KR20200085870A - 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체 및 그 제조방법 - Google Patents

세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체가 본원에서 제공된다. 상기 분해가능한 폼 세포지지체는 펙트산; 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 이온성 가교결합된 폴리갈락투론산 화합물, 및 표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머를 포함한다.

Description

세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체 및 그 제조방법
본 출원은 2017년 11월 21일자로 출원된 미국 가출원 제62/589,238호 및 2018년 2월 19일자로 출원된 미국 가출원 제62/632,178호의 우선권을 청구하며, 그 내용은 후술될 바와 같이 그 전체가 참고로서 포함된다.
분야
본 기재는 분해가능한 세포 배양 물질에 관한 것이다. 특히, 본 기재는 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체 및 이러한 분해가능한 폼 세포지지체의 제조방법에 관한 것이다.
생체외(In-vitro) 연구는 약물 발견 과정 및 잠재적인 신규 치료법의 탐색에 중요하다. 그러나, 2차원(2D) 배양 기판 상의 전통적인 생체외 세포 배양은 생체내(in-vivo) 환경을 모사하지 못한다. 생체내 환경의 대부분의 모든 세포가 3-차원(3D) 방식(fashion)으로 다른 세포 및 세포외 매트릭스에 의해 둘러싸이므로, 2D 세포 배양은 세포의 천연 3D 환경을 적절하게 모사하지 않는다. 2D 배양에서의 세포는 단단한 표면(rigid surface)에 고착하도록 강요되고 기하학적으로 제약되며, 세포내 신호에서 중요한 세포골격 규정을 변경하는 평평한 모폴로지를 취하며, 따라서 세포 성장, 이동 및 세포자살에 영향을 미칠 수 있다. 더욱이, 세포 분화, 증식, 및 유전자 발현에 중요한 ECM의 조직은 대부분의 2D 세포에 부재한다. 이러한 2D 배양에서의 한계는 종종 생체내에서 발견된 것과 크게 다른 생체외 생체 반응으로 귀결된다.
최근, 약물 발견에서, 화합물을 스크린하는 표준 과정은 2D 세포 배양-기반 시험으로 시작하며, 동물 모델 시험 및 임상 시험이 이어진다. 공연하게 입수 가능한 데이터에 따르면, 단지 약 10%의 화합물이 임상 개발을 통해서 성공적으로 진행한다. 많은 약물은 임상 효능 및/또는 허용가능하지 않은 유독성에 크게 기인하여 임상 시험(특히 임상 개발의 가장 값비싼 상인, 3상 동안) 동안 실패한다. 이러한 실패 부분은 약물에 대한 세포 반응이 비정상적인 미세환경에 기인하여 변경되는 2D 배양 시험으로부터 수집된 데이터에 기인한다. 약물 발견과 관련된 고 비용에 기인하여, 가능한 약물 발견 공정의 초기에 무효하거나 및/또는 허용가능하지 않은 유독성 화합물을 일축하는 능력에 대한 요구가 많아지고 있다. 생체내 세포 거동을 좀 더 사실적으로 모방할 수 있고 생체내 시험에 대해 좀 더 예측가능한 결과를 제공할 수 있는 생체외 세포-기반 시스템이 고려되고 있다.
최근의 연구는 2D 배양 대비, 3D 세포 배양이 생체내 세포에 의해 경험되는 환경을 좀 더 정확하게 나타낸다는 점을 제시하고 있으며, 3D 배양에서의 세포 반응이 2D 배양에서의 세포 반응보다 생체내 거동에 더욱 유사하다는 점을 증명하고 있다. 3D 배양의 추가적인 차원수는 둘러싸는 세포와의 상호작용을 하는 세포 표면 수용기의 공간 조직에 영향을 줄 뿐 아니라 세포에 물리적 제약을 유도하므로, 세포 반응에서 차이를 이끄는 것으로 믿어진다. 3D 배양에서의 이러한 공간적 그리고 물리적 관점은 외부에서부터 세포 내부까지의 신호 전달에 영향을 미치며, 궁극적으로 유전자 발현 및 세포 거동에 영향을 미치는 것으로 믿어진다.
3D 배양의 이점은 세포의 천연 3D 환경을 모사하는 세포 배양 기술의 개발에 영향을 준다. 일부 생물 반응 장치는 세포 접착 및 성장을 촉진하는 고정 또는 충전 층(bed)을 형성하는 고정 충전 물질(stationary packing material)의 형태로 캐리어를 포함한다. 상기 고정 층의 충전 물질의 배열은 국부적인 유체, 열 및 물질 이동에 영향을 미치며, 통상적으로 주어진 공간에서 세포 배양을 최대화하기 위하여 매우 조밀하다. 또 다른 3D 세포 배양 기술은 기공 내의 그리고 상기 매트릭스의 기타 내부 공간 내의 배양된 세포의 성장 및 증식을 촉진하는 다공성 3D 매트릭스 또는 세포지지체이다.
전술한 각 기술에서, 단백분해효소 처리는 세포를 채취(harvest)하는데 사용될 수 있다. 그러나, 단백분해효소 처리와 같은 공통적으로 사용되는 채취 과정은 세포 구조 및 기능을 손상시킬 수 있는 가혹한 환경에 세포를 둔다. 추가적으로, 단백분해효소 처리 단독은 종종 단지 제한된 양의 세포 분리를 야기한다. 고정 층 물질에 대하여, 문제는 부분적으로 채취된 세포의 수율을 증가시키고 층을 통해서 프로테아제제를 순환시키기 어렵게 만드는 고정 층 물질의 조밀하게 충전된 성질로부터 초래된다. 유사하게, 3D 매트릭스의 내부 공간을 통해서 프로테아제제를 순환시키는 것이 어려울 수 있으므로, 이는 차례로 채취 공정 동안 세포 제거가 어렵도록 한다. 상기 어려움은 매트릭스의 표면에 또는 상기 고정 상 물질의 표면에 세포를 부착시키는 역할을 하는 배양된 세포에 의해 분비된 세포외 거대분자의 존재에 의해 조합된다.
대안적으로 또는 단백분해효소 처리와의 조합 중 어느 하나로, 세포 채취를 위한 방법 및 시스템은 고정 층 물질 또는 3D 매트릭스로부터 배양된 세포를 방출하기 위한 기계력을 적용하도록 개발되어왔다. 예를 들어, 상기 고정 상 물질 또는 3D 매트릭스, 또는 상기 고정 상 물질 또는 3D 매트릭스를 포함하는 좀 더 큰 시스템이 배양된 세포를 방출하기 위하여 흔들리거나 진동될 수 있다. 기계력의 적용은 또한 배양된 세포에 물리적 손상을 야기할 수 있으며, 이는 차례로 세포 배양 수율을 감소시킨다.
대안적으로 또는 단백분해효소 처리와의 조합 중 어느 하나로, 세포 채취를 위한 방법 및 시스템은 고정 층 물질 또는 3D 매트릭스로부터 배양된 세포를 방출하기 위한 기계력을 적용하도록 개발되어왔다. 예를 들어, 상기 고정 상 물질 또는 3D 매트릭스, 또는 상기 고정 상 물질 또는 3D 매트릭스를 포함하는 좀 더 큰 시스템이 배양된 세포를 방출하기 위하여 흔들리거나 진동될 수 있다. 기계력의 적용은 또한 배양된 세포에 물리적 손상을 야기할 수 있으며, 이는 차례로 세포 배양 수율을 감소시킨다.
본 기재의 구현예에 따르면, 세포 배양을 위한 분해가능한 폼 세포지지체가 제공된다. 상기 분해가능한 폼 세포지지체는 펙트산; 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 이온성 가교결합된 폴리갈락투론산 화합물, 및 표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머를 포함한다.
본 기재의 구현예에 따르면, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법이 제공된다. 상기 방법은 펙트산; 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염 중 적어도 하나로부터 선택된 폴리갈락투론산 화합물을 수성 용액에 첨가하여 제1의 수성 혼합물을 형성하는 단계; 표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머 및 2가의 금속 염을 수성 용액에 첨가하여 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계; 상기 제1의 수성 혼합물과 제2의 제1의 수성 혼합물을 조합하여 조합된 수성 혼합물을 형성하는 단계; 상기 조합된 수성 혼합물에 겔 유도제를 첨가하는 단계; 및 상기 조합된 수성 혼합물에 기포를 도입하여 폼 세포지지체를 형성하는 단계를 포함한다.
본 기재의 구현예에 따르면, 분해가능한 폼 세포지지체(scaffold) 상의 세포 배양방법이 제공된다. 상기 방법은 세포가 분해가능한 폼 세포지지체의 기공으로 침투(enter)하도록 분해가능한 폼 세포지지체 상에 세포를 시딩하는(seeding) 단계, 및 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 분해가능한 세포지지체는 펙트산; 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염 중 적어도 하나로부터 선택된 이온성 가교결합된 폴리갈락투론산 화합물; 및 표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머를 포함한다.
본 기재의 구현예에 따르면, 분해가능한 폼 세포지지체로부터 세포 채취방법이 제공된다. 상기 방법은 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 효소에 노출시켜 분해가능한 폼 세포지지체를 소화시키는 단계; 및 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 착화제에 노출시키는 단계를 포함한다. 상기 분해가능한 세포지지체는 펙트산; 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염 중 적어도 하나로부터 선택된 이온성 가교결합된 폴리갈락투론산 화합물; 및 표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머를 포함한다. 본 기재의 구현예에 따르면, 조성물로부터 형성된 발포 세포지지체 생성물이 제공된다. 상기 조성물은 펙트산; 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염 중 적어도 하나로부터 선택된 이온성 가교결합된 폴리갈락투론산 화합물; 표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머; 및 약 55 중량% 미만의 수용성 가소제를 포함한다.
추가적인 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명에 설명될 것이며, 부분적으로는 이어지는 청구항, 첨부된 도면의 상세한 설명을 포함하는 본원에 기술된 실시예를 실시함으로써 인식되거나 또는 설명으로부터 통상의 기술자에게 쉽게 명백해질 것이다.
전술한 일반적인 설명 및 후술되는 상세한 설명 모두는 단지 예시를 위한 것으로서, 청구항의 성질 및 특성을 이해하기 위한 개관 또는 틀을 제공하는 것으로 의도됨이 이해되어야 한다. 첨부된 도면은 추가적인 이해를 제공하기 위하여 포함되며, 본 명세서에 포함되어 그 일부를 구성한다. 도면은 다양한 구현예의 원리 및 작동을 설명하기 위하여 주어지는 설명과 함께 하나 이상의 구현예를 예시한다.
본 기재는 다음의 설명 및 단순히 비-한정적 실시예로서 주어지는 첨부된 도면으로부터 좀 더 명확하게 이해될 것이다:
도 1은 본 기재에 따른 분해가능한 폼 세포지지체의 사시도이며;
도 2는 실시예 1에서 제조된 폼 세포지지체의 SEM 사진을 나타내며;
도 3은 실시예 2에서 제조된 폼 세포지지체의 SEM 사진을 나타내며;
도 4는 실시예 3에서 제조된 폼 세포지지체의 SEM 사진을 나타내며;
도 5는 실시예 4에서 제조된 폼 세포지지체의 SEM 사진을 나타내며;
도 6은 실시예 5에서 제조된 폼 세포지지체의 SEM 사진을 나타내며;
도 7은 실시예 6에서 제조된 폼 세포지지체의 SEM 사진을 나타내며;
도 8은 실시예 7에서 제조된 폼 세포지지체의 SEM 사진을 나타내며;
도 9는 실시예 8에서 제조된 폼 세포지지체의 SEM 사진을 나타내며;
도 10은 실시예 9에서 제조된 폼 세포지지체의 SEM 사진을 나타내며;
도 11은 실시예 10에서 제조된 폼 세포지지체의 SEM 사진을 나타내며;
도 12는 실시예 11에서 제조된 폼 세포지지체의 SEM 사진을 나타내며;
도 13은 다양한 양의 가소제가 첨가되어 4개의 폼 세포지지지체를 형성한 실시예 12에서 제조된 4개의 폼을 나타내며;
도 14는 실시예 13에서 제조된 폼 세포지지체의 SEM 사진을 나타내며;
도 15는 실시예 4에서 제조된 폼 세포지지체의 기공에 형성된 타원체를 나타내며;
도 16은 실시예 14에서 제조된 폼 세포지지체에 고착된 세포를 나타내며;
도 17은 실시예 15에서 제조된 폼 세포지지체에 고착된 세포를 나타내며;
도 18은 실시예 15에서 제조된 폼 세포지지체에 고착된 6일의 팽윤 후 세포를 나타내며;
도 19는 실시예 24의 각 배양 조건에 대해 감염된 HEK 세포의 GFP-양성율을 나타낸 막대 그래프이며;
도 20은 실시예 25의 폼 세포지지체 세트 당 감염된 세포의 GFP-양성율을 나타낸 막대 그래프이며;
도 21은 실시예 25의 폼 세포지지체 세트 당 바이리온(vp)의 수를 나타낸 막대 그래프이며;
도 22는 실시예 25의 폼 세포지지체 세트 당 얻어진 세폼 당 바이리온의 수를 나타낸 막대 그래프이며; 및
도 23은 감염 후 실시예 25의 폼 세포지지체의 각 세트에 대한 GFP 발현을 나타내는 세포의 분획을 나타내는 막대 그래프이다.
첨부된 도면에서 예시된 본 구현예, 실시예에서 참조가 상세히 이루어질 것이다. 가능한 한, 동일 참조 부호가 도면을 전체를 통해서 동일하거나 또는 유사한 부분을 나타내는데 사용될 것이다.
단수 형태 "하나의", "일" 및 "상기"는 맥락적으로 다르게 명시되지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 동일 특성을 개시하는 모든 범위의 끝점은 독립적으로 조합가능하며 개시된 끝점을 포괄한다. 모든 참조문헌은 참고로서 본원에 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "갖는다", "갖는", "포함하다", "포함하는", "포괄하다", "포괄하는" 또는 그 유사 표현은 열린 단부의 의미로 사용되며, 일반적으로 "포함하나, 이에 한정되지 않는" 것을 의미한다.
본원에 사용된 모든 과학적 그리고 기술적 용어는 다르게 명시되지 않는 한 당해 기술 분야에서 공통적으로 사용되는 의미를 갖는다. 본원에 제공된 정의는 본원에서 자주 사용되는 소정의 용어의 이해를 돕기 위한 것으로 본 기재의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
본 기재는 먼저 일반적으로 다음으로 수 개의 예시적인 구현예에 기초하여 상세히 아래에서 기술된다. 또 다른 개별적인 예시적인 구현예와 조합되어 나타낸 특징이 모두 실현되어야 하는 것은 아니다. 특히, 개별적인 특징들은 또한 생략되거나 또는 일부 예시적인 구현예 또는 기타 예시적인 구현예에 나타낸 다른 특징과 일부 다른 방식으로 조합될 수 있다.
본 기재의 구현예는 세포 배양을 위한 분해가능한 폼 세포지지체 및 이러한 분해가능한 폼 세포지지체의 제조방법에 관한 것이다. 본 기재의 구현예는 또한 분해가능한 폼 세포지지체에서 고착된 세포, 세포 응집체 또는 타원체의 세포 배양방법에 관한 것이다. 나아가, 본 기재의 구현예는 분해가능한 폼 세포지지체를 포함하는 생물 반응 장치 시스템에 관한 것이다. 아래 논의에서 좀 더 분명해진 것과 같이, 본원에 개시된 폼 세포지지체는 분해가능(dissolvable)하고 불용성(insoluble)인 것으로 기술된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "불용성"은 예를 들어 세포 배양 배지를 포함하는 통상적인 세포 배양 조건 하에서 가교결합되어 남는 녹지 않는(not soluble) 물질의 조합 또는 물질을 나타내는데 사용된다. 또한 본원에서 사용되는 바에 따라, 용어 "분해가능한"은 물질 또는 물질의 조합을 소화시키거나 또는 와해(breakdown)시키는 효소의 적합한 농도에 노출되는 경우 소화되는 물질 또는 물질의 조합을 나타내는데 사용된다. 본원에 기술된 바와 같은 분해가능한 폼 세포지지체는 열린 기공 아키텍쳐 및 높은 상호연결 기공을 갖는 다공성 세포지지체이다. 상기 세포지지체의 기공은 세포-대-세포 상호작용 및 3D 방식의 ECM의 형성이 도움이 되는 세포의 배양을 위한 보호된 환경을 제공한다. 상기 분해가능한 폼 세포지지체는 단백분해효소 처리 및/또는 기계적 채취 기술을 사용하여 세포를 손상시키지 않고 세포의 채취를 허용하는 완전하게 소화될 수 있다.
도 1은 본 기재에 따른 분해가능한 폼 세포지지체(10)의 사시도이다. 아래에서 좀 더 상세히 기술되고 본 기재의 다른 도면에서 좀 더 명백히질 것과 같이, 분해가능한 폼 세포지지체(10)는 열린 기공 아키텍쳐를 포함하는 다공성 폼이다. 분해가능한 폼 세포지지체(10)는 약 50 ㎛ 및 약 500 ㎛ 사이의 평균 기공 크기 직경 및 약 85% 내지 약 96%의 다공성을 갖는다. 분해가능한 폼 세포지지체(10)는 세포의 배양을 위한 폼 세포지지체의 기공 내에 보호된 환경을 제공한다. 추가적으로, 분해가능한 폼 세포지지체(10)는 또한 세포 손상 없이 세포지지체에서 배양된 세포의 채취를 용이하게 하는 물질의 와해 또는 소화시키는 적합한 효소에 노출되는 경우 분해가능하다.
본원에 기술된 분해가능한 폼 세포지지체는 적어도 하나의 이온성 가교결합된 다당류를 포함한다. 일반적으로, 다당류는 세포 배양 적용에 유익한 기여를 갖는다. 다당류는 친수성, 비-세포독성이며 배양 배지에서 안정하다. 실시예는 또한 폴리갈락투론산 (PGA)으로 알려진 펙트산 또는 이들의 염, 부분적으로 에스테르화된 펙트산 또는 이들의 염, 또는 부분적으로 아미드화된 펙트산 또는 이들의 염을 포함한다. 펙트산은 소정의 펙틴 에스테르의 가수분해를 통해서 형성될 수 있다. 펙틴은 세포 벽 다당류이며, 본래 식물에서 구조적인 역할을 갖는다. 펙틴의 주요 소스는 감귤 껍질(예를 들어, 레몬 및 라임의 껍질) 및 사과 껍질을 포함한다. 펙틴은 1,2-링크 L-람노스에 의해 랜덤으로 가로막힌, 1,4-링크 알파-D-갈락투로네이트 백본(galacturonate backbone)에 기반한 지배적인 선형 폴리머이다. 평균 분자량은 약 50,000 내지 약 200,000 달톤 범위이다.
펙틴의 폴리갈락투론산 사슬은 부분적으로 에스테르화될 수 있으며, 예를 들어, 메틸기 및 프리 산기(free acid group)가 부분적으로 또는 전체적으로 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 이온과 같은 1가의 이온으로 중화될 수 있다. 메탄올로 부분적으로 에스테르화된 폴리갈락투론산은 펙틴성 산으로 불리며, 이들의 염은 펙틴산염으로 불린다. 고 메톡실(HM) 펙틴에 대한 메틸화(DM)의 정도는 예를 들어 60 내지 75 mol%일 수 있고, 낮은 메톡실 (LM) 펙틴에 대한 것은 1 내지 40 mol%일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이 부분적으로 에스테르화된 폴리갈락투론산의 에스테르화 정도는 약 70 mol% 미만, 또는 약 60 mol% 미만, 또는 50 mol% 미만, 또는 약 40 mol% 미만, 및 이들 사이의 모든 값일 수 있다. 임의의 특정 이론에 구속되는 것을 원하지 않으나, 프리 카르복시산 기(에스테르화되지 않은)의 최소 양은 불용성인 분해가능한 세포지지체의 형성을 가능하게 하는 이온성 가교결합 정도를 촉진시키는 것으로 믿어진다.
대안적으로, 펙틴의 폴리갈락투론산 사슬은 부분적으로 아미드화될 수 있다. 폴리갈락투론산은 예를 들어, 암모니아의 처리에 의해 생산될 수 있다. 아미드화된 펙틴은 카르복시 기 (~COOH), 메틸 에스테르 기 (~COOCH3), 및 아미드화 기(-CONH2)를 함유한다. 아미드화 정도는 달라질 수 있으며, 예를 들어 약 10% 내지 약 40% 아미드화될 수 있다.
본 기재의 구현예에 따르면, 전술한 바와 같은 분해가능한 폼 세포지지체는 펙트산 및 부분적으로 에스테르화된 펙트산의 혼합물을 포함한다. 혼화성 폴리머와의 블렌드가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 펙트산 및/또는 부분적으로 에스테르화된 펙트산은 덱스트란, 치환된 셀룰로오스 유도체, 알긴산, 녹말es, 글리코겐, 아라비녹실란s, 아가로스, 등과 같은 기타 다당류와 혼합될 수 있다. 히알루론산 및 콘드로이틴 황산염과 같은 글리코사미노글리칸, 또는 엘라스틴, 피브린, 실크 피브로인, 콜라겐 및 이들의 유도체와 같은 다양한 단백질이 또한 사용될 수 있다. 수용성 합성 폴리머가 또한 펙트산 및/또는 부분적으로 에스테르화된 펙트산과 블렌드될 수 있다. 예시적인 수용성 합성 폴리머는 이에 한정되는 것은 아니나 폴리알킬렌 글리콜, 폴리(히드록시알킬(메스)아크릴레이트), 폴리(메스)아크릴아미드 및 유도체, 폴리(N-비닐-2-피롤리돈), 및 폴리비닐 알코올을 포함한다.
본 기재의 구현예에 따르면, 전술한 바와 같은 분해가능한 폼 세포지지체는 적어도 하나의 제1의 폴리머를 더욱 포함할 수 있다. 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 수용성이며, 비-이온성 가교결합성이며 표면 활성을 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표면 활성"은 두 개의 액체 또는 액체 및 고체 사이 또는 기체 및 액체 사이의 표면 장력(또는 계면 장력)을 낮추거나 또는 제거하기 위한 제제의 활성과 관련된다. 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 약 8 초과 또는 약 10 초과의 친수성-친유성 평형 (HLB)을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 약 8 및 약 40 사이 또는 약 10 및 약 40 사이의 HLB를 가질 수 있다. 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 약 8 및 약 15 사이, 또는 약 10 및 약 12 사이의 HLB를 가질 수 있다. HLB는 폴리머의 친유성 또는 친수성 정도에 대한 참조를 제공한다. 좀 더 큰 HLB 값은 좀 더 강한 친수성을 나타내는 한편, 좀 더 작은 HLB 값은 좀 더 강한 친유성을 나타낸다. 일반적으로, 상기 HLB 값은 1 내지 40의 범위로 달라지고, 상기 친수성-친유성 전이는 종종 약 8 및 약 10 사이로 고려된다. 상기 HLB 값이 친수성-친유성 전이 미만인 경우, 상기 물질은 친유성이고, 상기 HLB 값이 친수성-친유성 전이를 초과하는 경우, 상기 물질은 친수성이다.
본 기재의 구현예에 따른 예시적인 제1의 폴리머는 임의의 셀룰로오스 유도체, 단백질, 합성한 양쪽 친매성 폴리머, 및 이들의 조합일 수 있다. 예시적인 셀룰로오스 유도체는 이에 한정되는 것은 아니나, 하이드록시에틸셀룰로오스 (HEC), 하이드록시프로필셀룰로오스 (HPC), 메틸셀룰로오스 (MC), 하이드록시에틸메틸셀룰로오스 (HEMC), 및 하이드록시프로필-메틸셀룰로오스 (HPMC)를 포함한다. 예시적인 단백질은 이에 한정되는 것은 아니나 소 혈청 알부민 (BSA), 젤라틴, 카세인 및 하이드로포빈을 포함한다. 예시적인 합성 양쪽 친매성 폴리머는 이에 한정되는 것은 아니나 상품명 Synperonics® (Croda International, Snaith, United Kingdom로부터 상업적으로 입수 가능함) 하에 입수가능한 폴록사머, 상품명 Pluronics® (BASF Corp., Parsippany, NJ로부터 상업적으로 입수 가능함) 하에 입수가능한 폴록사머, 및 상품명 Kolliphor® (BASF Corp., Parsippany, NJ로부터 상업적으로 입수 가능함) 하에 입수 가능한 폴록사머를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 분해가능한 폼 세포지지체는 적어도 하나의 제2의 폴리머를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 적어도 하나의 제2의 폴리머는 수용성이며 어떠한 표면 활성도 갖지 않는다. 예시적인 제2의 폴리머는 임의의 합성 폴리머, 반합성 폴리머, 천연 폴리머 및 이들의 조합일 수 있다. 예시적인 합성 폴리머는 이에 한정되는 것은 아니나, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 카르복시비닐 폴리머, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드의 호모폴리머 및 코폴리머, 폴리비닐 메틸 에테르-말레산 무수물, 및 폴리에틸렌 산화물/폴리프로필렌 산화물 블록 코폴리머를 포함한다. 예시적인 반합성 폴리머는 이에 한정되는 것은 아니나, 덱스트란 유도체, 카르복시메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스 및 유도체, 메틸셀룰로오스 및 유도체, 에틸셀룰로오스 셀룰로오스, 에틸 하이드록시에틸 셀룰로오스, 및 하이드록시프로필 셀룰로오스를 포함한다. 예시적인 천연 폴리머는 이에 한정되는 것은 아니나, 녹말 및 녹말 유도체, 커드란, 풀루란 및 젤란검과 같은 미생물 발효에 의해 얻어진 폴리머, 크산탄 검, 덱스트란, 알부민과 같은 단백질, 카세인 및 카세인염, 젤라틴, 한천, 알긴산염 및 카라기닌과 같은 해초 추출물, 구아 검 및 유도체 및 로커스 콩 검과 같은 종자 추출물 및 히알루론산, 및 콘드로이틴 황산염을 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 분해가능한(dissolvable) 폼 세포지지체는 세포 배양 배지와 접촉하여 위치되는 경우 세포지지체의 분해(dissolution)를 방지하기 위하여 그리고 그들의 기계적 강도를 증가시키기 위하여 가교결합될 수 있다. 가교결합은 후술되는 바와 같은 이온성 겔화에 의해 수행될 수 있으며, 여기서 이온성 겔화는 가교결합된 세포지지체를 형성하기 위하여 다가의 짝이온의 존재에서 가교결합하기 위한 고분자전해질의 능력에 기반한다. 임의의 특정 이론에 구속되고자 하는 것은 아니나, 상기 분해가능한 폼 세포지지체의 다당류의 이온성 겔화는 이가의 양이온 및 다당류 사이의 강한 상호작용의 결과인 것으로 믿어진다.
본 기재의 구현예에 따르면, 본원에 기술된 세포지지체는 다공성 폼 세포지지체이다. 본원에 기술된 폼 세포지지체는 약 85% 내지 약 96%의 다공성을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 폼 세포지지체는 약 91% 내지 약 95%, 또는 약 94% 내지 약 96%의 다공성을 가질 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 용어 "다공성"은 분해가능한 세포지지체에서 열린 기공 부피의 측정을 나타내며, % 다공성의 항목으로 언급되며, 여기서 % 다공성은 분해가능한 폼 세포지지체의 총 부피에서 보이드(void)의 %이다. 본원에 기술된 폼 세포지지체는 약 50 ㎛ 및 약 500 ㎛ 사이의 평균 기공 크기 직경을 가질 수 있다. 예를 들어, 평균 기공 크기 직경은 약 75 ㎛ 및 약 450 ㎛ 사이, 또는 약 100 ㎛ 및 약 400 ㎛ 사이, 또는 150 ㎛ 및 약 350 ㎛ 사이 및 이들 사이의 모든 값일 수 있다.
본원에 기술된 세포지지체는 약 0.40 g/cc 미만의 습윤 밀도를 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 세포지지체는 약 0.35 g/cc 미만, 또는 약 0.30 g/cc 미만, 또는 약 0.25 g/cc 미만의 습윤 밀도를 가질 수 있다. 본원에 기술된 세포지지체는 약 0.16 g/cc 및 약 0.40 g/cc 사이, 또는 약 0.16 g/cc 및 약 0.35 g/cc 사이, 또는 약 0.16 g/cc 및 약 0.30 g/cc 사이, 또는 약 0.16 g/cc 및 약 0.25 g/cc 사이, 및 이들 사이의 모든 값의 습윤 밀도를 가질 수 있다. 본원에 기술된 세포지지체는 약 0.20 g/cc 미만의 건조 밀도를 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 세포지지체는 약 0.15 g/cc 미만, 또는 약 0.10 g/cc 미만, 또는 약 0.05 g/cc 미만의 건조 밀도를 가질 수 있다. 본원에 기술된 세포지지체는 약 0.02 g/cc 및 약 0.20 g/cc 사이, 또는 약 0.02 g/cc 및 약 0.15 g/cc 사이, 또는 약 0.02 g/cc 및 약 0.10 g/cc 사이, 또는 약 0.02 g/cc 및 약 0.05 g/cc 사이, 및 이들 사이의 모든 값의 건조 밀도를 가질 수 있다.
수 개의 기공 타입이 세포지지체에서 가능하다. 열린 기공은 세포지지체의 양면 상에서의 세포적 접근을 가능하게 하며, 분해가능한 세포지지체를 통해서 영양분의 액체 유동 및 수송을 가능하게 한다. 부분적으로 열린 기공은 세포 지지체의 일면 상에서의 세포적 접근을 가능하게 하나, 영양분 및 노폐물의 질량 수송은 확산에 한정된다. 닫힌 기공은 어떠한 오프닝도 갖지 않으며 세포 또는 영양분 및 노폐물의 질량 수송에 의해 접근 가능하지 않다. 본원에 기술된 분해가능한 폼 세포지지체는 열린 기공 아키텍쳐 및 높게 상호연결된 기공을 갖는다. 일반적으로, 상기 열린 기공 아키텍쳐 및 높게 상호연결된 기공은 분해가능한 폼 세포지지체의 기공 내로 세포의 이동을 가능하게 하며 또한 영양분, 산소 및 노폐물의 개선된 질량 수송을 촉진시킨다. 상기 열린 기공 아키텍쳐는 또한 ECM 재생을 위한 공간 및 세포-대-세포 상호작용을 위한 높은 표면적을 제공함으로써 세포 접착 및 세포 이동에 영향을 미친다.
본원에 기술된 분해가능한 폼 세포지지체는 물질을 소화 또는 와해시키는 적합한 효소에 노출되는 경우 소화된다. 폼 세포지지체의 소화, 세포 채취 또는 이들 모두에 적합한 비-단백질분해 효소는 펙틴소화 효소 또는 펙틴분해효소를 포함하며, 이는 펙틴질을 가수분해하는 관련 효소의 혼성 기이다. 펙틴분해효소 (폴리갈락투로나아제)는 복합 펙틴 분자를 좀 더 짧은 갈락투론산의 분자로 와해시키는 효소이다. 펙틴분해효소의 상업적으로 입수 가능한 소스는 PectinexTM ULTRA SP-L (Novozyme North American, Inc., Franklinton, NC로부터 상업적으로 입수 가능함)와 같은 다면-효소(multi-enzymatic), 아스페르길루스 아쿨레아투스(Aspergillus aculeatus)의 선택된 스트레인(selected strain)으로부터 생산된 펙틴소화(pectolytic) 효소이다. PectinexTM ULTRA SP-L은 주로 폴리갈락투로나아제, (EC 3.2.1.15) 펙틴트랜스엘리미나제 (EC 4.2.2.2) 및 펙틴에스테라아제 (EC: 3.1.1.11)를 함유한다. 상기 EC 명칭은 효소가 촉매 작용하는 화학 반응에 기반한 효소에 대한 효소 위원회 분류 체계이다.
본 기재의 구현예에 따르면, 분해가능한 폼 세포지지체의 소화는 또한 2가의 양이온 착화제에 세포지지체를 노출시키는 단계를 포함한다. 예시적인 착화제는 이에 한정되는 것은 아니나, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 사이클로헥산디아민테트라아세틱 (CDTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (EGTA), 구연산 및 타르타르산을 포함한다.
본원에 기술된 분해가능한 폼 세포지지체의 완전 소화에 대한 시간은 약 1시간 미만일 수 있다. 예를 들어, 폼 세포지지체의 완전 소화에 대한 시간은 약 45분 미만, 또는 약 30분 미만, 또는 약 15분 미만, 또는 약 1분 및 약 25분 사이, 또는 약 3 분 및 약 20 분 사이, 또는 약 5 분 및 약 15 분 사이일 수 있다.
본 기재의 구현예에 따르면, 본원에 기술된 세포지지체는 접착 폴리머 코팅을 더욱 포함할 수 있다. 상기 접착 폴리머는 펩티드를 포함할 수 있다. 예시적인 펩티드는 이에 한정되는 것은 아니나, BSP, 비트로넥틴, 섬유결합소, 라미닌, Type I 및 IV 콜라겐, 변성 콜라겐 (젤라틴), 및 like 펩티드s, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 추가적으로, 상기 펩티드는 RGD 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 코팅은 예를 들어 신더맥스® II-SC (Corning, Incorporated, Corning, NY로부터 상업적으로 입수 가능함)일 수 있다. 선택적으로, 상기 접착 폴리머ms 세포외 매트릭스를 포함할 수 있다. 상기 코팅은 예를 들어, Matrigel® (Corning, Incorporated, Corning, NY으로부터 상업적으로 입수 가능함)일 수 있다.
본 기재의 구현예에 따르면, 본원에 기술된 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법이 개시된다. 본원에 기술된 방법은 수성 용액에 다당류를 용해시키는 단계를 포함하는 제1의 수성 혼합물 형성단계를 포함할 수 있다. 다당류는 펙트산 또는 이들의 염, 부분적으로 에스테르화된 펙트산 또는 이들의 염, 또는 부분적으로 아미드화된 펙트산 또는 이들의 염 및 이러한 다당류의 블렌드와 같은, 전술한 바와 같은 것들일 수 있다.
본원에 기술된 분해가능한 폼 세포지지체를 형성하는 방법은 수성 용액에 물 불용성 2가의 금속 염을 포함하는 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 2가의 금속 염의 물질은 이에 한정되는 것은 아니나, 마그네슘, 칼슘, 아연, 스트론튬, 바륨, 및 유사 양이온, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 2가의 금속 염의 음이온은 이에 한정되는 것은 아니나, 수산염s, 타르타르산염, 인산염, 탄산염, 구연산염, 및 유사 유기물 및 무기 음이온 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 기재의 구현예에 따르면, 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 상기 제2의 수성 혼합물에 전술한 적어도 하나의 제1의 폴리머를 첨가하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 선택적으로, 본원에 기술된 방법은 상기 제2의 수성 혼합물에 상술한 적어도 하나의 제2의 폴리머를 첨가하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 본 기재의 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머 및 상기 적어도 하나의 제2의 폴리머는 상기 제2의 수성 혼합물에 개별적으로 첨가되거나 또는 제2의 수성 혼합물에 함께 첨가될 수 있다. 혼합물로서 첨가되는 경우, 상기 혼합물은 약 50%의 적어도 하나의 제1의 폴리머 및 약 50%의 적어도 하나의 제2의 폴리머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 혼합물은 약 35% 및 약 65% 사이(및 이들 사이의 모든 값)의 적어도 하나의 제1의 폴리머 및 약 35% 및 약 65% 사이(및 이들 사이의 모든 값)의 적어도 하나의 제2의 폴리머를 포함할 수 있다.
본 기재의 구현예에 따르면, 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 제2의 수성 혼합물에 수용성 가소제를 첨가하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 본원에 기술된 가소제는 무독성이며 상기 분해가능한 폼 세포지지체의 다당류의 용해도에 영향을 미치지 않는다. 가소제는 결과적인 폼이 소프트하고 유연하도록 결과적인 폼에 유연성(flexibility) 및 연질성(softness)을 제공한다. 본원에 기술된 가소제는 이에 한정되는 것은 아니나, 글리세롤, 소르비톨, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 조합과 같은 다가 알코올(polyhydric alcohol)을 포함할 수 있다. 상기 제2의 수성 혼합물에 수용성 가소제를 첨가하는 단계는 제2의 수성 혼합물을 형성하기 위하여 첨가된 총 고체 첨가제의 약 55중량% 미만을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제2의 수성 혼합물에 수용성 가소제를 첨가하는 단계는 제2의 수성 혼합물을 형성하기 위하여 첨가된 총 고체 첨가제의 약 50 중량% 미만, 또는 약 40 중량% 미만, 또는 약 30 중량% 미만, 또는 약 25 중량% 미만, 또는 약 15 중량% 및 약 55 중량% 사이, 또는 약 15 중량% 및 약 50 중량% 사이, 또는 약 15 중량% 및 약 40 중량% 사이, 또는 약 15 중량% 및 약 30 중량% 사이, 또는 약 15 중량% 및 약 25 중량% 사이, 또는 이들 사이의 모든 값을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바에 따라, 용어 "제2의 수성 혼합물을 형성하기 위하여 첨가된 총 고체 첨가제"는 물을 제외하고 수성 혼합물의 모든 성분을 나타낸다.
본 기재의 구현예에 따르면, 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 상기 제2의 수성 혼합물에 유화제를 첨가하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 본원에 기술된 유화제는 이에 한정되는 것은 아니나, Tween® 20, Tween® 80 (Croda International, Snaith, United Kingdom로부터 각각 상업적으로 입수 가능함)를 포함할 수 있다.
본 기재의 구현예에 따르면, 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 상기 제2의 수성 혼합물에 적어도 하나의 여과가능한 고체를 첨가하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 본원에 기술된 여과가능한 고체는 상기 폼 세포지지체의 형성 동안 기공을 강화하거나 또는 생성하는 물질을 포함한다. 여과가능한 고체는 이에 한정되는 것은 아니나 염, 생체적합성 단당 및 이당 및 수용성 단백질과 같은 무독성의 여과할 수 있는 물질일 수 있다. 예시적인 염은 이에 한정되는 것은 아니나 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 타르타르산 나트륨, 구연산 나트륨, 및 그 유사물을 포함한다. 예시적인 생체적합성 단당 및 이당은 이에 한정되는 것은 아니나 글루코스, 과당, 덱스트로오스, 말토스, 락토스 및 자당을 포함한다. 예시적인 수용성 단백질은 이에 한정되는 것은 아니나, 젤라틴 및 아가로스를 포함한다.
상기 제2의 수성 혼합물과 관련하여 상술한 물질 각각은 모두 선택적으로 상기 제2의 수성 혼합물에 첨가될 수 있으며, 상기 제2의 수성 혼합물에 두 개 이상의 물질이 동시에 첨가될 수 있는 가능성으로 임의의 순서로 상기 제2의 수성 혼합물에 첨가될 수 있다. 하나의 예시적인 방법에서, 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 2가의 금속 염을 포함하는 수성 용액에 여과가능한 고체를 첨가하는 단계 및 수성 혼합물에서 용해하는 여과가능한 고체의 용해를 촉진하기 위하여 수성 혼합물을 혼합하는 단계를 포함한다. 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머, 적어도 하나의 제2의 폴리머 및/또는 수용성 가소제는 연속적으로 상기 제2의 수성 혼합물에 첨가된다.
본원에 기술된 분해가능한 폼 세포지지체를 형성하는 방법은 상기 제1 및 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계, 상기 제1의 수성 혼합물과 제2의 수성 혼합물을 조합하여 조합된 수성 혼합물을 형성하는 단계를 연이어 더욱 포함할 수 있다. 폼은 혼합, 비팅(beating), 교반, 풍화(aerating), 휘핑(whipping), 주입(injecting) 또는 다른 기계적 액션을 통해서 상기 수성 혼합물 내에 기포가 도입됨으로써 상기 조합된 수성 혼합물로부터 형성될 수 있다. 기체는 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니나, 공기, 질소, 헬륨, 수소, 아르곤, 이산화 탄소 또는 기타 불활성 기체일 수 있다. 상기 조합된 수성 혼합물 내에 기포를 도입하는 단계는 약 30 분 미만의 기간 동안, 예를 들어, 약 1분 및 약 30 분, 또는 약 3 분 및 약 25 분 사이, 또는 약 5 분 및 약 20 분 사이 동안 수행될 수 있다. 기포를 상기 조합된 수성 혼합물 내에 도입하는 한편, 분해가능한 폼 세포지지체를 형성하는 방법은 상기 조합된 수성 혼합물에 겔 유도체를 첨가하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기 겔 유도체는 산을 천천히 발생하는 완충 작용 및/또는 물질을 제공하는 산일 수 있다. 예시적인 산은 이에 한정되는 것은 아니나 젖산 락톤, 글리콜산 락톤, 글루코노 델타 락톤 및 산 무수물을 포함한다.
본원에 기술된 분해가능한 폼 세포지지체를 형성하는 방법은 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 접착 폴리머 코팅으로 코팅하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 코팅하는 단계는 수성 용액에 접착 폴리머를 갖는 수성 용액에 세포지지체를 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 이전에 논의한 바와 같이, 상기 접착 폴리머는 펩티드를 포함할 수 있다. 예시적인 펩티드는 이에 한정되는 것은 아니나 BSP, 비트로넥틴, 섬유결합소, 라미닌, I형 및 IV형 콜라겐, 변성 콜라겐 (젤라틴), 및 유사 펩티드, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 추가적으로, 상기 펩티드는 RGD 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 코팅은 예를 들어 신더맥스® II-SC (Corning, Incorporated, Corning, NY으로부터 상업적으로 입수 가능함)일 수 있다.
본 기재의 구현예에 따르면, 본원에 기술된 분해가능한 폼 세포지지체 상에 세포를 배양하는 방법이 또한 개시된다. 임의의 유형의 세포가 이에 한정되는 것은 아니나, 무한증식 세포, 초대 배양 세포, 암 세포, 줄기 세포 (예를 들어, 배아 또는 유도 만능), 등을 포함하는 분해가능한 폼 세포지지체 상에 배양될 수 있다. 상기 세포는 포유류 세포, 조류 세포, 물고기 세포, 등일 수 있다. 상기 세포는 이에 한정되는 것은 아니나, 콩팥, 섬유아세포, 유방, 피부, 뇌, 난소, 폐, 뼈, 신경, 근육, 심장, 결장, 췌장, 면역 (예를 들어, B 세포), 혈액, 등을 포함하는 임의의 조직 타입일 수 있다. 상기 세포는 분산(예를 들어, 프레시 시드된), 융합(confluent), 2-차원, 3-차원, 타원체, 등을 포함하는 백에서 임의의 배양된 형태로 있을 수 있다. 분해가능한 폼 세포지지체 상에서의 세포의 배양은 상기 분해가능한 폼 세포지지체 상에 세포를 시딩하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 분해가능한 폼 세포지지체 상에 세포를 시딩하는 단계는 상기 세포지지체를 세포를 함유하는 용액과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 분해가능한 폼 세포지지체 상에 세포를 시딩하는 단계 동안, 상기 세포는 상기 분해가능한 폼 세포지지체의 기공으로 침투한다. 상기 분해가능한 폼 세포지지체가 접착 폴리머 코팅을 포함하는 경우, 세포는 분해가능한 폼 세포지지체의 기공을 침투하고 세포지지체 물질에 부착될 수 있다.
분해가능한 폼 세포지지체 상에의 세포 배양은 상기 세포지지체를 세포 배양 배지에 접촉시키는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 세포지지체를 세포 배양 배지에 접촉시키는 단계는 세포가 배양될 배지를 갖는 환경에서 세포지지체 상에 배양될 세포를 위치시키는 단계를 포함한다. 상기 세포지지체를 세포 배양 배지에 접촉시키는 단계는 상기 세포지지체 상에 세포 배양 배지를 피펫하는 단계(pipetting), 또는 세포 배양 배지에 세포지지체를 침지하는 단계, 또는 연속적인 방식으로 세포지지체 위로 세포 배양 배지를 통과시키는 단계를 포함할 수 있다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 바에 따라, 용어 "연속적인"은 세포 배양 환경 내로 그리고 밖으로 세포 배양 배지의 지속적인 유동으로 세포를 배양하는 것을 나타낸다. 상기 세포지지체 위로 세포 배양 배지를 연속적인 방식으로 통과시키는 단계는 미리결정된 기간의 시간 동안 세포 배양 배지에 세포지지체를 침지한 후, 미리결정된 기간의 시간 후 상기 세포 배양 배지의 적어도 일부를 제거하는 단계 및 상기 분해가능한 폼 세포지지체와 접촉하는 세포 배양 배지의 부피가 실질적으로 일정하게 남도록 프레시 세포 배양 배지를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 배양 배지는 임의의 미리결정된 스케줄에 따라 제거되고 재배치될 수 있다. 예를 들어, 적어도 일부의 세포 배양 배지가 매 시간, 또는 매 12 시간, 또는 매 24 시간, 또는 매 2 일, 또는 매 3 일, 또는 매 4 일, 또는 매 5 일마다 제거되고 재배치될 수 있다.
세포 배양 배지는 이에 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 설탕, 염, 아미노 산, 혈청 (예를 들어, 소태아 혈청), 항생제, 성장 인자, 분화 인자, 색료, 또는 기타 바람직한 인자일 수 있다. 예시적인 세포 배양 배지는 Dulbecco's Modified Eagle 배지 (DMEM), 햄스 F12 영양분 혼합물, 최소 필수영양 배지 (MEM), RPMI 배지, Iscove's Modified Dulbecco's 배지 (IMDM) MesencultTM-XF 배지, 및 그 유사물을 포함한다.
본 기재의 구현예에 따르면, 본원에 기술된 분해가능한 폼 세포지지체로부터 세포를 채취하는 방법이 개시된다. 본원에 기술된 세포를 채취하는 방법은 효소에 분해가능한 폼 세포지지체를 노출시킴으로써 분해가능한 폼 세포지지체를 소화시키는 단계를 포함할 수 있다. 이전에 논의한 바와 같이, 폼 세포지지체의 소화, 세포의 채취 또는 이들 모두에 적합한 비-단백질분해 효소는 펙틴소화 효소 또는 펙틴분해효소를 포함하며, 이는 펜틴질을 가수분해하는 관련 효소의 혼성 기이다. 상업적으로 입수가능한 소스의 펙틴분해효소는 PectinexTM ULTRA SP-L (Novozyme North American, Inc., Franklinton, NC로부터 상업적으로 입수 가능함), 아스페르길루스 아쿨레아투스의 선택된 스트레인(selected strain)으로부터 생산된 펙틴소화(pectolytic) 효소와 같은 일반적인 다면-효소이다. PectinexTM ULTRA SP-L은 주로 폴리갈락투로나아제, (EC 3.2.1.15) 펙틴트랜스엘리미나제 (EC 4.2.2.2) 및 펙틴에스테라아제 (EC: 3.1.1.11)를 함유한다. 상기 EC 명칭은 효소가 촉매 작용하는 화학 반응에 기반한 효소에 대한 효소 위원회 분류 체계이다.
효소에 분해가능한 폼 세포지지체를 노출시키는 단계는 약 1 및 약 200 U 사이의 효소 농도에 세포지지체를 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 약 2 U 및 약 150 U 사이, 또는 약 5 U 및 약 100 U 사이, 또는 약 10 U 및 약 75 U 사이, 및 이들 사이의 모든 값의 효소 농도에 세포지지체를 노출시키는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 세포를 채취하는 방법은 착화제에 물질을 노출시키는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 예시적인 착화제는 이에 한정되는 것은 아니나, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 사이클로헥산디아민테트라아세틱 (CDTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (EGTA), 구연산 및 타르타르산을 포함한다. 착화제에 분해가능한 폼 세포지지체를 노출시키는 단계는 약 1 mM 및 약 200 mM 사이의 착화제 농도에 세포지지체를 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 약 10 mM 및 약 150 mM 사이, 또는 약 20 mM 및 약 100 mM 사이, 또는 약 25 mM 및 약 50 mM 사이, 및 이들 사이의 모든 값의 착화제 농도에 상기 세포지지체를 노출시키는 단계를 포함할 수 있다.
실시예
본 기재의 구현예는 소정의 예시적이고 구체적인 구현예와 관련하여 아래에서 더욱 기술되며, 이는 단지 예시적인 것으로서 한정적으로 의도되지 않는다.
실시예 1
Figure pct00001
2.0 중량% 폴리갈락투론산 (PGA)을 함유하는 제1의 수성 혼합물이 104 ℃의 온도에서 오일 욕 세트 내의 탈염수에 약 162 그램의 폴리갈락투론산 나트륨 염을 용해시켜 제조되었다. 상기 수성 혼합물을 실온으로 냉각하였다. 제2의 수성 혼합물이 와이어 루프 위프(와이어 루프 휘프)가 장착된 KitchenAid 혼합기의 보울에서 약 24.52 그램의 초순수에 약 1.06 그램의 CaCO3를 첨가하여 제조되었다. 약 0.125 그램의 TWEEN® 20 (commercially available from Sigma-Aldrich, St. Louis, MO로부터 상업적으로 입수 가능함)가 또한 KitchenAid 혼합기의 보울에 첨가되었다. 다음으로, 약 17.5 그램의 자당이 혼합기 보울에 첨가되어 제2의 수성 혼합물에서 자당의 용해를 촉진하기 위하여 혼합되었다. 약 7.5 그램의 글리세롤, 약 1.94 그램 메토셀(Methocel) HPMC 컬미널(Culminal) 724 및 상기 제1의 수성 혼합물을 첨가하여 상기 혼합 보울에서 조합된 수성 혼합물을 형성하였고, 약 5분 동안 교반 속도(KitchenAid 혼합기의 속도 1)에서 혼합하였다. 상기 조합된 수성 혼합물을 다음으로 약 20분 동안 빠른 휘핑 속도(KitchenAid 혼합기의 속도 10)로 휘핑하여 조합된 수성 혼합물 내에 공기를 도입하였다. 상기 조합된 수성 혼합물의 휘핑을 지속하면서, 약 30 mL의 물에 약 3.77 그램의 글루코노락톤 (GDL) 용액을 혼합 보울에 첨가하고 휘핑을 약 1분동안 지속하였다.
약 0.25 g/cc의 젖은 폼 밀도를 갖는 불투명한 백색 폼이 전술한 공정에 따라 얻어졌다. 상기 폼은 폼 내에 가교결합이 일어나기에 충분하도록 약 1시간 동안 실온에서 혼합 보울에서 커버하지 않고 두었다. 다음으로, 상기 폼은 약 16시간 동안 약 -80 ℃의 온도에 노출되어 폼을 얼린 후, 약 72 시간 동안 -86℃의 온도 및 0.11 m막대의 압력에 노출되었다. 결과적인 폼은 약 0.04 내지 약 0.045 g/cc의 건조 폼 밀도를 갖는 것으로 관찰되었고, 높게 상호연결된 기공을 갖는 다공성인 것으로 관찰되었다. 도 2는 실시예 1에서 제조된 폼의 SEM 사진을 나타낸다. 결과적인 폼의 조성물은 약 1.3 중량% PGA, 약 0.78 중량% HPM 및 약 2.08 중량%의 총 고체 함량을 포함하는 것으로 결정되었다.
실시예 2
Figure pct00002
실시예 1에 기술된 공정이 제2의 수성 혼합물이 약 0.53 그램을 첨가하여 제조된 것을 제외하고는 반복되었다. 결과적인 폼은 높게 상호연결된 기공을 갖는 다공성으로 관찰되었다. 도 3은 실시예 2에서 제조된 폼의 SEM 사진을 나타낸다.
실시예 3
Figure pct00003
2.0 중량% 폴리갈락투론산 (PGA)을 함유하는 제1의 수성 혼합물이 104 ℃의 온도에서 오일 욕 세트에 탈염수 내 약 162 그램의 폴리갈락투론산 나트륨 염을 용해시켜 제조되었다. 상기 수성 혼합물이 실온으로 냉각되었다. 제2의 수성 혼합물이 초순수에 약 7.5 그램의 글리세롤을 첨가하고 약 30초 동안 800W에서 마이크로웨이브 하에 가열하여 제조되었다. 약 0.97 그램의 소(bovine) 젤라틴이 약 5.8 mL의 초순수에서 콜드-팽윤(cold-swell)된 후, 제2의 수성 혼합물에 첨가되어 용해가 관찰될 때까지 교반되었다. 약 1.06 그램의 CaCO3 및 약 0.125 그램의 TWEEN® 20이 상기 제2의 수성 혼합물에 첨가되었다. 다음으로, 상기 제2의 수성 혼합물이 약 1분 동안 초음파분해된 후 와이어 루프 휘프(wire loop whip)가 장착된 KitchenAid 혼합기의 보울에 옮겨졌다. 약 17.5 그램 자당 및 약 0.97 그램 메토셀 HPMC 컬미널 724이 다음으로 KitchenAid 혼합기의 보울에 첨가되고 수성 혼합물이 약 5분 동안 교반되었다. 2.0 중량% PGA를 함유하는 제1의 수성 혼합물이 첨가되어 혼합 보울에서 조합된 수성 혼합물을 형성하였고, 약 3분 동안 교반 속도(KitchenAid 혼합기의 스피드 1)로 혼합되었다. 다음으로, 상기 조합된 수성 혼합물을 약 20분 동안 빠른 휘핑 속도(KitchenAid 혼합기의 속도 10)에서 휘핑되어 상기 조합된 수성 혼합물에 공기를 도입하였다. 상기 조합된 수성 혼합물의 휘핑을 지속하면서, 약 30 mL의 물에 약 3.77 그램의 글루코노락톤 (GDL)의 용액이 혼합 보울에 첨가되어 휘핑이 약 1분 동안 지속되었다.
불투명한 백색 폼이 전술한 공정에 따라 얻어졌다. 상기 폼은 폼 내에 가교결합이 충분히 일어나도록 약 1시간 동안 실온에서 혼합 보울에서 커버하지 않고 두었다. 다음으로, 상기 폼은 약 -80℃의 온도에 약 16 시간 동안 노출되어 폼을 얼린 후, -86℃의 온도 및 0.11 m막대의 압력에 약 72시간 동안 노출되었다. 결과적인 폼은 약 0.04 g/cc의 건조 폼 밀도를 갖는 것으로 관찰되었고, 높게 상호연결된 기공을 갖는 다공성으로 관찰되었다. 도 4는 실시예 3에서 제조된 폼의 SEM 사진을 나타낸다.
실시예 4
Figure pct00004
실시예 3에서 기술된 공정이 소의 젤라틴 대신 약 0.97 그램의 돼지(porcine) 젤라틴이 약 5.8 mL의 초순수에서 콜드-팽윤된 후 상기 제2의 수성 혼합물에 첨가되고 용해가 관찰될 때까지 교반된 것을 제외하고 반복되었다. 결과적인 폼은 약 0.21 g/cc의 젖은 폼 밀도 및 약 0.06 g/cc의 건조 폼 밀도를 갖는 것으로 관찰되었고, 높게 상호연결된 기공을 갖는 다공성으로 관찰되었다. 도 5는 실시예 4에서 제조된 폼의 SEM 사진을 나타낸다.
실시예 5
Figure pct00005
104 ℃의 온도에서 오일 욕 세트에 탈염수에 약 172 그램의 3.0 중량% 폴리갈락투론산 나트륨 염을 용해시켜 제1의 수성 혼합물을 제조하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기술된 공정이 반복되었다. 추가적으로, 메토셀 HPMC 컬미널 724가 제2의 수성 혼합물로부터 생략되었다. 결과적인 폼은 약 0.40 g/cc의 젖은 폼 밀도 및 약 0.11 g/cc의 건조 폼 밀도를 갖는 것으로 관찰되었다. 상기 폼은 실시예 1에서 형성된 폼보다 덜 다공성이며, 상기 기공은 실시예 1에서 형성된 폼의 기공보다 덜 상호연결된 것으로 관찰되었다. 메토셀 HPMC 컬미널 724 또는 표면 활성을 갖는 임의의 폴리머의 생략은 폼의 기공들 사이의 상호연결성의 수준 및 다공성을 낮추는 것으로 믿어진다. 도 6은 실시예 5에서 제조된 폼의 SEM 사진을 나타낸다. 약 0.40 g/cc 초과의 습윤 밀도를 갖는 폼 및 약 0.11 g/cc 초과의 건조 밀도를 갖는 폼은 세포의 배양을 지지할 수 있는 것으로 증명되었으나, 약 0.40 g/cc 미만의 습윤 밀도 및 약 0.11 g/cc 미만의 건조 밀도를 갖는 폼은 실시예 5에서 형성된 폼이 갖는 것과 같은 젖은 그리고 건조 밀도를 갖는 폼에 비해서 개선된 세포 배양 조건을 나타내었다.
실시예 6
Figure pct00006
104 ℃의 온도에서 오일 욕 세트에서 탈염수에 약 162 그램의 1.59 중량% 폴리갈락투론산 나트륨 염을 용해시켜 제1의 수성 혼합물을 제조한 것을 제외하고는 실시예 1의 공정이 반복되었다. 추가적으로, 상기 제2의 수성 혼합물은 약 24.52 그램의 초순수에 0.53 그램의 CaCO3를 첨가하여 제조되었고, 약 2.58 그램 메토셀 HPMC 컬미널 724가 상기 제2의 수성 혼합물에 첨가되었다. 결과적인 폼은 약 0.36 g/cc의 젖은 폼 밀도 및 약 0.09 g/cc의 건조 폼 밀도를 갖는 것으로 관찰되었다. 도 7은 실시예 6에서 제조된 폼의 SEM 사진을 나타낸다.
실시예 7
Figure pct00007
자당이 제2의 수성 혼합물에 첨가되지 않은 것을 제외하고는 실시예 1의 공정이 반복되었다. 결과적인 폼은 약 0.23 g/cc의 젖은 폼 밀도 및 약 0.03 g/cc의 건조 폼 밀도를 갖는 것으로 관찰되었다. 도 8은 실시예 7에서 제조된 폼의 SEM 사진을 나타낸다.
실시예 8
Figure pct00008
104 ℃의 온도에서 오일 욕 세트에서 탈염수에 약 162 그램의 2.59 중량% 폴리갈락투론산 나트륨 염을 용해시켜 제1의 수성 혼합물을 제조한 것을 제외하고는 실시예 1의 공정이 반복되었다. 추가적으로, 상기 제2의 수성 혼합물은 제2의 수성 혼합물에 0.97 그램 메토셀 HPMC 컬미널 724을 첨가하여 제조되었다. 상기 조합된 수성 혼합물에서 PGA 대 메토셀 HPMC 컬미널 724의 비는 81/19로 제어되었다. 결과적인 폼은 약 0.18 g/cc의 젖은 폼 밀도 및 약 0.057 g/cc의 건조 폼 밀도를 갖는 것으로 관찰되었다. 도 9는 실시예 8에서 제조된 폼의 SEM 사진을 나타낸다.
실시예 9
Figure pct00009
제2의 수성 혼합물에 1.94 그램 덱스트란을 첨가하여 제2의 수성 혼합물이 제조되고, 상기 수성 혼합물로부터 메토셀 HPMC 컬미널 724이 생략된 것을 제외하고는 실시예 1의 공정이 반복되었다. 결과적인 폼은 약 0.34 g/cc의 젖은 폼 밀도 및 약 0.095 g/cc의 건조 폼 밀도를 갖는 것으로 관찰되었다. 상기 폼은 실시예 1에서 형성된 폼보다 덜 다공성이며, 실시예 1에서 형성된 폼의 기공보다 덜 상호연결된 것으로 관찰되었다. 메토셀 HPMC 컬미널 724 또는 표면 활성을 갖는 임의의 폴리머의 생략은 폼의 기공들 사이의 상호연결성의 수준을 감소시키는 것으로 믿어진다. 나아가, 어떠한 표면 활성도 갖지 않는 폴리머의 첨가는 폼 내 기공의 형성에 기여하지 않는다. 도 10은 실시예 9에서 제조된 폼의 SEM 사진을 나타낸다.
실시예 10
Figure pct00010
메토셀 HPMC 컬미널 724 대신 1.94 그램 Pluronic® P123을 제2의 수성 혼합물에 첨가하여 제2의 수성 혼합물을 제조한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기술된 공정이 반복되었다. 조합된 수성 혼합물 내의 PGA 대 Pluronic P123의 비율은 62.5/37.5로 제어되었다. 결과적인 폼은 약 0.18 g/cc의 젖은 폼 밀도 및 약 0.03 g/cc의 건조 폼 밀도를 가지며, 실시예 1에서 형성된 폼보다 큰 다공성을 갖는 것으로 관찰되었다. 도 11은 실시예 10에서 제조된 폼의 SEM 사진을 나타낸다.
실시예 11
Figure pct00011
메토셀 HPMC 컬미널 724 대신 50:50 중량 비 블랜드의 Pluronic P123 및 덱스트란을 첨가하여 제2의 수성 혼합물을 제조한 것을 제외하고는 실시예 1의 공정이 반복되었다. 결과적인 폼은 약 0.20 g/cc의 젖은 폼 밀도 및 약 0.038 g/cc의 건조 폼 밀도를 가지며 실시예 1에서 형성된 폼보다 큰 다공성을 갖는 것으로 관찰되었다. 도 12는 실시예 11에서 제조된 폼의 SEM 사진을 나타낸다.
실시예 12
Figure pct00012
다양한 양의 글리세롤이 제2의 수성 혼합물에 첨가된 다중 폼을 형성하기 위하여 실시예 11의 공정이 반복되었다. 본 실시예의 제1의 폼의 형성에서, 6.5 그램의 글리세롤이 제2의 수성 혼합물에 첨가되었다. 글리세롤은 조합된 수성 혼합물을 형성하기 위하여 첨가된 총 고체 첨가제의 19 중량%를 구성하였다. 결과적인 폼은 약 0.19 g/cc의 젖은 폼 밀도 및 약 0.055 g/cc의 건조 폼 밀도를 갖는 것으로 관찰되었다. 본 실시예의 제2의 폼의 형성에서, 7.5 그램의 글리세롤이 제2의 수성 혼합물에 첨가되었다. 글리세롤은 조합된 수성 혼합물을 형성하기 위하여 첨가된 총 고체 첨가제의 22 중량%를 구성하였다. 결과적인 폼은 약 0.21 g/cc의 젖은 폼 밀도 및 약 0.048 g/cc의 건조 폼 밀도를 갖는 것으로 관찰되었다. 본 실시예의 제3의 제1의 폼 형성에서, 19.44 그램의 글리세롤이 제2의 수성 혼합물에 첨가되었다. 글리세롤은 상기 조합된 수성 혼합물을 형성하기 위하여 첨가된 총 고체 첨가제의 42 중량%를 구성하였다. 결과적인 폼은 약 0.23 g/cc의 젖은 폼 밀도 및 약 0.23 g/cc의 건조 폼 밀도를 갖는 것으로 관찰되었다. 본 실시예의 제4의 폼 형성에서, 29.16 그램의 글리세롤이 제2의 수성 혼합물에 첨가되었다. 글리세롤은 조합된 수성 혼합물을 형성하기 위하여 첨가된 총 고체 첨가제의 52 중량%를 구성하였다. 결과적인 폼은 약 0.26 g/cc의 젖은 폼 밀도 및 약 0.35 g/cc의 건조 폼 밀도를 갖는 것으로 관찰되었다.
실시예 12의 제4의 폼은 폼의 형성 동안 첨가되는 경우, 밀도 및 다공성에 대한 가소제 양의 효과를 예시한다. 좀 더 느린 건조, 더 큰 밀도 및 적은 다공성이 가소제 함량을 증가하면서 관찰되었다. 또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, 일반적으로 원통형 형상의 폼은 제2의 수성 혼합물을 형성하기 위하여 첨가된 총 고체 첨가제의 약 20-25 중량% 위로 증가된 글리세롤의 양만큼 손실되었다(lost). 상기 폼의 기공의 다공성 및 상호연결성은 제2의 수성 혼합물에 첨가된 가소제의 양이 상기 제2의 수성 혼합물을 형성하기 위하여 첨가된 총 고체 첨가제의 약 52 중량% 미만인 경우 가장 큰 것으로 관찰되었다.
실시예 13
Figure pct00013
Pluronic P127 및 덱스트란의 50:50 중량 비율 블렌드를 첨가함으로써 제2의 수성 혼합물이 제조된 것을 제외하고는 실시예 1에 기술된 공정이 반복되었다. 결과적인 폼은 실시예 11에서 제조된 폼과 유사한 기공의 다공성 및 상호연결성을 갖는 것으로 관찰되었다. 도 14는 실시예 13에서 제조된 폼의 SEM 사진을 나타낸다.
실시예 14
실시예 1-12의 각 공정에 따라 형성된 폼은 신더맥스® II-SC로 코팅되었다. 250 μg/ml 신더맥스® II-SC 수성 에탄올 용액이 70:30의 에탄올:물의 비를 갖는 약 20 mL의 수성 에탄올 용액에 약 5.0 mg의 Corning® 신더맥스® II-SC 분말을 첨가함으로써 수성 에탄올 용액이 제조되었다. 약 2-3 mm 두께 및 약 22 mm의 직경을 갖는 각각의 폼이 폴리스티렌 6-정(Well) 세포 배양 플레이트의 사각 정에 위치되었다. 약 4.0 mL의 250 μg/ml 신더맥스® II-SC 수성 에탄올 용액이 각각의 정 및 플레이트에 첨가되고, 약 1.5 시간 동안 실온에 건드리지 않고 그대로 두었다. 과잉의 용액을 정으로부터 제거하고 폼이 약 5.0 mL의 70% 수성 에탄올로 한번 세척되었다. 다음으로, 상기 신더맥스® II-SC 코팅은 70% 수성 에탄올 (14 mL 에탄올 및 6.0 mL 물 에서의 40μl의 25% 글루타르알데히드 용액의 혼합에 의해 제조됨)을 첨가함으로써 가교결합되었다. 상기 플레이트는 약 1.5 시간 동안 실온으로 건드리지 않고 그대로 두어 가교결합이 일어나도록 하였다. 상기 폼은 다음으로 초순수로 세번 헹구었다.
실시예 15
실시예 1-12에서의 각 공정에 따라 형성된 폼이 젤라틴으로 코팅되었다. 0.1 중량% 젤라틴 용액이 초순수에서 약 500 mg의 젤라틴 분말(돼지 피부로부터의)을 팽윤시키고 이어서 20 mL의 초순수에서 균질화시킴으로써 제조되었다. 약 2-3 mm 두께 및 약 22 mm 직경을 갖는 각 폼을 폴리스티렌 6-정 세포 배양 플레이트의 개별적인 정에 위치시켰다. 약 4.0 mL의 젤라틴 용액이 각각의 정에 첨가되었고, 상기 플레이트를 약 1.5 시간 동안 실온에서 건드리지 않고 그대로 두었다. 과잉의 용액을 상기 정으로부터 제거하였고 폼은 약 5.0 mL의 70% 수성 에탄올로 한번 세척하였다. 다음으로, 상기 젤라틴 코팅은 70% 수성 에탄올에서의 0.05% v/v 글루타르알데히드 약 4.0 mL (25 mL 초순수에서 50μl의 25% 글루타르알데히드 용액을 혼합함으로써 제조됨)를 첨가함으로써 가교결합되었다. 상기 플레이트를 가교결합이 일어나도록 충분하게 약 1.5 시간 동안 실온에서 건드리지 않고 그대로 두었다. 다음으로, 상기 폼을 초순수로 3회 헹구었다.
실시예 16
실시예 4의 공정에 따라 형성된 폼 상에 베로(Vero) 세포의 배양이 조사되었다. 베로 세포(ATCC® CCL-81, ATCC, Manassas, VA로부터 상업적으로 입수 가능함)가 10% 소태아 혈청 (FBS)으로 보충된 IMDM 배지에서 세포 배양 플레이트 상에서 배양되었다. 상기 폼을 약 2-3 mm 두께 및 약 22 mm의 직경의 부위로 절단하였다. 상기 폼 부위는 약 5.0분 동안 70% 수성 에탄올에서 살균된 후 6-정 초-저압 부착(Ultra-Low Attachment) 세포 배양 플레이트의 개별적인 정에 위치되었다. 상기 폼 부위는 IMDM 배지에서 한번 그리고 초순수로 두번 세척되었다. 과잉의 배지가 시딩 전 정으로부터 제거되었다.
베로 세포가 트립신을 이용하여 세포 배양 플레이트로부터 채취되었고, IMDM 배지에서 재-현탁되었드며, 약 100,000 세포를 함유하는 150 μL가 6-정 세포 배양 플레이트의 정 내에 위치된 각 폼 부위에 시드되었다. 상기 6- 세포 배양 플레이트가 세포 배양 인큐베이터에 위치되었고, 약 2.0 시간 후, 약 3.0 mL의 IMDM 배지가 각 정에 첨가되었다. 세포 배양 인큐베이터에서 약 18 시간 후, 상기 폼 부위는 위상 대비 현미경법을 사용하여 가시화되었다. 위상 대비 현미경법으로부터 얻어진 이미지를 도 15에 나타냈으며, 이는 미코팅된 폼 부위에 세포가 고착되지 않으나, 대신 상기 폼 부위의 기공에서 형성된 타원체에 대신 고착됨을 나타낸다. 이처럼, 본 기재의 분해가능한 폼 세포지지체는 타원체 또는 비-고착 세포를 배양하는데 사용될 수 있다.
실시예 17
실시예 4의 공정에 따라 형성되고 실시예 14의 공정에 따라 코팅된 폼 상에 인간 중간 줄기 세포 (hMSC)의 배양이 조사되었다. hMSC Passage 2 (RoosterBio Inc., Frederick, MD로부터 상업적으로 입수 가능함)가 MesencultTM-XF 배지 (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada로부터 상업적으로 입수 가능한 혈청-프리 배지)에서 세포 배양 플레이트 상에 배양되었다. 상기 폼이 약 2-3 mm 두께 및 약 22 mm의 직경을 갖는 부위로 절단되었다. 상기 폼 부위가 약 5.0분 동안 70% 수성 에탄올에서 살균된 후, 6-정 초-저압 부착 세포 배양 플레이트의 개별적인 정에 위치되었다. 상기 폼 부위가 초순수로 2회 그리고 MesencultTM-XF 배지에서 1회 세척되었다. 과잉의 배지가 시딩 전 정으로부터 제거되었다.
hMSC가 트립신을 사용하여 세포 배양 플레이트로부터 채취되고, MesencultTMXF 배지에서 재-현탁되었고 약 100,000 세포를 함유하는 150 μL가 6-정 세포 배양 플레이트의 정에 위치된 각 폼 부위에 시드되었다. 상기 6-정 세포 배양 플레이트가 세포 배양 인큐베이터에 위치되었고, 약 2.0 시간 후, 약 3.0 mL의 MesencultTM-XF 배지가 각 정에 첨가되었다. 세포 배양 인큐베이터에서 약 18 시간 후, 세포가 1 μg/mL Calcein-AM로 염색되었고 형광 현미 기술을 사용하여 가시화되었다. 형광 현미 기술로부터 얻어진 이미지를 도 16에 나타내었으며, 이는 세포가 폼 부위에 고착될 수 있으며, 폼 부위의 기공 내에 스프레드될 수 있다는 점을 나타낸다. 이처럼, 본 기재의 Corning® 신더맥스® II-SC로 코팅된 분해가능한 폼 세포지지체는 타원체 또는 비-고착 세포에 덧붙여 고착 세포를 배양하는데 사용될 수 있으며, 상기 세포지지체는 혈청-프리 배지에서 세포 배양을 지지함이 결정되었다.
실시예 18
실시예 4의 공정에 따라 형성되고 실시예 15의 공정에 따라 코팅된 폼 상에 인간 중간 줄기 세포 (hMSC)의 배양이 조사되었다. 실시예 17에서 사용된 hMSC Passage 2는 10% 소태아 혈청 (FBS)으로 보충된 IMDM 배지에서 세포 배양 플레이트 상에 배양되었다. 상기 폼은 약 2-3 mm 두께 및 약 22 mm의 직경인 부위들로 절단되었다. 상기 폼 부위는 약 5.0 분 동안 70% 수성 에탄올에서 살균된 후, 6-정 초-저압 부착 세포 배양 플레이트의 개별적인 정에 위치되었다. 상기 폼 부위는 초순수에서 2회 및 MesencultTM-XF 배지에서 1회 세척되었다. 과잉의 배지가 시딩 전 정으로부터 제거되었다.
hMSC가 트립신을 사용하여 세포 배양 플레이트로부터 채취되었고 IMDM 배지에서 재-현탁되었고, 약 100,000 세포를 함유하는 150 μL가 6-정 세포 배양 플레이트의 정에 위치된 각 폼 부위에 시드되었다. 상기 6-정 세포 배양 플레이트가 세포 배양 인큐베이터에 위치되었고, 약 2.0 시간 후, 약 3.0 mL의 IMDM 배지가 각 정에 첨가되었다. 세포 배양 인큐베이터에서 약 18 시간 후, 세포는 1μg/mL Calcein-AM로 염색되었고, 형광 현미 기술을 사용하여 가시화되었다. 상기 형광 현미 기술로부터 얻어진 이미지를 도 17에 나타내었으며, 이는 세포가 폼부위에 부착될 수 이TDMAU, 폼 부위의 기공 내에 스프레드될 수 있음을 나타낸다. hMSC 세포의 팽창이 6일 동안 폼 상에서 진행될 수 있었고 다시 형광 현미 기술을 사용하여 가시화되었다. 6일 후 형광 현미 기술로부터 얻어진 이미지를 도 18에 나타내며, 이는 세포가 폼 부위에 부착되며, 나아가 폼 부위의 기공 내로 스프레드됨을 나타낸다. 이처럼, 본 기재의 젤라틴으로 코팅된 분해가능한 폼 세포지지체는 타원체 또는 비-고착 세포에 덧붙여 고착 세포를 배양하는데 사용될 수 있으며, 세포지지체는 혈청-함유 배지에서 세포 배양을 지지함이 결정되었다.
실시예 19
실시예 2 및 4의 공정에 따라 형성되고 실시예 15의 공정에 따라 코팅된 폼 상에 베로 세포의 팽창이 조사되었다. 실시예 16에서 사용된 베로 세포는 10% 소태아 혈청 (FBS)으로 보충된 IMDM 배지에서 조직 배양 처리된 (TCT) 플레이트 상에서 배양되었다. 상기 폼은 약 2-3 mm 두께 및 약 22 mm의 직경인 부위로 절단되었다. 상기 폼 부위가 약 5.0 분 동안 70% 수성 에탄올에서 살균된 후 폴리스티렌 6-정 세포 배양 플레이트의 개별적인 정에 위치되었다. 상기 폼 부위는 초순수에서 2회 및 IMDM 배지에서 1회 세척되었다. 과잉의 배지가 시딩 전 정으로부터 제거되었다.
트립신을 사용하여 TCT 플레이트로부터 베로 세포가 채취되었고 IMDM 배지에서 재-현탁되었다. 일부 폼 부위가 약 25,000 세포를 함유하는 150 μL로 시드되었고 다른 폼 부위가 약 50,000 세포를 함유하는 150 μL로 시드되었으며, 여기서 상기 폼 부위는 6-정 세포 배양 플레이트의 정에 위치되었다. 상기 6-정 세포 배양 플레이트가 세포 배양 인큐베이터에 약 6일 동안 위치되었다. 약 6 일 후, 상기 배지가 제거되고 폼이 약 50 U/mL 펙틴분해효소 및 약 5.0 mM EDTA를 함유하는 약 2.0 mL의 소화 용액의 각 정에 첨가함으로써 분해되었다. 상기 폼은 5.0 분 하에 분해되는 것이 관찰되었다. 폼의 분해에 이어서, 세포가 "트리판 블루 실행성 시험 수행 규약: 기술 참조 가이드" Lonza Cologne GmbH, 2012년 9월. 아래로부터 검색됨:
http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_BenchGuides_Protocol_for_Performing_a_Trypan_Blue_Viability_Test__Technical_Reference_Guide.pdf.
에 설명된 프리판 블루 배제 규약을 사용하여 카운트되었다.
상기 세포가 상기 폼 부위의 모든 기공 표면 상에서 이식됨이 관찰되었다. 약 70 내지 90 배(fold) 팽창이 실시예 4의 공정에 따라 형성된 코팅된 폼에서 관찰되었고, 약 40 내지 70 배 팽창이 실시예 2의 공정에 따라 형성된 코팅된 폼에서 관찰되었다. 이처럼, 본 기재의 젤라틴으로 코팅된 분해가능한 폼 세포지지체는 베로 세포의 팽창에 사용될 수 있음이 결정되었다.
실시예 20
실시예 4의 공정에 따라 형성되고 실시예 15의 공정에 따라 코팅된 폼 상에 인간 중간 줄기 세포 (hMSC)의 분화가 조사되었다. 실시예 17에서 사용된 hMSC Passage 2가 MesencultTM-XF 배지에서 세포 배양 플레이트 상에서 배양되었다. 상기 폼이 약 2-3 mm 두께 및 약 22 mm의 직경을 갖는 부위로 절단되었다. 상기 폼 부위는 약 5.0 분 동안 70% 수성 에탄올에서 살균된 후, 폴리스티렌 6-정 세포 배양 플레이트의 개별적인 정에 위치되었다. 상기 폼 부위는 초순수에서 2회 및 MesencultTM-XF 배지에서 1회 세척되었다. 과잉의 배지가 시딩 전 정으로부터 제거되었다.
hMSC가 트립신을 사용하여 세포 배양 플레이트로부터 채취되었고 MesencultTM-XF 배지에서 재-현탁되었고, 약 100,000 세포를 함유하는 150 μL가 6-정 세포 배양 플레이트의 정에 위치된 각 폼 부위에 시드되었다. 상기 6-정 세포 배양 플레이트가 세포 배양 인큐베이터에 3일동안 위치되었다. 약 3 일 후, 상기 MesencultTM-XF 배지가 제거되었고 골세포 분화 배지, 연골세포 분화 배지, 및 지방세포 분화 배지 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA로부터, 상품명 StemProTM 골형성 분화 Kit, StemProTM 연골형성 분화 Kit 및 StemProTM 지질생성 분화 Kit 하에 각각 상업적으로 입수 가능함)가 상기 정에 첨가되었고, 여기서 각각의 타입의 분화 배지는 다른 타입의 분화 배지와 다른 정의 폼 부위에 첨가되었다. 3주 후 골세포 분화 배지에 노출된 폼 부위가 알리자린 레드로 염색되었고, 연골세포 분화 배지에 노출된 폼부위가 알시안 블루로 염색되었으며, 지방세포 분화 배지에 노출된 폼 부위가 오일 레드 O로 염색되었다. 염색 후, 본 기재의 젤라틴으로 코팅된 분해가능한 폼 세포지지체 상에 배양된 hSMC가 연골발생, 골형성 및 지방생성 분화를 유지함이 발견되었다. 이처럼, 본 기재의 분해가능한 폼 세포지지체 상에 배양된 세포는 생체내 세포의 생체 반응과 유사한 생체 반응을 나타냄이 결정되었다.
실시예 21
실시예 2, 11 및 13의 공정에 따라 형성되고 실시예 14의 공정에 따라 코팅된 폼 상의 인간 중간 줄기 세포s (hMSC)의 팽창이 조사되었다. 실시예 17에서 사용된 hMSC Passage 2가 MesencultTM-XF 배지에서 세포 배양 플레이트 상에 배양되었다. 상기 폼은 약 2-3 mm 두께 및 약 22 mm의 직경을 갖는 부위로 절단되었다. 상기 폼 부위는 약 5.0 분 동안 70% 수성 에탄올에서 살균된 후, 6-정 초-저압 부착 세포 배양 플레이트의 개별적인 정에 위치되었다. 상기 폼 부위는 초순수로 2회 그리고 MesencultTM-XF 배지로 1회 세척되었다. 과잉의 배지가 시딩 전에 정으로부터 제거되었다.
hMSC가 트립신을 사용하여 세포 배양 플레이트로부터 채취되고, MesencultTM-XF 배지에서 재-현탁되고, 약 100,000 세포를 함유하는 150 μL가 각 폼 부위에서 시드되었으며, 이는 6-정 세포 배양 플레이트의 정에 위치되었다. 상기 6-정 세포 배양 플레이트는 약 7일 동안 세포 배양 인큐베이터에 위치되었고, 4일째 프레시 배지로 대체되었다. 약 7 일 후, 상기 배지가 제거되고 폼이 약 50 U/mL 펙틴분해효소 및 약 5.0 mM EDTA를 함유하는 약 2.0 mL의 소화 용액의 각 정에 첨가됨으로써 폼이 분해되었다. 상기 폼은 5.0 분 하에 분해되는 것이 관찰되었다. 폼의 분해에 이어, 세포가 전술한 트리판 블루 배제 규약을 사용하여 카운트되었다. 상기 폼 부위의 모든 기공 표면 상에 세포가 이식되며, 본 기재의 Corning® 신더맥스® II-SC로 코팅된 분해가능한 폼 세포지지체 상의 hSMC의 팽창이 성공적으로 달성되었음이 관찰되었다.
실시예 22
실시예 2 및 11의 공정에 따라 형성되고 실시예 14의 공정에 따라 코팅된 폼 상의 고정 조건 및 동적 조건에서 인간 중간 줄기 세포 (hMSC)의 배양 비교가 조사되었다. hMSC Passage 2는 실시예 17에서와 같이 배양되었다. hMSC는 트립신을 사용하여 세포 배양 플레이트로부터 채취되고, MesencultTM-XF 배지에서 재-현탁되며, 약 100,000 세포를 함유하는 150 μL가 실시예 2에서 형성된 20개의 폼 세포지지체에 그리고 실시예 11에서 형성된 20개의 폼 세포지지체에 시드되었다. 상기 세포지지체는 약 2시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 위치된 6-정 세포 배양 플레이트의 정에 위치되었다. 약 2 시간 후, 실시예 2에 따라 형성된 세포지지체 함유 6-정 세포 배양 플레이트, 및 실시예에 따라 형성된 세포지지체 함유 6-정 세포 배양 플레이트가 인큐베이터로부터 제거되었고, 세포지지체가 개별적인 생물 반응 장치로 수송되었다. 다른 6-정 세포 배양 플레이트는 인큐베이터에 남았다. 모든 세포지지체가 약 6일 동안 각각의 조건 하에서 유지된 후, 약 50 U/mL 펙틴분해효소 및 약 5.0 mM EDTA를 함유하는 소화 용액의 첨가에 의해 분해되었다. 폼의 분해에 이어서, 세포가 전술한 트리판 블루 배제 규약을 사용하여 카운트되었다. 본 기재의 Corning® 신더맥스® II-SC로 코팅된 분해가능한 폼 세포지지체 상의 세포의 팽창은 동적 조건 하에서와 유사한 정적 조건 하에서인 것이 관찰되었다.
실시예 23
인간 중간 줄기 세포 (hMSC)의 다중-수(multi-passage) 배양이 조사되었다. 본원에 기술된 바와 같이, 세포 배양의 배양 수(passage number)는 배양이 계대배양된, 즉 채취되고 재시드된 회수의 기록이다. 따라서, 본 기재와 관련된 다중-수 배양은 세포가 하나의 분해가능한 폼 세포지지체로부터 채치되고 상이한 분해가능한 폼 세포지지체 상에 재시드된 공정을 기술한다. hMSC는 트립신을 사용하여 세포 배양 플레이트로부터 채취되고, MesencultTM-XF 배지에서 재-현탁되며 약 100,000 세포를 함유하는 150 μL가 실시예 2에서 형성되고 실시예 14에서 코팅된 폼 세포지지체의 제1의 세트에서 시드되었다. 상기 세포지지체는 MesencultTM-XF 배지에 위치되고, 약 6일 동안 세포 배양 인큐베이터에 위치되었다. 약 6 일 후, 상기 세포지지체는 약 50 U/mL 펙틴분해효소 및 약 5.0 mM EDTA를 함유하는 소화 용액의 첨가에 의해 분해되었다. 상기 폼의 분해에 이어서, 세포가 전술한 트리판 배제 규약을 사용하여 카운트되었다. 다음으로, 제1의 세트의 세포지지체로부터 채취된 약 100,000 세포를 함유하는 용액이 실시예 2에서 형성되고 실시예 14에서 코팅된 제2의 세트의 폼 세포지지체를 시드하는데 사용되었다. 상기 세포지지체는 MesencultTM-XF 배지에 위치되고 약 7일 동안 세포 배양 인큐베이터에 위치되었다. 약 7 일 후, 상기 세포지지체는 약 50 U/mL 펙틴분해효소 및 약 5.0 mM EDTA를 함유하는 소화 용액의 첨가에 의해 분해되었다. 상기 폼의 분해에 이어서, 세포가 트리판 블루 배제 규약을 사용하여 카운트되었다. 다음으로, 상기 제2의 세트의 세포지지체로부터 채취된 약 100,000 세포를 함유하는 용액이 실시예 2에서 형성되고 실시예 14에서 코팅된 제3의 세트의 폼 세포지지체를 시드하는데 사용되었다. 상기 세포지지체는 MesencultTM-XF 배지에 위치되었고, 약 7일 동안 세포 배양 인큐베이터에 위치되었다. 약 7일 후, 상기 세포지지체는 약 50 U/mL 펙틴분해효소 및 약 5.0 mM EDTA를 함유하는 소화 용액의 첨가에 의해 분해되었다. 폼의 분해에 이어서, 세포가 트리판 블루 배제 규약을 사용하여 카운트된 후, 실시예 20에서 사용된 분화 배지, 연골세포 분화 배지, 및 지방세포 분화 배지에 세포가 노출된 세포 배양 플레이트 상에 시드되었다. 3주 후, 골세포 분화 배지에 노출된 세포가 알리자린 레드로 염색되었고, 연골세포 분화 배지에 노출된 세포가 알시안 블루로 염색되었고, 지방세포 분화 배지에 노출된 세포가 오일 레드 O으로 염색되었다. 염색 후, 본 기재의 Corning® 신더맥스® II-SC로 코팅된 분해가능한 폼 세포지지체 상에서 다중-수 배양을 경험한 hSMC가 연골발생, 골형성 및 지방생성 분화를 유지함이 관찰되었다.
실시예 24
실시예 11의 공정에 따라 형성되고 실시예 14의 공정에 따라 코팅된 폼 세포지지체 상에의 인간 배아 콩팥 (HEK) 세포의 트랜스펙션이 Corning® 신더맥스® II-SC 분해가능한 마이크로캐리어(Corning Incorporated, Corning, NY으로부터 상업적으로 입수 가능함) 상에서 HEK 세포의 트랜스펙션과 비교되었다. HEK 세포가 분해가능한 마이크로캐리어 상에 시드되었다. 제1의 세트의 분해가능한 마이크로캐리어가 6-정 세포 배양 플레이트에 위치되고 10% 소태아 혈청 (FBS)으로 보충된 IMDM 배지에 노출되었다. 상기 6-정 세포 배양 플레이트가 세포 인큐베이터에 위치되고 약 3일 동안 고정 조건에서 팽창되었다. 제2의 세트의 분해가능한 마이크로캐리어가 1회용 스피너 플라스크에 위치되었고 간헐적 교반으로(매 2.0 시간 15분 동안 교반) 약 3일 동안 10% 소태아 혈청 (FBS)으로 보충된 IMDM 배지에 현탁되었다. 약 3일 후, 약 150 μL의 트랜스펙션 시약이 6-정 세포 배양 플레이트의 정에서 분해가능한 마이크로캐리어에 첨가되었고, 약 1.0 mL의 트랜스펙션 시약이 연속된 간헐적 교반으로 스피너 플라스크에 첨가되었다.
폼의 부위가 HEK 세포로 시드되었다. 일부 폼 부위가 6-정 세포 배양 플레이트에 위치되고, 10% 소태아 혈청 (FBS)으로 보충된 IMDM 배지에 노출된 후, 6-정 배양 플레이트가 약 3일 동안 세포 인큐베이터에 위치되었다. 다른 폼 부위가 약 3일 동안 방사형 유량 관류 카트리지 장치의 챔버에 위치되었다. 상기 관류 카트리지 장치는 10% 소태아 혈청 (FBS) 보충된 소모(spent) IMDM 배지의 연속적인 제거 및 상기 챔버로부터 10% 소태아 혈청 (FBS) 보충된 프레시 IMDM 배지의 첨가를 가능하게 한다. 약 3일 후, 약 150 μL의 트랜스펙션 시약이 6-정 세포 배양 플레이트의 정에서 폼 부위에 첨가되었고, 약 1.0 mL의 트랜스펙션 시약이 관류 카트리지 장치에서 폼 부위에 첨가되었다.
상기 트랜스펙션 시약의 첨가 후, 세포가 분해가능한 마이크로캐리어로부터 그리고 폼 부위로부터 채취되었고, 보고 유전자 발현 수준이 보고 유전자로서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 반응을 측정함으로써 검출되었다. 트랜스펙션 효율의 지표로서 사용될 수 있는, 감염된 HEK 세포의 GFP-양성 백분율이 유동 세포분석법에 의해 측정되었다. 본원에서 사용되는 바에 따라, 용어 "트랜스펙션 효율"은 트랜스펙션 시약에 노출 후 세포 내에 존재하는 주어진 핵산 또는 생물학적 활성 분자를 갖는 세포의 백분율을 나타낸다. 도 19는 각 배양 조건에 대하여 감염된 HEX 세포의 GFP-양성 백분율을 나타내는 막대 그래프이다. 도시된 바와 같이: 막대(1610)는 6-정 세포 배양 플레이트에서 분해 가능한 폼 부위 상에서 배양된 감염된 HEK 세포의 GFP-양성 백분율을 나타내며; 막대(1620)은 관류 카트리지 장치에서 분해가능한 폼 부위 상에서 배양된 감염된 HEK 세포의 GFP-양성 백분율을 나타내며; 막대(1630)는 6-정 세포 배양 플레이트에서 분해가능한 마이크로캐리어 상에서 분양된 감염된 HEK 세포의 GFP-양성 백분율을 나타내며; 그리고 막대(1640)는 스피너 플라스크에서 분해가능한 마이크로캐리어 상에서 배양된 감염된 HEK 세포의 GFP-양성 백분율을 나타낸다. 본 기재의 Corning® 신더맥스® II-SC로 코팅된 분해가능한 폼 세포지지체 상에서 배양된 세포는 마이크로캐리어 상에서 배양된 세포보다 좀 더 큰 트랜스펙션 효율을 나타내는 것으로 관찰되었다. 특정 이론에 한정되길 바라는 것은 아니나, 폼 세포지지체의 기공 내의 세포는 마이크로캐리어의 표면에 부착된 세포보다 트랜스펙션 시약에 더 많은 노출을 경험하는 것으로 믿어진다.
실시예 25
실시예 11의 공정에 따라 형성되고 실시예 14의 공정에 따라 코팅된 폼 세포지지체 상에서 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터의 보호가 증명되었다. 제1의 및 제2의 세트의 폼 세포지지체가 1백만 293aav 세포로 시드되었고 방사형 유량 관류 카트리지 장치의 챔버로 전달되었으며, 여기서 이들은 10% 소태아 혈청 (FBS)이 보충된 IMDM 배지에 노출되었다.
약 24 시간 후, 제1의 세트의 폼 세포지지체로부터의 세포가 칼슘 인산염 트랜스펙션 방법을 사용하여 AAV-2 헬퍼 프리 포장 시스템(Helper Free Packaging System) (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA로부터 상업적으로 입수 가능함)으로 감염되었다. 또한, 약 24시간 후, 제2의 세트의 폼 세포지지체로부터의 세포가 PEI 방법을 사용하여 AAV-2 헬퍼 프리 포장 시스템으로 감염되었다. 칼슘 인산염 방법에서, 세포는 6.4 μg/mL의 플라스미드 농도 및 1:1:1 몰 비의 플라스미드로 제조된 칼슘 인산염/DNA 복합체로 약 18시간 동안 배양되었다. PEI 방법에서, 폼 세포지지체 상의 세포는 2μg 플라스미드/mL로 감염되었다. 각각의 PEI 방법에서, 2/1의 PEI/DNA 비 및 1:1:1 몰 비의 플라스미드가 사용되었다.
방사형 유량 관류 카트리지 장치가 약 2 시간 동안 20 mL/min 그리고 나서 약 16시간 동안 5 mL/min의 관류 속도에서 작동되었다. 모든 세트의 세포에 대해서, 배지가 제거되었고, 약 18시간 후 프레시 배지로 대체되었다. 다음으로, 세포는 트랜스펙션 후 72시간 더욱 배양되고 채취되었다. 상기 폼 세포지지체는 약 50 U/mL 펙틴분해효소 및 약 5.0 mM EDTA를 함유하는 소화 용액의 첨가에 의해 수집되고 분해되었다. 폼 세포지지체의 분해에 이어서, 세포는 원심분리법을 사용하여 수집되고 dPBS에서 세척되었다. 세포의 부위는 유동 세포분석법 분석을 위하여 유지되고, 남은 세포는 50U/mL 벤조나제(benzonase)로 보충된 0.1% 나트륨 탄산소산염 완충제, 20mM 트리스 pH8, 150mM NaCl을 사용하여 용해되었다. 37℃에서 약 30분의 배양 후, 바이러스 추출물은 14,000 rpm에서 약 5분 동안 원심분리범에 의해 정화되었다. 바이러스 역가(Viral titers)는 AAV-2 ELISA 분석을 사용하여 측정되었다(PROGEN Biotechnik GmbH, Heidelberg, Germany로부터 상업적으로 입수 가능함).
트랜스펙션 효율은 유동 세포분석법을 사용하여 분석되었고, 우수한 트랜스펙션 효율이 관찰되었다. 도 20은 폼 세포지지체의 각 세트에 대해 감염된 세포의 GFP-양성 백분율을 나타내는 막대 그래프이다. 도시된 바와 같이: 막대(1710)는 트랜스펙션 효율이 약 86.4%로 측정되는 트랜스펙션 방법에서 칼슘 인산염 트랜스펙션 방법을 사용하여 감염된 세포의 GFP-양성 백분율을 나타내며; 그리고 막대( 1720)는 트랜스펙션 효율이 약 73.8%로 측정된 PEI 트랜스펙션 방법을 사용하여 감염된 세포의 GFP-양성 백분율을 나타낸다.
바이러스 역가(Virus titer)는 또한 ELISA 분석을 사용하여 측정되었다. 도 21은 폼 세포지지체의 세트 당 바이리온 (vp)의 수를 나타내는 막대 그래프이다. 도시된 바와 같이: 막대(1810)는 8.7 x 1011 바이리온이 측정된 칼슘 인산염 트랜스펙션 방법을 사용하여 감염된 세포의 바이리온을 나타내며; 막대(1820)는 5.7 x 1011 바이리온이 측정된 PEI 트랜스펙션 방법을 사용하여 감염된 세포의 바이리온을 나타낸다. 도 22는 폼 세포지지체의 세트 당 세포 당 바이리온의 수를 나타내는 막대 그래프이다. 도시된 바와 같이: 막대(1910)는 1.17 x 105 바이리온/세포가 측정된 칼슘 인산염 트랜스펙션 방법을 사용하여 감염된 세포의 바이리온/세포를 나타내며; 막대(1920)는 6.8 x 104 바이리온/세포가 측정된 PEI 트랜스펙션 방법을 사용하여 감염된 세포의 바이리온/세포를 나타낸다.
마지막으로, 바이러스 벡터의 기능성이 감염된 HEK 293 세포에서 GFP 발현을 유도하기 위한 추출 능력을 시험함으로써 평가되었다. 바이러스 벡터 전염력은 감염시키기 위한 105 바이리온s/세포를 사용하여 제조된 추출물로 HEK 293 세포를 감염시킴으로써 평가되었다. 감염 후 약 72시간, 감염된 HEK 세포의 GFP-양성 백분율이 유동 세포분석법에 의해 측정되었다. 감염이 폼 세포지지체의 각 세트로부터 세포에 대해 관찰되었다. GFP 발현은 유전자 전달의 효율을 확인하는데 사용되었으며, 이는 본 실시예에 대해서 약 10% 내지 약 26%의 범위였다. 이처럼, 기능성 AAV 벡터는 본원에 기술된 폼 세포지지체 상에서 제조될 수 있는 것으로 결론지어졌다. 도 23은 감염 후 폼 세포지지체의 각 세트에 대해서 GFP 발현을 나타내는 세포의 분획을 나타내는 막대 그래프이다. 도시된 바와 같이: 막대(2010)는 약 26%의 세포가 GFP 발현을 나타내는 칼슘 인산염 트랜스펙션 방법을 사용하여 감염된 세포에 대해 GFP 발현을 나타내는 세포의 분획을 나타내며; 그리고 막대(2020)는 약 10%의 세포가 GFP 발현을 나타내는 PEI 트랜스펙션 방법을 사용하여 감염된 세포에 대해 GFP 발현을 나타내는 세포의 분획을 나타낸다.
본 기재의 관점(1)에 따르면, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체가 제공된다. 상기 분해가능한 폼 세포지지체는 펙트산; 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염 중 적어도 하나로부터 선택된 이온성 가교결합된(ionotropically crosslinked) 폴리갈락투론산 화합물; 및 표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머를 포함한다.
본 기재의 관점(2)에 따르면, 관점 (1)의 분해가능한 폼 세포지지체는 접착 폴리머 코팅을 더욱 포함하여 제공된다.
본 기재의 관점(3)에 따르면, 관점(2)의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 상기 접착 폴리머 코팅이 펩티드를 포함하는 것으로 제공된다.
본 기재의 관점(4)에 따르면, 관점 (2)의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 접착 폴리머 코팅은 BSP, 비트로넥틴, 섬유결합소, 라미닌, 1형 콜라겐, 4형 콜라겐, 변성 콜라겐 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선태된 펩티드를 포함한다.
본 기재의 관점(5)에 따르면, 관점 (2)의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 상기 접착 폴리머 코팅은 신더맥스® II-SC를 포함한다.
본 기재의 관점(6)에 따르면, 관점 (1)-(5) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 적어도 하나의 제1의 폴리머는 약 8 초과의 친수성-친유성 평형 (HLB)을 갖는다.
본 기재의 관점(7)에 따르면, 관점 (1)-(6) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 적어도 하나의 제1의 폴리머는 약 10 초과의 친수성-친유성 평형 (HLB)을 갖는다.
본 기재의 관점(8)에 따르면, 관점 (1)-(7) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 약 10 및 약 40 사이의 친수성-친유성 평형 (HLB)을 가질 수 있다.
본 기재의 관점(9)에 따르면, 관점 (1)-(8) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 셀룰로오스 유도체를 포함한다.
본 기재의 관점(10)에 따르면, 관점 (9)의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 셀룰로오스 유도체는 하이드록시에틸셀룰로오스 (HEC), 하이드록시프로필셀룰로오스 (HPC), 메틸셀룰로오스 (MC), 하이드록시에틸메틸셀룰로오스 (HEMC), 및 하이드록시프로필-메틸셀룰로오스 (HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(11)에 따르면, 관점 (1)-(8) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 단백질을 포함한다.
본 기재의 관점(12)에 따르면, 관점 (11)의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 상기 단백질은 소 혈청 알부민 (BSA), 젤라틴, 카세인 및 하이드로포빈으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(13)에 따르면, 관점 (1)-(8) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 합성한 양쪽 친매성 폴리머를 포함한다.
본 기재의 관점(14)에 따르면, 관점 (13)의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 상기 합성한 양쪽 친매성 폴리머는 폴록사머를 포함한다.
본 기재의 관점(15)에 따르면, 관점 (1)-(14) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 표면 활성을 갖는 적어도 2개의 제1의 수용성 폴리머를 더욱 포함한다.
본 기재의 관점(16)에 따르면, 관점 (1)-(15) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 표면 활성을 갖지 않는 적어도 하나의 제2의 폴리머를 더욱 포함한다.
본 기재의 관점(17)에 따르면, 관점 (16)의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 적어도 하나의 제2의 폴리머는 합성 폴리머를 포함한다.
본 기재의 관점(18)에 따르면, 관점 (17)의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 상기 합성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 카르복시비닐 폴리머, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드의 호모폴리머 및 코폴리머, 폴리비닐 메틸 에테르-말레산 무수물, 및 폴리에틸렌 산화물/폴리프로필렌 산화물 블록 코폴리머로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(19)에 따르면, 관점 (16)의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 적어도 하나의 제2의 폴리머는 반합성 폴리머를 포함한다.
본 기재의 관점(20)에 따르면, 관점 (19)의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 상기 반합성 폴리머는 덱스트란 유도체s, 카르복시메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스 및 유도체, 메틸셀룰로오스 및 유도체, 에틸셀룰로오스 셀룰로오스, 에틸 하이드록시에틸 셀룰로오스, 및 하이드록시프로필 셀룰로오스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(21)에 따르면, 관점 (16)의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 적어도 하나의 제2의 폴리머는 천연 폴리머를 포함한다.
본 기재의 관점(22)에 따르면, 관점 (21)의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 상기 천연 폴리머는 녹말, 녹말 유도체, 커드란, 풀루란, 젤란검, 크산탄 검, 덱스트란, 알부민, 카세인, 카세인염, 젤라틴, 한천, 알긴산염, 카라기닌, 구아 검, 구아 검 유도체, 로커스 콩 검, 히알루론산, 및 콘드로이틴 황산염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(23)에 따르면, 관점 (1)-(22) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 수용성 가소제를 더욱 포함한다.
본 기재의 관점(24)에 따르면, 관점 (23)의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 상기 수용성 가소제는 글리세롤, 다가 알코올, 소르비톨, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(25)에 따르면, 관점 (23)-(24) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 약 55 중량% 미만의 수용성 가소제를 더욱 포함한다.
본 기재의 관점(26)에 따르면, 관점 (23)-(25) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 약 15 중량% 및 약 55 중량% 사이의 수용성 가소제를 포함한다.
본 기재의 관점(27)에 따르면, 관점 (1)-(26) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 약 85% 및 약 96% 사이의 다공성을 포함한다.
본 기재의 관점(28)에 따르면, 관점 (1)-(27) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 약 50 ㎛ 및 약 500 ㎛ 사이의 평균 기공 크기 직경을 포함한다.
본 기재의 관점(29)에 따르면, 관점 (1)-(28) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 약 75 ㎛ 및 약 450 ㎛ 사이의 평균 기공 크기 직경을 포함한다.
본 기재의 관점(30)에 따르면, 관점 (1)-(29) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 약 100 ㎛ 및 약 400 ㎛ 사이의 평균 기공 크기 직경을 포함한다.
본 기재의 관점(31)에 따르면, 관점 (1)-(30) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 약 0.40 g/cc 미만의 습윤 밀도를 포함한다.
본 기재의 관점(32)에 따르면, 관점 (1)-(31) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 약 0.30 g/cc 미만의 습윤 밀도를 포함한다.
본 기재의 관점(33)에 따르면, 관점 (1)-(32) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 약 0.16 g/cc 및 약 0.40 g/cc 사이의 습윤 밀도를 포함한다.
본 기재의 관점(34)에 따르면, 관점 (1)-(33) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 약 0.20 g/cc 미만의 건조 밀도를 포함한다.
본 기재의 관점(35)에 따르면, 관점 (1)-(34) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 약 0.10 g/cc 미만의 건조 밀도를 포함한다.
본 기재의 관점(36)에 따르면, 관점 (1)-(35) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 약 0.02 g/cc 및 약 0.20 g/cc 사이의 건조 밀도를 포함한다.
본 기재의 관점(37)에 따르면, 관점 (1)-(36) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 열린 기공 아키텍쳐를 포함한다.
본 기재의 관점(38)에 따르면, 관점 (1)-(37) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 분해가능한 폼 세포지지체의 소화는 약 1시간 미만에서 완성된다.
본 기재의 관점(39)에 따르면, 관점 (1)-(38) 중 어느 하나의 분해가능한 폼 세포지지체에서, 분해가능한 폼 세포지지체의 소화는 약 15분 미만에서 완성된다.
본 기재의 관점(40)에 따르면, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법이 제공된다. 상기 방법은 다음을 포함한다: 펙트산; 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염 중 적어도 하나로부터 선택된 폴리갈락투론산 화합물을 수성 용액에 첨가하여 제1의 수성 혼합물을 형성하는 단계; 표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머 및 2가의 금속 염을 수성 용액에 첨가하여 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계; 상기 제1의 수성 혼합물과 제2의 제1의 수성 혼합물을 조합하여 조합된 수성 혼합물을 형성하는 단계; 상기 조합된 수성 혼합물에 겔 유도제를 첨가하는 단계; 및 상기 조합된 수성 혼합물에 기포를 도입하여 폼 세포지지체를 형성하는 단계.
본 기재의 관점(41)에 따르면, 관점 (40)의 방법에서, 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 표면 활성을 갖지 않는 적어도 하나의 제2의 폴리머를 첨가하는 단계를 더욱 포함한다.
본 기재의 관점(42)에 따르면, 관점 (41)의 방법에서 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머 및 적어도 하나의 제2의 폴리머를 첨가하는 단계는 약 35% 및 약 65% 사이의 적어도 하나의 제1의 폴리머 및 약 35% 및 약 65% 사이의 적어도 하나의 제2의 폴리머를 첨가하는 단계를 포함한다.
본 기재의 관점(43)에 따르면, 관점 (40)-(42) 중 어느 하나의 방법에서, 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 표면 활성을 갖는 적어도 2개의 제1의 수용성 폴리머를 첨가하는 단계를 포함한다.
본 기재의 관점(44)에 따르면, 관점 (40)-(43) 중 어느 하나의 방법에서, 상기 2가의 금속 염은 마그네슘, 칼슘, 아연, 스트론튬, 바륨, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 양이온; 및 수산염, 타르타르산염, 인산염, 탄산염, 구연산염, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 음이온을 포함한다.
본 기재의 관점(45)에 따르면, 관점 (40)-(43) 중 어느 하나의 방법에서, 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 상기 제2의 수성 혼합물에 수용성 가소제를 첨가하는 단계를 더욱 포함한다.
본 기재의 관점(46)에 따르면, 관점 (45)의 방법에서, 상기 수용성 가소제는 글리세롤, 다가 알코올, 소르비톨, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(47)에 따르면, 관점 (45)-(46) 중 어느 하나의 방법에서, 상기 수용성 가소제는 상기 제2의 수성 혼합물의 총 고체 첨가제의 약 55 중량% 미만을 포함한다.
본 기재의 관점(48)에 따르면, 관점 (45)-(47) 중 어느 하나의 방법에서, 상기 수용성 가소제는 상기 제2의 수성 혼합물의 총 고체 첨가제의 약 15 중량% 및 약 55 중량% 사이를 포함한다.
본 기재의 관점(49)에 따르면, 관점 (40)-(48) 중 어느 하나의 방법에서, 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 제2의수성 혼합물에 유화제를 첨가하는 단계를 더욱 포함한다.
본 기재의 관점(49)에 따르면, 관점 (40)-(48) 중 어느 하나의 방법에서, 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 제2의 수성 혼합물에 유화제를 첨가하는 단계를 더욱 포함한다.
본 기재의 관점(50)에 따르면, 관점 (40)-(49) 중 어느 하나의 방법에서, 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 제2의 수성 혼합물에 적어도 하나의 여과가능한 고체를 첨가하는 단계를 더욱 포함한다.
본 기재의 관점(51)에 따르면, 관점 (50)의 방법에서, 상기 적어도 하나의 여과가능한 고체는 염, 생체적합성 단당 및 이당 및 수용성 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(52)에 따르면, 관점 (40)-(51) 중 어느 하나의 관점에서, 상기 겔 유도체는 젖산 락톤, 글리콜산 락톤, 글루코노 델타 락톤 및 산 무수물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(53)에 따르면, 관점 (40)-(52) 중 어느 하나의 방법에서, 접촉 폴리머 코팅으로 상기 분해 가능한 폼 세포지지체를 코팅하는 단계를 더욱 포함한다.
본 기재의 관점(54)에 따르면, 관점 (53)의 방법에서, 상기 접착 폴리머 코팅은 펩티드를 포함한다.
본 기재의 관점(55)에 따르면, 관점 (53)의 방법에서, 상기 접착 폴리머 코팅은BSP, 비트로넥틴, 섬유결합소, 라미닌, 1형 콜라겐, 4형 콜라겐, 변성 콜라겐 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드를 포함한다.
본 기재의 관점(56)에 따르면, 관점 (53)의 방법에서, 상기 접착 폴리머 코팅은 신더맥스® II-SC를 포함한다.
본 기재의 관점(57)에 따르면, 분해가능한 폼 세포지지체 상의 세포 배양방법이 제공된다. 상기 방법은 다음을 포함한다: 세포가 분해가능한 폼 세포지지체의 기공으로 침투하도록 분해가능한 폼 세포지지체 상에 세포를 시딩하는(seeding) 단계, 상기 분해가능한 세포지지체는 펙트산; 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염 중 적어도 하나로부터 선택된 이온성 가교결합된 폴리갈락투론산 화합물; 및 표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머를 포함함; 및 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계.
본 기재의 관점(58)에 따르면, 관점 (57)의 방법에서, 세포는 상기 분해가능한 폼 세포지지체의 기공에서 응집하여 타원체를 형성한다.
본 기재의 관점(59)에 따르면, 관점 (57)-(58) 중 어느 하나의 방법에서, 상기 분해가능한 폼 세포지지체는 접착 폴리머 코팅을 포함하며, 분해가능한 폼 세포지지체 상에 세포를 시딩하는 단계는 상기 분해가능한 폼 세포지지체의 표면에 세포를 고착시키는 단계를 포함한다.
본 기재의 관점(60)에 따르면, 관점 (57)-(59) 중 어느 하나의 방법에서, 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 세포 배양 배지에 접촉시키는 단계는 세포 배양 배지에 분해가능한 폼 세포지지체를 침지시키는 단계를 포함한다.
본 기재의 관점(61)에 따르면, 관점 (57)-(60) 중 어느 하나의 방법에서, 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 세포 배양 배지에 접촉시키는 단계는 상기 분해가능한 폼 세포지지체 위로 세포 배양 배지를 연속적으로 통과시키는 단계를 포함한다.
본 기재의 관점(62)에 따르면, 관점 (61)의 방법에서, 상기 분해가능한 폼 세포지지체 위로 세포 배양 배지를 연속적으로 통과시키는 단계는 상기 세포 배양 배지의 적어도 일부를 상기 분해가능한 폼 세포지지체와의 접촉에서 제거하는 단계 및 상기 분해가능한 폼 세포지지체와 접촉한 세포 배양 배지의 부피가 실질적으로 일정하게 남도록 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 프레시 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 기재의 관점(63)에 따르면, 분해가능한 폼 세포지지체로부터 세포 채취방법이 제공된다. 상기 방법은 다음을 포함한다: 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 효소에 노출시켜 분해가능한 폼 세포지지체를 소화시키는 단계; 상기 분해가능한 세포지지체는 다음을 포함함: 펙트산; 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염 중 적어도 하나로부터 선택된 이온성 가교결합된 폴리갈락투론산 화합물; 및 표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머; 및 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 착화제에 노출시키는 단계.
본 기재의 관점(64)에 따르면, 관점 (63)의 방법에서, 상기 효소는 비-단백질분해 효소를 포함한다.
본 기재의 관점(65)에 따르면, 관점 (64)의 방법에서, 상기 비-단백질분해 효소는 펙틴소화 효소 및 펙틴분해효소로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(66)에 따르면, 관점 (63)-(65) 중 어느 하나의 방법에서, 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 소화시키는 단계는 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 약 1 U 및 약 200 U 사이의 효소에 노출시키는 단계를 포함한다.
본 기재의 관점(67)에 따르면, 관점 (63)-(66) 중 어느 하나의 방법에서, 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 약 1 mM 및 약 200 mM 사이의 착화제에 노출시키는 단계를 포함한다.
본 기재의 관점(68)에 따르면, 조성물로부터 형성된 발포 세포지지체 생성물이 제공된다. 상기 조성물은 다음을 포함한다: 펙트산; 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염 중 적어도 하나로부터 선택된 이온성 가교결합된 폴리갈락투론산 화합물; 표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머; 및 약 55 중량% 미만의 수용성 가소제.
본 기재의 관점(69)에 따르면, 관점 (98)의 발포 세포지지체 생성물에서, 접착 폴리머 코팅을 더욱 포함한다.
본 기재의 관점(70)에 따르면, 관점 (69)의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 접착 폴리머 코팅은 펩티드를 포함한다.
본 기재의 관점(71)에 따르면, 관점 (69)의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 접착 폴리머 코팅은 BSP, 비트로넥틴, 섬유결합소, 라미닌, 1형 콜라겐, 4형 콜라겐, 변성 콜라겐 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드를 포함한다.
본 기재의 관점(72)에 따르면, 관점 (69)의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 접착 폴리머 코팅은 신더맥스® II-SC를 포함한다.
본 기재의 관점(73)에 따르면, 관점 (68)-(72) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 약 8 초과의 친수성-친유성 평형 (HLB)을 갖는다.
본 기재의 관점(74)에 따르면, 관점 (68)-(73) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 약 10 초과의 친수성-친유성 평형 (HLB)을 갖는다.
본 기재의 관점(75)에 따르면, 관점 (68)-(74) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 약 10 및 약 40 사이의 친수성-친유성 평형 (HLB)을 가질 수 있다.
본 기재의 관점(76)에 따르면, 관점 (68)-(75) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 셀룰로오스 유도체를 포함한다.
본 기재의 관점(77)에 따르면, 관점 (76)의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 셀룰로오스 유도체는 하이드록시에틸셀룰로오스 (HEC), 하이드록시프로필셀룰로오스 (HPC), 메틸셀룰로오스 (MC), 하이드록시에틸메틸셀룰로오스 (HEMC), 및 하이드록시프로필-메틸셀룰로오스 (HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(78)에 따르면, 관점 (68)-(75) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 단백질을 포함한다.
본 기재의 관점(79)에 따르면, 관점 (78)의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 단백질은 소 혈청 알부민 (BSA), 젤라틴, 카세인 및 하이드로포빈으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(80)에 따르면, 관점 (68)-(75) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 합성한 양쪽 친매성 폴리머를 포함한다.
본 기재의 관점(81)에 따르면, 관점 (80)의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 합성한 양쪽 친매성 폴리머는 폴록사머를 포함한다.
본 기재의 관점(82)에 따르면, 관점 (68)-(81) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 표면 활성을 갖는 적어도 2개의 제1의 수용성 폴리머를 포함한다.
본 기재의 관점(83)에 따르면, 관점 (68)-(82) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 폼 세포지지체 조성물은 표면 활성을 갖지 않는 적어도 하나의 제2의 폴리머를 더욱 포함한다.
본 기재의 관점(84)에 따르면, 관점 (83)의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 적어도 하나의 제2의 폴리머는 합성 폴리머를 포함한다.
본 기재의 관점(85)에 따르면, 관점 (84)의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 합성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 카르복시비닐 폴리머, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아미드, N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드의 호모폴리머 및 코폴리머, 폴리비닐 메틸 에테르-말레산 무수물, 및 폴리에틸렌 산화물/폴리프로필렌 산화물 블록 코폴리머로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(86)에 따르면, 관점 (83)의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 적어도 하나의 제2의 폴리머는 반합성 폴리머를 포함한다.
본 기재의 관점(87)에 따르면, 관점 (86)의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 반합성 폴리머는 덱스트란 유도체, 카르복시메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스 및 유도체, 메틸셀룰로오스 및 유도체, 에틸셀룰로오스 셀룰로오스, 에틸 하이드록시에틸 셀룰로오스, 및 하이드록시프로필 셀룰로오스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(88)에 따르면, 관점 (83)의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 적어도 하나의 제2의 폴리머는 천연 폴리머를 포함한다.
본 기재의 관점(89)에 따르면, 관점 (88)의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 천연 폴리머는 녹말, 녹말 유도체, 커드란, 풀루란, 젤란검, 크산탄 검, 덱스트란, 알부민, 카세인, 카세인염, 젤라틴, 한천, 알긴산염, 카라기닌, 구아 검, 구아 검 유도체, 로커스 콩 검, 히알루론산, 및 콘드로이틴 황산염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(90)에 따르면, 관점 (68)-(89) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 상기 수용성 가소제는 글리세롤, 다가 알코올, 소르비톨, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 기재의 관점(91)에 따르면, 관점 (68)-(90) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 약 15 중량% 및 약 55 중량% 사이의 수용성 가소제를 포함한다.
본 기재의 관점(92)에 따르면, 관점 (68)-(91) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 약 85% 및 약 96% 사이의 다공성을 포함한다.
본 기재의 관점(93)에 따르면, 관점 (68)-(92) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 약 50 ㎛ 및 약 500 ㎛ 사이의 평균 기공 크기 직경을 포함한다.
본 기재의 관점(94)에 따르면, 관점 (68)-(93) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 약 75 ㎛ 및 약 450 ㎛ 사이의 평균 기공 크기 직경을 포함한다.
본 기재의 관점(95)에 따르면, 관점 (68)-(94) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 약 100 ㎛ 및 약 400 ㎛ 사이의 평균 기공 크기 직경을 포함한다.
본 기재의 관점(96)에 따르면, 관점 (68)-(95) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 약 0.40 g/cc 미만의 습윤 밀도를 포함한다.
본 기재의 관점(97)에 따르면, 관점 (68)-(96) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 약 0.30 g/cc 미만의 습윤 밀도를 포함한다.
본 기재의 관점(98)에 따르면, 관점 (68)-(97) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 약 0.16 g/cc 및 약 0.40 g/cc 사이의 습윤 밀도를 포함한다.
본 기재의 관점(99)에 따르면, 관점 (68)-(98) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 약 0.20 g/cc 미만의 건조 밀도를 포함한다.
본 기재의 관점(100)에 따르면, 관점 (68)-(99) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 약 0.10 g/cc 미만의 건조 밀도를 포함한다.
본 기재의 관점(101)에 따르면, 관점 (68)-(100) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 약 0.02 g/cc 및 약 0.20 g/cc 사이의 건조 밀도를 포함한다.
본 기재의 관점(102)에 따르면, 관점 (68)-(101) 중 어느 하나의 발포 세포지지체 생성물에서, 열린 기공 아키텍쳐를 포함한다.
본 기재는 제한된 수의 구현예르 포함하는 한편, 본 기재의 이익을 갖는 통상의 기술자는 다른 구현예가 본 기재의 범위를 벗어나지 않고 창안될 수 있음을 인식할 것이다.

Claims (65)

  1. 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체(foam scaffold)로서,
    펙트산; 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염 중 적어도 하나로부터 선택된 이온성 가교결합된(ionotropically crosslinked) 폴리갈락투론산 화합물; 및
    표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머를 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    수용성 가소제를 더욱 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  3. 청구항 2에 있어서,
    약 55 중량% 미만의 수용성 가소제를 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  4. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    접착 폴리머 코팅을 더욱 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 접착 폴리머 코팅은 펩티드를 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  6. 청구항 4에 있어서,
    상기 접착 폴리머 코팅은 BSP, 비트로넥틴, 섬유결합소, 라미닌, 1형 콜라겐, 4형 콜라겐, 변성 콜라겐 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  7. 청구항 4에 있어서,
    상기 접착 폴리머 코팅은 신더맥스(Synthemax)® II-SC를 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  8. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 약 8 초과의 친수성-친유성 평형 (HLB)을 갖는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  9. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 셀룰로오스 유도체를 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  10. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 단백질을 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  11. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 합성한 양쪽 친매성 폴리머를 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  12. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    표면 활성을 갖는 적어도 두 개의 제1의 수용성 폴리머를 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  13. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제2의 폴리머를 더욱 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제2의 폴리머는 합성 폴리머를 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  15. 청구항 13에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제2의 폴리머는 반합성 폴리머를 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  16. 청구항 13에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제2의 폴리머는 천연 폴리머를 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  17. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    약 50 ㎛ 및 약 500 ㎛ 사이의 평균 기공 크기 직경을 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  18. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    약 0.40 g/cc 미만의 습윤 밀도를 포함하는, 세포 배양용 분해가능한 폼 세포지지체.
  19. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    열린 기공 아키텍쳐를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체.
  20. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분해가능한 폼 세포지지체의 소화(digestion)는 약 1 시간 미만에서 완성되는, 분해가능한 폼 세포지지체.
  21. 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법으로서,
    상기 방법은:
    펙트산; 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염 중 적어도 하나로부터 선택된 폴리갈락투론산 화합물을 수성 용액에 첨가하여 제1의 수성 혼합물을 형성하는 단계;
    표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머 및 2가의 금속 염을 수성 용액에 첨가하여 제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계;
    상기 제1의 수성 혼합물과 제2의 제1의 수성 혼합물을 조합하여 조합된 수성 혼합물을 형성하는 단계;
    상기 조합된 수성 혼합물에 겔 유도제를 첨가하는 단계; 및
    상기 조합된 수성 혼합물 내에 기포를 도입하여 폼 세포지지체를 형성하는 단계를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법.
  22. 청구항 21에 있어서,
    제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 상기 제2의 수성 혼합물에 수용성 가소제를 첨가하는 단계를 더욱 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법.
  23. 청구항 22에 있어서,
    상기 수용성 가소제는 상기 제2의 수성 혼합물의 총 고체 첨가제의 약 55 중량% 미만을 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법.
  24. 청구항 21 내지 23 중 어느 한 항에 있어서,
    제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 표면 활성을 갖지 않는 적어도 하나의 제2의 폴리머를 첨가하는 단계를 더욱 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법.
  25. 청구항 24에 있어서,
    적어도 하나의 제1의 폴리머 및 적어도 하나의 제2의 폴리머를 첨가하는 단계는 약 35% 및 약 65% 사이의 적어도 하나의 제1의 폴리머 및 약 35% 및 약 65% 사이의 적어도 하나의 제2의 폴리머를 첨가하는 단계를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법.
  26. 청구항 21 내지 25 중 어느 한 항에 있어서,
    제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 표면 활성을 갖는 적어도 두 개의 제1의 수용성 폴리머를 첨가하는 단계를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법.
  27. 청구항 21 내지 26 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 2가의 금속 염은:
    마그네슘, 칼슘, 아연, 스트론튬, 바륨, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 양이온; 및
    수산염, 타르타르산염, 인산염, 탄산염, 구연산염, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 음이온을 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법.
  28. 청구항 21 내지 27 중 어느 한 항에 있어서,
    제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 상기 제2의 수성 혼합물에 유화제를 첨가하는 단계를 더욱 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법.
  29. 청구항 21 내지 28 중 어느 한 항에 있어서,
    제2의 수성 혼합물을 형성하는 단계는 상기 제2의 수성 혼합물에 적어도 하나의 여과가능한(leachable) 고체를 첨가하는 단계를 더욱 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법.
  30. 청구항 29에 있어서,
    상기 적어도 하나의 여과가능한 고체는 염, 생체적합성 단당 및 이당 및 수용성 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법.
  31. 청구항 21 내지 30 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 겔 유도체는 젖산 락톤, 글리콜산 락톤, 글루코노 델타 락톤 및 산 무수물로 이루어진 군으로부터 선택된, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법.
  32. 청구항 21 내지 31 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분해가능한 폼 세포지지체를 접착 폴리머 코팅으로 코팅하는 단계를 더욱 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법.
  33. 청구항 32에 있어서,
    상기 접착 폴리머 코팅은 펩티드를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법.
  34. 청구항 32에 있어서,
    상기 접착 폴리머 코팅은 BSP, 비트로넥틴, 섬유결합소, 라미닌, 1형 콜라겐, 4형 콜라겐, 변성 콜라겐 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법.
  35. 청구항 32에 있어서,
    상기 접착 폴리머 코팅은 신더맥스® II-SC를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체의 형성방법.
  36. 분해가능한 폼 세포지지체 상의 세포 배양방법으로서,
    상기 방법은:
    세포가 분해가능한 폼 세포지지체의 기공으로 침투하도록 분해가능한 폼 세포지지체 상에 세포를 시딩하는(seeding) 단계, 상기 분해가능한 세포지지체는 다음을 포함함:
    펙트산; 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염 중 적어도 하나로부터 선택된 이온성 가교결합된 폴리갈락투론산 화합물; 및
    표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머; 및
    상기 분해가능한 폼 세포지지체를 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체 상의 세포 배양방법.
  37. 청구항 36에 있어서,
    상기 세포는 상기 분해가능한 폼 세포지지체의 기공에서 응집하여 타원체를 형성하는, 분해가능한 폼 세포지지체 상의 세포 배양방법.
  38. 청구항 36 내지 37 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분해가능한 폼 세포지지체는 접착 폴리머 코팅을 포함하며, 여기서 분해가능한 폼 세포지지체 상에 세포를 시딩하는 단계는 상기 분해가능한 폼 세포지지체의 표면에 세포를 고착시키는 단계를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체 상의 세포 배양방법.
  39. 청구항 36 내지 38 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분해가능한 폼 세포지지체를 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계는 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 세포 배양 배지에 침지시키는 단계를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체 상의 세포 배양방법.
  40. 청구항 36 내지 39 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분해가능한 폼 세포지지체를 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계는 상기 분해가능한 폼 세포지지체 위로 세포 배양 배지를 연속적으로 통과시키는 단계를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체 상의 세포 배양방법.
  41. 청구항 40에 있어서,
    상기 분해가능한 폼 세포지지체 위로 세포 배양 배지를 연속적으로 통과시키는 단계는 상기 세포 배양 배지의 적어도 일부를 상기 분해가능한 폼 세포지지체와의 접촉에서 제거하는 단계 및 상기 분해가능한 폼 세포지지체와 접촉한 세포 배양 배지의 부피가 실질적으로 일정하게 남도록 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 프레시 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체 상의 세포 배양방법.
  42. 분해가능한 폼 세포지지체로부터 세포 채취방법으로서,
    상기 방법은:
    상기 분해가능한 폼 세포지지체를 효소에 노출시켜 분해가능한 폼 세포지지체를 소화시키는 단계;
    상기 분해가능한 세포지지체는 다음을 포함함:
    펙트산; 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염 중 적어도 하나로부터 선택된 이온성 가교결합된 폴리갈락투론산 화합물; 및
    표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머; 및
    상기 분해가능한 폼 세포지지체를 착화제에 노출시키는 단계를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체로부터 세포 채취방법.
  43. 청구항 42에 있어서,
    상기 효소는 비-단백질분해 효소를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체로부터 세포 채취방법.
  44. 청구항 43에 있어서,
    상기 비-단백질분해 효소는 펙틴소화 효소 및 펙틴분해효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 분해가능한 폼 세포지지체로부터 세포 채취방법.
  45. 청구항 42 내지 44 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분해가능한 폼 세포지지체를 소화시키는 단계는 상기 분해가능한 폼 세포지지체를 약 1 U 및 약 200 U 사이의 효소에 노출시키는 단계를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체로부터 세포 채취방법.
  46. 청구항 42 내지 45 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분해가능한 폼 세포지지체를 약 1 mM 및 약 200 mM 사이의 착화제에 노출시키는 단계를 포함하는, 분해가능한 폼 세포지지체로부터 세포 채취방법.
  47. 다음을 포함하는 조성물로부터 형성된 발포 세포지지체 생성물:
    펙트산, 부분적으로 에스테르화된 펙트산, 부분적으로 아미드화된 펙트산 및 이들의 염 중 적어도 하나로부터 선택된 이온성 가교결합된 폴리갈락투론산 화합물;
    표면 활성을 갖는 적어도 하나의 제1의 수용성 폴리머; 및
    약 55 중량% 미만의 수용성 가소제.
  48. 청구항 47에 있어서,
    약 15 중량% 및 약 55 중량% 사이의 수용성 가소제를 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  49. 청구항 47 내지 48 중 어느 한 항에 있어서,
    접착 폴리머 코팅을 더욱 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  50. 청구항 49에 있어서,
    상기 접착 폴리머 코팅은 펩티드를 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  51. 청구항 49에 있어서,
    상기 접착 폴리머 코팅은 BSP, 비트로넥틴, 섬유결합소, 라미닌, 1형 콜라겐, 4형 콜라겐, 변성 콜라겐 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  52. 청구항 49에 있어서,
    상기 접착 폴리머 코팅은 신더맥스® II-SC를 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  53. 청구항 47 내지 52 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 약 8 초과의 친수성-친유성 평형 (HLB)을 갖는, 발포 세포지지체 생성물.
  54. 청구항 47 내지 53 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 셀룰로오스 유도체를 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  55. 청구항 47 내지 53 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 단백질을 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  56. 청구항 47 내지 53 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제1의 폴리머는 합성한 양쪽 친매성 폴리머를 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  57. 청구항 47 내지 56 중 어느 한 항에 있어서,
    표면 활성을 갖는 적어도 2개의 제1의 수용성 폴리머를 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  58. 청구항 47 내지 57 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폼 세포지지체 조성물은 표면 활성을 갖지 않는 적어도 하나의 제2의 폴리머를 더욱 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  59. 청구항 58에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제2의 폴리머는 합성 폴리머를 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  60. 청구항 58에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제2의 폴리머는 반합성 폴리머를 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  61. 청구항 58에 있어서,
    상기 적어도 하나의 제2의 폴리머는 천연 폴리머를 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  62. 청구항 47 내지 61 중 어느 한 항에 있어서,
    약 85% 및 약 96% 사이의 다공성을 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  63. 청구항 47 내지 62 중 어느 한 항에 있어서,
    약 50 ㎛ 및 약 500 ㎛ 사이의 평균 기공 크기 직경을 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  64. 청구항 47 내지 63 중 어느 한 항에 있어서,
    약 0.40 g/cc 미만의 습윤 밀도를 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
  65. 청구항 47 내지 64 중 어느 한 항에 있어서,
    열린 기공 아키텍쳐를 포함하는, 발포 세포지지체 생성물.
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