CN106811408A - 基于微流控芯片的三维血脑屏障模型的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于微流控芯片的三维血脑屏障模型的建立方法。该微流控芯片主要包括三层结构：主通道层、胶原通道层和玻璃底层；主通道层包含细胞入口、主通道和废液出口；细胞入口和废液出口通过主通道连接，胶原通道层包含胶原入口、胶原液池和胶原通道，胶原入口和胶原液池通过胶原通道连接；同时主通道和胶原液池上下直接联通。三维血脑屏障模型的建立方法，方法过程如下：(1)胶原工作液的配制；(2)芯片内细胞接种及血脑屏障模型的建立。本发明与现有血脑屏障模型相比，解决了细胞间非接触式共培养和耗时长的问题，更接近体内真实的生理环境，显著降低了细胞和试剂的消耗量，提高实验效率。

Description

基于微流控芯片的三维血脑屏障模型的建立方法
技术领域
本发明涉及将微流控芯片技术应用到体内组织和器官的模拟与应用领域，具体涉及一种基于微流控芯片的三维血脑屏障模型的建立方法。
背景技术
自19世纪末，研究者认识到在大脑和脑血管之间有屏障组织的存在，称为“血脑屏障”。血脑屏障主要是由脑微血管内皮细胞、脑星形胶质细胞和周细胞等细胞成分共同组成的功能性屏障，可调节细胞、分子、营养物质等进出大脑以维持整个脑微环境的稳定性。研究发现，很多脑部异常和脑部疾病都与血脑屏障的破坏有关，也有很多疾病随着恶性程度的发展能够破坏血脑屏障。但是，由于血脑屏障对屏障外分子的特异性转运和屏障作用，很多药物无法顺利通过血脑屏障进而无法对相应脑部破坏和疾病进行有效的控制和治疗。因此，根据体内血脑屏障的结构和功能特性，体外建立稳定有效的血脑屏障模型，对于进一步研究血脑屏障的功能机制和原理、研究其对分子的转运能力及对脑损伤的机制，对新药的研究与开发至关重要。
血脑屏障体外模型的研究发展至今，主要依赖于商品化的Transwell小室，将内皮细胞和胶质细胞分别培养在聚碳酸酯膜的两侧以建立血脑屏障模型，研究二维层面的血脑屏障模型的结构和功能。主要存在的问题是Transwell小室构建的血脑屏障模型无法实现体内模型中血管和基质交界处所形成的界面，也无法加诸流体条件以模拟体内血脑屏障处的血流条件，不符合体内血脑屏障的生理环境，且内皮细胞和胶质细胞非接触式共培养，也不符合体内血脑屏障真实的生理组成，因此难以成为功能完善的血脑屏障模型并进行后续研究。
微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的技术，在生物医学领域得到了广泛的应用，且因其与细胞尺寸相匹配、近生理的微环境以及时空可控性，易于通过灵活的结构设计和多样的制作方法实现细胞水平的应用而逐渐成为新型的细胞学研究的重要技术手段和平台。目前，应用微流控芯片为技术平台建立血脑屏障模型，并进一步应用到药物筛选研究中还处于起步阶段。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的三维血脑屏障模型的建立方法，该方法能够建立一种近生理的三维血脑屏障模型并应用于针对脑肿瘤的药物筛选。
该微流控芯片主要包括三层结构：主通道层、胶原通道层和玻璃底层；主通道层包含细胞入口、主通道和废液出口；细胞入口和废液出口通过主通道连接，胶原通道层包含胶原入口、胶原液池和胶原通道，胶原入口和胶原液池通过胶原通道连接；同时主通道和胶原液池上下直接联通。
所述微流控芯片的主通道层和胶原通道层为两块相同大小的PDMS聚合物，主通道层PDMS芯片厚度为0.8-2mm，主通道层中主通道宽度为1mm，胶原通道层PDMS芯片厚度为0.5-1mm，胶原液池的直径为800μm，两层PDMS芯片封接后，主通道可将胶原液池完全覆盖；完全封接在一起的两块PDMS芯片再封接在洁净玻璃上，构成完整的芯片。
由于胶原通道层上的胶原入口与主通道层上的细胞入口和废液出口互相联通，因此胶原入口处同时可用于底层液体的收集。
所述整个芯片设计可并排封接在足够大的洁净玻璃底面以增加通量，个数可在1-100个之间。
一种基于微流控芯片的三维血脑屏障模型的建立方法，方法过程如下：
(1)胶原工作液的配制
将I型鼠尾胶原按照配方配制为终浓度为3～9mg/mL的工作液，用移液器将配制好的胶原工作液从胶原入口加入到胶原通道中，将整个芯片置于恒温培养箱中孵育30-45分钟，促使胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶。
(2)芯片内细胞接种及血脑屏障模型的建立
分别将新生SD大鼠的原代脑星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞消化为单细胞悬液，密度为5×105-1×106cells/mL。先从细胞入口向主通道中注入原代脑星形胶质细胞悬液，静置8-10分钟，再从细胞入口向主通道中注入原代脑微血管内皮细胞悬液，静置8-10分钟后，将整个芯片置于恒温培养箱中继续培养2-4天，每24小时换液一次。
所述步骤(1)中，鼠尾胶原的工作液浓度优选6mg/mL。
所述步骤(2)中，所用的大鼠脑星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞均为未经传代培养的原代细胞。
本发明在微流控芯片上构建三维血脑屏障模型，并可对其进行结构和功能的表征，为后续研究和应用提供平台。本发明与现有血脑屏障模型相比，解决了细胞间非接触式共培养和耗时长的问题，更接近体内真实的生理环境，显著降低了细胞和试剂的消耗量，提高实验效率。
附图说明
图1本发明所提供的微流控芯片结构示意图；(a)为主通道层结构示意图，(b)为胶原通道层结构示意图，(c)玻璃底层结构示意图；
其中，1主通道层、2细胞入口、3主通道、4废液出口、5胶原通道层、6胶原入口、7胶原液池、8胶原通道、9玻璃底层。
图2胶原加入芯片后，在胶原液池形成的清晰界面及三维基质均匀胶丝；
图3芯片上先后接种脑星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞并连续培养48小时后，上层脑微血管内皮细胞的增殖表征(bright)以及活性表征(vWF)；
图4芯片上血脑屏障中紧密连接蛋白ZO-1的表达情况，(1)、(2)、(3)分别表示三个胶原液池平行孔中的ZO-1的表达情况；
图5芯片上血脑屏障中葡萄糖转运体蛋白Glut-1的表达情况，其中Glut-1为蛋白表征，DAPI为细胞核表征，Merge为二者的叠加；
图6芯片上血脑屏障中极性转运体蛋白P-glycoprotein的表达情况，其中P-glycoprotein为蛋白表征，DAPI为细胞核表征，Merge为二者的叠加。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
本发明的微流控芯片，结构如图1所示。该微流控芯片主要包括三层结构：主通道层1、胶原通道层5和玻璃底层8；主通道层1包含细胞入口2、主通道3和废液出口4，细胞入口2和废液出口4通过主通道3连接；胶原通道层5包含胶原入口6、胶原液池7和胶原通道8，胶原入口6和胶原液池7通过胶原通道8连接；同时主通道3和胶原液池7上下直接联通。
主通道层PDMS厚度为1mm，主通道宽度为1mm；胶原通道层、PDMS厚度为0.5mm，胶原液池直径为800μm。两层PDMS芯片封接后，主通道可将胶原液池完全覆盖；完全封接在一起的两块PDMS芯片再封接在洁净玻璃上，构成完整的芯片。
实施例1
原代脑微血管内皮细胞和原代脑星形胶质细胞共培养在三维胶原表面的生长和增殖表征
配制浓度为6mg/mL的胶原工作液，从胶原入口加入到胶原通道中直至注满胶原液池，37℃凝胶30min，形成的胶丝分布如图2所示。从细胞入口向主通道中加入消化为单细胞悬液的新生SD大鼠的脑星形胶质细胞到主通道中，细胞悬液密度为5×106-1×107cells/mL，静置5min，使胶质细胞充分贴附在胶原表面，再从细胞入口向主通道中加入消化为单细胞悬液的新生SD大鼠的脑微血管内皮细胞到加入到主通道中，细胞悬液密度为5×106-1×107cells/mL，静置5min，使内皮细胞充分贴附在胶质细胞层的表面，随后将整个芯片置于培养箱中继续培养48小时，每隔24h换液一次，并拍照记录细胞生长和增殖融合的情况，如图3所示。48小时后，进行细胞免疫荧光染色，监测蛋白为内皮细胞特异性标记物vWF，方法如下：4％多聚甲醛进行细胞固定，PBS缓冲液冲洗三次，每次10min；0.1％triton X-100致孔剂作用10min，PBS缓冲液冲洗三次，每次10min；山羊封闭血清作用1小时，一抗(兔抗大鼠vWF)1:100稀释，4℃过夜孵育，PBS缓冲液冲洗三次，每次10min；二抗(TRITC标记的山羊抗兔IgG)1:100稀释，常温孵育1小时，PBS缓冲液冲洗三次，每次10min；冲洗完毕后荧光显微镜下拍照，记录vWF蛋白的表达情况，结果如图3所示。
实施例2
芯片上血脑屏障功能性蛋白的表征
利用实验室自行设计制作的微流控芯片，结构如图1所示。当经过连续培养48小时，血脑屏障形成后，进行内皮细胞的免疫荧光染色，监测蛋白为内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、葡萄糖转运体蛋白Glut-1和极性转运体蛋白P-glycoprotein，方法如实施例1所述。最后采用荧光显微镜拍照，结果如图4、图5、图6所示。

Claims (7)

1.一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要包括三层结构：主通道层(1)、胶原通道层(5)和玻璃底层(9)；主通道层(1)包含细胞入口(2)、主通道(3)和废液出口(4)；细胞入口(2)和废液出口(4)通过主通道(3)连接，胶原通道层(5)包含胶原入口(6)、胶原液池(7)和胶原通道(8)，胶原入口(6)和胶原液池(7)通过胶原通道(8)连接；同时主通道(3)和胶原液池(7)上下直接联通。
2.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片的主通道层和胶原通道层为两块相同大小的PDMS聚合物，主通道层PDMS芯片厚度为0.8-2mm，主通道层中主通道宽度为1mm，胶原通道层PDMS芯片厚度为0.5-1mm，胶原液池的直径为800μm，两层PDMS芯片封接后，主通道可将胶原液池完全覆盖；完全封接在一起的两块PDMS芯片再封接在洁净玻璃上，构成完整的芯片。
3.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：由于胶原通道层上的胶原入口与主通道层上的细胞入口和废液出口互相联通；因此，从主通道中灌注的液体渗入胶原通道中后可由胶原入口进行收集。
4.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：整个芯片设计可并排封接在足够大的洁净玻璃底面以增加通量，个数可在1-100个之间。
5.一种基于权利要求1所述微流控芯片的三维血脑屏障模型的建立方法，其特征在于方法过程如下：
(1)胶原工作液的配制
将I型鼠尾胶原按照配方配制为终浓度为3-9mg/mL的工作液，用移液器将配制好的胶原工作液从胶原入口加入到胶原通道中，将整个芯片置于恒温培养箱中孵育30-45分钟，促使胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶；
(2)芯片内细胞接种及血脑屏障模型的建立
将新生SD大鼠的原代脑星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞消化为单细胞悬液，密度为5×105-1×106cells/mL；先从细胞入口向主通道中注入原代脑星形胶质细胞悬液，静置8-10分钟，再从细胞入口向主通道中注入原代脑微血管内皮细胞悬液，静置8-10分钟后，将整个芯片置于恒温培养箱中继续培养2-4天，每24小时换液一次。
6.按照权利要求5所述的基于微流控芯片的三维血脑屏障模型的建立方法，其特征在于：所述步骤(1)中，鼠尾胶原的工作液浓度优选6mg/mL。
7.按照权利要求5所述的基于微流控芯片的三维血脑屏障模型的建立方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所用的大鼠的原代脑脑星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞均为未经传代培养的原代细胞。
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