CN104630059A - 用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微加工技术与组织工程技术领域，尤其涉及用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片及方法。所述微流控芯片，用于建立三种细胞共培养模型，通过利用微流控芯片内部的贯通微流道让不同的细胞在不同的区域，其中两种细胞之间是可以通过贯通的微流道进行细胞通讯。所以，本方案实现了在体外构建一种能够在立体或者平面空间上实现神经血管单元中星形胶质细胞作为中间桥梁连接神经元和微血管内皮细胞的新模型，将能更科学真实地在体外再现大脑中的神经血管网络，为中枢神经系统疾病尤其是脑血管的临床基础研究提供一个更好的平台，同时微流控芯片作为新兴的生物芯片，借助其体外构建神经血管单元，势必进一步拓宽微流控芯片的应用范围。

Description

用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片及方法

技术领域

本发明涉及微加工技术与组织工程技术领域，尤其涉及用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片及方法。

背景技术

近年来，随着我国人口老年化程度的不断加剧，同时由于遗传因素及环境因素的影响，中枢神经系统疾病逐渐成为临床医学专家们需要面对的一项重要挑战。长期以来，基于对神经退行性病变机理的研究，人们一直以神经细胞为作用对象，以单一靶点作为研究目标，试图以神经保护的治疗策略来阻止神经退行性疾病的发生发展。然而，针对神经系统的疾病，单一的细胞内途径或细胞类型是远远不够的，有效的治疗策略必须超越单一的治疗靶点。神经血管单元(neurovascular unit,NVU)提供了一个大脑发生退行病变后更为全面的整合的治疗靶点。此概念的提出旨在强调神经元、神经胶质细胞和血管内皮间相互联系及相互影响的重要性，并将三者放在一个微小的三维环境中研究，为整体研究神经元损伤及保护机制、寻找临床治疗的新靶点提供依据。

构建一种与载体相似的、由“神经血管单元”主要结构和功能细胞组成的体外共培养模型，用于脑神经血管疾病的病理生理研究及其防治药物的筛选，具有极为重要的意义。目前国内外有利用transwell培养小室为媒介建立体外“神经血管单元”模型的研究报道，也有不少学者通过脑片培养来体外模拟神经血管单元。但是利用新兴的微流控芯片(microfludic chip)来模拟神经血管单元尚不多见，且其侧重点多用于构建一种新型的体外血脑屏障(Blood BrainBarrier，BBB)来用于中枢神经系统药物的筛选，并不是神经血管单元模型。因为其未能充分而科学的理解脑中神经血管相互联系与影响之网络，只是建立起神经血管单元中星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞联系而忽略了星形胶质细胞与神经元的直接联系，或者是建立了星形胶质细胞与神经元直接联系而忽略了其同样也与脑微血管内皮细胞的直接接触关系。目前体外建立神经血管单元细胞模型多使用以transwell培养小室为媒介，此模型虽然结合原代神经细胞培养技术及大鼠脑微血管内皮细胞培养技术，将神经元、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞培养在一个立体的三维空间体系中，但是由于transwell小室结构构造的限制，以上三种细胞只能实现其中立体空间上的两种直接接触联系。与大脑中星形胶质细胞作为桥梁共同连接其他两种要素细胞的真实构架(神经元—星形胶质细胞—脑微血管内皮细胞)仍有较大差距。故目前亟待一种新的装置来实现立体或者平面空间上神经血管单元中星形胶质细胞作为中间桥梁连接神经元和微血管内皮细胞。

微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代细胞研究的重要平台。它对于实验结果能够实时追踪和原位观察，给研究脑疾病尤其是脑血管疾病的基础研究提供一个稳定科学的平台。2011年Devi Majumdar和他的同事实现了大鼠海马神经元和星形胶质细胞在微流控芯片上的共培养生长。Ross Booth等利用多层次微流控芯片装置、脑微血管内皮细胞及星形胶质细胞细胞系在体外模拟血脑屏障(BBB)。AKHAchyuta等在微流控芯片立体空间上模拟神经血管单元，其中上池是脑微血管内皮细胞细胞层，下池是星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞的混合培养，但该模型存在的较大缺陷是未实现星形胶质细胞的足突直接连接脑微血管内皮细胞层。

发明内容

本发明的目的在于提出用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片及方法，能够非常简单地实现星形胶质细胞的足突直接连接脑微血管内皮细胞层，同时又能与神经元细胞层建立联系，实现了单个星形胶质细胞的足突即连接脑微血管内皮细胞同时又连接神经元胞体。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片，包括：位于中间的第一流道，位于第一流道两侧且呈回形弯曲的对称结构的第二流道和第三流道，以及用于连接第一流道与第二流道、第一流道与第三流道的细流道；

所述第一流道，用于接种神经血管单元中的星形胶质细胞；

所述第二流道，用于接种神经血管单元中的神经元；

所述第三流道，用于接种神经血管单元中的脑微血管内皮细胞。

其中，所述第一流道、第二流道、第三流道的池深均为40-60μm，所述细流道高度为5-10μm。

一种用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片的制造方法，包括：

步骤1、在衬底材料上通过光刻技术制作细流道；

步骤2、在衬底材料上通过光刻技术制作第一流道、第二流道及第三流道；

步骤3、使用PDMS倒模复制出光刻的模板结构；

步骤4、与玻璃基底封接以形成封闭的流道，完成微流控芯片结构的制造。

其中，在步骤1之前，还包括：选择衬底材料；

所述步骤1、在衬底材料上通过光刻技术制作细流道，包括：

匀胶，将光刻胶滴在衬底材料上，利用匀胶机完成涂胶；

软烘，对涂胶后的衬底材料进行两级加热；

光刻，利用光刻机及第一掩膜板制作出细流道光刻胶结构。

其中，所述光刻胶的型号为SU8-3005，滴在衬底材料上的光刻胶的量为0.5-1.5mL，所述匀胶机的转速为2500-3500rmp，所述匀胶机的转动时间为20-60s，涂覆光刻胶的厚度为5-10μm；

所述两级加热，包括：60-70℃温度下烘烤1-2分钟，90-100℃温度下烘烤2-4分钟。

其中，所述滴在衬底材料上的光刻胶的量为1mL，所述匀胶机的转速为3000rmp，所述匀胶机的转动时间为30s；

所述两级加热，包括65℃温度下烘烤1分钟，95℃温度下烘烤3分钟。

其中，所述步骤2、在衬底材料上通过光刻技术制作第一流道、第二流道及第三流道，包括：

匀胶，将光刻胶滴在细流道光刻胶结构上，利用匀胶机完成涂胶；

软烘，对涂胶后的衬底材料进行两级加热；

光刻，利用光刻机及第二掩膜板制作出第一流道、第二流道及第三流道的光刻胶结构。

其中，所述步骤2中的所述光刻胶的型号为SU8-3050，所述匀胶机的转速为2500-3500rmp，所述匀胶机的转动时间为20-60s，涂覆光刻胶的厚度为40-60μm；

所述步骤2中的所述两级加热，包括：60-70℃温度下烘烤1-2分钟，90-100℃温度下烘烤2-4分钟。

其中，所述步骤2中的所述匀胶机的转速为3000rmp，所述匀胶机的转动时间为30s，所述两级加热，包括65℃温度下烘烤1分钟，95℃温度下烘烤3分钟。

其中，所述步骤2还包括：

坚膜烘焙，对细流道光刻胶结构以及第一流道、第二流道及第三流道的光刻胶结构进行两级加热；

显影，利用显影液将细流道光刻胶结构以及第一流道、第二流道及第三流道的光刻胶结构中的没有固化的光刻胶去除；

最后坚膜。

其中，所述坚膜烘焙中的两级加热，包括：60-70℃温度下烘烤1-2分钟，90-100℃温度下烘烤2-4分钟；

所述显影液为SU8显影液；

所述最后坚膜的温度为130-170℃。

其中，所述坚膜烘焙中的两级加热，包括：65℃温度下烘烤1分钟，95℃温度下烘烤3分钟；

所述最后坚膜的温度为150℃。

一种使用上述所述的用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片培养细胞方法，包括：

提取、纯化神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞；

在微流控芯片结构的第一流道接种星形胶质细胞后，再在第二流道接种神经元，记录二者生长状态，并用TJU1标记神经元和用GFAP标记星形胶质细胞，观察二者连接状态；

在微流控芯片结构的第三流道接种脑微血管内皮细胞后，再在第一流道接种星形胶质细胞，记录二者生长状态，并用GFAP标记星形胶质细胞和vWF标记脑微血管内皮细胞，观察二者连接状态；

在微流控芯片结构的第一流道接种星形胶质细胞后，再在第三流道接种脑微血管内皮细胞，最后在第二流道接种神经元，调整培养条件，记录三者生长状态，并用GFAP标记星形胶质细胞、vWF标记脑微血管内皮细胞和TJU1标记神经元，观察三者连接状态。

其中，所述神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞来自于原代大鼠的脑皮层部位。

有益效果：

本发明所述的微流控芯片，用于建立三种细胞共培养模型。通过利用微流控芯片内部的贯通微流道让不同的细胞在不同的区域，其中两种细胞之间是可以通过贯通的微流道进行细胞通讯。所以，本方案实现了在体外构建一种能够在立体或者平面空间上实现神经血管单元中星形胶质细胞作为中间桥梁连接神经元和微血管内皮细胞的新模型，将能更科学真实地在体外再现大脑中的神经血管网络，为中枢神经系统疾病尤其是脑血管的临床基础研究提供一个更好的平台，同时微流控芯片作为新兴的生物芯片，借助其体外构建神经血管单元，势必进一步拓宽微流控芯片的应用范围。

附图说明

图1是本发明具体实施方式提供的一种用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片的结构示意图。

图2是图1中微流控芯片的局部放大图。

图3是本发明具体实施方式提供的一种用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片的制造方法的流程图。

图4是本发明具体实施方式提供的一种利用用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片培养细胞方法的流程图。

图中：

1-第一流道；2-第二流道；3-第三流道；4-细流道。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

实施例1：

图1是本发明具体实施方式提供的一种用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片的结构示意图。图2是图1中微流控芯片的局部放大图。如图1、2所示，本发明所述的一种用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片，包括：位于中间的第一流道1，位于第一流道1两侧且呈回形弯曲的对称结构的第二流道2和第三流道3，以及用于连接第一流道1与第二流道2、第一流道1与第三流道3的细流道4；

所述第一流道1，用于接种神经血管单元中的星形胶质细胞；

所述第二流道2，用于接种神经血管单元中的神经元；

所述第三流道3，用于接种神经血管单元中的脑微血管内皮细胞。

本发明所述的微流控芯片，用于建立三种细胞共培养模型。通过利用微流控芯片内部的贯通微流道让不同的细胞在不同的区域，其中两种细胞之间是可以通过贯通的微流道进行细胞通讯。所以，本方案实现了在体外构建一种能够在立体或者平面空间上实现神经血管单元中星形胶质细胞作为中间桥梁连接神经元和微血管内皮细胞的新模型，将能更科学真实地在体外再现大脑中的神经血管网络，为中枢神经系统疾病尤其是脑血管的临床基础研究提供一个更好的平台，同时微流控芯片作为新兴的生物芯片，借助其体外构建神经血管单元，势必进一步拓宽微流控芯片的应用范围。

优选地，所述第一流道1、第二流道2、第三流道3的池深均为40-60μm，所述细流道高度为5-10μm。由于贯通细流道结构的高度和宽度都控制在5-10μm，可以限制细胞只在各自的区域生长。

本发明技术方案是一种用于建立三类细胞体外共培养模型的回形贯通微流控芯片，它包括三条可以分别接种不同细胞的流道以及为实现不同细胞交流而设计的贯通流道两两之间连接的细流道4。由于在血管神经单元中星形胶质细胞是作为桥梁，负责沟通神经元和脑微血管内皮细胞的重要作用，因此星形胶质细胞接种在中间那条流道上。另外，由于人体内真正的神经血管单元是由单个星形胶质细胞负责连接神经元和脑微血管内皮细胞的，所以本发明装置的关键设计是回形弯曲的对称结构，中间流道的两侧是对称的弯曲回形结构，较宽的区域可以为细胞的分裂生长提供足够的空间，较窄的区域是用于建立单个星形胶质细胞通过两侧之间的贯通细流道4与神经元和脑微血管内皮细胞交流的。通过借助微流控芯片这个媒介，结合原代培养神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞技术，在二维平面实现以星形胶质细胞为桥梁沟通神经元和脑微血管内皮细胞的新型体外神经血管单元模型，解决了神经血管单元中三种要素细胞分别在芯片上培养及神经元与星形胶质细胞、星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞共培养的重大科学问题。

实施例2：

图3是本发明具体实施方式提供的一种用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片的制造方法的流程图。如图3所示，本发明所述的一种用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片的制造方法，包括：

步骤1、在衬底材料上通过光刻技术制作细流道4；

步骤2、在衬底材料上通过光刻技术制作第一流道1、第二流道2及第三流道3；

步骤3、使用PDMS倒模复制出光刻的模板结构；

步骤4、与玻璃基底封接以形成封闭的流道，完成微流控芯片结构的制造。

本发明提供的一种用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片的制造方法，首先需要选择衬底材料，选择使用表面干净的3英寸硅片作为衬底，采用微电子制作工艺技术、在衬底材料上分别制作细流道4光刻胶结构、以及第一流道1、第二流道2及第三流道3光刻胶结构，然后采用与光刻胶型号匹配的显影液对上述形成的光刻胶结构显影去除经UV紫外光照射后没有发生化学反应部分的光刻胶，最终形成细流道4、以及第一流道1、第二流道2及第三流道3结构。然后通过PDMS倒模复制出光刻好的结构后与玻璃基底封接以形成封闭的流道，完成微流控芯片结构的制造。这里需要说明的是，PDMS(polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)是一种制作微流控芯片的材料，因其成本低，使用简单，同硅片之间具有良好的粘附性，而且具有良好的化学惰性等特点，成为一种广泛应用于微流控等领域的聚合物材料。

所述步骤1、在衬底材料上通过光刻技术制作细流道4，包括：

匀胶，将光刻胶滴在衬底材料上，利用匀胶机完成涂胶；

软烘，对涂胶后的衬底材料进行两级加热；

光刻，利用光刻机及第一掩膜板制作出细流道4光刻胶结构。

在上述步骤1中，所述光刻胶的型号为SU8-3005，滴在衬底材料上的光刻胶的量为0.5-1.5mL，所述匀胶机的转速为2500-3500rmp，所述匀胶机的转动时间为20-60s，涂覆光刻胶的厚度为5-10μm；所述两级加热，包括：60-70℃温度下烘烤1-2分钟，90-100℃温度下烘烤2-4分钟。

作为一种优选地实施方式，所述滴在衬底材料上的光刻胶的量为1mL，所述匀胶机的转速为3000rmp，所述匀胶机的转动时间为30s；所述两级加热，包括65℃温度下烘烤1分钟，95℃温度下烘烤3分钟。通过采用该组参数，能够制作出精细度较高的细流道4光刻胶结构。

所述步骤2、在衬底材料上通过光刻技术制作第一流道1、第二流道2及第三流道3，包括：

匀胶，将光刻胶滴在细流道4光刻胶结构上，利用匀胶机完成涂胶；

软烘，对涂胶后的衬底材料进行两级加热；

光刻，利用光刻机及第二掩膜板制作出第一流道1、第二流道2及第三流道3的光刻胶结构。

在上述步骤2中的所述光刻胶的型号为SU8-3050，所述匀胶机的转速为2500-3500rmp，所述匀胶机的转动时间为20-60s，涂覆光刻胶的厚度为40-60μm；所述步骤2中的所述两级加热，包括：60-70℃温度下烘烤1-2分钟，90-100℃温度下烘烤2-4分钟。

作为一种优选地实施方式，所述步骤2中的所述匀胶机的转速为3000rmp，所述匀胶机的转动时间为30s，所述两级加热，包括65℃温度下烘烤1分钟，95℃温度下烘烤3分钟。通过采用该组参数，能够制作出精细度较高的第一流道1、第二流道2及第三流道3的光刻胶结构。

步骤2，还包括：

坚膜烘焙，对细流道4光刻胶结构以及第一流道1、第二流道2及第三流道3的光刻胶结构进行两级加热；

显影，利用显影液将细流道4光刻胶结构以及第一流道1、第二流道2及第三流道3的光刻胶结构中的没有固化的光刻胶去除；

最后坚膜。

所述坚膜烘焙中的两级加热，包括：60-70℃温度下烘烤1-2分钟，90-100℃温度下烘烤2-4分钟；所述显影液为SU8显影液；所述最后坚膜的温度为130-170℃。

作为一种优选地实施方式，所述坚膜烘焙中的两级加热，包括：65℃温度下烘烤1分钟，95℃温度下烘烤3分钟；所述最后坚膜的温度为150℃。通过采用该组参数，能够制作出精细度高的微流控芯片结构。

实施例3：

图4是本发明具体实施方式提供的一种利用用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片培养细胞方法的流程图。如图4所示，本发明所述的一种使用上述所述的用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片培养细胞方法，包括：

提取、纯化神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞；

在微流控芯片结构的第一流道1接种星形胶质细胞后，再在第二流道2接种神经元，记录二者生长状态，并用TJU1标记神经元和用GFAP标记星形胶质细胞，观察二者连接状态；

在微流控芯片结构的第三流道3接种脑微血管内皮细胞后，再在第一流道1接种星形胶质细胞，记录二者生长状态，并用GFAP标记星形胶质细胞和vWF标记脑微血管内皮细胞，观察二者连接状态；

在微流控芯片结构的第一流道1接种星形胶质细胞后，再在第三流道3接种脑微血管内皮细胞，最后在第二流道2接种神经元，调整培养条件，记录三者生长状态，并用GFAP标记星形胶质细胞、vWF标记脑微血管内皮细胞和TJU1标记神经元，观察三者连接状态。

在本方案中，所述神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞来自于原代大鼠的脑皮层部位。

需要说明的是，本方案所提到的GFAP、vWF、TJU1为神经系统中细胞的标记物，其中，GFAP为星形胶质细胞活化的标志物(glial fibrillary acidicprotein，神经胶质酸性蛋白)，vWF为血管性假血友病因子(von Willebrandfactor,vWF)由血管内皮细胞及巨核细胞合成和分泌，TJU1为未成熟神经元标记物。

综上所述，本发明具有以下优点：

1、实现星形胶质细胞的足突直接连接脑微血管内皮细胞层；

2、实现单个星形胶质细胞的足突即连接脑微血管内皮细胞同时又连接神经元胞体；

3、细胞可以在一个完全密闭的环境下生长，从而能有效地避免污染的现象出现；

4、可以为3种细胞共培养提供一个非常有用的技术平台。

经过大量的实验证明本发明具有极高的可重复性和易操作性，并能形成非常完美的预期细胞生子格局，所实验的细胞类型包括神经元、星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞，都能非常健康地在本发明的微流控芯片中生长，实验结果证明本发明装置可以非常有效地构建神经元、星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞三种细胞共培养的神经血管单元模型。

本发明构建一种回形贯通流道结构的芯片用于神经元、星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞三种细胞共培养的神经血管单元模型，不仅可以用于构建神经血管单元模型，还可用于模拟肾小球单元模型的构建。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片，其特征在于，包括：位于中间的第一流道，位于第一流道两侧且呈回形弯曲的对称结构的第二流道和第三流道，以及用于连接第一流道与第二流道、第一流道与第三流道的细流道；

所述第一流道，用于接种神经血管单元中的星形胶质细胞；

所述第二流道，用于接种神经血管单元中的神经元；

所述第三流道，用于接种神经血管单元中的脑微血管内皮细胞。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一流道、第二流道、第三流道的池深均为40-60μm，所述细流道的高度为5-10μm。

3.一种用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片的制造方法，其特征在于，包括：

步骤1、在衬底材料上通过光刻技术制作细流道；

步骤2、在衬底材料上通过光刻技术制作第一流道、第二流道及第三流道；

步骤3、使用PDMS倒模复制出光刻的模板结构；

步骤4、与玻璃基底封接以形成封闭的流道，完成微流控芯片结构的制造。

4.根据权利要求3所述的制造方法，其特征在于，在步骤1之前，还包括：选择衬底材料；

所述步骤1、在衬底材料上通过光刻技术制作细流道，包括：

匀胶，将光刻胶滴在衬底材料上，利用匀胶机完成涂胶；

软烘，对涂胶后的衬底材料进行两级加热；

光刻，利用光刻机及第一掩膜板制作出细流道光刻胶结构。

5.根据权利要求4所述的制造方法，其特征在于，所述光刻胶的型号为SU8-3005，滴在衬底材料上的光刻胶的量为0.5-1.5mL，所述匀胶机的转速为2500-3500rmp，所述匀胶机的转动时间为20-60s，涂覆光刻胶的厚度为5-10μm；

所述两级加热，包括：60-70℃温度下烘烤1-2分钟，90-100℃温度下烘烤2-4分钟。

6.根据权利要求5所述的制造方法，其特征在于，所述滴在衬底材料上的光刻胶的量为1mL，所述匀胶机的转速为3000rmp，所述匀胶机的转动时间为30s；

所述两级加热，包括65℃温度下烘烤1分钟，95℃温度下烘烤3分钟。

7.根据权利要求4所述的制造方法，其特征在于，所述步骤2、在衬底材料上通过光刻技术制作第一流道、第二流道及第三流道，包括：

匀胶，将光刻胶滴在细流道光刻胶结构上，利用匀胶机完成涂胶；

软烘，对涂胶后的衬底材料进行两级加热；

光刻，利用光刻机及第二掩膜板制作出第一流道、第二流道及第三流道的光刻胶结构。

8.根据权利要求7所述的制造方法，其特征在于，所述步骤2中的所述光刻胶的型号为SU8-3050，所述匀胶机的转速为2500-3500rmp，所述匀胶机的转动时间为20-60s，涂覆光刻胶的厚度为40-60μm；

所述步骤2中的所述两级加热，包括：60-70℃温度下烘烤1-2分钟，90-100℃温度下烘烤2-4分钟。

9.根据权利要求8所述的制造方法，其特征在于，所述步骤2中的所述匀胶机的转速为3000rmp，所述匀胶机的转动时间为30s，所述两级加热，包括65℃温度下烘烤1分钟，95℃温度下烘烤3分钟。

10.根据权利要求7所述的制造方法，其特征在于，所述步骤2还包括：

坚膜烘焙，对细流道光刻胶结构以及第一流道、第二流道及第三流道的光刻胶结构进行两级加热；

显影，利用显影液将细流道光刻胶结构以及第一流道、第二流道及第三流道的光刻胶结构中的没有固化的光刻胶去除；

最后坚膜。

11.根据权利要求10所述的制造方法，其特征在于，所述坚膜烘焙中的两级加热，包括：60-70℃温度下烘烤1-2分钟，90-100℃温度下烘烤2-4分钟；

所述显影液为SU8显影液；

所述最后坚膜的温度为130-170℃。

12.根据权利要求11所述的制造方法，其特征在于，所述坚膜烘焙中的两级加热，包括：65℃温度下烘烤1分钟，95℃温度下烘烤3分钟；

所述最后坚膜的温度为150℃。

13.一种使用权利要求1或2所述的用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片培养细胞方法，其特征在于，包括：

提取、纯化神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞；

在微流控芯片结构的第一流道接种星形胶质细胞后，再在第二流道接种神经元，记录二者生长状态，并用TJU1标记神经元和用GFAP标记星形胶质细胞，观察二者连接状态；

在微流控芯片结构的第三流道接种脑微血管内皮细胞后，再在第一流道接种星形胶质细胞，记录二者生长状态，并用GFAP标记星形胶质细胞和vWF标记脑微血管内皮细胞，观察二者连接状态；

在微流控芯片结构的第一流道接种星形胶质细胞后，再在第三流道接种脑微血管内皮细胞，最后在第二流道接种神经元，调整培养条件，记录三者生长状态，并用GFAP标记星形胶质细胞、vWF标记脑微血管内皮细胞和TJU1标记神经元，观察三者连接状态。

14.根据权利要求13所述的培养细胞方法，其特征在于，所述神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞来自于原代大鼠的脑皮层部位。