KR20130113774A - 시료 중의 표적물질을 효율적으로 처리하는 방법 - Google Patents

시료 중의 표적물질을 효율적으로 처리하는 방법 Download PDF

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Abstract

탄성막을 포함하는 미세유동장치를 이용하여 시료 중의 표적물질을 효율적으로 처리하는 방법이 제공된다.

Description

시료 중의 표적물질을 효율적으로 처리하는 방법{Method of processing target material in a sample}
하나 이상의 양상은 시료 중의 표적물질을 효율적으로 처리하는 방법에 관한 것이다.
질병진단을 위한 미세 유체 분석 시스템 (micro total analysis system, μTAS)은 소량의 샘플을 이용하여 빠른 분석과 현장 진단이 가능한 특징을 가지고 있어서 차세대 의료 분석기기 플랫폼으로 유망하다. 이러한 분석기기는 공통적으로 환자 샘플로부터 세포 및 핵산과 같은 분석대상 물질을 분리하는 과정을 필요로 한다.
이러한 과정을 위한 전통적 방식으로는 고체상에서 세포 및 핵산과 같은 분석대상 물질을 포획하고, 세척한 다음, 용리(elution)시키는 과정을 포함하는 고체상 추출(solid phase extraction, SPE)방식이 알려져 있다. 마이크로 디바이스 상에서도 SPE를 구현하기 위한 다양한 시도들이 이루어지고 있다.
고체 상에 세포 및 핵산을 포획하기 위해서는 넓은 표면적을 가지며, 단위부피당 표면적 비 (surface-to-volume ratio, SVR)가 큰 미세 구조를 요구하게 되는데, 이것은 포획 효율 및 처리용량(capacity)을 증가시키기 위한 것이다.
넓은 표면적 및 높은 SVR의 고체상으로는 마이크로 필라(micro-pillar) 또는 충진된 비드(packed bead) 형태가 주종을 이루고 있다.
마이크로 필라는 전통적인 MEMS 기술 및 LIGA 공정 등을 통하여 비교적 정확하게 마이크로 칩 상에 제작할 수 있다. 그러나 공정비용이 비싸다.
비드를 이용하는 경우는 캐필러리(capillary) 관에 비드를 충진하는 방법이 활용된 바가 있다. 그러나 밀집 패킹(close packing)을 확인하기 어렵고, 제작하기도 어렵다.
보다 발전된 방법으로는 솔-겔(sol-gel) 물질을 비드와 같이 이용하는 방법이나 유기 다공성 고분자 구조물과 비드를 같이 이용하는 방법 등이 있다.
상기의 방법들은 유리(glass), 실리콘(Si), 폴리머(polymer) 등을 활용하여 마이크로 쳄버를 제작한 후, 그 내부에 단순히 비드를 채우는 방식으로, 비드 밀집 패킹(bead close packing) 달성이 어렵고, 또한 유기물 등을 이용하기에 복잡한 제작 과정 및 재현성 확보에 어려운 면을 가지고 있다.　　
일 양상은 시료 중의 표적물질을 효율적으로 처리하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 미세유동장치의 표적물질에 결합하는 물질을 포함하는 고체 지지체를 포함하는 제1 챔버에 표적물질을 포함하는 시료를 도입하여 표적물질을 상기 고체 지지체에 결합시키는 단계를 포함하는, 시료 중의 표적물질을 처리하는 방법으로서, 상기 미세유동장치는 입구 및 출구를 포함하는 제1 챔버, 압력 제공 수단이 연결된 제2 챔버 및 제1 챔버와 제2 챔버의 사이에 위치하고 제1 챔버와 제2 챔버의 적어도 일부분의 벽을 형성하는 탄성막을 포함하는 것이고, 상기 도입 단계 및 그 후의 처리 단계 중 하나 이상의 단계는 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 또는 제2 챔버에 음압을 제공하여 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 수행하는 단계인 것인 방법을 제공한다.
상기 도입은 제1 챔버의 출구를 폐쇄 또는 폐쇄하지 않은 상태에서 입구를 통하여 시료를 도입하는 것을 포함한다. 출구를 폐쇄하지 않은 상태에서 입구를 통하여 시료를 도입하는 것은 시료를 입구로부터 출구를 통하여 연속적으로 흘려줌으로써 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 도입 단계 및 그 후의 처리 단계 중 하나 이상의 단계는 제1 챔버의 입구로부터 출구를 통하여 시료를 흘려줌으로써 수행되는 것일 수 있다. 시료의 유속은 10μl/min 내지 500μl/min, 예를 들면, 20μl/min 내지 500μl/min, 50μl/min 내지 500μl/min, 75μl/min 내지 500μl/min, 100μl/min 내지 500μl/min, 200μl/min 내지 500μl/min, 300μl/min 내지 500μl/min, 또는 400μl/min 내지 500μl/min일 수 있다. 상기 도입은 표적물질에 상기 표적물질에 결합하는 물질에 결합하기에 적합한 조건에서 이루어질 수 있다. 시료를 제1 챔버에 도입하는 것은 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 입구에 양압을 가하는 것 및/또는 출구에 음압을 가하는 것에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 시료 도입 단계후 처리 단계는 세척하는 단계, 건조하는 단계, 및 용출하는 단계 중 하나 이상일 수 있다. 세척하는 단계는 세척액을 고체 지지체에 접촉시켜 고체 지지체에 결합되지 않은 물질 또는 약하게 결합된 물질을 제거하는 것을 포함한다. 상기 세척하는 단계는 고체 지지체에 결합된 표적물질은 실질적으로 제거하지 않는 조건에서 이루어지는 것일 수 있다. 건조하는 단계는 제1 챔버의 입구로부터 출구를 통하여 기체, 예를 들면 공기를 흘려주어 고체 지지체를 건조시키는 것을 포함한다. 상기 용출하는 단계는, 용출액을 고체 지지체와 접촉시켜 고체 지지체로부터 표적물질을 분리하는 것을 포함한다. 예를 들면, 고체 지지체로부터 세포 또는 생물물질을 분리하기에 적합한 조건하에서, 세포 용출액을 고체 지지체에 접촉시키는 단계를 포함한다.
상기 시료는 표적물질을 포함하는 것이면 어느 것이나 될 수 있다. 상기 표적물질은 생물 또는 비생물 유래 물질일 수 있다. 생물 유래 물질은 바이러스 또는 생물로부터 유래된 물질일 수 있다. 생물 유래 물질은 세포, 또는 그 성분을 포함한다. 상기 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 그람 양성 또는 음성 박테리아 세포일 수 있다. 상기 생물 세포 성분은 단백질, 당, 지방, 핵산 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 시료는 예를 들면, 생물학적 물질을 포함하는 시료일 수 있다. 예를 들면, 혈액, 뇨, 점막 스왑 (예, 비강 스왑), 타액, 체액, 조직, 생검물 및 이들의 조합일 수 있다.
상기 표적물질에 결합하는 물질은 표적물질에 특이적 또는 비특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 특이적으로 결합하는 것은 예를 들면, 표적물질에 대하여 넓은 의미의 리간드와 수용체의 관계에 있는 것일 수 있다. 항원에 대하여 항체, 리간드에 대한 수용체, 효소와 기질 또는 억제인자 등이 포함될 수 있다. 비특이적으로 결합하는 박테리아 세포에 대하여, 상기 물질 물접촉각 70도 내지 95도인 표면을 갖는 물질, 또는 1차, 2차, 3차, 및 4차 아미노기로부터 선택된 하나이상의 아미노기를 갖는 하나이상의 아미노실란 모이어티를 가진 물질일 수 있다. 3차 아미노기는 아미드기 또는 니트릴기를 제외한, 3차 아미노기일 수 있다. 상기 아미노실란 모이어티는 고체 지지체의 표면에 아미노실란 분자를 침적시켜 얻어진 것일 수 있다. 상기 아미노실란 분자는 X1, X2, 및 X3이 각각 독립적으로 수소, 알콕시기 (-OR) 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되고, X1, X2, 및 X3 중 하나이상은 알콕시기인 식 (X1)(X2)(X3)Si(Y)를 갖는 유기 아미노실란 분자일 수 있다. 상기 알콕시기 (-OR)에 있어서, R은 1 내지 20개 탄소원자를 갖는 히드로카르보닐기일 수 있다. 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 등일 수 있다. 상기 할로겐은 F, Cl, Br, I 또는 At일 수 있다. Y는 하나이상의 아미노기를 가진 유기 모이어티일 수 있다. 상기 유기 모이어티는 아미노알킬, 또는 폴리에틸렌이민일 수 있다. 상기 아미노알킬에서, 상기 알킬기는 1 내지 20 탄소 원자를 가질 수 있다. 상기 폴리에틸렌이민은 n이 2 내지 100일 수 있는, 식 -[CH2CH2NH]n-을 갖는 것일 수 있다. 상기 알콕시기(-OR)는 수성 환경에 가수분해되어, 히드록시를 생성하고, 이들 중 하나이상이 고체 지지체 표면뿐만 아니라 이웃하는 유기실란 분자에서 발견된 표면 -OH기와 축합 및 제거 반응을 일으킬 수 있다. 상기 아미노실란 분자는 3-아미노프로필트리에톡시실란 (GAPS), 또는 N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란 (EDA) 및 (3-트리메톡시실릴-프로필)디에틸렌트리아민(DETA)과 같은 폴리에틸렌이민트리에톡시실란일 수 있다. 상기 아미노실란은 알려진 방법에 의하여 고체 지지체 상에 코팅될 수 있다. 상기 코팅은 딥 코팅, 스핀 코팅 또는 화학기상증착 (CVD)에 의하여 이루어질 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 물접촉각 (water contact angle)은 Kruss Drop Shape Analysis System Type DSA 10 Mk2에 의하여 측정된 물접촉각일 수 있다. 1.5uL 증류수 방울을 시료 상에 자동적으로 위치시킨다. 상기 방울을 CCD-카메라에 의하여 10 초 동안 매 0.2초 마다 모니터링하고, Drop Shape Analysis Software (DSA version 1.7, Kruss)에 의하여 분석된다. 방울의 완전한 프로필을 탄젠트 법에 의하여 일반적 conic section equation에 핏팅시켰다. 상기 각은 좌측각 및 우측각 모두에서 결정하였다. 평균값을 각 방울에 대하여 계산하고, 시료당 총 다섯 방울을 측정하였다. 다섯 방울의 평균을 접촉각으로 취하였다.
상기 방법에 있어서, 상기 미세유동장치는 입구 및 출구를 포함하는 제1 챔버, 압력 제공 수단이 연결된 제2 챔버 및 제1 챔버와 제2 챔버의 사이에 위치하고 제1 챔버와 제2 챔버의 적어도 일부분의 벽을 형성하는 탄성막을 포함한다. 상기 입구 및/또는 출구는 제1 챔버에 실질적으로 이격 없이 배치되어 있거나, 유체소통가능하게 채널에 의하여 연결된 것일 수 있다. 제1 챔버 및/또는 제2 챔버는 제2 챔버에 양압 또는 음압이 제공되지 않은 상태에서, 1ul 내지 500ul, 예를 들면, 1ul 내지 500ul,10ul 내지 500ul, 20ul 내지 500ul, 50ul 내지 500ul, 75ul 내지 500ul, 100ul 내지 500ul, 200ul 내지 500ul, 300ul 내지 500ul, 400ul 내지 500ul, 또는 1ul 내지 400ul,1ul 내지 300ul, 1ul 내지 200ul, 1ul 내지 100ul, 10ul 내지 100ul, 20ul 내지 100ul, 50ul 내지 100ul, 또는 75ul 내지 100ul의 부피를 갖는 것일 수 있다.
상기 탄성막은 제2 챔버에 양압 또는 음압을 제공하여 탄성막을 제1 챔버 및/또는 제2 챔버를 향하여 이동시키거나 진동시킬 수 있도록 된 것일 수 있다. 상기 탄성막은 폴리디메틸실록산 (PDMS: polydimethylsiloxane), 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 테플론 (teflon), 또는 이들의 조합으로 된 것일 수 있다. 상기 탄성막의 두께는 제2 챔버에 양압 또는 음압을 제공하여 탄성막을 제1 챔버 및/또는 제2 챔버를 향하여 이동시키거나 진동시킬 수 있도록 하는 두께일 수 있다. 또한, 상기 두께는 선택된 탄성물질에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 두께는 10μm 내지 5000μm, 예를 들면, 10μm 내지 1000μm, 50μm 내지 1000μm, 100μm 내지 1000μm, 200μm 내지 1000μm, 300μm 내지 1000μm, 400μm 내지 1000μm, 500μm 내지 1000μm, 700μm 내지 1000μm, 10μm 내지 900μm, 50μm 내지 800μm, 100μm 내지 700μm, 200μm 내지 600μm, 또는 200μm 내지 500μm일 수 있다. 상기 압력 제공 수단은 공압 펌프와 같은 펌프일 수 있다. 상기 압력제공 수단은 제2 챔버에 양압, 음압 및 이들의 조합을 주기적 또는 비주기적, 연속 또는 불연속적으로 제공할 수 있도록 하는 압력 조절기 (controller)에 연결될 수 있다. 상기 압력 제공 수단은 제2 챔버에 제어된 압력을 제공할 수 있으며, 그에 따라 상기 탄성막은 압력에 따라 신장할 수 있다. 즉, 양압인 경우, 제1 챔버를 향하여 신장할 수 있으며, 음압인 경우, 제2 챔버를 향하여 신장할 수 있다. 또한 양압 및 음압의 조합이 제공되는 경우, 상기 탄성막은 제2 챔버에 압력이 인가되지 않은 휴지 위치 (resting position)에 대하여 진동할 수 있다. 상기 진동은 제1 챔버 중의 고체 지지체 사이에 충돌 (solid support collision)을 유도할 수 있다. 상기 충돌은 상기 고체 지지체에 결합된 표적물질의 처리, 예를 들면 세포의 경우 파쇄 (lysis)를 유도할 수 있다. 또한, 용액과 고체 지지체의 상호작용을 촉진시킬 수 있다. 상기 탄성막은 제1 챔버 또는 제2 챔버를 향하여 신장된 상태를 유지하면서, 진동될 수 있다.
상기 압력 조절기는 상기한 일 양상에 따른 시료 중의 표적물질을 처리하는 방법에서, 시료를 제1 챔버에 도입하는 단계 및 그 후의 처리 단계 중 하나 이상의 단계에서 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태 또는 제2 챔버에 음압을 제공하여 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태가 되도록 하는 신호가 저장된 저장 매체를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 저장매체는 세포를 포함하는 시료에 대하여, 시료 도입 단계, 및 세척 단계는 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태가 되도록 하는 신호가 저장된 것일 수 있으며, 세포 파쇄 단계는 제2 챔버에 음압을 제공하여 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태가 되도록 하는 신호가 저장된 것일 수 있다.
또한, 상기 저장매체는 표적물질로서, 핵산, 단백질 또는 당을 포함하는 시료에 대하여, 시료 도입 단계, 세척 단계 및 표적물질 용출 단계는 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태가 되도록 하는 신호가 저장된 것일 수 있는 것일 수 있다.
또한, 상기 저장 매체는 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태 또는 제2 챔버에 음압을 제공하여 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태가 되도록 하는 신호가 저장된 동시에, 이 상태에서 탄성막이 진동하도록 하도록 압력 변이를 제공하도록 하는 신호가 저장 매체를 포함하는 것일 수 있다.
따라서, 상기 방법은 상기 저장 매체에 저장된 압력 조절 신호에 따라 제2 챔버의 압력을 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 조절은 마이크로프로세서에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 마이크로프로세서는 상기 저장 매체에 작동가능하게 연결된 것일 있다. 상기 저장 매체는 마이크로프로세서 판독가능한 것일 수 있다.
상기 고체 지지체는 세포 파쇄 수단으로 사용될 수 있도록 충분히 굳은 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 고체 물질로 되어 있어 있거나 고체 물질로 코팅된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 자성 또는 비자성 고체 지지체일 수 있다. 상기 고체 지지체는 유리 비드, 금속 비드, 및 금속 산화물 중 하나이상으로 된 비드일 수 있다. 상기 금속 산화물로는 ZrO2, SiO2, Al2O3, Fe2O3, TiO2 및 이들의 혼합물 중 어느 하나일 수 있다. 상기 혼합물은, 예를 들면 ZrO2와 SiO2를 포함하는 혼합물일 수 있다. 상기 금속 비드는, 예를 들면 스틸 또는 스테린리스 스틸일 수 있다.
상기 고체 지지체는 반드시 마이크로미터 수준의 치수를 갖는 것은 아니며, 상기 장치의 작동에 의하여 시료를 처리하는 데 사용, 예를 들면, 세포를 파쇄할 수 있는 치수를 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 고체 지지체는 단면의 가장 긴 폭의 길이가 10nm 내지 1000μm, 10nm 내지 500μm, 100nm 내지 100μm, 또는 1μm 내지 500μm인 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 구형, 판형, 또는 복수의 면을 갖는 형태일 수 있다. 상기 고체 지지체는 제1 챔버 중 복수개 예를 들면, 2개 이상, 10개, 100개, 1000개, 10,000개, 100,000개 또는 108개 이상을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 고체 지지체는 챔버 중 상기 1-108개, 예를 들면, 10-108개, 100-108개, 1000-108개,104-108개,105-108개,106-108개,107-108개, 10-107개, 100-107개, 1000-107개,104-107개,105-107개, 또는 106-107개 포함되는 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 제1 챔버의 제조시에 미리 도입되어 있어 입구 또는 출구를 통하여 배출될 수 없도록 되어 있는 것일 수 있다. 상기 고체 지지체의 밀도는 D>1g/㎤, 예를 들면, 1-20g/㎤일 수 있다.
제1 챔버의 벽면 및 고체 지지체의 표면 중 하나이상은 표적물질, 예를 들면 세포 또는 바이러스와 결합하는 물질로 되어 있거나 그 물질이 결합되어 있는 것일 수 있다. 상기 결합하는 물질은 상기 세포 또는 바이러스와 특이적으로 결합하는 물질인 것일 수 있다. 상기 특이적으로 결합하는 물질은 항원에 대한 항체, 효소에 대한 기질 또는 저해제, 기질에 대한 효소, 리간드에 대한 수용체, 수용체에 대한 리간드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 결합하는 물질은 상기 세포 또는 바이러스와 비특이적으로 결합하는 물질인 것일 수 있다. 상기 비특이적으로 결합하는 물질은 물접촉각 70°내지 95°의 소수성을 갖는 물질 또는 하나이상의 아미노기를 갖는 물질인 것일 수 있다. 상기 하나이상의 아미노기를 갖는 물질은 중합체인 것일 수 있다. 상기 하나이상의 아미노기를 갖는 물질은 폴리에틸렌이민 (PEIM)인 것일 수 있다. 상기 물접촉각 70°내지 95°의 소수성을 갖는 물질은 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필) 암모늄 클로리드 [octadecyldimethyl(3-trimethoxysilyl propyl) ammonium chloride: OTC] 또는 트리테카플루오로테르라히드로옥틸 트리메톡시실란 (tridecafluorotetrahydrooctyl trimethoxysilane:DFS)인 것일 수 있다. 따라서, 상기 결합하는 물질을 포함하는 제1 챔버의 벽면 및 고체 지지체의 표면은 세포 또는 바이러스를 포획 또는 흡착하여 세포 또는 바이러스 분리에 사용될 수 있다. 상기 고체 지지체는 제1 챔버의 벽면에 결합되지 않고 내부에 포함된 것일 수 있다.
상기 미세유동장치는 제2 챔버가 각각 압력 제공 수단에 연결된 복수 개의 서브챔버를 포함하고, 제1 챔버와 제2 챔버의 각 서브챔버 사이에 위치하고 제1 챔버와 제2 챔버의 각 서브챔버의 벽의 적어도 일부분을 이루는 탄성막을 포함하는 것일 수 있다.
제2 챔버에 제공되는 양압은 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 움직이게 함으로써, 제1 챔버에 포함된 고체 지지체의 표면적은 그대로 유지하면서, 그 부피를 감소시킬 수 있다. 즉, 챔버 부피에 대한 고체 지지체의 표면의 비 (SVR)를 증가시킬 수 있다. 상기 방법은 입구 및 출구 하나 이상이 개방된 상태에서 제2 챔버에 양압을 제공하여, 제1 챔버 부피에 대한 고체 지지체의 표면의 비 (SVR)를 증가시키는 단계를 포함한다. 제2 챔버에 제공되는 양압은 예를 들면, 제1 챔버의 부피에 대한 상기 고체 지지체의 표면적의 비 (surface-to-volume ratio: SVR) 값이 0.05 이상, 예를 들면, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 또는 0.15 이상이 되도록 하는 것일 수 있다. 예를 들면, SVR이 0.05 내지 0.15, 0.11 내지 0.15, 0.12 내지 0.15, 0.13 내지 0.15, 0.14 내지 0.15, 0.10 내지 0.14, 0.11 내지 0.14, 0.12 내지 0.14, 또는 0.13 내지 0.14가 되도록 하는 것일 수 있다. 또한, 제2 챔버에 제공되는 음압은 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 움직이게 함으로써, 제1 챔버에 포함된 고체 지지체의 표면적은 그대로 유지하면서, 그 부피를 증가시킬 수 있다. 즉, 챔버 부피에 대한 고체 지지체의 표면의 비 (SVR)를 감소시킬 수 있다. 상기 방법은 입구 및 출구 하나 이상이 개방된 상태에서 제2 챔버에 음압을 제공하여, 제1 챔버 부피에 대한 고체 지지체의 표면의 비 (SVR)를 감소시키는 단계를 포함한다. 또한, 제2 챔버에 제공되는 양압, 음압 또는 이들의 조합은 상기 탄성막을 진동하게 할 수 있다. 상기 양압 또는 음압의 크기는 선택되는 탄성막 및 그 두께에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 200μm 내지 300μm PDMS 막에 대하여 상기 양압은 10 내지 300kPa, 예를 들면, 30 내지 300kPa, 50 내지 300kPa, 70 내지 300kPa, 100 내지 300kPa, 200 내지 300kPa, 10 내지 200kPa, 30 내지 150kPa, 또는 50 내지 100kPa일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 시료 도입 단계 및 그 이후의 시료 처리 단계 중 하나 이상의 각 단계는 제2 챔버에 제공되는 양압만이 제공된 상태에서 수행되는 것일 수 있다. 즉, 각 단계 중에는 양압이 제거되거나 음압이 제공되지 않은 상태에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 방법의 일 구체예는, 상기 표적물질은 세포이고, 상기 탄성막을 진동시켜, 상기 세포를 파쇄하는 단계를 더 포함하는 것이다. 상기 세포는 박테리아 세포일 수 있다. 박테리아 세포는 예를 들면, 그람 양성 또는 음성 세포일 수 있다. 상기 진동은 제2 챔버에 양압, 음압 또는 이들의 조합을 제공함으로써 제공되는 것일 수 있다.
상기 구체예에서, 상기 탄성막은 0.001Hz-100kHz, 예를 들면, 0.01Hz-100kHz, 0.1Hz-100kHz, 1Hz-100kHz, 5Hz-100kHz 또는 10Hz-100kHz로 진동시키는 것일 수 있다. 압력은 상기 입구 및 출구 중 하나 이상에 연결된 유체의 유입 및 유출을 위한 동력을 제공하는 수단에 의하여 제공될 수 있다. 상기 동력 제공 수단은 유체의 이동을 유도할 수 있는 것, 예를 들면, 펌프를 포함한 상기 챔버에 양압 또는 음압을 제공할 수 있는 것일 수 있다. 상기 펌프는 미세유동장치에 구현될 수 있는 미세펌프(micropump)일 수 있다. 상기 미세펌프는 기계적 또는 비기계적 장치일 수 있다. 상기 기계적 미세펌프는 보통 발동기(actuator) 및 막 또는 플랩(flaps)인 움직이는 부분(moving parts)을 포함한다. 구동력은 압전(piezoelectric), 정전기적(electrostatic), 열공압적(thermo-pneumatic), 공압(pneumatic) 또는 자기적 효과를 이용하여 생성될 수 있다. 비기계적 펌프는 전기-수동력(electro-hydrodynamic), 전기-삼투적(electro-osmoticc) 또는 초음파 흐름 발생에 의하여 기능할 수 있다.
다른 구체예는, 상기 표적물질은 세포이고, 상기 시료 도입 후 제2 챔버에 음압을 제공하여 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태 (예, SVR 값 0.05 미만)에서 제1 챔버에 세포 파쇄액을 도입하여 상기 고체 지지체에 결합된 표적물질을 파쇄하는 단계를 더 포함하는 것이다. 상기 세포는 박테리아 세포일 수 있다. 박테리아 세포는 예를 들면, 그람 양성 또는 음성 세포일 수 있다. 상기 세포 파쇄액의 도입은 출구를 폐쇄시킨 상태에서 이루어질 수도 있고, 시료 도입 후 입구를 폐쇄시키는 단계를 포함할 수 있다. 그러나, 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서, 즉 출구를 폐쇄하지 않더라도 세포 파쇄액이 출구로 방출되지 않도록 하는 공간이 발생하고 있기 때문에, 출구를 폐쇄시키지 않은 상태에서 세포 파쇄액을 도입하는 것도 가능하다. 따라서, 일 구체예는, 출구를 폐쇄시키지 않은 상태에서 세포 파쇄액을 도입하는 단계를 포함한다. 상기 세포 파쇄액은 세포를 파쇄하는 것으로 알려진 물질을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 리소자임과 같은 효소를 포함하는 특이적 세포 파쇄 물질 또는 계면활성제와 같은 비특이적 세포 파쇄물질을 포함하는 것일 수 있다. 비특이적 세포 파쇄물질은 예를 들면, NaOH 또는 KOH 용액일 수 있다. 상기 세포 파쇄액의 도입은 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 즉, 휴지 수준에 비하여 제1 챔버의 SVR이 감소된 상태에서 수행하여, 고체 지지체에 의한 유체 저항을 적게 하여, 소량 용액의 제어를 용이하게 할 수 있다.
상기 구체예에서, 상기 세포 파쇄액의 도입 후 상기 탄성막을 진동시켜 세포 파쇄를 촉진하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 진동은 양압, 음압 및 이들의 조합을 제공하여 유도되는 것일 수 있다. 상기 진동은 제1 챔버 중의 고체 지지체 사이에 충돌 (solid support collision)을 유도할 수 있다. 상기 충돌은 상기 고체 지지체에 결합된 표적물질의 처리, 예를 들면 세포의 경우 파쇄 (lysis)를 촉진할 수 있다.
상기 구체예에서, 상기 탄성막은 0.001Hz-100kHz, 예를 들면, 0.01Hz-100kHz, 0.1Hz-100kHz, 1Hz-100kHz, 5Hz-100kHz 또는 10Hz-100kHz로 진동시키는 것일 수 있다. 압력은 상기 입구 및 출구 중 하나 이상에 연결된 유체의 유입 및 유출을 위한 동력을 제공하는 수단에 의하여 제공될 수 있다. 상기 동력 제공 수단은 유체의 이동을 유도할 수 있는 것, 예를 들면, 펌프를 포함한 상기 챔버에 양압 또는 음압을 제공할 수 있는 것일 수 있다. 상기 펌프는 미세유동장치에 구현될 수 있는 미세펌프(micropump)일 수 있다. 상기 미세펌프는 기계적 또는 비기계적 장치일 수 있다. 상기 기계적 미세펌프는 보통 발동기(actuatore) 및 막 또는 플랩(flaps)인 움직이는 부분(moving parts)을 포함한다. 구동력은 압전(piezoelectric), 정전기적(electrostatic), 열공압적(thermo-pneumatic), 공압(pneumatic) 또는 자기적 효과를 이용하여 생성될 수 있다. 비기계적 펌프는 전기-수동력(electro-hydrodynamic), 전기-삼투적(electro-osmoticc) 또는 초음파 흐름 발생에 의하여 기능할 수 있다.
상기 구체예에서, 상기 파쇄 단계 전에, 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버에 세척액을 도입하여 상기 고체 지지체에 결합되지 않은 물질 또는 약하게 결합된 물질을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 탄성막은 또한, 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서, 진동시킬 수 있다. 예를 들면, 세척 중 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서, 즉, 제2 챔버에 양압을 제공하는 것을 유지하면서, 제2 챔버에 압력의 변이를 제공함으로써 상기 탄성막을 진동시킬 수 있다. 이렇게 함으로써, 세척의 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 진동의 빈도를 조절함으로써, 세척에 의하여 제거되는 물질의 양 및/또는 종류를 조절할 수 있다. 즉, 세척의 엄격도 (stringency)를 조절할 수 있다.
상기 구체예에서, 상기 세척 단계 후, 제2 챔버를 가압하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버의 입구로부터 출구를 통하여 기체를 흘려줌으로써 상기 고체 지지체를 건조시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 기체는 공기 또는 질소일 수 있다.
상기 구체예에서, 상기 표적물질에 결합하는 물질은 물접촉각 70도 내지 95도인 표면을 갖는 물질, 또는 1차, 2차, 3차, 및 4차 아미노기로부터 선택된 하나이상의 아미노기를 갖는 하나이상의 아미노실란 모이어티를 가진 물질일 수 있다. 또한, 상기 파쇄는 NaOH 용액 중에서 이루어질 수 있다. NaOH 용액의 주입에 의하여 세포를 파쇄하고, 세포로부터 핵산을 방출시킬 수 있다. 그 후 NaOH 용액을 회수함으로써, 분리된 핵산을 포함하는 용액을 얻을 수 있다.
상기 구체예에서, 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버에 용리액을 도입하여 상기 고체 지지체를 포함하고 있는 제1 챔버 중의 핵산을 용출시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 용출은 핵산을 고체 지지체로부터 분리하는 조건에서 이루어질 수 있다. 상기 조건은 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 상기 용리액은 생화학적 버퍼 (PBS), 물, 염수, Tris 버퍼, NaOH 등일 수 있다.
상기 방법의 다른 구체예는, 미세유동장치의 표적물질에 결합하는 물질을 포함하는 고체 지지체를 포함하는 제1 챔버에 표적물질을 포함하는 시료를 도입하여 표적물질을 상기 고체 지지체에 결합시키는 단계를 포함하는, 시료 중의 표적물질을 처리하는 방법으로서, 상기 미세유동장치는 입구 및 출구를 포함하는 제1 챔버, 압력 제공 수단이 연결된 제2 챔버 및 제1 챔버와 제2 챔버의 사이에 위치하고 제1 챔버와 제2 챔버의 적어도 일부분의 벽을 형성하는 탄성막을 포함하는 것이고, 상기 도입 단계 및 그 후의 처리 단계 중 하나 이상의 단계는 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 수행하는 단계이고, 상기 표적물질은 세포이고, 상기 표적물질에 결합하는 물질은 물접촉각 70도 내지 95도인 표면을 갖는 물질, 또는 1차, 2차, 3차, 및 4차 아미노기로부터 선택된 하나이상의 아미노기를 갖는 하나이상의 아미노실란 모이어티를 가진 물질이고, 상기 도입은 pH 3.0 내지 6.0, 염 농도 10mM 내지 500mM에서 이루어지는 것인 단계이고,
제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버로 신장시킨 상태에서 제1 챔버에 세척액을 도입하여 상기 고체 지지체에 결합하지 않은 물질 또는 약하게 결합된 물질을 제거하는 단계;
제2 챔버에 음압을 제공하여 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버에 세포 파쇄액을 도입하여 상기 고체 지지체에 결합된 표적물질을 파쇄하는 단계; 및 상기 파쇄 단계 후에, 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버에 용리액을 도입하여 제1 챔버 중의 핵산을 용출시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법을 제공한다.
상기 방법의 다른 구체예는, 미세유동장치의 표적물질에 결합하는 물질을 포함하는 고체 지지체를 포함하는 제1 챔버에 표적물질을 포함하는 시료를 도입하여 표적물질을 상기 고체 지지체에 결합시키는 단계로서, 상기 미세유동장치는 입구 및 출구를 포함하는 제1 챔버, 압력 제공 수단이 연결된 제2 챔버 및 제1 챔버와 제2 챔버의 사이에 위치하고 제1 챔버와 제2 챔버의 적어도 일부분의 벽을 형성하는 탄성막을 포함하는 것이고, 상기 표적물질은 핵산이고, 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 수행하는 단계;
제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버에 세척액을 도입하여 상기 고체 지지체에 결합하지 않은 물질 또는 약하게 결합된 물질을 제거하는 단계; 및
제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버에 용리액을 도입하여 상기 고체 지지체로부터 핵산을 용출시키는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공하는 것이다.
상기 구체예에서, 상기 표적물질에 결합하는 물질은 핵산에 결합하는 물질로서, 임의의 알려진 물질일 수 있다. 핵산에 결합하는 물질은 특이적 또는 비특이적 결합물질일 수 있다. 예를 들면, 금속 산화물, 전기적 양성 특성을 띄는 관능기를 갖는 물질, 전기적 음성 특징을 갖는 관능기를 갖는 물질, 또는 전기적 양성과 음성 특성을 띄는 관능기를 동시에 갖는 물질일 수 있다. 금속 산화물에는 ZrO2, SiO2, Al2O3, Fe2O3, TiO2 및 이들의 혼합물 중 어느 하나일 수 있다. 전기적 양성 특성을 갖는 관능기로는 1차, 2차, 3차, 또는 4차 아미노기일 수 있다. 전기적 음성을 띄는 관능기로는 카르복실기 등일 수 있다. 상기 핵산에 결합하는 물질은 카오프로픽 또는 코스모트로픽 염 용액, 폴리에틸렌 글리콜과 같이 핵산 결합 촉진 물질을 함유하고 있는 버퍼 예를 들면, 생화학적 버퍼 중에서 핵산과 결합되어, 그 결합을 최적화시킬 수 있다. 상기 시료는 세포 파쇄물 또는 바이러스 파쇄물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 구체예에서, 상기 세척액은 고체 지지체에 결합된 핵산을 실질적으로 제거하지 않으면서, 상기 고체 지지체에 결합하지 않은 물질 또는 약하게 결합된 물질을 제거하는 것일 수 있다. 세척액 및 세척 조건은 당업자가 적절하게 선택할 수 있다.
상기 구체예에서, 용리액은 고체 지지체에 결합되어 있는 핵산을 이탈시키는 성질을 갖는 것으로, 임의의 알려진 용액일 수 있다. 예를 들면, 물, 버퍼 (예, PBS, TRIS 버퍼)일 수 있다. 용리액 및 용출 조건은 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 핵산의 용출은 용출에 사용된 용리액의 조건, 예를 들면, 염 농도, pH 등을 최적화하여 그 목적을 달성할 수 있다. 본 구체예에서, 달리 언급되지 않은 요소는 위에서 설명한 바와 동일하며, 중복을 회피하기 위하여 다시 기재하지 않는다.
도 1은 상기 시료 중의 표적물질을 처리하는 방법에 사용될 수 있는 미세유동장치의 일 구체예(20)를 나타내는 도면이다. 도 1을 참조하면, 장치(20)는 상판(21), 하판(23), 및 막(26)을 포함한다. 막(26)은 상판(21)과 하판(23) 사이에 구비된다. 상판(21)의 일부분에 마련된 공간이 제1 챔버(22)를 형성하고, 하판(23)의 일부분에 마련된 공간이 제2 챔버(24)를 형성한다. 제1 및 제2 챔버(22, 24)는 막(26)으로 분리되어 있어 제1 및 제2 챔버(22, 24) 사이에 막(26)이 구비된 것으로 볼 수 있다. 부연 설명하면, 제1 챔버(22)는 상판(21)과 막(26)에 의하여 경계가 형성되는 공간이고, 제2 챔버(24)는 하판(23)과 막(26)에 의하여 경계가 형성되는 공간이다.
막(26)은 가요성(flexible) 또는 탄성인 것으로 폴리머 막일 수 있는데, 예를 들면 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane: PDMS) 막일 수 있다. 막(26)의 두께는, 예를 들면 1㎛-5mm일 수 있다. 제1 챔버(22)는 복수의 고체 지지체를 포함한다. 도 1은 이러한 고체 지지체의 예로서 마이크로입자(28)를 보여주고 있다. 제1 챔버(22)는 막(26)에 의해 경계가 형성되므로 마이크로입자(28)는 막(26)과 접촉할 수 있다. 마이크로입자(28)는, 예를 들면 1-1,000㎛의 직경을 갖는 것일 수 있다. 제1 챔버(22) 내에서 마이크로입자(28)의 밀도(D)는 D>1g/㎤일 수 있는데, 예를 들면 밀도(D)는 1-20g/㎤일 수 있다. 상기 마이크로입자는 액체 매질 1㎕ 당 1개 이상, 예를 들면, 10개, 100개, 1000개, 10000개, 또는 109개 이상 포함되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 마이크로입자는 챔버 중의 액체 매질 1㎕ 당 상기 1-108개, 예를 들면, 100-106개로 챔버 중에 포함되는 것일 수 있다. 마이크로입자(28)는 유리 비드(glass bead)일 수 있다. 또한, 마이크로입자(28)는 금속 산화물 비드 혹은 금속 비드일 수 있다. 상기 금속 산화물로는 ZrO2, SiO2, Al2O3, Fe2O3, TiO2 및 이들의 혼합물 중 어느 하나일 수 있다. 상기 혼합물은, 예를 들면 ZrO2와 SiO2를 포함하는 혼합물일 수 있다. 상기 금속 비드는, 예를 들면 스틸(steel) 또는 스렌리스 스틸(stainless steel)일 수 있다. 마이크로입자(28)가 유리 혹은 금속 산화물의 조성을 갖는 경우, 세포 포획 또는 흡착을 위한 표면 개질(surface modification)을 용이하게 수행할 수 있다.
장치(20)는 유입구(30)와 유출구(32)를 포함한다. 유입구(30)와 유출구(32)의 직경은 마이크로입자(28)의 직경보다 작을 수 있다. 유입구(30)를 통해서 파쇄 대상 세포를 포함하는 용액이 제1 챔버(22)에 유입된다. 유출구(32)를 통해서 세포벽 파쇄에 따른 핵산 등을 포함하는 파쇄 결과물이 유출된다. 유입구(30)는 상판(21)의 한쪽 벽을 관통하여 제1 챔버(22)의 한쪽과 연결된다. 유출구(32)는 상판(21)의 다른 쪽 벽을 관통하여 제1 챔버의 다른 쪽에 연결된다.
제2 챔버(24)는 막(26)을 주기적 또는 비주기적으로 가압하는 유체, 예컨대 공기가 유입되는 공간을 포함하는 공압챔버(pneumatic chamber)일 수 있다. 제2 챔버(24)에 압력이 높은 유체가 유입됨으로써 막(26)은 압력을 받게 된다. 막(26)이 압력을 받게 되면 막(26)은 제1 챔버(22)쪽으로 볼록하게 되어 제1 챔버(22)의 공간 부피가 감소하고, 감압하게 되면 막(26)은 제2 챔버(24) 아래쪽으로 오목하게 된다. 제2 챔버(24)는 챔버 내부를 가압할 유체의 유입 통로이면서 상기 유체의 배출 통로인 포트(port)(34)를 갖고 있다. 포트(34)를 통해서 제2 챔버(24)에 유체를 주기적 또는 비주기적으로 유입 및 배출시킴으로써, 막(26)은 주기적 또는 비주기적으로 진동될 수 있다. 이러한 막(26)의 진동은 마이크로입자(28)와 직접적인 접촉 혹은 제1 챔버(22)에 포함된 용액을 통하여 결국 제1 챔버(22)에 있는 마이크로입자(28)에 주기적 또는 비주기적 압력을 가하게 된다. 이 결과 마이크로입자(28)의 이동(motion)이 유도되고, 이러한 마이크로입자의 이동 과정에서 마이크로입자(28)는 서로 충돌하거나 챔버의 벽면과 충돌하게 된다. 마이크로입자(28)의 이러한 이동에 의해 제1 챔버(22) 내부에 유입된 표적물질, 예를 들면 세포들은 전단(shearing) 또는 그라인딩(grinding)되어 세포들은 파쇄된다. 제2 챔버(24)에 대한 유체의 공급 및 배출을 통한 제2 챔버(24) 내부의 가압 및 감압은 막(26)의 진동수가 0.001Hz-100kHz가 되도록 자유롭게 제어할 수 있다.
한편, 마이크로입자(28)는 도 2에 도시한 바와 같이 표면에 특이적(specific) 혹은 비특이적(nonspecific) 표적물질 결합 물질, 예를 들면 세포 포획이 가능한 물질(28A)이 존재할 수 있다. 예를 들면, 특정한 세포만을 포획하는 경우, 마이크로입자(28) 표면에 항체 또는 앱타머 등을 코팅할 수 있다. 비특정 세포의 경우, 소수성 혹은 정전기적 힘의 작용에 의해 포획될 수 있다. 상기 결합 물질은 상기한 물접촉각 70도 내지 95도인 표면을 갖는 물질, 또는 1차, 2차, 3차, 및 4차 아미노기로부터 선택된 하나이상의 아미노기를 갖는 하나이상의 아미노실란 모이어티를 가진 물질일 수 있다.
물질(28A)은 유기 실란(organosilane)과 같은 알려진 물질을 이용하여 다양하게 마이크로입자(28) 표면을 개질하여 형성할 수 있다.
이와 같이 마이크로입자(28)의 표면에 특정 또는 비특정 세포에 대한 친화도를 갖는 물질이 존재하는 경우, 제1 챔버(22)에 유입된 세포는 마이크로입자(28)에 포획될 수 있다. 이러한 상태에서 막(26)이 진동되면, 마이크로입자(28)의 운동이 야기되면서 서로 또는 벽면과 부딪치게 된다. 이러한 과정에서 마이크로입자(28)에 포획된 세포는 파쇄될 수 있다.
한편, 제1 챔버(22)에 파쇄할 세포를 포함하는 용액을 공급한 다음, 세포 파쇄 효과를 증가시킬 수 있는 물질을 제1 챔버(22)에 공급한 후, 세포 파쇄를 실시할 수 있다. 이때, 상기 물질은 세포 용해액(lysis solution)일 수 있다. 상기 세포 용해액은, 예를 들면 NaOH, KOH, 카오트로프 용액, 계면활성제 등일 수 있다. 이러한 물질의 사용 농도는 세포 파쇄 후의 후속 공정, 예를 들면 PCR에 영향을 주지 않을 정도의 농도를 사용함으로써 세포 파쇄후 추가적인 정제 과정 없이 PCR에 적용할 수 있다. PCR에 영향을 미치는 농도를 사용하는 경우, 정제과정을 추가로 수행할 수 있다. 상기 세포 용해액은 세포 파쇄후에 공급하여, 핵산을 용이하게 배출시키는데 사용할 수도 있다.
다른 한편으로, 상기 세포를 포함하는 용액을 제1 챔버(22)에 공급한 다음,제1 챔버(22)에 추가적으로 세포 용해액을 공급함이 없이 세포 파쇄를 실시할 수 있다.
도 3은 도 1의 장치(20)의 변형예를 보여준다. 도 1과 다른 부분에 대해서만 설명한다. 다른 도면에 대해서도 동일하다.
도 3을 참조하면, 유입구(30)와 유출구(32)의 직경은 마이크로입자(28)의 직경보다 크다. 유입구(30)의 내면에 복수의 제1 돌기(40)가 분포되어 있다. 복수의 제1 돌기(40)는 유입구(30) 내면에 균일하게 분포될 수 있다. 복수의 제1 돌기(40)는 서로 마주하도록 구비될 수 있다. 제1 돌기(40)에 의해 유입구(30)의 실질적 직경 혹은 유효 직경은 마이크로입자(28)보다 작아진다. 유출구(32)의 내면에는 제2 돌기(42)가 분포되어 있다. 제2 돌기(42)의 분포는 제1 돌기(40)의 분포를 따를 수 있다. 제2 돌기(42)에 의해 유출구(32)의 실질적 혹은 유효 직경은 마이크로입자(28)보다 작을 수 있다. 제1 및 제2 돌기(40, 42)의 모양을 동일할 수 있으나, 다를 수도 있다. 제1 및 제2 돌기(40, 42)를 구비하는 대신, 유입구(30)와 유출구(32)의 내면 자체를 올록 볼록 주름지게 할 수도 있다.
도 4는 도 1의 장치(20)의 다른 변형예를 보여준다.
도 4를 참조하면, 유입구(30)의 구조적 특징은 도 3에서 설명한 바와 동일할 수 있다. 유출구(32)에 필터(44)가 구비될 수 있다. 필터(44)는 파쇄된 세포의 내용물이 통과할 수 있는 다공성 물질일 수 있다. 유입구(30)의 직경은 도 1에서처럼 마이크로입자(28)의 직경보다 작을 수 있다.
도 5는 도 1의 장치(20)의 또 다른 변형예를 보여준다.
도 5를 참조하면, 도 1의 제2 챔버(24) 위치에 2개의 챔버, 곧 제3 및 제4 챔버(24A, 24B)가 존재한다. 제3 및 제4 챔버(24A, 24B)는 격벽(48)으로 분리되어 있다. 제3 및 제4 챔버(24A, 24B)의 역할은 제2 챔버(24)와 동일할 수 있다. 제3 챔버(24A)는 제1 포트(34A)를 구비하고, 제4 챔버(24B)는 제2 포트(34B)를 구비한다. 제1 및 제2 포트(34A, 34B)의 역할은 제2 챔버(24)의 포트(34)와 동일할 수 있다. 유입구(30)와 유출구(32)의 구조적 특징은 도 3 또는 도 4의 경우와 동일할 수도 있다. 압력의 인가는 제1 및 제2 포트(34A, 34B)에 동시에 또는 순차적으로 인가되어 상기 막(26)이 동시에 또는 순차적으로 진동되도록 할 수 있다. 또한, 압력의 인가는 제1 및 제2 포트(34A, 34B)에 동일 또는 다른 위상의 압력이 인가되어 각 챔버의 상기 막(26)이 동일 또는 다른 위상으로 진동되도록 할 수 있다. 예를 들면, 압력의 인가는 제1 포트(34A)에 양압을 인가하고, 제2 포트(34B)에는 음압이 인가되어 제3 챔버(24A)의 상기 막(26)과 제4 챔버(24B)의 상기 막(26)이 서로 반대 위상으로 진동하도록 하는 것일 수 있다.
도 6은 도 1의 장치(20)의 또 다른 변형예를 보여준다.
도 6을 참조하면, 도 1의 제2 챔버(24)의 위치에 3개의 챔버, 곧 제3 내지 제5 챔버(24A, 24B, 24C)가 존재한다. 제3 내지 제5 챔버(24A, 24B, 24C)의 역할은 도 1의 제2 챔버(24)와 동일할 수 있다. 제3 및 제5 챔버(24A, 24C)는 제1 격벽(48A)으로 분리되어 있다. 제4 및 제5 챔버(34B, 34C)는 제2 격벽(48B)으로 분리되어 있다. 제3 내지 제5 챔버(24A, 24B, 24C)는 각각 제1 내지 제3 포트(34A, 34B, 34C)를 갖고 있다. 제1 내지 제3 포트(34A, 34B, 34C)의 역할은 제2 챔버(24)의 포트(34)와 동일할 수 있다. 도 6은 도 1의 제2 챔버(24)를 3개의 챔버로 분할한 경우를 보여주지만, 도 1의 제2 챔버(24)는 3개 이상의 챔버로 분할될 수 있다. 압력의 인가는 제1 내지 제3 포트(34A, 34B, 34C)에 동시에 또는 순차적으로 인가되어 각 챔버의 상기 막(26)이 동시에 또는 순차적으로 진동되도록 할 수 있다. 또한, 압력의 인가는 제1 내지 제3 포트(34A, 34B, 34C)에 동일 또는 다른 위상의 압력이 인가되어 각 챔버의 상기 막(26)이 동일 또는 다른 위상으로 진동되도록 할 수 있다. 예를 들면, 압력의 인가는 제1 포트(34A) 및 제3 포트(34C)에 양압을 인가하고, 제2 포트(34B)에는 음압을 인가하여 제3 챔버 및 제5 챔버(24A, 24C)의 상기 막(26)과 제4 챔버(24B)의 상기 막(26)이 서로 반대 위상으로 진동하도록 하는 것일 수 있다.
도 1 및 도 3 내지 도 6에서 제1 및 제2 챔버(22, 24)의 역할은 바뀔 수도 있다. 곧, 제1 및 제2 챔버(22, 24) 중 어느 하나에 마이크로입자(28)가 구비될 수 있고, 나머지 하나는 가압을 위한 유체가 유입되는 챔버로 사용될 수도 있다. 또한, 제2 챔버(24)가 가압을 위한 유체가 유입되는 챔버일 때, 제2 챔버(24)의 포트(34)는 제2 챔버(24) 내부를 가압 또는 감압할 수 있는 압력 조절기(미도시)에 연결될 수 있다. 제3 내지 제5 챔버(24A, 24B, 24C) 또한 마찬가지다.
일 양상에 따른 시료 중의 표적물질을 처리하는 방법에 따르면, 시료 중의 표적물질을 효율적으로 처리할 수 있다. 상기 처리는 표적물질 결합, 세척, 건조, 및 이들의 조합을 포함한다. 표적물질이 세포 및/또는 생물물질인 경우, 상기 처리는 세포 결합, 세척, 건조, 파쇄 및 생물물질 분리를 포함한다. 또한, 상기 양상에 따르면, 탄성막의 굴절을 이용하여 고체 지지체가 충진된 챔버의 SVR을 일정하게 조절함으로서, 고체 지지체 표면과 시료 중의 표적물질의 상호작용을 증가시킬 수 있다.
다른 양상은 입구 및 출구를 포함하는 제1 챔버, 압력 제공 수단이 연결된 제2 챔버 및 제1 챔버와 제2 챔버의 사이에 위치하고 제1 챔버와 제2 챔버의 적어도 일부분의 벽을 형성하는 탄성막을 포함하고,제1 챔버는 표적물질에 결합하는 물질을 포함하는 고체 지지체를 포함하는 것인 미세유동장치를 제공한다.
상기 미세유동장치에 대한 설명 중, 상기 시료 중의 표적물질을 처리하는 방법에 사용된 미세유동장치와 중복되는 부분에 대하여는 달리 언급이 없는 상기한 바와 같으며, 중복을 회피하기 위하여 설명이 생략될 수 있다.
상기 미세유동장치는 시료 중의 표적물질을 처리하기 위한 장치일 수 있다. 상기 처리는, 표적 물질을 제1 챔버에 도입하는 단계, 고체 지지체에 결합시키는 단계, 세척하는 단계, 건조시키는 단계, 상기 탄성막을 진동시켜 제1 챔버 중의 고체 지지체를 교반하는 단계, 고체 지지체에 결합되거나 제1 챔버 중에 존재하는 표적물질을 제1 챔버 밖으로 배출하는 단계 중 하나 이상을 포함한다. 상기 교반에 의하여 상기 고체 지지체에 충돌이 유도될 수 있다.
상기 미세유동장치에 있어서, 제1 챔버에는 유체의 이동을 위한 구동력을 제공하기 위한 압력 제공수단이 연결될 수 있다. 또한, 상기 미세유동장치는 제1 챔버에 유체 소통가능하게 연결된 하나 이상의 저장소를 포함할 수 있다. 상기 저장소는 세척액, 용리액, 및/또는 pH 조절제 저장소 중 하나이상일 수 있다.
"미세유동장치 (microfluidic)"란 단면의 길이가 마이크로센티 미터 범위인 하나이상의 채널 또는 챔버를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 가장 긴 단면이 1um 내지 1000um인 하나이사의 채널 또는 챔버를 갖는 것일 수 있다.
상기 미세유동장치에 있어서, 상기 입구 및/또는 출구는 제1 챔버에 실질적으로 이격 없이 배치되어 있거나, 유체소통가능하게 채널에 의하여 연결된 것일 수 있다. 제1 챔버 및/또는 제2 챔버는 제2 챔버에 양압 또는 음압이 제공되지 않은 상태에서, 1ul 내지 500ul, 예를 들면, 1ul 내지 500ul,10ul 내지 500ul, 20ul 내지 500ul, 50ul 내지 500ul, 75ul 내지 500ul, 100ul 내지 500ul, 200ul 내지 500ul, 300ul 내지 500ul, 400ul 내지 500ul, 또는 1ul 내지 400ul,1ul 내지 300ul, 1ul 내지 200ul, 1ul 내지 100ul, 10ul 내지 100ul, 20ul 내지 100ul, 50ul 내지 100ul, 또는 75ul 내지 100ul의 부피를 갖는 것일 수 있다.
상기 탄성막은 제2 챔버에 양압 또는 음압을 제공하여 탄성막을 제1 챔버 및/또는 제2 챔버를 향하여 이동시키거나 진동시킬 수 있도록 된 것일 수 있다. 상기 탄성막은 폴리디메틸실록산 (PDMS: polydimethylsiloxane), 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 테플론 (teflon), 또는 이들의 조합으로 된 것일 수 있다. 상기 탄성막의 두께는 제2 챔버에 양압 또는 음압을 제공하여 탄성막을 제1 챔버 및/또는 제2 챔버를 향하여 이동시키거나 진동시킬 수 있도록 하는 두께일 수 있다. 또한, 상기 두께는 선택된 탄성물질에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 두께는 10μm 내지 5000μm, 예를 들면, 10μm 내지 1000μm, 50μm 내지 1000μm, 100μm 내지 1000μm, 200μm 내지 1000μm, 300μm 내지 1000μm, 400μm 내지 1000μm, 500μm 내지 1000μm, 700μm 내지 1000μm, 10μm 내지 900μm, 50μm 내지 800μm, 100μm 내지 700μm, 200μm 내지 600μm, 또는 200μm 내지 500μm일 수 있다. 상기 압력 제공 수단은 공압 펌프와 같은 펌프일 수 있다. 상기 압력제공 수단은 제2 챔버에 양압, 음압 및 이들의 조합을 주기적 또는 비주기적, 연속 또는 불연속적으로 제공할 수 있도록 하는 압력 조절기 (pressure controller)에 연결될 수 있다. 상기 압력 제공 수단은 제2 챔버에 제어된 압력을 제공할 수 있으며, 그에 따라 상기 탄성막은 압력에 따라 신장할 수 있다. 즉, 양압인 경우, 제1 챔버를 향하여 신장할 수 있으며, 음압인 경우, 제2 챔버를 향하여 신장할 수 있다. 또한 양압 및 음압의 조합이 제공되는 경우, 상기 탄성막은 제2 챔버에 압력이 인가되지 않은 휴지 위치 (resting position)에 대하여 진동할 수 있다. 상기 진동은 제1 챔버 중의 고체 지지체 사이에 충돌 (solid support collision)을 유도할 수 있다. 상기 충돌은 상기 고체 지지체에 결합된 표적물질의 처리, 예를 들면 세포의 경우 파쇄 (lysis)를 유도할 수 있다. 또한, 용액과 고체 지지체의 상호작용을 촉진시킬 수 있다. 상기 탄성막은 제1 챔버 또는 제2 챔버를 향하여 신장된 상태를 유지하면서, 진동될 수 있다.
상기 압력 조절기는 상기한 일 양상에 따른 시료 중의 표적물질을 처리하는 방법에서, 시료를 제1 챔버에 도입하는 단계 및 그 후의 처리 단계 중 하나 이상의 단계에서 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태 또는 제2 챔버에 음압을 제공하여 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태가 되도록 하는 신호가 저장된 저장 매체를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 저장매체는 세포를 포함하는 시료에 대하여, 시료 도입 단계, 및 세척 단계는 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태가 되도록 하는 신호가 저장된 것일 수 있으며, 세포 파쇄 단계는 제2 챔버에 음압을 제공하여 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태가 되도록 하는 압력 제공 신호가 저장된 것일 수 있다.
또한, 상기 저장매체는 표적물질로서, 핵산, 단백질 또는 당을 포함하는 시료에 대하여, 시료 도입 단계, 세척 단계 및 표적물질 용출 단계는 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태가 되도록 하는 압력 제공 신호가 저장된 것일 수 있는 것일 수 있다.
또한, 상기 저장 매체는 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태 또는 제2 챔버에 음압을 제공하여 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태가 되도록 하는 신호가 저장된 동시에, 이 상태에서 탄성막이 진동하도록 하도록 압력 변이를 제공하도록 하는 신호가 저장 매체를 포함하는 것일 수 있다.
따라서, 상기 방법은 상기 저장 매체에 저장된 압력 조절 신호에 따라 제2 챔버의 압력을 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 조절은 마이크로프로세서에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 마이크로프로세서는 상기 저장 매체에 작동가능하게 연결된 것일 있다. 상기 저장 매체는 마이크로프로세서 판독가능한 것일 수 있다.
상기 고체 지지체는 예를 들면, 세포 파쇄 수단으로 사용될 수 있도록 충분히 굳은 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 고체 물질로 되어 있어 있거나 고체 물질로 코팅된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 자성 또는 비자성 고체 지지체일 수 있다. 상기 고체 지지체는 유리 비드, 금속 비드, 및 금속 산화물 중 하나이상으로 된 비드일 수 있다. 상기 금속 산화물로는 ZrO2, SiO2, Al2O3, Fe2O3, TiO2 및 이들의 혼합물 중 어느 하나일 수 있다. 상기 혼합물은, 예를 들면 ZrO2와 SiO2를 포함하는 혼합물일 수 있다. 상기 금속 비드는, 예를 들면 스틸 또는 스테린리스 스틸일 수 있다.
상기 고체 지지체는 반드시 마이크로미터 수준의 치수를 갖는 것은 아니며, 상기 장치의 작동에 의하여 시료를 처리하는 데 사용, 예를 들면, 세포를 파쇄할 수 있는 치수를 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 고체 지지체는 단면의 가장 긴 폭의 길이가 10nm 내지 1000μm, 10nm 내지 500μm, 100nm 내지 100μm, 또는 1μm 내지 500μm인 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 구형, 판형, 또는 복수의 면을 갖는 형태일 수 있다. 상기 고체 지지체는 제1 챔버 중 복수개 예를 들면, 2개 이상, 10개, 100개, 1000개, 10,000개, 100,000개 또는 108개 이상을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 고체 지지체는 챔버 중 상기 1-108개, 예를 들면, 10-108개, 100-108개, 1000-108개,104-108개,105-108개,106-108개,107-108개, 10-107개, 100-107개, 1000-107개,104-107개,105-107개, 또는 106-107개 포함되는 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 제1 챔버의 제조시에 미리 도입되어 있어 입구 또는 출구를 통하여 배출될 수 없도록 되어 있는 것일 수 있다. 상기 고체 지지체의 밀도는 D>1g/㎤, 예를 들면, 1-20g/㎤일 수 있다.
제1 챔버의 벽면 및 고체 지지체의 표면 중 하나이상은 표적물질, 예를 들면 세포 또는 바이러스와 결합하는 물질로 되어 있거나 그 물질이 결합되어 있는 것일 수 있다. 상기 표적물질에 결합하는 물질은 표적물질에 특이적 또는 비특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 특이적으로 결합하는 것은 예를 들면, 표적물질에 대하여 넓은 의미의 리간드와 수용체의 관계에 있는 것일 수 있다. 항원에 대하여 항체, 리간드에 대한 수용체, 효소와 기질 또는 억제인자 등이 포함될 수 있다. 비특이적으로 결합하는 박테리아 세포에 대하여, 상기 물질 물접촉각 70도 내지 95도인 표면을 갖는 물질, 또는 1차, 2차, 3차, 및 4차 아미노기로부터 선택된 하나이상의 아미노기를 갖는 하나이상의 아미노실란 모이어티를 가진 물질일 수 있다. 3차 아미노기는 아미드기 또는 니트릴기를 제외한, 3차 아미노기일 수 있다. 상기 아미노실란 모이어티는 고체 지지체의 표면에 아미노실란 분자를 침적시켜 얻어진 것일 수 있다. 상기 아미노실란 분자는 X1, X2, 및 X3이 각각 독립적으로 수소, 알콕시기 (-OR) 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되고, X1, X2, 및 X3 중 하나이상은 알콕시기인 식 (X1)(X2)(X3)Si(Y)를 갖는 유기 아미노실란 분자일 수 있다. 상기 알콕시기 (-OR)에 있어서, R은 1 내지 20개 탄소원자를 갖는 히드로카르보닐기일 수 있다. 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 등일 수 있다. 상기 할로겐은 F, Cl, Br, I 또는 At일 수 있다. Y는 하나이상의 아미노기를 가진 유기 모이어티일 수 있다. 상기 유기 모이어티는 아미노알킬, 또는 폴리에틸렌이민일 수 있다. 상기 아미노알킬에서, 상기 알킬기는 1 내지 20 탄소 원자를 가질 수 있다. 상기 폴리에틸렌이민은 n이 2 내지 100일 수 있는, 식 -[CH2CH2NH]n-을 갖는 것일 수 있다. 상기 알콕시기(-OR)는 수성 환경에 가수분해되어, 히드록시를 생성하고, 이들 중 하나이상이 고체 지지체 표면뿐만 아니라 이웃하는 유기실란 분자에서 발견된 표면 -OH기와 축합 및 제거 반응을 일으킬 수 있다. 상기 아미노실란 분자는 3-아미노프로필트리에톡시실란 (GAPS), 또는 N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란 (EDA) 및 (3-트리메톡시실릴-프로필)디에틸렌트리아민(DETA)과 같은 폴리에틸렌이민트리에톡시실란일 수 있다. 상기 아미노실란은 알려진 방법에 의하여 고체 지지체 상에 코팅될 수 있다. 상기 코팅은 딥 코팅, 스핀 코팅 또는 화학기상증착 (CVD)에 의하여 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 결합하는 물질을 포함하는 제1 챔버의 벽면 및/또는 고체 지지체의 표면은 표적물질, 예를 들면 세포 또는 바이러스를 포획 또는 흡착하여 세포 또는 바이러스 분리에 사용될 수 있다. 상기 고체 지지체는 제1 챔버의 벽면에 결합되지 않고 내부에 포함된 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 물접촉각 (water contact angle)은 Kruss Drop Shape Analysis System Type DSA 10 Mk2에 의하여 측정된 물접촉각일 수 있다. 1.5uL 증류수 방울을 시료 상에 자동적으로 위치시킨다. 상기 방울을 CCD-카메라에 의하여 10 초 동안 매 0.2초 마다 모니터링하고, Drop Shape Analysis Software (DSA version 1.7, Kruss)에 의하여 분석된다. 방울의 완전한 프로필을 탄젠트 법에 의하여 일반적 conic section equation에 핏팅시켰다. 상기 각은 좌측각 및 우측각 모두에서 결정하였다. 평균값을 각 방울에 대하여 계산하고, 시료당 총 다섯 방울을 측정하였다. 다섯 방울의 평균을 접촉각으로 취하였다.
상기 미세유동장치는 제2 챔버가 각각 압력 제공 수단에 연결된 복수 개의 서브챔버를 포함하고, 제1 챔버와 제2 챔버의 각 서브챔버 사이에 위치하고 제1 챔버와 제2 챔버의 각 서브챔버의 벽의 적어도 일부분을 이루는 탄성막을 포함하는 것일 수 있다.
제2 챔버에 제공되는 양압은 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 움직이게 함으로써, 제1 챔버에 포함된 고체 지지체의 표면적은 그대로 유지하면서, 그 부피를 감소시킬 수 있다. 즉, 챔버 부피에 대한 고체 지지체의 표면의 비 (SVR)를 증가시킬 수 있다. 상기 미세유동장치는 입구 및 출구 하나 이상이 개방된 상태에서 제2 챔버에 양압을 제공하여, 제1 챔버 부피에 대한 고체 지지체의 표면의 비 (SVR)를 증가시킬 수 있다. 제2 챔버에 제공되는 양압은 예를 들면, 제1 챔버의 부피에 대한 상기 고체 지지체의 표면적의 비 (surface-to-volume ratio: SVR) 값이 0.05 이상, 예를 들면, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 또는 0.15 이상이 되도록 하는 것일 수 있다. 예를 들면, SVR이 0.05 내지 0.15, 0.11 내지 0.15, 0.12 내지 0.15, 0.13 내지 0.15, 0.14 내지 0.15, 0.10 내지 0.14, 0.11 내지 0.14, 0.12 내지 0.14, 또는 0.13 내지 0.14가 되도록 하는 것일 수 있다. 또한, 제2 챔버에 제공되는 음압은 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 움직이게 함으로써, 제1 챔버에 포함된 고체 지지체의 표면적은 그대로 유지하면서, 그 부피를 증가시킬 수 있다. 즉, 챔버 부피에 대한 고체 지지체의 표면의 비 (SVR)를 감소시킬 수 있다. 또한, 제2 챔버에 제공되는 양압, 음압 또는 이들의 조합은 상기 탄성막을 진동하게 할 수 있다. 상기 양압 또는 음압의 크기는 선택되는 탄성막 및 그 두께에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 200μm 내지 300μm PDMS 막에 대하여 상기 양압은 10 내지 300kPa, 예를 들면, 30 내지 300kPa, 50 내지 300kPa, 70 내지 300kPa, 100 내지 300kPa, 200 내지 300kPa, 10 내지 200kPa, 30 내지 150kPa, 또는 50 내지 100kPa일 수 있다.
도 1과 도 3 내지 도 6은 세포 파쇄 방법에 사용될 수 있는 장치의 일 구체예의 단면도들이다.
도 2는 비드 표면에 세포 포획을 가능하게 하는 유기막이 존재하는 경우를 나타낸 단면도이다.
도 7 및 도 8은 세포 파쇄 방법에 사용된 세포 파쇄 장치의 일 예를 나타내는 도면이다.
도 9는 도 7 및 8의 미세유동장치를 이용하여 시료 중의 세포를 분리하고 그로부터 핵산을 분리하는 과정을 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 10은 PDMS 막의 굴절이 챔버 중의 비드 충진도에 미치는 영향을 확인하는데 사용된 실험 모델 (a) 및 그 결과 (b)를 나타낸 도면이다.
도 11은 용출 분획 (eluate fraction)에 따른 DNA 양 (Ct)을 나타낸 도면이다.
도 12는 초기 MRSA 농도에 따른 핵산 분리 결과를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1. 재료 및 방법
본 실시예에 사용된 재료 및 방법은 달리 언급이 없는 한, 아래 기재되는 재료 및 방법을 사용하였다.
(1) 세포 및 배양물
본 연구에 사용된 메티실린-저항성 스타필로코쿠스 아우레우스 (methicillin-resistant staphylococcus aureus: MRSA) 균주는 메티실린-저항성 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC BAA-1717 (MREJ 타입 ii), NCTC 13395 (MREJ 타입 v), 및 JCSC 3624 (MREJ 타입 xii)이었다. MRSA 균주는 37℃에서 밤새 50 mL 트립티카제 소이 브로트(trypticase soy broth: TSB) (Becton, Dickinson and Company) 중에 성장시켰고 1X PBS 용액 (pH 7.4)으로 2회 세척한 후 적절한 농도로 현탁시켰다. 0.2 OD (optical density)는 약 108 CFU (colony forming unit)/mL에 해당함을 확인하였다.
(2) 미세유동장치의 제조, 시험 기구 및 비드 표면 변형
(2.1) 미세유동장치 제조
미세유동장치는 2개의 유리 칩 사이에 공통의 탄성막을 위치시켜 제조하였다. 상기 유리 칩은 각각 챔버 및 채널의 일부 또는 전부가 형성되어 있으며, 상기 챔버 및 채널은 상기 탄성막을 사이에 두고 제1 유리칩과 제2 유리칩을 결합시킴으로써 완성되었고, 그에 따라 비드 충진 미세유동장치 (bead-packed microfluidic device)를 제조하였다.
구체적으로, 상기 제1 및 제2 유리 칩은 통상적인 포토리소그래피, 식각공정 및 습식 식각 공정을 통해 유리 웨이퍼에 채널 및 챔버를 형성시킴으로써 제조되었다. 6인치의 유리 웨이퍼(borosilicate, 700㎛ 두께)를 피라나 용액으로 세척한 후, 세척된 유리 웨이퍼 상에 500nm 두께로 무정형 폴리실리콘층을 저압화학증기증착(low pressure chemical vapor deposition: LPCVD)하였다. 다음, 감광막을 이용하여 상기 증착된 폴리실리콘층의 일부를 노출시키는 패터닝 공정을 실시하였다. 다음, 건식 식각으로 상기 폴리실리콘층의 노출된 부분을 제거하였다. 이후, 상기 감광막을 스트리핑하고, 노출된 유리 웨이퍼를 불산 용액(HF 49%)으로 습식 식각하여, 깊이와 폭이 각각 약 100㎛인 채널을 형성하였다. 상기 채널을 형성하기 위한 식각 과정에서 비드의 고립을 위하여 약 20㎛ 돌출된 댐(돌기: weir)을 형성하였다. 이 댐은 밸브 시트 (valve seat) 및 비드 포획(bead trapping) 댐 (weir)의 기능을 동시에 수행할 수 있도록 한다.
다음, 상기 폴리실리콘층을 제거하고, 건식 필름 레지스트(dry film resist: DFT)를 코팅하고 패터닝한다. 이후, 비드가 위치하는 부피 약 15.5㎕의 챔버와 유체의 유입 또는 유출을 위한 홀(holes)을 샌드 블라스팅(sand-blasting) 방법으로 형성되게 하였다. 계속해서, 유리 웨이퍼를 칩 형태로 다이싱한 다음, 플라즈마를 사용하여 세척하였다. 다음, 플라즈마 활성화된 약 250㎛ 두께의 PDMS 막 (Rogers)을 중간층으로 하여, 위에서 제작된 비드를 함유하게 될 챔버를 포함하는 유체 칩(fluidic chip) (이하 제1 유리 칩이라고도 함)과 비드를 함유하지 않고 공압 펌프로서 역할을 하게 될 챔버를 포함하는 공압 칩(pneumatic chip)(이하 제2 유리 칩이라고도 함)을 영구적으로 결합시켰다. PDMS 막은 모노리트 가요성(monolithic flexible)이며, 유체 흐름 조절을 위한 도구 즉, 펌핑 및 밸브로서 뿐만 아니라, 공압 진동(pneumatic vibration)을 통한 비드 충돌(bead collision)을 위한 동력 (atuator)으로서 이용되었다.
달리 언급이 없는 한 약 15-16mg(약 2x105개)의 표면 개질된 유리 비드를 생성된 비드 챔버에 넣고, PCR-적합성 접착 테이프 (PCR-compatible adhesive tape)(Applied biosystems)를 올려 놓아 챔버를 밀폐시켰다. 상기 접착된 테이프 상에 폴리카르보네이트 판(polycarbonate plate)를 덮어 동작, 예를 들면 DNA 추출 과정, 중에 테이프가 휘는 것을 방지하였다. 상기 표면 개질된 유리 비드는 챔버에 직접 넣을 수 있다.
PDMS 막 조작은 솔레노이드 밸브의 어레이 (S070-5DC, SMC)를 공압 챔버에 연결하여 챔버 중에 양압 또는 음압을 적용함으로써 조절가능하게 하였다. 상기 밸브들은 전기적 공압 조절기(electro-pneumatic-regulator) (ITV0030-3BL, SMC)와 랩뷰(LabVIEW) 소프트 웨어(National Instruments)에 연결되었다. 유체 이송과 연결된 상기 밸브 조작은 각 단계에서 상기 랩뷰 인터페이스로 가시화하여 핵산 추출과정을 모니터링하였다.
도 7 및 도 8은 시료 처리 방법에 사용된 미세유동장치의 일 예를 나타내는 도면이다. 도 7은 PDMS 막의 진동을 통하여 비드 충돌을 유도하는 비드 충진된 미세유동장치의 단면도를 나타낸 도면이다. 도 7에는 입구(30)와 출구(32)에는 각각 돌기(40,42)가 형성되어 있고, 입구(30)와 출구(32)는 액체 채널(48, 50)을 통하여 유입 포트 및 유출 포트에 연결되어 있으며, 상기 유입 포트와 입구(40) 및 유출 포트와 출구(42)의 상판에는 밸브 시트(44,46)가 형성되어 있고 그에 대응되는 하판에는 공압 챔버 (34A,34D)가 형성되어 있다. 비드를 함유하는 제1 챔버는 부피 15.5 uL이고, 크기는 약 6mm x 4mm x 0.75mm (가장 긴 길이x 가장 짧은 길이 x 깊이)이었다. 2개의 공압 이동 챔버는 총 부피 약 3uL이었고, 크기는 약 6mm x 4mm x 0.2mm (가장 긴 길이x 가장 짧은 길이 x 깊이)이었다.
도 8은 3개 층으로 구성된 모노리트 유리-PDMS-유리 장치 및 그의 유체 성분 및 공압 성분의 확대도이다.
(2.2) 유리 비드 개질
직경 약 30~50㎛의 유리 비드(Polysciences, Inc.)를 피라나 용액으로 세척한 후, 증류수를 이용하여 충분히 세척하고, 여과 및 진공 건조하였다.
다음, 에탄올 중 5%(v/v)의 트리메톡시실릴프로필 개질된 폴리에틸렌이민(trimethoxysilylpropyl modified (polyethyleneimine: 이하 PEIM이라 함)(Gelest, Inc.) 용액을 비드 표면 개질 용액으로 제조하였다. 비드를 상기 제조된 용액 중에 담그고 부드럽게 혼합하면서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 비드를 여과 및 신선한 에탄올로 3회 세척하였다. 최종 회수된 유리 비드는 110℃의 오븐에서 40분 동안 소성을 수행하였다. 그 결과 표면이 폴리에틸렌이민(PEIM)으로 코팅된 유리 비드를 얻었다. 상기 PEIM은 세포에 비특이적으로 결합하는 특성을 가지고 있어, 상기 유리 비드는 세포를 비특이적으로 분리하는데 사용될 수 있다.
(3) 스왑으로부터 세포 방출 효율 측정
2개의 상업적으로 스왑, 깃털 스왑 (flocked swab) (Cat. No. 553C, Copan) 및 섬유 스왑 (fiber swab) (Cat. No. 220099, BBLTM CultureSwabTM, BD)을 그 세포 방출 효율을 결정하기 위하여 시험하였다.
알려진 농도의 MRSA 현탁액 (1xPBS 버퍼, pH 7.4)을 연속 희석하여 약 103 CFU/mL의 농도를 얻었다. 그의 100 ul 분액을 1.5 mL 마이크로원심 튜브 (microcentrifuge tubes) 중 900ul의 PBS 버퍼 중에 첨가하였다. 이를 초기 MRSA 수로서 Petrifilm (3M, USA) 상에 도말하였다. 스왑을 1mL MRSA 현탁액 (약 103 CFU/ml, 흡수된 액체 부피는 약 100uL이었다)에 담그고, 다음으로 1mL의 신선한 PBS 버퍼 중에 1 분 동안 브로텍싱하였다. 방출된 MRSA를 가진 용액을 회수된 MRSA 세포 수로서 Petrifilm 상에 도말하였다. 각 스왑에 대하여 3배수 (triplicate)로 수행하였으며, 3개 다른 생산 로트에 대하여 반복하였다. 이들을 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하고 형성된 콜로니를 새었다. 세포 방출 효율은 회수된 박테리아 콜로니 수를 최초 박테리아 콜로니 수로 나누어 계산하였다. 세포 포획 효율도 상기 비드 충진된 미세유동장치를 통과시키기 전과 후의 용액 중의 콜로니를 새어 결정하였다.
(4) 비강 스왑 중 MRSA 로부터 DNA 추출 효율
음성 비강 스왑을 풀링하고(pooling), MRSA-양성 시료로서 분석 시험을 위하여 MRSA로 스파이킹하였다. 건조 깃털 스왑을 사용하여 건강한 지원자의 전비공 (anterior nares)으로부터 표본을 수집하였다. 상기 수집된 스왑을 소듐 포스페이트 버퍼 (PBS) (50 mM, pH 3.0, Sigma-Aldrich) 중에 풀링하였다. 그 후, 1분 동안 보르텍싱하여 MRSA 방출을 모사하였다 (음성 대조군 마트릭스: negative nasal matrix). 음성 대조군 마트릭스의 부피는 1mL 당 1 스왑으로 조정하였다. 또 다른 건조 스왑을 모사된 양성 MRSA 스왑으로서 알려진 농도의 MRSA 현탁액로 적셨다. 스왑 줄기 (swab stem)을 부러뜨리고, 보르텍싱함으로써 흡수된 MRSA를 음성 비강 마트릭스 1mL 중에 방출시켰다.
그 결과 얻어진 MRSA-양성 비강 스왑을 포어 크기 3 um를 가진 IsoporeTM membrane filter(Millipore)를 통과시켰다. 1mL의 여과된 MRSA-양성 비강 스왑, 세척을 위한 0.5 mL의 Tris-EDTA 버퍼 (10 mM, pH 8, Ambion), 및 세포 파쇄를 위한 10 uL의 NaOH 용액 (0.02 N, Sigma-Aldrich)을 미세유동장치의 액체 저장소에 미리 분배하였다.
상기 액체를 압력 구동 방식으로 이동시켜 그 작동 액체 압력을 예비 실험에서 결정하였다. 상기 비강 스왑 용액을 제2 챔버에 150kPa의 양압을 가하여 PDMS 막을 제1 챔버를 향하여 압력을 가하면서 약 50 kPa에서 약 200uL/min의 유속으로 비드 충진된 제1 챔버를 통과시켰다. 초기 시료 적재 후, PDMS 막을 향하여 신장된 상태를 유지하면서, 약 80 kPa에서 유속 약 500uL/min으로 세척액 (Tris-EDTA 버퍼 (10mM, pH8, Ambion))을 흘려주어 제1 챔버를 세척하고, 질소 공기를 100 kPa로 30초 동안 흘려주어 질소 건조시켰다.
포획된 세포를 파쇄하기 위하여, 상기 PDMS 막을 제2 챔버를 향하여 이격시킨 상태 (-150kPa)에서 6uL의 NaOH를 주입하였고, 비드가 충진된 제1 챔버의 입구 및 출구 측에 구비된 밸브를 폐쇄시켰다.
다음으로, 두 개의 공압 이격 챔버 (pneumatic displacement chambers) 즉, 제1 챔버 및 제2 챔버의 압력을 한 사이클의 첫번째 반 동안 한 챔버는 양압 (80kPa)으로 다른 챔버는 음압 (-80kPa)으로 비대칭적으로 교대되게 하고, 한 사이클의 두 번째 반 동안은 역전되게 하였다. 상기 PDMS 막은 5분 동안 10 Hz의 주파수로 진동하였다. 그 결과, 상기 진동에 의하여 세포는 파쇄되었다.
DNA를 함유한 세포 파쇄물은 상기 PDMS 막을 제1 챔버를 향하여 이격시킨 상태 (150kPa)에서, 100 kPa의 액체 압력에 의하여 4 uL의 NaOH를 더 주입함으로써 DNA를 포함하고 있는 파쇄물을 용출시켰다.
액체 시료의 도입 단계부터 DNA 용출 단계까지의 총 공정에 소요된 시간은 20분 미만이었다. 추가적인 DNA 정제 공정은 수행되지 않았다. 상기 미세유동장치의 분석적 민감도를 측정하기 위하여, 세가지 타입의 MRSA 균주에 대하여, 적어도 7 반복 (replicates)을 각 농도에서 시험하였다 (10, 20, 100 및 200 CFU/스왑). PCR 기계에 의하여 만들어진 양성 콜 (positive call)의 수에 따르면 (즉, Ct 컷오프 값은 40이다), 95% 신뢰 구간을 가진 분석 민감도가 probit regression model (MINITABTM Release 14.20)을 사용한 통계 분석에 의하여 예측되었다.
도 9는 일 구체예에 따른 시료 처리 방법을 도식적으로 나타낸 도면이다. 도 9는 액체 시료의 도입 단계부터 DNA 용출 단계까지의 총 공정을 나타낸 것이다. 도 9에는 (a) 세포를 포함하는 시료를 도입하여 세포를 비드에 결합시키는 단계를 나타낸다. 즉, 세포 포획 단계를 나타낸다. 포획된 세포는 세척 및/또는 건조될 수 있다 (b). 다음으로, 세척 및/또는 건조된 제1 챔버에 세포 파쇄액을 도입하는 단계를 나타낸다 (c). (d)는 도입된 세포 파쇄액과 비드를 PDMS 막의 비대칭 진동에 의하여 혼합하여 세포를 파쇄하는 단계를 나타낸다. (e)는 세포 파쇄물이 포함된 제1 챔버로부터 DNA를 용출하는 단계를 나타낸다. 다른 구체예에 있어서, 세척 단계, 건조 단계, 및 파쇄액 도입 단계 중 하나 이상은 생략될 수 있다. 예를 들면, 세척 단계, 건조 단계, 및 파쇄액 도입 단계를 수행하지 않고, 비드에 결합된 세포를 PDMS 막의 진동에 의하여 파쇄하는 것도 가능하다. 또한, 세척하는 단계를 생략하거나, 건조하는 단계를 생략하거나, 파쇄액을 도입하는 단계가 생략될 수 있다. 도 9는 도 7의 미세유동장치를 간단하게 나타낸 것으로 일부 구조가 생략된 것이다.
실험군의 Ct 값과 비교하기 위하여 양성 대조군 시료를 그 Ct 값을 준비하였다. PBS 버퍼 중 MRSA 현탁앨을 13,200 rpm에서 20 분 동안 원심분리하고 상등액을 버렸다. 남은 세포 펠렛을 table-top bead-beating instrument (GENIE 2, Fisher Scientific)로 처리하였다. 상기 세포 펠렛에 30 mg의 민 유리 비드 (bare glass bead) 및 10 uL의 세포 파쇄 용액 (lysis solution) (0.02N, NaOH)을 첨가한 후, 전 속력으로 5 분 동안 격렬한 보르텍싱을 수행하였다. 간단한 원심분리 후 방출된 DNA 용액을 회수하였다. 정확한 비교를 위하여, 주입된 세포 수 및 용출 부피 (eluate volume)를 두 방법에 대하여 항상 동일하게 조절하였다.
(5) 실시간 PCR 에 의한 DNA 증폭
분석적 거동을 평가하기 위하여, LightCyclerTM 480 real-time PCR system (Roche)을 사용하여 real-time PCR (polymerase chain reaction) assays을 수행하였다.
MRSA를 확인하기 위하여, SCCmec Right Extremity Junction (MREJ)라 불리는 삽입 부위 (integration site)에 인접한 staphylococcal chromosomal cassette (SCCmec)의 연결 (junction regions)의 서열과 orfX region을 특이적으로 증폭하였다. 각 Primer3 software (Whitehead Institute/MT Center for Genome Research)를 사용하여 고안된 사용된 특이적 프라이머 세트는 다음과 같다: MREJ type ii (forward: 서열번호 1 및 리버스: 서열번호 2), type v (포워드: 서열번호 3 및 리버스: 서열번호 4), 및 type xii (포워드: 서열번호 5 및 리버스: 서열번호 6).
다음 조성을 갖는 PCR 반응 혼합물 (20uL)을 제조하였다: 0.4 uM TaqMan probe (FAM-5'-aga Gca Ttt Aag Att Atg cg (서열번호 7)-3'-BHQ1, LNA 염기는 대문자로 표시함, Sigma), 1uM 각 primer (Sigma), 1x LightCyclerTM 480 Probes master mix (Roche), 및 4 uL 추출된 DNA 용액. 10 분 동안 전 변성 후 열순환은 95℃에서 20초 동안 변성 단계 및 60℃에서 40초 동안 연장 단계에 의하여 수행되었다.
PCR 증폭산물의 크기는 MREJ type ii, v, xii에 대하여 각각 91, 96, 및 89bp이었다. 이들은 전기영동에 의하여 더 확인되었다 (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies).
(6) PDMS 막 굴절 ( deflection ) 모사
비드 충진에 대한 PDMS 막 굴절의 영향을 조사하기 위하여, 도 10a에 나타낸 바와 같은 상기 미세유동장치에 대한 간단한 선대칭 모델 (axisymmetric model)을 사용하였다.
PDMS 막의 상부측 경계 상에 균일한 압력 (Pneumatic) 로드 조건을 설정하였다. y-방향의 제로 이동 조건은 좌측 경계상에 설정하고 x-방향 및 y-방향의 제로 이동 조건은 아래측 경계상에 설정하였다. 챔버 깊이는 10 내지 100um로 변화시키는 동안 PDMS 막 두께는 250um로 고정하였다.
상기 모델을 공압이 증가량 (increment) 10kPa로 0에서 300 kPa로 증가됨에 따라 CFD-ACE+ (ver. 2009, ESI Group, France) 중의 Stress and Grid Deformation module를 사용하여 정상상태 문제로서 풀었다. 도 10b에 나타낸 바와 같이, 상기 증가량은 초기 상태 (0-10kPa) 및 PDSM와 유리 사이의 접촉 근처에서 2 kPa로 감소되었다. 공압 증가는 음의 부피를 가진 임의의 요소가 생성되는 경우 종료하였다. 표준 1차 요소 (firs element)를 사용하였으며, 노드와 요소의 총수는 각각 3815 및 3649였다.
모사에 사용된 물질 특성은 다음과 같다:
PDMS: 밀도 = 970 kg/m3, 탄성의 Young's modulus = 750 kPa,
Poisson's ratio = 0.5 ;
유리: 밀도 = 2520 kg/m3,
탄성의 Young's modulus = 80 GPa,
Poisson's ratio = 0.3.
실시예1 : 비드 충진도와 세포 포획 효율
본 실시예에서는 PDMS 막의 굴절이 챔버 중의 비드 충진도에 미치는 영향을 조사하였다.
도 10은 PDMS 막의 굴절이 챔버 중의 비드 충진도에 미치는 영향을 확인하는데 사용된 실험 모델 (a) 및 그 결과 (b)를 나타낸 도면이다. 실험은 (6)에서 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 10b에서 공실율(vacancy ratio)은 PDMS 막에 의하여 이동되지 않은 빈공간 부피 (void volume)을 초기 챔버 부피로 나눈 것으로 정의된다. 도 10b에 나타낸 바와 같이, 공실율은 PDMS 막이 PDMS 막과 챔버 사이에 접촉없이 굴절됨에 따라 급격하게 감소하였다. 접촉이 일어난 후, 상기 공실율은 상기 PDMS 막의 가장자리 부분 (edge part)이 점진적으로 굴절되고 상기 PDMS 막의 중앙 부분 (central part)에 압축이 부분적으로 발생하기 때문에, 점진적으로 감소하였다. 압력이 100kPa를 초과하여 증가된 경우, 상기 공실율은 대부분 10% 미만이 되었다. 이들 결과는 대부분의 유리 비드는 막의 공압 굴절에 의하여 무작위적으로 밀집 충진 (close-packed)된다는 것을 나타낸다.
비드 충진도는 막 상태 및 비드 양에 의하여 영향을 받을 수 있다. 따라서, 또한, 본 실시예에서는 막 상태 및 비드 양이 세포 포획에 미치는 영향을 측정함으로써 조사하였다. 이 결과는 비드 충진도가 세포 포획에 미치는 영향을 나타낸다.
표 1은 막 상태 및 비드 양이 SVR(μm-1) 및 세포 포획에 미치는 영향을 측정함으로써 조사한 결과를 나타낸 것이다.
비드 양 (mg) 상향 (upward) 휴지 (rest)
SVR(μm-1) 포획 효율(%) SVR(μm-1) 포획 효율(%)
10 0.15 95.1±1.2 0.05 37.2±5.9
13 0.15 97.0±1.3 0.08 60.8±6.4
16 0.15 97.8±0.6 0.11 87.2±4.4
표 1은 소듐 포스페이트 (50mM, pH 4.0) 중의 1mL MRSA (ATCC BAA-1717, 106 CFU/ml)를 적용하였으며, 각 조건에 대하여 3반복을 수행한 결과이다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 적용된 비드의 양이 16mg으로부터 10mg으로 감소함(즉, 38% 감소)에 따라 총 비드 표면적은 비례하여 감소하였다. 그러나, PDMS 막은 비드 양에 상관없이 위로 가압된 상태 (즉, 제1 챔버를 향하여 가압된 상태)이기 때문에, SVR은 불변이었다 (0.15μm-1). SVR은 균일한 비드 직경 (40um) 및 밀집 충진 비율 (close packing ratio) 50%이라는 가정하에 계산되었다. PDMS 막이 위로 가압된 경우, 휴지 상태인 경우에 비하여 세포 포획 효율 및 표준편차가 더 좋은 것으로 밝혀졌다.
이 결과는 공압에 의하여 유도된 비드의 밀집 충진 (close packing)은 SVR을 증가시키는데 아주 효과적이고, 그에 따라 액체 용액과 비드표면 사이의 상호작용을 최대화시킴으로써 분석 거동을 개선시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, SVR은 고상 추출을 위하여 표면적보다 더 중요한 변수라는 것을 나타낸다. 비드 10mg/SVR 0.15μm-1의 세포 포획 효율은 비드 16mg/SVR 0.11μm-1의 세포 포획 효율보다 더 높은 것으로 밝혀졌다.
비드 충진도의 조절은 본 발명의 방법에 사용된 탄성막의 가요성을 조절하거나, 비드 양을 조절함으로써 이루어질 수 있다.
실시예 2: PDMS 막 진동이 소량 DNA 용출에 미치는 영향
일반적으로 고상 DNA 분리는 크로마토그래피 분리와 같이 정지상에서 수행되었고, 그에 따라 표적 DNA는 시간 의존적 용출액 분획 (eluate fraction)을 취함으로써 회수되었다. 분리 칼럼이 자연적으로 정지되어 있으므로, 액체와 고제 지지체 사이의 물질 이동 (mass transport)은 확산에만 기초한 것이다. 그러므로, PCR과 같은 후속 검출 공정에 더 적합한, 농도를 증가시키기 위하여 작은 용출 부피 (≤10uL)로 고상 표면으로부터 DNA를 방출하는 것은 어려웠다. 작은 용출 부피는 높은 검출 민감도를 위하여 부피 당 표적 카피 수를 증가시키기 위한 것이다.
따라서, 본 실시예에서는 PDMS 막 진동이 소량 DNA 용출에 미치는 영향을 조사하였다. 구체적으로, 먼저 세포를 포획하기 위하여 1mL의 두 개의 다른 농도의 MRSA 현탁액 (ATCC BAA-1717, 103 CFU/ml 및 105 CFU/ml)을 미세유동장치의 비드 충진된 챔버에 도입하였다. 세포 포획 과정은 (4)에 기재된 바와 동일하게 수행하였다 (비드 양 16mg). 이 과정에서, PDMS 막을 진동시킴으로써 비드 충진된 칼럼의 특성을 잃지 않으면서 격렬하게 교반하였다. 즉, 심지어 세포막 파괴가 가능하게 하였다 (도 9 (d)). 비드 표면에 결합된 세포를 파쇄하기 위하여 6uL NaOH 용액을 도입하는 것을 촉진하기 위하여, 막을 아래 방향으로 함으로써 비드 챔버의 빈공간 부피 (void volume)을 약 3 uL 증가시켰다 (도 9 c)). 다음으로, PDMS 막을 비대칭적으로 진동시켜 세포 막 파쇄를 유도하고 세포 또는 비드 표면으로부터 DNA 방출이 되도록 하였다.
포획된 세포로부터 DNA 회수율을 결정하기 위하여, 막 진동에 사용된 첫번째 6uL 용액을 회수한 후 추가 3회 액체 분획 (6uL)을 연속적으로 통과시켰다. 각 분획 중의 DNA 양은 실시간 PCR 증폭에 의하여 추정하였다.
도 11은 용출 분획 (eluate fraction)에 따른 DNA 양 (Ct)을 나타낸 도면이다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 첫번째 두 분획의 Ct 값은 다른 것에 비하여 3 Ct 차이로 더 낮았다. PCR 효율이 100%인 경우, 초기 DNA 주형 카피수의 10 배 차이는 Ct 값이 3.3 차이를 발생시킨다. 따라서, 상기 결과는 대부분의 DNA (약 90%)는 12uL 용출액에 의하여 비드 충진된 챔버로부터 용출된다는 것을 나타낸다. 그러므로, 100 배 부피 감소(즉, 초기 1mL 비강 스왑 시료를 10uL DNA 용출액으로)의 상당한 정도가 DNA 농도의 증가로 전이될 것이다. 이는 검출 민감도에 양성 영향 (positive effect)을 미친다. 도 11에서, 103 CFU/ml 시료의 4번째 분획은 검출되지 않았다. PTC (양성 대조군)는 원심분리 및 그 후 24uL NaOH 용액에 의한 table-top-bead-beating 파쇄에 의하여 얻었다. 1uL DNA 용액을 주형으로서 PCR에 포함되었다. 각 조건에 대하여 3반복되었다.
실시예 3: 비강 스왑으로부터 MRSA 검출
본 실시예에서는, 비강 스왑 중의 MRSA에 대한 전 DNA 추출과정을 진행하였다. 상기 전 과정은 스왑 (swabbing), 스왑으로부터 세포 방출, 예비 여과 및 DNA 추출을 위한 미세유동장치의 비드 충진된 챔버로의 로딩을 포함한다. 예비 실험 결과 깃털 타입 스왑 (flocked type swab)이 섬유 타입 스왑 (fiber type swab)에 비하여 세포 방출 효율과 제품에 따른 변이가 적은 것으로 나타났기 때문에, 깃털 타입 스왑을 사용하였다.
구체적으로, MRSA-스파이킹된 비강 스왑을 예비 여과하여 큰 불순물에 의하여 야기되는 미세유동장치 막힘을 방지하였다. 예비 여과에 따른 MRSA 손실은 10% 미만인 것으로 측정되었다 (콜로니 카운팅에 의하여 입증됨). 스와빙으로부터 실시간 PCR까지의 전 단계는 다양한 MRSA 농도에 대하여 성공적으로 수행되었다 (104, 103, 및 102 CFU/swab).
도 12는 초기 MRSA 농도에 따른 핵산 분리 결과를 나타낸 도면이다. 도 12는 초기 세포 수 (CFU/스왑)에 따른 스왑으로부터 MRSA (NCTC 13395)의 검출 결과를 나타낸다. DNA 분리 과정은 재료 및 방법에서 기술된 바와 같다. 방출된 DNA는 총 10uL NaOH 용액에 의하여 용출하고, 양성 대조군 (positive control: PTC)과 함께, 그 중 4uL를 PCR에서 주형으로 사용하였다.
MRSA로 스파이킹되지 않은 음성 비강 마트릭스는 산물이 증폭되지 않았다. PTC (양성 대조군)은 스왑으로부터 MRSA 방출 및 예비 여과 단계 없이 PBS 중의 MRSA 현탁액으로부터 준비되었다. 구체적으로, 원심분리한 후 10uL NaOH 용액과 함께 table-top bead beating 파쇄에 의하여 얻어졌다. 양성 대조군이 실험군에서와 같이 비강 스왑으로부터 준비되는 경우, PCR 증폭은 원심분리 및 그 후 작은 부피 (10uL)에 의한 세포 파쇄로부터 야기된 농축된 불순물로 인하여 현저하게 저해되었다.
이러한 결과는, 일 구체예에 따른 방법에 사용되는 미세유동장치에 시료를 흘려주는 상태에서의 세포 포획 (flow-through cell capture)과 세척 단계를 통하여 PCR 저해제를 제거할 수 있고, 그에 따라 비강 스왑 중의 MRSA가 성공적으로 검출할 수 있다는 것을 나타낸다.
본 실시예에서는 또한, 각각 다른 농도 (10, 20, 100, 및 200 CFU/스왑)에서 3개 타입의 MRSA 균주 (MREJ 타입 ii, v 및 xii)을 시험함으로써, 음성 대조군과 재현가능하게 구분될 수 있는 스왑 당 가장 낮은 수의 CFU로 정의된, 분석 민감도 (즉, 검출의 한계 (limit of detection))을 추정하였다.
표 2는 3개 MRSA 균주에 대한 추정된 분석 민감도 (CFU/스왑, 95% 신뢰 구간) 및 다른 방법과의 비교 결과를 나타낸 것이다.
방법 분석 민감도 (CFU/스왑) 분석물 희석 비율
(스왑/PCR)
MREJ 타입 va MREJ 타입 xiib MREJ 타입 iib
본 발명의 방법 54 47 61 0.4
XpertTM SA nasal complete 97 127 256 -
NucliSENS
EasyQTM MRSA		 200 182 227 0.02
GeneOhmTM MRSA ACP Assay 130 386 576 0.004
표 2에서, 스왑 (양성 스왑) 중의 MRSA는 버퍼 용액 (소듐 포스페이트, 50mM)a 또는 음성 비강 마트릭스b 중에 각각 방출되었다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 분석 민감도는 시험된 3개 균주에 대하여 95% 신뢰 구간으로 약 47-61 CFU/스왑인 것으로 예측되었다. 또한, 일 구체예에 따른 방법에 사용된 미세유동장치는 상업적 MRSA 검출 방법에 비하여 더 낫거나 비슷하였다. 이러한 거동은 상업적 방법의 분석물 희석 비율에 대한 분석물 희석 비율 (analyte dilution rate: ADR)을 조사하여 분석하였다.
ADR은 최종 PCR 중에 얼마 많은 분석물이 포함되어 있는지를 나타낸다. 즉, 증폭 반응 당 스왑 양의 이론 값이다. 예를 들면, 본 발명의 일 구체예에 따른 방법은, 1mL 중의 1 스왑을 10uL 용출 용액으로 처리되고, 그 중 4uL가 PCR 중에 포함되었다. 이는 ADR 0.4 스왑/PCR을 생성하며, 이는 미세유동장치에 탄성 또는 가용성 벽을 도입함으로써 효과적으로 달성되었다.
ADR은 생물분석 방법의 이론적 분석물 강화 비율 (theoretical analyte enrichment ratio)을 기술하기 위한 지표가 될 수 있다. 적용된 분석 공정 (즉, DNA 추출 및 증폭)의 차이에 따라 다른 분석 수행 결과가 나올 수 있다. 그러나, 기본적인 ADR 값의 10-100배 차이 (1-2 orders of magnitue)는 분석 민감도에 현저한 영향을 미칠 수 있다. 더 높은 ADR을 제공하는 미세 분석 시스템, 예를 들면, μTAS (micro total analysis system)는 종래 table-top 진단 방법에 대하여 경쟁력을 제공할 수 있다.
20:세포 또는 바이러스 파쇄용 장치 21, 23:상판 및 하판
22, 24, 24A, 24B, 24C:제1 내지 제5 챔버
26:멤브레인 28:마이크로 비드(bead)
28A:유기막 30:유입구
32:유출구 34:포트
34A, 34B, 34C:제1 내지 제3 포트
40, 42:제1 및 제2 돌기 48:격벽
48A, 48B:제1 및 제2 격벽
<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Method of treating target material in a sample <130> PN095291 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer : MREJ type ii <400> 1 cgggttgtgt taattgaac 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer : MREJ type ii <400> 2 gaagcggctg aaaaaaccgc a 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer : MREJ type v <400> 3 cgggttgtgt taattgaac 19 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer : MREJ type v <400> 4 taaaattacg gctgaaataa ccgcat 26 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer : MREJ type xii <400> 5 cgggttgtgt taattgaac 19 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer : MREJ type xii <400> 6 acaatccgtt ttttagtttt atttatgata cg 32 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan probe: 5' terminal is labelled with FAM and 3' terminal is labelled with BHQ1 <400> 7 agagcattta agattatgcg 20

Claims (21)

  1. 미세유동장치의 표적물질에 결합하는 물질을 포함하는 고체 지지체를 포함하는 제1 챔버에 표적물질을 포함하는 시료를 도입하여 표적물질을 상기 고체 지지체에 결합시키는 단계를 포함하는, 시료 중의 표적물질을 처리하는 방법으로서,
    상기 미세유동장치는 입구 및 출구를 포함하는 제1 챔버, 압력 제공 수단이 연결된 제2 챔버 및 제1 챔버와 제2 챔버의 사이에 위치하고 제1 챔버와 제2 챔버의 적어도 일부분의 벽을 형성하는 탄성막을 포함하는 것이고,
    상기 도입 단계 및 그 후의 처리 단계 중 하나 이상의 단계는 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 또는 제2 챔버에 음압을 제공하여 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 수행하는 단계인 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 시료 도입 단계, 세척하는 단계, 건조하는 단계, 및 용출하는 단계 중 하나 이상은 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 수행하는 단계인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 도입 단계 및 그 후의 처리 단계 중 하나 이상의 단계는 제1 챔버의 입구로부터 출구를 통하여 시료를 흘려줌으로써 수행되는 것인 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 시료의 유속은 10μl/min 내지 500μl/min인 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 제2 챔버에 양압 또는 음압이 제공되지 않은 경우, 제1 챔버의 부피는 1ul 내지 100ul인 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 양압은 제1 챔버의 부피에 대한 상기 고체 지지체의 표면적의 비 (surface-to-volume ratio: SVR) 값이 0.05 이상이 되도록 하는 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 표적물질은 세포이고, 상기 시료 도입 후 제2 챔버에 음압을 제공하여 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버에 세포 파쇄액을 도입하여 상기 고체 지지체에 결합된 표적물질을 파쇄하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 세포 파쇄액의 도입은 출구를 폐쇄시키거나 폐쇄시키지 않은 상태에서 이루어지고, 시료 도입 후 입구를 폐쇄시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 세포 파쇄액의 도입 후 상기 탄성막을 진동시켜 세포 파쇄를 촉진하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 미세유동장치는 제2 챔버가 각각 압력 제공 수단에 연결된 복수 개의 서브챔버를 포함하고, 제1 챔버와 제2 챔버의 각 서브챔버 사이에 위치하고 제1 챔버와 제2 챔버의 각 서브챔버의 벽의 적어도 일부분을 이루는 탄성막을 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 7에 있어서, 상기 파쇄 단계 전에, 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버에 세척액을 도입하여 상기 고체 지지체에 결합되지 않은 물질 또는 약하게 결합된 물질을 제거하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 세척 단계 후, 제2 챔버를 가압하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버의 입구로부터 출구를 통하여 기체를 흘려줌으로써 상기 고체 지지체를 건조시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  13. 청구항 7에 있어서, 상기 표적물질에 결합하는 물질은 물접촉각 70도 내지 95도인 표면을 갖는 물질, 또는 1차, 2차, 3차, 및 4차 아미노기로부터 선택된 하나이상의 아미노기를 갖는 하나이상의 아미노실란 모이어티를 가진 물질인 것인 방법.
  14. 청구항 7에 있어서, 상기 음압은 제1 챔버의 부피에 대한 상기 고체 지지체의 표면적의 비 (surface-to-volume ratio: SVR) 값이 0.05 미만이 되도록 하는 것인 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버에 용리액을 도입하여 상기 고체 지지체를 포함하고 있는 제1 챔버 중의 핵산을 용출시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  16. 미세유동장치의 표적물질에 결합하는 물질을 포함하는 고체 지지체를 포함하는 제1 챔버에 표적물질을 포함하는 시료를 도입하여 표적물질을 상기 고체 지지체에 결합시키는 단계를 포함하는, 시료 중의 표적물질을 처리하는 방법으로서,
    상기 미세유동장치는 입구 및 출구를 포함하는 제1 챔버, 압력 제공 수단이 연결된 제2 챔버 및 제1 챔버와 제2 챔버의 사이에 위치하고 제1 챔버와 제2 챔버의 적어도 일부분의 벽을 형성하는 탄성막을 포함하는 것이고,
    상기 도입 단계 및 그 후의 처리 단계 중 하나 이상의 단계는 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 수행하는 단계이고, 상기 표적물질은 세포이고, 상기 표적물질에 결합하는 물질은 물접촉각 70도 내지 95도인 표면을 갖는 물질, 또는 1차, 2차, 3차, 및 4차 아미노기로부터 선택된 하나이상의 아미노기를 갖는 하나이상의 아미노실란 모이어티를 가진 물질이고, 상기 도입은 pH 3.0 내지 6.0, 염 농도 10mM 내지 500mM에서 이루어지는 것인 단계이고,
    제2 챔버에 음압을 제공하여 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버에 세포 파쇄액을 도입하여 상기 고체 지지체에 결합된 표적물질을 파쇄하는 단계;
    상기 파쇄 단계 후에, 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버에 세척액을 도입하여 상기 고체 지지체에 결합하지 않은 물질 또는 약하게 결합된 물질을 제거하는 단계; 및
    제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버에 용리액을 도입하여 상기 고체 지지체를 포함하고 있는 제1 챔버 중의 핵산을 용출시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  17. 미세유동장치의 표적물질에 결합하는 물질을 포함하는 고체 지지체를 포함하는 제1 챔버에 표적물질을 포함하는 시료를 도입하여 표적물질을 상기 고체 지지체에 결합시키는 단계로서, 상기 미세유동장치는 입구 및 출구를 포함하는 제1 챔버, 압력 제공 수단이 연결된 제2 챔버 및 제1 챔버와 제2 챔버의 사이에 위치하고 제1 챔버와 제2 챔버의 적어도 일부분의 벽을 형성하는 탄성막을 포함하는 것이고, 상기 표적물질은 핵산이고, 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 수행하는 단계;
    제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버에 세척액을 도입하여 상기 고체 지지체에 결합하지 않은 물질 또는 약하게 결합된 물질을 제거하는 단계; 및
    제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태에서 제1 챔버에 용리액을 도입하여 상기 고체 지지체로부터 핵산을 용출시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  18. 입구 및 출구를 포함하는 제1 챔버,
    압력 제공 수단이 연결된 제2 챔버 및
    제1 챔버와 제2 챔버의 사이에 위치하고 제1 챔버와 제2 챔버의 적어도 일부분의 벽을 형성하는 탄성막을 포함하고,
    제1 챔버는 표적물질에 결합하는 물질을 포함하는 고체 지지체를 포함하는 것인 미세유동장치.
  19. 청구항 18에 있어서, 제2 챔버에 작동가능하게 연결된 압력 조절기를 더 포함하고, 상기 압력조절기는 시료를 제1 챔버에 도입하는 단계 및 그 후의 처리 단계 중 하나 이상의 단계에서 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태 또는 제2 챔버에 음압을 제공하여 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태가 되도록 하는 신호가 저장된 저장 매체를 포함하는 것인 미세유동장치.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 저장매체는 세포를 포함하는 시료에 대하여, 시료 도입 단계, 및 세척 단계는 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태가 되도록 하는 압력 제공 신호가 저장된 것이고, 세포 파쇄 단계는 제2 챔버에 음압을 제공하여 상기 탄성막을 제2 챔버를 향하여 신장시킨 상태가 되도록 하는 압력 제공 신호가 저장된 것인 미세유동장치.
  21. 청구항 19에 있어서, 상기 저장매체는 표적물질로서, 핵산, 단백질 또는 당을 포함하는 시료에 대하여, 시료 도입 단계, 세척 단계 및 표적물질 용출 단계는 제2 챔버에 양압을 제공하여 상기 탄성막을 제1 챔버를 향하여 신장시킨 상태가 되도록 하는 압력 제공 신호가 저장된 것인 미세유동장치.
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