσης της Salmonella σε έξι διαφορετικά φίλτρα και, (β) η αποτελεσματικότητα δέσμευσης της L. Pneumophilla.
Λεπτομερής περιγραφή της εφεύρεσης
Η παρούσα εφεύρεση παρουσιάζει μία διαγνωστική μικρορευστομηχανική ψηφίδα, με την οποία επιτυγχάνεται εξαιρετικά γρήγορη, ευαίσθητη, εξαιρετικά ειδική και ακριβής ανίχνευση βακτηρίων σε ένα δείγμα. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης λαμβάνονται σε 1-2 ώρες, σε αντίθεση με τις τυπικές εργαστηριακές μεθόδους, όπου λαμβάνονται μετά από μερικές ημέρες.
Επομένως, η παρούσα εφεύρεση παρέχει μία μικρορευστομηχανική ψηφίδα για την ανάλυση της παρουσίας βακτηρίων σε ένα δείγμα, στην οποία η ψηφίδα αποτελείται από ένα μικροκανάλι σε μία πολυμερική επιφάνεια, η οποία είναι νανοϋφασμένη με πλάσμα οξυγόνου ή φθορίου ή φθοράνθρακα κάτω από ανισοτροπικές συνθήκες εγχάραξης και παρουσία αναστολέων εγχάραξης. Στην επιφάνεια του μικροκαναλιού ακινητοποιείται ειδικό αντίσωμα έναντι των βακτηρίων, ενώ το βάθος του μικροκανανλιού κυμαίνεται από 100μm έως 500μm.
Η ψηφίδα της παρούσας εφεύρεσης για την ανίχνευση οποιουδήποτε βακτηρίου. Κατά προτίμηση επιλέγεται ένα από τα βακτήρια: Legionella spp, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Vibrio spp. (συμπεριλαμβανομένων V. cholerae and V. parahaemolyticus), B. cereus, Salmonella spp., Clostridium botulinum, Shigella spp., τοξικογενής E. cob (ETEC και EHEC), Campylobacter, Yersinia, Listeria, και Aeromonas. Ακόμα πιο εξειδικευμένα επιλέγεται ένα από τα βακτήρια Legionella spp., και Salmonella spp.
Η παραγωγή αντισωμάτων ειδικών έναντι των βακτηρίων καθώς και εκκινητών για την ενίσχυση του DNA των βακτηρίων είναι ευρέως γνωτή στους ειδικούς του χώρου. Τα αντισώματα μπορούν να ακινητοποιηθούν στην επιφάνεια του μικροκαναλιού, για παράδειγμα, με προσρόφηση σε συνδυασμό με χημική αντίδραση λόγω των δραστικών χημικών ομάδων που δημιουργούνται στην επιφάνεια μετά την επεξεργασία με πλάσμα.
Κατά προτίμηση, το βάθος του καναλιού κυμαίνεται από 300μm έως 500μm. Σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση το δείγμα μπορεί να είναι υγρό, όπως νερό ή βιολογικά υγρά ή να προέρχεται από άλλη πηγή, όπως μία στερεή επιφάνεια.
Η ανάλυση ύπαρξης βακτηρίων σε ένα δείγμα σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση βασίζεται στη δέσμευση των βακτηρίων μέσω ανοσοσυγγένειας, η οποία ακολουθείται από ενίσχυση του DNA και ανίχνευση μέσω απλής χρωματικής αλλαγής. Αυτή η διπλή ειδικότητα (δέσμευση βακτηρίων σε αντισώματα μέσω ανοσοσυγγένειας και ενίσχυση του DNA) προσφέρει μεγάλη εξειδίκευση και επιπρόσθετα παρέχει τη δυνατότητα διάκρισης μεταξύ ζωντανών και νεκρών βακτηρίων, κάτι το οποίο διαδραματίζει καίριο ρόλο στη λήψη απόφασης και την εφαρμογή κατάλληλων μέτρων. Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό της παρούσας εφεύρεσης είναι ότι η ανίχνευση των βακτηρίων μέσω χρωματικής αλλαγής πραγματοποιείται στην ίδια μικρορευστομηχανική ψηφίδα (όπου λαμβάνουν χώρα η δέσμευση μέσω ανοσοσυγγένειας και η ενίσχυση του DNA), χωρίς να απαιτείται μεταφορά του δείγματος σε κάποιο φρεάτιο ή άλλη μονάδα. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω επιλογής του σωστού βάθους του μικροκαναλιού.
Η μικρορευστομηχανική ψηφίδα αποτελείται από μία είσοδο και ένα φρεάτιο αποβλήτων, που είναι συνδεδεμένο με ένα μικρορευστομηχανικό κανάλι. Το κανάλι με το φρεάτιο αποβλήτων συνδέονται μέσω μίας υδρόφοβης βαλβίδας, η οποία αποτρέπει πιθανή απώλεια δείγματος ή επιστροφή αποβλήτων. Η ψηφίδα αποτελείται από ένα μικρορευστομηχανικό κανάλι αναφοράς και ένα κανάλι εισαγωγής δείγματος. Η ψηφίδα κατασκευάζεται σε ένα πολυμερικό υπόστρωμα ή σε υπόστρωμα επικαλυμμένο με πολυμερές. Για παράδειγμα, το υπόστρωμα μπορεί να είναι γυαλί επικαλυμμένο με υμένιο πολυμερούς. Κατά προτίμηση, το πολυμερές της ψηφίδας της παρούσας εφεύρεσης ανήκει στην κατηγορία των ακρυλικών συμπολυμερών, ή επιλέγεται από μια ομάδα που αποτελείται από συμπολυμερές κυκλολεφίνης (COP), πολυστυρένιο (PS), πολυ(αιθερο αιθεροκετόνη) (PEEK), και πολύ(διμέθυλο σιλοξάνη) (PDMS). Κατά ακόμα μεγαλύτερη προτίμηση, το οργανικό πολυμερές που χρησιμοποιείται είναι πολυ(μεθακρυλικός μεθυλεστέρας) (ΡΜΜΑ).
Η επιφάνεια της διαγνωστικής ψηφίδας είναι νανούφασμένη με τη βοήθεια της τεχνολογίας πλάσματος αερίων (Κ. Tsougeni, et al., Langmuir, 2010, 26, 13883-13891; K Tsougeni, et al., Lab Chip, 2010, 10, 462-469; K Tsougeni, et al., Lab on a Chip, 2016, 16, 120-131; K. Tsougeni, et al., ACS Applied Materials & Interfaces, 2015, 7, 14670-14681; K. Tsougeni, et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012, 403, 2757-2764).
Οι νανοϋφασμένες επιφάνειες χαρακτηρίζονται από αυξημένη ενεργή επιφάνεια, στην οποία προσροφάται μεγάλος αριθμός μορίων δέσμευσης, με σκοπό την απομόνωση βακτηρίων με πολύ υψηλή εξειδίκευση και αποτελεσματικότητα. Μετά την επιτόπια δέσμευση των βακτηρίων, ακολουθεί η ενίσχυση του DNA και η ανίχνευση των βακτηρίων με γυμνό μάτι, μέσω χρωματικής αλλαγής, η οποία χαρακτηρίζεται από υψηλή ευαισθησία (λιγότερα από 5 βακτήρια).
Τυπικά, η νανοΰφανση των διαγνωστικών ψηφίδων πραγματοποιείται με κατεργασία με πλάσμα αερίων. Κατά προτίμηση, οι επιφάνειες εγχαράσσονται και νανοϋφαίνονται σε πλάσμα οξυγόνου ή φθορίου ή φθοράνθρακα ή μίγματος αυτών των αερίων. Όταν μεταβάλλεται η ενέργεια των ιόντων, ο χρόνος κατεργασίας και η θερμοκρασία δημιουργούνται ποικίλες γεωμετρίες στις επιφάνειες με αποτέλεσμα τη διαφορετική αύξηση της ενεργής επιφάνειας σε σύγκριση με τις μη κατεργασμένες επιφάνειες.
Η εγχάραξη και νανοΰφανση των επιφανειών μπορεί να πραγματοποιηθεί με χρήση ενός ελικοειδούς αντιδραστήρα υψηλής πυκνότητας ή ενός αντιδραστήρα επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος ή ενός αντιδραστήρα εγχάραξης με δραστικά ιόντα ή άλλον αντιδραστήρα εγχάραξης με πλάσμα.
Η εγχάραξη πρέπει να πραγματοποιείται παρουσία παρεμποδιστών εγχάραξης. Όπως περιγράφεται στα προηγούμενα διπλώματα ευρεσιτεχνίας μας GR20050100473, W02007031799, GR20080100404 and W02009150479 η δημιουργία νανοϋφής οφείλεται στην εγχάραξη του πολυμερούς με ταυτόχρονη εναπόθεση μη εγχαράξιμων παρεμποδιστών, οι οποίοι προέρχονται από τα τοιχώματα του αντιδραστήρα πλάσματος ή από τα ηλεκτρόδια ή από την εγχάραξη πολυμερών τα οποία ήδη εμπεριέχουν αυτούς τους παρεμποδιστές στο σύνολο του πολυμερικού υλικού ή μόνο στην επιφάνεια του. Σε επαγωγικά συζευγμένους αντιδραστήρες πλάσματος ή σε ελικοειδείς αντιδραστήρες κύματος, εάν τα ηλεκτροστατικά πεδία δεν είναι προστατευμένα στην κεραία, ιονοβολή του διηλεκτρικού υλικού κατά τη διάρκεια της εγχάραξης δημιουργεί τους παρεμποδιστές της εγχάραξης με αποτέλεσμα το σχηματισμό νανοϋφής (Ε. Gogolides, et al., Journal of Physics D: Applied Physics, 2011,44, 174021). Παρεμποδιστές της εγχάραξης μπορούν επίσης να δημιουργηθούν από το ηλεκτρόδιο ή από το δακτύλιο του ηλεκτροδίου. Σε αντιδραστήρες εγχάραξης δραστικών ιόντων η δημιουργία παρεμποδιστών εγχάραξης οφείλεται σε ιονοβολή του υλικού του ηλεκτροδίου. Η αλλαγή των παραμέτρων του πλάσματος -για ένα συγκεκριμένο αντιδραστήρα- αλλάζει επίσης τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά της νανοϋφής.
Η εγχάραξη πρέπει να πραγματοποιείται απευθείας με ενεργά ιόντα σε αντιδραστήρες εγχάραξης με δραστικά ιόντα ή σε ελικοειδείς αντιδραστήρες υψηλής πυκνότητας, με χαμηλή πίεση η οποία κυμαίνεται από 5 - 100 mT, ισχύ από 100 - 1000 W και δυναμικό αυτοπόλωσης -20 - 200V.
Στην παρούσα εφεύρεση οι διαγνωστικές ψηφίδες ενεργοποιούνται εκ των προτέρων με βιομόρια και προτιμότερα λυοφιλοποιημένα βιομόρια. Με τον τρόπο αυτό καθίσταται δυνατή η αποθήκευση μακράς διάρκειας (μέχρι 18 μήνες) και η μεταφορά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και διευκολύνεται η ανάλυση από τον τελικό χρήστη.
Η διαγνωστική ψηφίδα διακρίνεται από υψηλή εξειδίκευση έναντι των βακτηρίων στόχων, λόγω της δέσμευσης βάσει της ανοσοσυγγένειας και της ενίσχυσης του DNA. Για παράδειγμα, στην περίπτωση της Legionella spp., με τη χρήση της ψηφίδας μπορεί να γίνει ανίχνευση, ποσοτικοποίηση και διαχωρισμός μεταξύ των διαφορετικών οροτύπων της Legionella, όπως η L. Pneumophila ορότυποι 1-13, η L. Longbeachae και η L. Bozemanii.
Η ψηφίδα χαρακτηρίζεται από διπλή ειδικότητα λόγω 1) του βιομορίου που χρησιμοποιείται για την τροποποίηση της ψηφίδας και τη δέσμευση συγκεκριμένων βακτηρίων και 2) των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση του DNA των δεσμευμένων βακτηρίων.
Ο σχεδιασμός και η λειτουργία της ψηφίδας περιλαμβάνουν αρκετές καινοτομίες. Σε προηγούμενες εργασίες μας (Κ. Tsougeni, et al., Lab on a Chip, 2016, 16, 120-131) προκειμένου να μεγιστοποιηθεί η αποτελεσματικότητα δέσμευσης των βακτηρίων, προσπαθήσαμε να μεγιστοποιήσουμε την περιοχή δέσμευσης των βακτηρίων αυξάνοντας το μήκος της ψηφίδας, το οποίο έχει το μειονέκτημα της αύξησης του όγκου της ψηφίδας και συνεπώς του κόστους των αντιδραστηρίων για την ενίσχυση του DNA. Προκειμένου να μειωθεί ο όγκος της ψηφίδας απαιτείται το βάθος των μικροκαναλιών να κυμαίνεται σε διαστάσεις μερικών δεκάδων μικρομέτρων. Ωστόσο, στα ρηχά μικροκανάλια καθίσταται αδύνατη η χρωματομετρική ανίχνευση στην ψηφίδα μέσω απορρόφησης, λόγω της πολύ μικρής οπτικής διαδρομής (η αλλαγή του χρώματος δεν μπορεί να ανιχνευθεί από το μάτι ή την κάμερα). Πρόσφατα, βρέθηκε ότι όταν το βάθος του μικροδιαύλου ευρίσκεται εντός της απαιτούμενης περιοχής είναι δυνατόν να διαπιστωθεί η έκβαση της ανάλυσης με χρωματομετρική ανίχνευση, για παράδειγμα, με γυμνό μάτι ή κάμερα. Κατά προτίμηση, το μήκος του καναλιού πρέπει να είναι τέτοιο ώστε ο όγκος της ψηφίδας να κυμαίνεται από 10 μικρόλιτρα έως 60 μικρόλιτρα και να μην αυξάνεται η κατανάλωση των αντιδραστηρίων.
Μία άλλη εφαρμογή της παρούσας εφεύρεσης είναι η ανίχνευση ενός βακτηρίου σε ένα δείγμα με τη χρήση της μικρορευστομηχανικής ψηφίδας όπως περιγράφεται παραπάνω, όπου η μέθοδος θα περιλαμβάνει την προσυγκέντρωση του δείγματος, την έγχυση του δείγματος στη μικρορευστομηχανική ψηφίδα και την οπτική ανίχνευση, για παράδειγμα, μέσω αλλαγής χρώματος. Εάν το δείγμα προέρχεται από στερεή επιφάνεια, συλλέγεται με τη βοήθεια στυλεού και στη συνέχεια πραγματοποιείται εκχύλιση του υγρού μετά από εμβάπτιση του στυλεού σε ρυθμιστικό διάλυμα και ανάδευση μέσω αναδευτήρα. Με τον τρόπο αυτό, τα δείγματα από στερεές επιφάνειες μετατρέπονται σε υγρά. Πριν την εισαγωγή του δείγματος στη μικρορευστομηχανική ψηφίδα της παρούσας εφεύρεσης, απαιτείται προσυγκέντρωση του δείγματος, προκειμένου να μειωθεί ο όγκος του δείγματος από μερικές εκατοντάδες mL σε μερικές εκατοντάδες μικρόλιτρα. Ανάλογα με την εφαρμογή, αναπτύσσεται πρωτόκολλο συγκέντρωσης του δείγματος με διήθηση ή φυγοκέντρηση. 20-500 mL μολυσμένου νερού ή άλλου υγρού φυγοκεντρούνται ή διηθούνται, έχοντας ως αποτέλεσμα τη δημιουργία μίας στερεής στιβάδας βακτηρίων στον πυθμένα του σωλήνα (ίζημα). Το υπερκείμενο υγρό απομακρύνεται και το ίζημα αναδιασπείρεται σε 25 - 50 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος. Τέλος, το εναιωρούμενο διάλυμα βακτηρίων εγχύεται στην ενεργοποιημένη ψηφίδα προκειμένου να πραγματοποιηθεί η δέσμευση των βακτηρίων από το αντίσωμα. Για τη διήθηση χρησιμοποιούνται συνήθως φίλτρα 0,2 μικρομέτρων. Προτιμώμενα φίλτρα είναι εκείνα που περιέχουν σουλφονικά ή νάιλον και οξική κυτταρίνη (ανάλογα με το βακτήριο) και ο προτιμώμενος νεκρός όγκος του φίλτρου είναι 50-500 μικρολίτρα.
Οι παρόντες εφευρέτες ανακάλυψαν επίσης ότι κατά την εισαγωγή του δείγματος στην ψηφίδα υπό συνεχή ροή, μειώνεται σημαντικά η αποτελεσματικότητα δέσμευσης των βακτηρίων, ακόμα και για πολύ μικρές ταχύτητες ροής και παρότι η νανοδομημένη επιφάνεια που προσφέρεται μπορεί να είναι επαρκής για τη δέσμευση των βακτηρίων. Το φαινόμενο αυτό είναι πιο έντονο όταν ό όγκος του δείγματος είναι μεγαλύτερος από 100 μικρόλιτρα. Απροσδόκητα, αυτό το φαινόμενο μπορεί να εξαλειφθεί με έγχυση του δείγματος σε στάδια, ως εξής: Εισάγεται όγκος δείγματος ίσος με τον όγκο της ψηφίδας και αφήνεται να αντιδράσει με το αντίσωμα για χρονικό διάστημα που κυμαίνεται από λίγα λεπτά έως μισή ώρα. Μετά τη δέσμευση των βακτηρίων στο αντίσωμα, το δείγμα μεταφέρεται με έμβολο στα απορρίμματα και γίνεται έγχυση νέου δείγματος ίσου όγκου δείγματος και αφήνεται να αντιδράσει με τα αντισώματα. Η έγχυση του δείγματος σε 1-4 στάδια διατηρεί την υψηλή αποτελεσματικότητα της ψηφίδας, ενώ παράλληλα ο όγκος της ψηφίδας παραμένει μικρός και το βάθος της ψηφίδας είναι ικανοποιητικό για οπτική ανίχνευση.
Σύμφωνα με την παρούσα εφεύρεση, η δέσμευση των βακτηρίων λαμβάνει χώρα σε ψηφίδες με νανοδομημένες επιφάνειες, οι οποίες έχουν ενεργοποιηθεί με αντισώματα και όχι με μαγνητικά σφαιρίδια. Δεν απαιτείται η χρήση μαγνήτη.
Μετά τη δέσμευση των βακτηρίων, εισάγεται διάλυμα λύσης και ένα μίγμα για την ενίσχυση του DNA. Από τις ποικίλες μεθόδους ενίσχυσης, προτιμάται η ισοθερμική ενίσχυση. Μία προτιμητέα μέθοδος ισοθερμικής ενίσχυσης είναι η LAMP.
Η ανίχνευση πραγματοποιείται οπτικά μέσω χρωματικής αλλαγής η οποία παρατηρείται με το μάτι ή με κάμερα.
Το κατώτερο όριο ανίχνευσης της επιτόπιας δέσμευσης των βακτηρίων στην ψηφίδα, ακολουθούμενης από ενίσχυση του DNA και χρωματική ανίχνευση είναι μικρότερο από 5 CFU. Η ευαισθησία των ψηφίδων μπορεί να προσαρμοστεί ανάλογα με τα όρια της νομοθεσίας για συγκεκριμένα δείγματα, όπως το πόσιμο νερό, το νερό άρδευσης κλπ.
Η αξεπέραστη ευαισθησία, μικρότερη από 5 CFU, είναι για παράδειγμα μία τάξη μεγέθους πιο ευαίσθητη από το όριο ανίχνευσης της Legionella spp. που ορίζεται από την ισχύουσα νομοθεσία για πόσιμο νερό (100 CFU / 100 ml νερού).
Ένα θετικό δείγμα καταδεικνύει την ύπαρξη βακτηρίων στο δείγμα σε αριθμό μεγαλύτερο από αυτόν που ορίζεται από την ισχύουσα νομοθεσία.
Ένα αρνητικό δείγμα καταδεικνύει ότι το δείγμα δεν έχει βακτήρια ή έχει βακτήρια σε αριθμό μικρότερο από εκείνο που ορίζεται από την ισχύουσα νομοθεσία.
Η διαγνωστική ψηφίδα παρουσιάζει πολλά πλεονεκτήματα έναντι των σημερινών τεχνολογιών καθώς επιτυγχάνεται: μείωση του χρόνου ανάλυσης κατά 99%, απλοποίηση της κατασκευής μέσω προηγμένης τεχνολογίας, συμπεριλαμβανομένης και της οπτικής ανίχνευσης, εξάλειψη της ανάγκης επίπονων και χρονοβόρων πρωτοκόλλων καλλιέργειας καθώς και εξειδικευμένου προσωπικού, μείωση του κόστους, χρήση απλών πρωτοκόλλων και υψηλή εξειδίκευση ως προς τα βακτήρια για τα οποία έχει σχεδιαστεί η ψηφίδα.
Τα πλεονεκτήματα της παρούσας εφεύρεσης περιλαμβάνουν απλότητα, ταχύτητα και σταθερότητα στο χρόνο, ικανότητα διάκρισης ανάμεσα σε ζωντανούς και νεκρούς παθογόνους οργανισμούς, δυνατότητα παραλληλισμού, φορητότητα (συσκευή χειρός που μπορεί να χρησιμοποιηθεί στο σημείο ανάγκης, δηλ. το πεδίο ενδιαφέροντος ή ένα εργαστήριο) και ανίχνευση των βακτηρίων σε νερό ή άλλα υγρά καθώς και σε στερεές επιφάνειες.
Οι διαγνωστικές ψηφίδες μπορούν να βρουν εφαρμογή σε πολλούς τομείς, μεταξύ των οποίων: εκπαίδευση, τρόφιμα και αναψυκτικά, ξενοδοχεία ιαματικά λουτρά, θαλάσσια ιαματικά λουτρά, πλοία, έλαια και αέρια, συμβατική και πυρηνική ενέργεια, νοσοκομεία, μονάδες υγείας, εγκαταστάσεις επεξεργασίας γάλακτος και άλλων τροφίμων, κλπ.
Η παρούσα μεθοδολογία ανοίγει το δρόμο για τη δημιουργία προϊόντων νέας γενιάς για την ταχεία ανάλυση βακτηρίων, με εφαρμογή στην ασφάλεια των τροφίμων και είναι ισχυρός υποψήφιος για το σημείο ενδιαφέροντος.
Παραδείγματα
Παράδειγμα 1: Κατασκευή και χαρακτηρισμός του διαγνωστικού μικροεργαστηρίου σε ψηφίδα με χρήση ενεργοποιημένων και ξηραμένων υπό ψύξη ψηφίδων
Στην εικόνα 1 περιγράφεται σχηματικά η πορεία κατασκευής της διαγνωστικής μικρορευστομηχανικής ψηφίδας για ανάλυση νερού. Οι ψηφίδες κατασκευάζονται σε ακρυλικά πολυμερικά υποστρώματα πάχους 4 mm. Η μέθοδος που επιλέχθηκε για την κατασκευή του πρωτοτύπου ήταν μικροδιάτρηση (micromilling) αριθμητικού ελέγχου μέσω υπολογιστή. Η διαδικασία σχεδιασμού και κατασκευής των ψηφίδων είναι οικονομική και στηρίζεται στην καινοτόμα και γρήγορη (της τάξεως των 15 min) ναοδόμηση μέσω πλάσματος των τοιχωμάτων της πολυμερικής ψηφίδας, για την αύξηση της αποτελεσματικότητας δέσμευσης των αντισωμάτων (Κ. Tsougeni, et al., Lab on a Chip, 2016, 16, 120-131; K. Tsougeni, et al., ACS Applied Materials & Interfaces, 2015, 7, 14670-14681; K. Tsougeni, et al., Langmuir, 2010, 26, 13883-13891). Μετά το σχεδίασμά του μικροκαναλιού με micromilling, ακολούθησε νανοΰφανση με πλάσμα οξυγόνου μέσω μίας μεμβρανικής μάσκας, προκειμένου να αποφευχθεί η δημιουργία τραχύτητας και η ενεργοποίηση της επιφάνειας από το πλάσμα εκτός του καναλιού και να πραγματοποιηθεί μόνο στον πυθμένα του μικροκαναλιού. Αυτό είχε σαν αποτέλεσμα οι επιφάνειες εκτός του καναλιού να είναι λείες και να επιτυγχάνεται καλή σφράγιση της μικρορευστομηχανικής διάταξης με μία απλή μεμβράνη συγκολλήσεως, ευαίσθητη στην πίεση. Τα αντισώματα ακινητοποιούνται πριν από τη χρήση και η ενεργοποιημένη ψηφίδα υποβάλλεται σε ξήρανση υπό ψύξη, προκειμένου να απλουστευθεί σημαντικά η εργασία του τελικού χρήστη. Η τελική διαγνωστική ψηφίδα αποτελείται από 2 μικροκανάλια, που περιλαμβάνουν αρνητικά (δηλαδή δεν υπάρχουν κύτταρα ή DNA εκμαγείο για τις αντιδράσεις LAMP) και θετικά δείγματα προκειμένου να καταγραφούν τα αρνητικά και θετικά στατιστικά σήματα και να ενισχυθεί η ερμηνεία των δεδομένων. Το βάθος των μικροκαναλιών κυμαίνεται στα ~00 μm ενώ το ύψος της τραχύτητας είναι ~ 5 pm.
Παράδειγμα 2: Η λειτουργία του διαγνωστικού μικροεργαστηρίου σε ψηφίδα και η επικύρωση του πρωτοκόλλου για την ανάλυση δειγμάτων νερού
Ένα σχεδιάγραμμα της διαδικασίας δύο σταδίων απεικονίζεται στην Εικόνα 2: α) Διήθηση ή φυγοκέντρηση και επαναδιαλυτοποίηση σε μικρό όγκο για προσυγκέντρωση, β) δέσμευση στην ψηφίδα με χρήση ξηραμένων υπό ψύξη αντισωμάτων, λύση των δεσμευμένων κυττάρων στην ψηφίδα και ενίσχυση του DNA μέσω LAMP στην ψηφίδα, ακολουθούμενη από ανίχνευση μέσω χρωματικής αλλαγής. Η πορεία που ακολουθείται στην ψηφίδα είναι η εξής: i) έγχυση δείγματος νερού (συνολικός όγκος 25 - 100 μΕ), ii) έγχυση ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (PBS) για την έκπλυση των μη δεσμευμένων βακτηρίων PBS (συνολικός όγκος 30 pL), iii) έγχυση των αντιδραστηρίων της LAMP (συνολικός όγκος 24 μL), iν) χημική λύση με Triton (το οποίο περιλαμβάνεται στο μίγμα της LAMP) για 10 min, ν) θέρμανση για 60 min στους 65°C, νϊ) παρατήρηση χρωματικής αλλαγής με γυμνό μάτι. Η έκβαση της χρωματικής LAMP επαληθεύεται μέσω αλλαγής του χρώματος από ροζ (αρνητικό, χωρίς κύτταρα) σε κίτρινο (θετικό) και παρατηρείται με γυμνό μάτι.
Χρησιμοποιήθηκε μία διαγνωστική συσκευή για τη Legionella, η οποία συνδυάζει τη δέσμευση των βακτηρίων στη ψηφίδα βάσει ανοσοσυγγένειας, τη χημική λύση και την ισοθερμική ενίσχυση του DNA, όλα σε μία μικρορευστομηχανική διάταξη. Στη συνέχεια, ακολουθεί ανίχνευση της ύπαρξης βακτηριακού DNA της Legionella σε ένα δείγμα, μέσω χρωματικής αλλαγής. Πραγματοποιείται λήψη του δείγματος και προετοιμασία σύμφωνα με το πρωτόκολλο (βλ. παράδειγμα 1) και ακολουθεί έγχυση του δείγματος στην είσοδο του καναλιού. Κατά την παρουσία βακτηριακού DNA, το «θετικό κανάλι» γίνεται κίτρινο. Περιλαμβάνεται και «αρνητικό κανάλι», το οποίο παραμένει πάντα ροζ μετά την επιτυχή ολοκλήρωση του τεστ.
Προκειμένου να αποδειχθεί ότι το μικροεργαστήριο σε ψηφίδα μπορεί να λειτουργεί με δείγματα διαφορετικών συγκέντρωσης, συμπεριλαμβάνουμε δεδομένα που δείχνουν τις επιδόσεις χρησιμοποιώντας διαφορετική συγκέντρωση μετά από προ-συγκέντρωση δειγμάτων νερού κάτω και πάνω από το όριο συγκέντρωσης της Legionella που επιβάλλει η νέα νομοθεσία της ΕΕ. Τα αποτελέσματα που αφορούν τα θετικά δείγματα καταδεικνύουν μία μετατόπιση στο κίτρινο, από θαμπό σε λαμπερό, με αύξηση του αριθμού των κυττάρων σε 10<4>CFUs. Για αριθμούς μεγαλύτερους από 10<4>CFUs, δεν παρατηρούνται σημαντικές αλλαγές αποδεικνύοντας ότι υπάρχει κορεσμός. Τα αποτελέσματα επαληθεύτηκαν περαιτέρω μέσω ηλεκτροφόρησης σε πηκτή. Η μεγάλη διαφορά χρώματος ανάμεσα στα αρνητικά και τα θετικά δείγματα υπόσχεται μια πολύ ευαίσθητη με γυμνό μάτι, ακόμη και μικρού αριθμού κυττάρων. Σημειώνουμε ότι το χαμηλότερο όριο ανίχνευσης είναι 5 CFU. Επιπλέον, με σκοποό να πραγματοποιηθεί ημιποσοτικοποίηση των ληφθέντων αποτελεσμάτων, μετράται η απορρόφηση των δειγμάτων και υπολογίζεται ο λόγος απορροφήσεως Α430/Α560 (Σχήμα 3), ο οποίος είναι ανάλογος με τη μείωση του pH που προκύπτει από την παραγωγή πρωτονίων κατά την εξέλιξη της ενίσχυσης μέσω LAMP.
Παράδειγμα 3: Βάθος των ψηφίδων ανίχνευσης της Legionella Ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία με αυτήν που περιγράφηκε στο παράδειγμα 2 (μέτρηση απορρόφησης κατά μήκος των μικροκαναλιών) σε μικροκανάλια αυξανόμενου βάθους (από 100 έως 500 μm). Αυτό είναι απαραίτητο προκειμένου να βελτιστοποιηθεί η αλλαγή χρώματος με ημι-ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων ως συνάρτηση του βάθους των μικροδιαύλων. Η απορρόγηση των δειγμάτων μετρήθηκε σε κανάλια με βάθος από 100 έως 500 μm και υπολογίστηκε ο λόγος απορρόφησης Α430/Α560 (Εικόνα 4), ο οποίος είναι ανάλογος με τη μείωση του pH που προκύπτει από την παραγωγή πρωτονίων κατά την εξέλιξη της ενίσχυσης μέσω LAMP. Αποδεικνύεται ότι ο λόγος της απορρόφησης Α430/Α560 αυξάνεται καθώς το βάθος των μικροκανανλιών αυξάνει. Επομένως, επιλέχθηκε μικροκανάλι βάθους 500 μm το οποίο συνδυάζει υψηλή απορρόφηση και μικρό όγκο αντιδραστηρίων (για μείωση του κόστους).
Παράδειγμα 4: Ανίχνευση Salmonella, e-coli, Listeria, B. Cereus Η ίδια ψηφίδα που περιγράφηκε στα παραδείγματα 2 & 3, με τη χρήση ωστόσο κατάλληλων αντισωμάτων, διαφορετικών από αυτά που χρησιμοποιήθηκαν παραπάνω και διαφορετικών εκκινητών για την ανίχνευση του DNA, εφαρμόστηκε και για άλλη βακτήρια από τη λίστα των κοινών παθογόνων, συμπεριλαμβανομένων των: Salmonella, E-coli, Listeria and B. Cereus. Χρησιμοποιήσαμε την ψηφίδα για τη δέσμευση, τη χημική λύση και την ενίσχυση του DNA αυτών των βακτηρίων, αποδεικνύοντας τη γενική φύση της προσέγγισής μας για διαφορετικά βακτήρια. Στην Εικόνα 5 (α), περιλαμβάνονται δεδομένα τα οποία καταδεικνύουν την αποτελεσματικότητα δέσμευσης πέντε διαφορετικών βακτηρίων (E-coli, Salmonella, Listeria, Β. Cereus, L. Pneumophilla) στην ψηφίδα, κατόπιν έγχυσης του δείγματος αμέσως μετά το στάδιο της προσυγκέντρωσης. Η αποτελεσματικότητα δέσμευσης εξαρτάται από το βακτήριο και κυμαίνεται από ~35% έως 70% (υψηλότερη αποτελεσματικότητα δέσμευσης παρατηρήθηκε για την E-coli, τη Salmonella, και την L. Pneumophilla). Η χημική λύση επετεύχθη με χρήση διαλύματος Triton Χ-100 περιεκτικότητας 0.04% (ο/ο) για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου και ακολούθησε ενίσχυση του DNA. Στην Εικόνα 5 (β) παρουσιάζεται η νείσχυση του DNA της Salmonella πάνω στην ψηφίδα.
Παράδειγμα 5: Επιλογή φίλτρων για την προσυγκέντρωση του δείγματος για διαφορετικά βατκήρια (L. Pneumophilla, Salmonella)
Το πρωτόκολλο της προσυγκέντρωσης των βακτηρίων μέσω διήθησης, όπως περιγράφηκε στο παράδειγμα 2, παρουσιάζεται για δύο βακτήρια, την L. Pneumophilla και τη Salmonella. 20 mL επιμολυσμένου νερού ή άλλου υγρού διηθείται σε ποικιλία φίλτρων 0.2 μικρομέτρων, έχοντας ως αποτέλεσμα τη δημιουργία βακτηριακού ιζήματος. Στην εικόνα 6 (α) απεικονίζεται η αποτελεσματικότητα δέσμευσης της Salmonella σε έξι διαφορετικά φίλτρα, ενώ στην εικόνα 6 (β) απεικονίζεται η αποτελεσματικότητα δέσμευσης της L. Pneumophilla. Παρατηρείται ότι τα προτιμώμενα φίλτρα είναι εκείνα που περιέχουν σουλφονικά ή νάιλον για την L. Pneumophilla και νάιλον, οξική κυτταρίνη ή εστέρα κυτταρίνης για τη Salmonella. Ο προτιμώμενος νεκρός όγκος του φίλτρου είναι 50-500 μικρολίτρα.
Παράδειγμα 6: Ανίχνευση της Legionella spp. από επιχρήσματα επιφανειακών δειγμάτων
Δοκιμάστηκε η ανάκτηση βακτηρίων από άλλα δείγματα πέραν των υγρών, όπως από στερεές επιφάνειες, Recovering bacteria from other samples except liquids, such as solid surfaces was also tested, αποδεικνύοντας τη γενική φύση της προσέγγισής μας. Για τη συλλογή των βακτηρίων από τις επιφάνειες χρησιμοποιήθηκε βαμβακοφόρς στυλεός. Η περιοχή δειγματοληψίας ήταν ~10 cm<2>. Τα βακτήρια ανακτήθηκαν μέσω εμβάπτισης του στυλεού σε διάλυμα εκχύλισης, υπό ανάδευση. Έπειτα, ακολουθήθηκε η ίδια πορεία που περιγράφηκε στα παραδείγματα 2 και 3. Αυτή η πορεία ακολουθήθηκε για τη λήψη βακτηρίων από επιφάνειες, όπως για παράδειγμα φίλτρα κλιματιστικών και αναλύθηκαν 8 δείγματα. Μετά την ανάλυση των δειγμάτων και την παρατήρηση της χρωματικής αλλαγής βρέθηκε ότι 3 δείγματα ήταν θετικά και 5 αρνητικά, σύμφωνα τη μέθοδο ISO 11731 (2017).

Claims (10)

Αξιώσεις
1. Μία μικρορευστομηχανική διάταξη για την ανάλυση της παρουσίας βακτηρίων σε ένα δείγμα, όπου η ψηφίδα αποτελείται από ένα μικροκανάλι σε πολυμερική επιφάνεια, όπου η πολυμερική επιφάνεια είναι ναοϋφασμένη με πλάσμα οξυγόνου ή φθορίου ή φθοράνθρακα κάτω από ανισοτροπικές συνθήκες εγχάραξης και παρουσία αναστολέων εγχάραξης, όπου η ψηφίδα περιλαμβάνει ένα ειδικό αντίσωμα έναντι των βακτηρίων στην επιφάνεια του μικροκαναλιού και όπου το βάθος του μικροκαναλιού κυμαίνεται από 100 μm έως 500 μm.
2. Χρήση μίας μικρορευστομηχανικής ψηφίδας σύμφωνα με την αξίωση 1 για την ανάλυση της παρουσίας βακτηρίων σε ένα δείγμα.
3. Χρήση σύμφωνα με τις αξιώσεις 1 και 2, όπου το βακτήριο είναι ένα από τα εξής: Legionella spp., Clostridium Perfringens, Staphylococcus Aureus, Vibrio, B. cereus, Salmonella spp., Clostridium Botulinum, Shigella, toxigenic E. coli, Campylobacter, Yersinia, Listeria, και Aeromonas.
4. Χρήση σύμφωνα με την αξίωση 3, όπου η ανάλυση πραγματοποιείται μέσω ενίσχυσης του DNA και κατά προτίμηση με ισοθερμική, υποβοηθούμενη με βρόγχο ενίσχυση DNA (loop-mediated isothermal DNA amplification).
5. Χρήση σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 2 έως 4, όπου η παρουσία των βακτηρίων αξιολογείται στη μικρορευστομηχανική ψηφίδα μέσω οπτικής παρατήρησης της αλλαγής του χρώματος.
6. Η πορεία της ανάλυσης για την παρουσία βακτηρίων σε ένα δείγμα, η οποία αποτελείται από τα ακόλουθα στάδια
α) προσυγκέντρωση του δείγματος,
β) έγχυση του δέιγματος στη μικρορευστομηχανική ψηφίδα της αξίωσης 1,
γ) ενίσχυση του DNA στη μικρορευστομηχανική ψηφίδα
δ) αξιολόγηση της παρουσίας βακτηρίων στη μικρορευστομηχανική ψηφίδα μέσω οπτικής παρατήρησης της χρωματικής αλλαγής.
7. Η πορεία σύμφωνα με την αξίωση 6, όπου η προσυγκέντρωση του δείγματος πραγματοποιείται με φυγοκέντρηση ή διήθηση.
8. Η πορεία σύμφωνα με την αξίωση 7, όπου τα χρησιμοποιούμενα φίλτρα αποτελούνται από νάυλον, οξική κυτταρίνη ή σουλφονικά.
9. Η πορεία σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 6 έως 8, όπου η έγχυση του δείγματος πραγματοποιείται σε στάδια και όπου ο όγκος του κάθε σταδίου ισοδυναμεί με τον όγκο του μικροκαναλιού της μικρορευστομηχανικής ψηφίδας.
10. Η πορεία σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 6 έως 9, όπου το βακτήριο είναι ένα από τα εξής: Legionella spp., Clostridium Perfringens, Staphylococcus Aureus, Vibrio, B. cereus, Salmonella spp., Clostridium Botulinum, Shigella, toxigenic E. coli, Campylobacter, Yersinia, Listeria, και Aeromonas.
GR20190100415A 2019-09-25 2019-09-25 Διαγνωστικη ψηφιδα για την αναλυση της παρουσιας βακτηριων σε ενα δειγμα GR1010186B (el)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GR20190100415A GR1010186B (el) 2019-09-25 2019-09-25 Διαγνωστικη ψηφιδα για την αναλυση της παρουσιας βακτηριων σε ενα δειγμα
EP20386048.1A EP3798320A1 (en) 2019-09-25 2020-09-25 Diagnostic chip for analyzing the presence of bacteria in a sample

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GR20190100415A GR1010186B (el) 2019-09-25 2019-09-25 Διαγνωστικη ψηφιδα για την αναλυση της παρουσιας βακτηριων σε ενα δειγμα

Publications (2)

Publication Number Publication Date
GR20190100415A GR20190100415A (el) 2021-04-16
GR1010186B true GR1010186B (el) 2022-03-02

Family

ID=73040012

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
GR20190100415A GR1010186B (el) 2019-09-25 2019-09-25 Διαγνωστικη ψηφιδα για την αναλυση της παρουσιας βακτηριων σε ενα δειγμα

Country Status (2)

Country Link
EP (1) EP3798320A1 (el)
GR (1) GR1010186B (el)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR1010468B (el) * 2022-03-03 2023-05-31 Σπυριδων Ανδρεας Κωνσταντινου Παπαθεοδωρου Αναπτυξη καινοτομου συσκευης μικρορευστομηχανικης (microfluidic device) για την ανιχνευση παθογονων βακτηριων

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114018812B (zh) * 2021-11-10 2023-10-20 重庆大学 一种细菌采集检测一体化微流控荧光芯片及其应用
CN115430469B (zh) * 2022-09-01 2023-08-04 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种用于病原菌快速检测的滑动微流控芯片

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3187595A1 (en) * 2015-12-30 2017-07-05 Fundacion Gaiker Method for the detection of legionella spp. strains in environmental samples based on loop-mediated isothermal amplification (lamp), detection reagent, set of primers, device for dosing and preparing the sample for analysis, support, and system for dosing and preparing the sample for analysis
US20180080067A1 (en) * 2016-09-14 2018-03-22 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Rapid pertussis diagnosis on a point-of-care hybrid microfluidic biochip
GR1009425B (el) * 2015-09-09 2019-01-15 Εθνικο Κεντρο Ερευνας Φυσικων Επιστημων "Δημοκριτος" Μικρο-νανοδομημενη με πλασμα πολυμερικη μικρορευστονικη διαταξη για καθαρισμο νουκλεϊκων οξεων

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7351376B1 (en) * 2000-06-05 2008-04-01 California Institute Of Technology Integrated active flux microfluidic devices and methods
GR1006890B (el) 2005-09-16 2010-07-19 Ευαγγελος Γογγολιδης Μεθοδος για την κατασκευη επιφανειων μεγαλου επιφανειακου λογου και μεγαλου λογου ασυμμετριας σε υποστρωματα.
GR1006618B (el) 2008-06-13 2009-12-03 Εθνικο Κεντρο Ερευνας Φυσικων Επιστημων (Εκεφε) "Δημοκριτος" Μεθοδος για την κατασκευη περιοδικων δομων σε πολυμερη με διεργασιες πλασματος
US9376713B2 (en) * 2009-09-23 2016-06-28 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Label free detection of nucleic acid amplification
US20130157283A1 (en) * 2010-01-19 2013-06-20 President And Fellows Of Harvard College Rapid pathogen diagnostic device and method

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR1009425B (el) * 2015-09-09 2019-01-15 Εθνικο Κεντρο Ερευνας Φυσικων Επιστημων "Δημοκριτος" Μικρο-νανοδομημενη με πλασμα πολυμερικη μικρορευστονικη διαταξη για καθαρισμο νουκλεϊκων οξεων
EP3187595A1 (en) * 2015-12-30 2017-07-05 Fundacion Gaiker Method for the detection of legionella spp. strains in environmental samples based on loop-mediated isothermal amplification (lamp), detection reagent, set of primers, device for dosing and preparing the sample for analysis, support, and system for dosing and preparing the sample for analysis
US20180080067A1 (en) * 2016-09-14 2018-03-22 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Rapid pertussis diagnosis on a point-of-care hybrid microfluidic biochip

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TSOUGENI K.; KASTANIA A.S.; KAPROU G.D.; ECK MICHAEL; JOBST GERHARD; PETROU P.S.; KAKABAKOS S.E.; MASTELLOS D.; GOGOLIDES E.; TSER: "A modular integrated lab-on-a-chip platform for fast and highly efficient sample preparation for foodborne pathogen screening", SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICAL, ELSEVIER BV, NL, vol. 288, 1 January 1900 (1900-01-01), NL , pages 171 - 179, XP085643112, ISSN: 0925-4005, DOI: 10.1016/j.snb.2019.02.070 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR1010468B (el) * 2022-03-03 2023-05-31 Σπυριδων Ανδρεας Κωνσταντινου Παπαθεοδωρου Αναπτυξη καινοτομου συσκευης μικρορευστομηχανικης (microfluidic device) για την ανιχνευση παθογονων βακτηριων

Also Published As

Publication number Publication date
EP3798320A1 (en) 2021-03-31
GR20190100415A (el) 2021-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zulkifli et al. Detection of contaminants in water supply: A review on state-of-the-art monitoring technologies and their applications
Paul et al. Advances in point-of-care nucleic acid extraction technologies for rapid diagnosis of human and plant diseases
Vidic et al. Point-of-need DNA testing for detection of foodborne pathogenic bacteria
CN109563462B (zh) 检测特定核酸序列的完全集成的手持式设备
Bridle et al. Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring: A review
Gao et al. Recent advances in microfluidic devices for foodborne pathogens detection
Abbasian et al. Microbiological sensing technologies: a review
Park et al. Advances in microfluidic PCR for point-of-care infectious disease diagnostics
Tsougeni et al. Lab-on-Chip platform and protocol for rapid foodborne pathogen detection comprising on-chip cell capture, lysis, DNA amplification and surface-acoustic-wave detection
EP3798320A1 (en) Diagnostic chip for analyzing the presence of bacteria in a sample
Han et al. Microfluidic devices for multiplexed detection of foodborne pathogens
Lopez-Roldan et al. On-line bacteriological detection in water
Ramadan et al. Microfluidic applications of functionalized magnetic particles for environmental analysis: focus on waterborne pathogen detection
JP2019525136A5 (el)
Xia et al. Identifying multiple bacterial pathogens by loop-mediated isothermal amplification on a rotate & react slipchip
Dao et al. Rapid and sensitive detection of Salmonella based on microfluidic enrichment with a label-free nanobiosensing platform
WO2011020011A2 (en) Droplet actuator and droplet-based techniques
EP1593747B2 (en) Process for the enumeration and identification of microorganisms
Keçili et al. Micro total analysis systems with nanomaterials
Lonchamps et al. Detection of pathogens in foods using microfluidic “lab-on-chip”: A mini review
US20210180116A1 (en) Assay using multi-layer membrane to detect microbiological target and method of manufacturing multi-layer membrane
Oon et al. Waterborne pathogens detection technologies: advances, challenges, and future perspectives
Dinh et al. Fabrication of a fully integrated paper microdevice for point-of-care testing of infectious disease using Safranin O dye coupled with loop-mediated isothermal amplification
Tambi et al. Methods for detection and enumeration of coliforms in drinking water: a review
Lu et al. Sensitive and automated detection of bacteria by CRISPR/Cas12a-assisted amplification with digital microfluidics

Legal Events

Date Code Title Description
PG Patent granted

Effective date: 20220418