CN113454166A

CN113454166A - 基于多糖和两性离子聚合物的水凝胶组合物及其使用方法

Info

Publication number: CN113454166A
Application number: CN201980092569.6A
Authority: CN
Inventors: 安德鲁·威廉·辛克莱; 蒂莫西·詹姆斯·富吉哈拉
Original assignee: Teplute Medical Technology Co ltd
Current assignee: Teplute Medical Technology Co ltd
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2021-09-28
Also published as: EP3898840A1; US20210301108A1; JP2022514331A; EP3898840A4; WO2020131513A1

Abstract

公开了同时包含多糖基和聚两性离子组分的水凝胶组合物，该多糖基和聚两性离子组分以使得这种组合网络表现出材料特性的方式交联或混合在一起；此类组合物的制备方法；以及将该组合物用于各种临床和生物医学应用的方法。该水凝胶组合物可以包含多个聚两性离子组分和多个多糖基组分。

Description

基于多糖和两性离子聚合物的水凝胶组合物及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年12月19日提交的美国临时申请号62/782,213(代理人案号54671-703.101)的权益，其全部内容通过引用并入本文。

政府许可权利声明

本发明是在国家科学基金会授予的SBIR 1747283的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

背景技术

本申请总体上涉及生物相容性水凝胶组合物，并且更具体地涉及用于临床和生物医学制剂的聚两性离子-多糖混合水凝胶组合物及其合成和使用方法。水凝胶是与天然组织享有许多特性的高度水合聚合物网络，并且近年来在美容、外科手术和再生医疗程序中变得越来越普遍。然而，尽管进行了广泛的研究和开发，但开发适用于临床植入或注射的安全、功能性和生物相容性的聚合物材料和水凝胶仍是一个挑战。目前，水凝胶最普遍的临床应用之一是作为软组织或真皮填充剂。

水凝胶可以根据其目标功能或预期应用分为各种分类法。与本发明相关的水凝胶类别之间的一个区别是它们通过一种或多种生理、生化或环境机制被降解、再吸收或代谢的能力。这些机制可以包括酯水解、二硫键断裂和酶促或蛋白水解降解。水凝胶类别之间的另一个常见区别是它们的粘弹性或剪切依赖的材料特性。实际上，这些粘弹性决定了水凝胶组合物是否可以通过针头注射或涂抹在表面或组织上——尤其是可注射性对于许多非侵入性临床应用(包括药物贮库、生物制剂和美容或重建程序)来说是期望的。水凝胶类别之间的第三个常见区别是它们的合成或生物来源，其通常与它们的大分子或聚合物网络结构有关。众所周知的合成水凝胶的示例包括交联的聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯和聚乙二醇。众所周知的生物衍生或天然存在的水凝胶的示例包括化学或物理交联的多糖，诸如透明质酸(通常以其透明质酸钠盐形式使用)、葡聚糖和藻酸盐；蛋白质或氨基酸衍生的水凝胶，诸如明胶和胶原蛋白也很常见。

在真皮填充剂制剂以及其他临床和生物医学应用中，透明质酸(HA)是最常见的组分之一。HA是一种天然存在的、高度生物相容性和水溶性的多糖，特别是一种糖胺聚糖。HA是细胞外基质的主要组分，广泛分布和富含于人和其他动物体内。一般成年人体内含有约15克内源性HA。通过被称为透明质酸酶的一类酶，人体每天降解并重新合成约五克的内源性透明质酸。透明质酸酶切割HA主链，将其高分子量(1000+kDa或1+MDa)降低为低聚糖，并导致HA最终完全代谢。

许多基于HA的临床制剂与内源性HA的不同之处在于它们结合了一定程度的化学交联以稳定它们免于快速降解并调节它们的粘弹性。生产交联HA制剂的最常见方法是通过1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。BDDE交联的HA真皮填充剂组合物具有通常3-6个月的寿命；交联会减慢或延迟酶分解，但不能无限期地防止降解。基于HA的真皮填充剂最近取得成功的一个关键原因是它们出色的安全记录。如果需要，局部透明质酸酶应用也可用于在注射后以非侵入性方式快速降解凝胶。虽然这种酶可逆性在许多应用中被认为是期望的，但它与当前基于HA的水凝胶的一个重大技术缺陷有关：它们的生理寿命有限。

合成来源的水凝胶也已用于各种临床和生物医学应用。例如，通过亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)或类似物交联的合成聚丙烯酰胺凝胶已被批准并在某些司法管辖区用作真皮填充剂，基于聚乙二醇(PEG)的水凝胶在组织工程研究中很常见。这些合成水凝胶通常不可生物降解，并且如果被引入人体，在没有外科手术干预的情况下通常被认为是永久性的。至关重要的是，该类别的许多水凝胶已被证明会引起与炎症和免疫原性相关的更频繁和严重的急性和迟发不良反应。然而，尽管它们的免疫原性导致其受欢迎程度近年来急剧下降，但许多患者仍将其较长的寿命视为期望的特征。总之，与必须分离和纯化的生物来源凝胶(诸如HA)相比，以临床使用所需的高纯度生产合成水凝胶通常更具成本效益。

在所有天然和合成的水凝胶化学物质中，聚两性离子水凝胶因其独特的生物相容性而在近年来受到特别关注。这些聚合物沿其链包含重复的阳离子和阴离子基团对，模拟包含细胞膜的磷脂或许多蛋白质的混合电荷表面。据报道，由两性离子聚合物聚羧基甜菜碱(polyCB)形成的水凝胶在植入小鼠体内时可抑制异物反应并抵抗胶原囊形成，这是所有生物材料中的一个独特特征。此外，封装在polyCB水凝胶中的干细胞保持其治疗多能性并且可以避免非特异性分化，进一步支持这种合成材料独特的高生物相容性。

尽管基于HA的可注射水凝胶作为真皮填充剂广受欢迎，并且研究了各种各样的合成和其他天然来源的材料替代品和添加剂，但仍需要结合高安全性和延长生理寿命的可注射和支持性水凝胶。本发明寻求满足这种需要并提供进一步的相关优点。

发明内容

本发明提供了同时包含多糖基和聚两性离子组分的水凝胶组合物，它们以某种方式交联或混合在一起，使得这种组合网络表现出生物医学应用期望的材料特性或临床效用。

在一方面，本发明提供了一种包含多个聚两性离子组分(Z*)和多糖基组分(C*)的水凝胶组合物，其中一个或多个Z*和C*组分通过一种或多种类型的化学或物理缔合或键连接，如以下结构所示：

其中，

C*表示多糖组分；

C₁是所述多糖组分的一部分，包含天然或自然存在形式的多糖或多糖盐的一个或多个结构单元，或者为空；

C₂是所述多糖组分的一部分，包含由一个或多个化学或结构修饰修饰的多糖或多糖盐的一个或多个结构单元，并且通过连接组分X₁连接至聚两性离子组分Z*；

m是从1至约10,000的整数，描述代表性多糖基组分C*的分子量，其可以是C₁和C₂结构单元的随机或结构化组合；

X₁是将多糖基组分连接至聚两性离子组分的化学或物理缔合或键；

Z*表示聚两性离子组分；

Z₂是所述聚两性离子组分的一部分，其可沿聚合物主链、在一个或多个聚合物链末端存在，或者并入聚合物侧链中，包含两性离子聚合物或低聚物的一个或多个结构单元，通过连接组分X₁连接至多糖组分C*；

Z₁是所述聚两性离子组分的一部分，包含两性离子聚合物或低聚物的一个或多个结构单元；

n是从1至约10,000的整数，描述代表性聚两性离子组分Z*的分子量或聚合度，其可以是Z₁和Z₂结构单元的随机或结构化组合；

R₁和R₂是聚两性离子(Z_n)、多糖基(C_m)性质或其他性质(N)的其他组分，其可通过连接组分X₂或X₃连接至任何代表性C*或Z*；或者为空。

在一些实施方案中，所述聚两性离子组分基于聚羧基甜菜碱、聚胆碱磷酸、聚磺基甜菜碱、聚磷酸甜菜碱、聚三甲胺N-氧化物或聚四氢嘧啶，包括官能化衍生物、共聚物或药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述聚两性离子组分基于具有阳离子和阴离子重复单元的基本上电中性的共聚物，或者混合电荷共聚物，包括混合电荷肽。

在一些实施方案中，所述多糖组分是糖胺聚糖，更具体地基于透明质酸(HA)或任何其药学上可接受的透明质酸盐，带有或不带有不同程度的用于赋予合成所述水凝胶组合物或所需的附加化学官能度或其他功能的化学修饰。

在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种活性剂，诸如提供治疗、防腐、材料或美容效用的药物或添加剂。

在一些实施方案中，所述聚两性离子和多糖网络结构可以补充或掺入具有美容或治疗效用的一种或多种添加剂，诸如局部麻醉剂、肽、核酸、蛋白质、其他生物分子、纳米颗粒、微粒、胶束、脂质体、聚合物囊泡、药物、药物前体或其他药理学或生化活性物种。

在一些实施方案中，所述组合物可以包括未交联或以其他方式化学键合至网络的交联主体的聚两性离子和/或多糖组分，用于包括粘度调节或促进局部麻醉剂递送的目的。

在一个实施方案中，提供了一种包含可注射、支持性材料形式的水凝胶组合物的产物，该可注射、支持性材料适于增加或替换丢失或损坏的组织，或者用于提供另一种美容或再生功能。

在示例性的实施方案中，所提供的组合物高度适于增加、支持、增强或替换患者的软组织以用于美容或再生益处，并且由透明质酸酶类的酶稳定化防止过早降解，同时通过局部注射的同类酶保持可逆性。

在另一实施方案中，提供了一种包含可注射材料制剂形式的水凝胶组合物的产物，该可注射材料制剂含有药物或生物分子以形成药物贮库或用于程序化释放所述药物或生物分子的其他此类保护性或稳定化环境。

在另一实施方案中，提供了一种包含水合或冻干形式的水凝胶组合物的产物，该水合或冻干形式创造了适于离体(ex vivo)细胞培养、可注射细胞治疗制剂或组织工程或基于细胞的治疗的其他方面的细胞或组织培养支架。

所述组合物可以包含聚两性离子组分，所述聚两性离子组分含有各种网络支化几何形状、流体动力学大小和分子量，其与所述多糖组分化学交联和/或物理缠结，或者在其自身和所述多糖组分之间发生交联和/或物理缠结。

所述组合物可以包含多糖组分，所述多糖组分含有各种网络支化几何形状、流体动力学大小和分子量，其与所述聚两性离子组分化学交联和/或物理缠结，或者在其自身和所述聚两性离子组分之间发生交联和/或物理缠结。

在另一方面，本发明提供了用于合成和使用此类组合物的方法，其具有临床或生物医学应用期望的特性。

在一方面，所述组合物中聚两性离子基组分与多糖基组分的重量比为约0.01至约1000。例如，聚两性离子组分与多糖组分的重量比可以为约1:100、1:10、1:1、5:1、10:1、100:1、500:1或1000:1。

在一些实施方案中，所述组合物在设计的水合度下在最终产物中具有约10mg/mL至300mg/mL的总聚合物浓度。例如，所述组合物中的总聚合物浓度可以为约15mg/mL、25mg/mL、75mg/mL、100mg/mL或250mg/mL。

在一个实施方案中，所述组合物具有约20mg/mL的聚两性离子组分浓度和约10mg/mL的多糖基组分浓度。

在另一实施方案中，所述组合物具有约40mg/mL的聚两性离子组分浓度和约10mg/mL的多糖基组分浓度。

在另一实施方案中，所述组合物具有约400mg/mL的聚两性离子组分浓度和约15mg/mL的多糖基组分浓度。

在一些实施方案中，所述聚两性离子组分的一部分化学交联至所述多糖组分的一部分，其中所述多糖组分先前已通过光引发、自由基介导的聚合反应用诸如甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺或丙烯酰胺基团等可聚合的侧基部分修饰。

在一些实施方案中，所述组合物通过两段交联反应形成，其中所述多糖组分的一部分或全部先被修饰、官能化和/或交联，然后在第二合成步骤中移接、结合或附着所述聚两性离子组分。

在一些实施方案中，所有组分部分或完全溶解在反应前溶液中，其可以包括两性离子单体或聚合物、修饰或天然的多糖(诸如基于透明质酸的多糖)、交联多糖、光活性自由基引发分子和其他添加剂。可将该溶液在真空下脱气或用惰性气体(诸如氮气)吹扫并暴露于紫外或可见光辐射以引发形成期望组合物的反应。该反应前溶液的pH、盐度和缓冲物种可以从许多可用选项中选择。

在一些实施方案中，将反应后水凝胶产物在具有期望pH、盐度和缓冲物种含量的水溶液中平衡或透析24小时至两周或更长时间。通常，该平衡溶液每天更新一次或多次，以促进水凝胶溶胀以及任何未反应或不需要的杂质的扩散或透析，以将它们从水凝胶组合物中去除。

在一些实施方案中，在聚合之后，在透析或纯化步骤之前或之后，将反应后的水凝胶产物加工成较小的水凝胶或微凝胶，在水合或干燥条件下，使用任何加工方法将块体水凝胶研磨、碾磨、挤出、切碎、切割、造粒、分散、均化或剪切成较小单元。

在一些实施方案中，组合物可以包含或含有微凝胶，该微凝胶在聚合反应期间(例如在诸如微乳液聚合等过程中)以其最终大小或接近其最终大小产生，或者源自一种或多种块体水凝胶组合物并在聚合后使用任何加工步骤将大小调整为其最终尺寸。

在一些实施方案中，所述组合物可以包含如上所述的微凝胶以及相同或不同化学组合物的连续水凝胶或聚合物相。

在一些实施方案中，在选定的合成或制造加工步骤后将所述组合物冻干以促进随后的合成或制造步骤，或保持脱水形式直至使用。

在一些实施方案中，在选定的合成或制造加工步骤后将所述组合物在有机溶剂或溶剂混合物中沉淀并干燥以促进随后的合成或制造步骤，或保持干燥、固态或粉末形式直至使用。

在一些实施方案中，一个或多个合成或加工步骤可以在无菌条件下进行，包括反应前溶液的无菌过滤、无菌操作的使用以及无菌平衡缓冲液的使用。在所述组合物的制备和加工期间，包括在冻干或干燥步骤期间或之后，可以使用专门的过滤器、屏障和容器。

在一些实施方案中，所述组合物可以在包装到其最终容器中之前、期间或之后进行最终灭菌。所述组合物的最终形式可以采取冻干粉末或基质的形式，或者可以采取含水量低于、等于或高于其平衡含水量的水合凝胶制剂的形式。

定义

本说明书中使用的某些术语旨在指代以下定义，详述如下。当术语的定义偏离该术语的常用含义时，除非特别指明，否则申请人旨在使用以下提供的定义。

术语“单体”是当聚合时在聚合物结构中贡献一个或多个结构单元的可聚合化合物。

术语“聚合物”是指由单种单体聚合而成的产物。

术语“共聚物”是指由两种或更多种不同单体聚合而成的聚合物。在共聚物中可以分别控制每个结构单元的数量和性质。除非另外明确说明，否则结构单元可以以纯随机、交替随机、规则交替、规则嵌段或随机嵌段构型布置。

术语“结构单元”是指聚合物中的原子或原子团，其包括聚合物链的一部分及其侧链原子或原子团(如果有的话)。结构单元可以指重复单元。结构单元也可以指聚合物链上的端基。

术语“重复单元”对应于最小的结构单元，其重复构成规则的大分子(或低聚物分子或嵌段)。

术语“透明质酸”或“HA”是指任何平均分子量和分子量分布的众所周知的多糖和糖胺聚糖，并且也可以指任何其药学上可接受的透明质酸盐，包括但不限于透明质酸钠(NaHA)、透明质酸钾、透明质酸镁、透明质酸钙或其组合。

术语“两性离子聚合物”或“聚两性离子组分”是指具有两性离子结构单元的聚合物或共聚物。两性离子结构单元具有包括两性离子基团的侧基(即，从聚合物主链侧垂的基团)。代表性的两性离子侧基包括羧基甜菜碱基团(例如，—R_a—N⁺(R_b)(R_c)—R_d—CO₂ ^-)，其中R_a是将聚合物主链共价偶联至羧基甜菜碱基团的阳离子氮中心的连接基团，R_b和R_c是氮取代基，R_d是将阳离子氮中心共价偶联至羧基甜菜碱基团的羧基的连接基团)。

术语“官能化”是指包含官能团的单体、聚合物或共聚物，该官能团使得单体、聚合物或共聚物对与另一单体、聚合物、共聚物或生物或药理学物种的共价偶联具有反应性。在本发明的实践中，本发明的官能化单体、聚合物和共聚物(其可以源自多糖、源自两性离子材料或其他来源)通过其官能团反应以形成将单体、聚合物或共聚物共价偶联(例如，将聚合物与共聚物交联)的共价键。

术语“高压灭菌器稳定”描述了一种抗降解的组合物产物，例如该组合物产物在有效高压灭菌器灭菌后保持以下项中的至少一项，优选所有项：透明外观、pH、挤出力和/或流变特性、聚合物浓度、无菌性、渗透压以及组合物中存在的任何添加剂或附加物种的浓度。

术语“冻干稳定”描述了一种抗降解的组合物产物，例如该组合物产物在通过冻干或冷冻干燥程序完全去除水或缓冲液后保持以下项中的至少一项，优选所有项：透明外观、pH、挤出力和/或流变特性、聚合物浓度、无菌性、渗透压以及组合物中存在的任何添加剂或附加物种的浓度。

本文中表达任何聚合物或化学物种的“分子量”的所有数字应理解为表示以道尔顿为单位的重均分子量(Mw)。

除非另有说明，否则当提及组合物的任何聚合物组分时，“高分子量”描述具有高于约100,000Da(0.1MDa)的分子量，通常不超过约3,000,000Da(3MDa)的分子量的材料。

除非另有说明，否则当提及组合物的任何聚合、低聚或其他化学物种，或参与组合物生产的物种，或由组合物降解产生的物种时，“低分子量”描述具有低于约100,000Da(0.1MDa)的分子量的材料。

术语“交联”是指在组合物的聚两性离子和/或多糖组分之中或之间连接单个聚合物分子的分子间连接。特别地，交联度或修饰度进一步定义为描述交联点的摩尔量相对于聚合物或聚合物组合物中总结构单元的无量纲数或摩尔％。

如本文所用，术语“内聚性”通常是指水凝胶组合物通过某些程序或处理保持其超分子特性的能力。在本发明的一些实施方案中，内聚性是指在组合物经受不同的剪切速率(例如，在通过针注射期间)之后，选定的流变特性(例如，弹性模量)恢复，而不会破裂成不可恢复的组分凝胶块。

术语“弹性模量”、“储能模量”或“G′(G撇)”是指描述水凝胶组合物对弹性变形的抵抗力的流变特性，以Pa(帕斯卡)表示。在典型条件下，强凝胶比弱凝胶具有更大的G′。

术语“粘性模量”、“损耗模量”或“G″(G两撇)”是指描述水凝胶组合物对粘性变形的抵抗力的流变特性，以Pa(帕斯卡)表示。G″与G′一起描述对变形的总抵抗力。

术语“微凝胶”是指具有微米尺寸(即，具有约1至约1000微米的直径)的水凝胶。

附图说明

通过结合附图参考以下详细描述，本发明的上述方面和许多伴随的优点将变得容易领会同时变得更好理解。

图1图示了本发明的一个方面的概念模型。每个空心圆圈表示组合物的两性离子结构单元，而每个实心圆圈表示组合物的多糖结构单元。相同类型的相邻结构单元的链被认为是“组分”。如图1所示，包含所公开的组合物的每个组分的至少一个(可能有许多)结构单元通过“交联点”共价键合至另一组分的至少一个(可能有许多)结构单元。该图示仅旨在促进对本发明的理想化概念实施方案的理解，而不应被视为分子结构的定量或化学准确表示。

图2图示了本发明的一些方面的代表性概念模型。图中的绳状描绘代表聚合物组分，并且聚合物交点处的圆形符号代表可能的交联点。如在图例中所述，轮廓的或未填充的组分代表本发明的聚两性离子方面，而实线的或填充的组分代表本发明的多糖方面。组合物的酶促或蛋白水解降解可以产生较小的组分诸如低聚物，或者一些组分可在生理环境中完全降解或代谢。该概念图仅旨在促进对本发明的一个理想化方面的理解，而不应被视为任何分子结构的定量或化学准确表示。

图3A-3B示出了本发明的一个实施方案的相同制剂的代表性流变特性。图3A显示了如振荡应变扫描实验所证明的剪切稀化流变特性。在该实验中，描绘了当振荡应变从0.05％增加到2000％时的存储(G′，实线)和损耗(G″，虚线)模量。图3B示出了该相同制剂的动态振荡频率扫描。在该实验中，在0.1Hz至100Hz之间的所有角频率下，G′比G″占主导地位，这显示弹性网络在各种条件下保持原状。

图4A-4C示出了本发明的其他选定制剂或实施方案的代表性流变特性。图4A示出了当振荡应变从0.05％增加到5000％时的存储(G′，实线)和损失(G″，虚线)模量。图4A中描绘的制剂的特征在于，在低于100％的应变下G′>1000Pa，以及在约500％时的高“交叉”应变。图4B示出了当振荡应变从0.1％增加到1000％时的存储(G′，实线)和损失(G″，虚线)模量。图4B中描绘的制剂是具有不同比例的聚两性离子组分与多糖组分的两种制剂的混合组合物。图4C示出了当振荡应变从0.1％增加到2000％时的存储(G′，实线)和损失(G″，虚线)模量。图4C中描绘的制剂是在两步交联反应中形成的组合物。

图5示出了与市售的BDDE交联透明质酸水凝胶(对照)相比，两个示例制剂(RIF-201和RIF-088)的代表性体外(in vitro)酶促降解，证明了本发明的一些实施方案的酶促+降解的可调稳定性。在本发明的许多实施方案中，组合物显示出比HA-BDDE组合物增加的酶促降解稳定性，同时保持完全的酶促降解性。

图6示出了使用Instron拉伸/压缩力测试设备测量的代表性注射力或针头挤出力特性。

图7示出了对于本发明的一些实施方案重要的代表性分子结构，特别是用各种基团修饰用于进一步交联反应的透明质酸的代表性结构，其是本发明的多糖组分的一个示例。在所示的示例结构中，在总长度为x+y个二糖单元的给定多糖链中，有x个修饰HA的二糖单元和y个未修饰HA的单元。

具体实施方式

本公开内容总体上涉及生物相容性水凝胶组合物，并且更具体地涉及包含聚两性离子和多糖组分的水凝胶组合物、其制备及其使用方法。

水凝胶包含水或其他水相以及交联的大分子基质。通常，所公开组合物的水凝胶包含交联的分子基质，该分子基质含有聚两性离子组分(Z*)和多糖组分(C*)，其中一个或多个Z*和C*组分通过一种或多种类型的化学或物理缔合或键连接，由以下结构(I)表示：

其中，

C*表示多糖组分；

C₁是多糖组分的一部分，包含天然或自然存在形式的多糖或多糖盐的一个或多个结构单元，或者为空；

C₂是多糖组分的一部分，包含由一个或多个化学或结构修饰修饰的多糖或多糖盐的一个或多个结构单元，并且通过连接组分X₁连接至聚两性离子组分Z*；

Z*表示聚两性离子组分；

Z₂是聚两性离子组分的一部分，其可沿聚合物主链、在一个或多个聚合物链末端存在，或者并入聚合物侧链中，包含两性离子聚合物或低聚物的一个或多个结构单元，通过连接组分X₁连接至多糖组分C*；

Z₁是聚两性离子组分的一部分，包含两性离子聚合物或低聚物的一个或多个结构单元；

R₁和R₂是聚两性离子(Z_n)、多糖基(C_m)性质或任何其他性质(N)的其他组分，其可通过连接组分X₂或X₃连接至任何代表性C*或Z*；或者为空。

在一方面，聚两性离子组分(Z*)基于多种两性离子结构单元，其可以包括羧基甜菜碱、磷酰胆碱、磺基甜菜碱、磷酸甜菜碱、氧化三甲胺(TMAO)、四氢嘧啶或附着至可聚合主链结构的另一两性离子部分。在一些实施方案中，聚两性离子组分的代表性结构单元可具有由以下通用结构(II)表示的式：

其中，

R₄选自氢、氟、三氟甲基、C1-C6烷基和C6-C12芳基；

R₅和R₆独立地选自氢、烷基和芳基，或与它们所附着的氮一起形成阳离子中心；

L₄是将阳离子中心[N⁺(R₅)(R₆)]共价偶联至聚合物主链[-(CH₂-CR₄)_n-]的连接物；

L₅是将阴离子中心[A₂(＝O)O^-]共价偶联至阳离子中心的连接物；

A₂是C、S、SO、P或PO；

n是从约5至约10,000的整数；以及

代表重复或结构单元与相邻重复单元或交联点共价连接的点。

在一个实施方案中，R₄是C1-C3烷基。

R₅和R₆独立地选自氢、烷基和芳基，或与它们所附着的氮一起形成阳离子中心。在一个实施方案中，R₅和R₆是C1-C3烷基。

在某些实施方案中，L₄选自-C(＝O)O-(CH₂)_n-和-C(＝O)NH-(CH₂)_n-，其中n是从1至20的整数。在某些实施方案中，L₄是-C(＝O)O-(CH₂)_n-，其中n是1-6。

在某些实施方案中，L₅是-(CH₂)_n-，其中n是从1至20的整数。

在某些实施方案中，A₂是C或SO。

在某些实施方案中，n是从5至约5,000的整数。

在一个实施方案中，R₄、R₅和R₆是甲基，L₄是-C(＝O)O-(CH₂)₂-，L₅是-(CH₂)-，A₁是C，并且n是从10至约1,000的整数。

在优选的实施方案中，聚两性离子组分可以基于通过在聚合反应中使一种或多种羧基甜菜碱丙烯酰胺单体或单体衍生物反应形成的结构单元。某些羧基甜菜碱丙烯酰胺单体的代表性结构称为羧基甜菜碱丙烯酰胺-1(CBAA-1)、羧基甜菜碱丙烯酰胺-2(CBAA-2)，代表性的羧基甜菜碱丙烯酰胺-2-酯(CBAA-2-酯)如下(III)所示：

其中CBAA-2-酯中的‘R’基团可以是出于任何原因选择的能够通过这样的键与CBAA-2共价连接的任何基团。

在某些实施方案中，聚两性离子组分可以是基于聚羧基甜菜碱的单体或聚合物和其他类别的离子或非离子单体或聚合物的混合物，或者聚羧基甜菜碱和其他类别的离子或非离子单体的共聚物，或者阳离子和阴离子单体/聚合物的混合物或共聚物，使得聚两性离子组分的整体特性基本上为两性离子、混合电荷或抵抗蛋白质粘附和非特异性生物相互作用。

在某些实施方案中，聚两性离子组分可包括官能化的基于羧基甜菜碱的单体、低聚物或聚合物，其在某些实施方案中包含：(a)选自叠氮化物和炔烃、叠氮化物和烯烃、硫醇和马来酰亚胺、硫醇和烯烃、硫醇和二硫化物、硫醇和降冰片烯的反应对之一，或者任何其他“点击”、生物正交或其他反应对；(b)所述官能团位于聚合结构的末端或作为官能化至结构单元侧链的侧基，或者为不同的共聚单体。

在某些实施方案中，聚两性离子组分可以含有各种网络支化几何形状、流体动力学大小和分子量，其与多糖组分化学交联和/或物理缠结，或者在其自身和多糖组分之间发生交联和/或物理缠结。

在另一方面，多糖组分(C*)基于具有一般序列的多个结构单元，该一般序列被本领域普通技术人员认为是单糖、二糖或寡糖的聚合物，或者这些单糖、二糖或寡糖的天然和化学修饰形式的任何组合。

在某些实施方案中，多糖组分基于天然或化学修饰的琼脂、藻酸盐、卡拉胶、纤维素、壳聚糖、甲壳素、环糊精、葡聚糖、结冷胶、糖原、刺梧桐胶、菊粉、果胶、聚葡萄糖、黄原胶或任何其他淀粉、树胶或其他多糖，包括其官能化衍生物、糊精化、水解、氧化、烷基化、羟烷基化、乙酰化、分馏和物理修饰的淀粉及其任何药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，多糖组分可以基于糖胺聚糖，糖胺聚糖是一种特定类别的多糖，其包括透明质酸钠和其他透明质酸盐以及硫酸软骨素、硫酸肝素和其他示例。

在优选的实施方案中，多糖组分基于透明质酸(HA)，也称为透明质酸钠或玻尿酸，它是一种非硫酸化的糖胺聚糖，通常包含D-葡萄糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)的二糖单元，它们交替连接，形成线性聚合物。天然存在的HA可增强保水能力、抵抗静水压力、无免疫原性且在人体中很常见，并且如果期望可进行化学修饰。HA的结构如下(IV)所示：

在某些实施方案中，多糖组分、聚两性离子组分或交联点可以易于通过酶促、蛋白水解、水解或其他机制降解(即，可生物降解)。这些机制可以包括酯水解、二硫键断裂和其他形式的酶促或蛋白水解降解。

在示例性的实施方案中，多糖组分基于HA，该HA具有一种或多种化学修饰以赋予用于合成完整组合物可能必需的附加官能度。

在某些实施方案中，可以先对多糖组分的一部分用一个或多个可聚合的侧基部分(诸如甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺或其他丙烯酰基)修饰，以允许通过自由基介导的聚合反应交联。

在某些实施方案中，多糖组分包含使用本领域技术人员已知的HA交联方法(例如，在碱性水溶液条件下通过1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE))在合成本发明的完整组合物之前形成的交联HA网络。

在某些实施方案中，HA、修饰HA或其他多糖组分的分子量可以变化。例如，HA可以具有约10,000Da至约10,000,000Da、约50,000Da至约5,000,000Da或约100,000Da至约3,000,000Da，或者约1,000,000Da(1MDa)的分子量。

组合物可以包含多糖组分，多糖组分含有各种网络支化几何形状、流体动力学大小和分子量，其与聚两性离子组分化学交联和/或物理缠结，或者在其自身和聚两性离子组分之间发生交联和/或物理缠结。在将多糖或HA组分交联至聚两性离子组分的反应发生后，所得交联的大分子产物可能含有与反应前溶液中的多糖或HA组分相比增加、降低或相当分子量的一些多糖或HA组分。在这种情况下，术语“分子量”应用于基质的一部分，即使由于交联导致HA组分的多糖实际上可能不是独特的或单独的分子。

在一些实施方案中，组合物可以包括未化学键合至网络主体的聚两性离子和/或多糖组分，用于包括粘度调节或局部麻醉剂递送的目的。

在另一方面，聚两性离子组分的一些部分的至少一个(可能有许多)结构单元通过任何化学或物理缔合或纠缠连接至多糖组分的一部分的至少一个(可能有许多)结构单元。

在某些实施方案中，交联点可以包括在形成最终组合物的反应之前或期间被官能化为多糖和/或聚两性离子组分的化学结构。

在一些实施方案中，交联点可由一个或多个包含一种或多种丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺的基团或在自由基介导的聚合反应中具有反应性的其他含丙烯酰基的基团形成。

在一些实施方案中，交联点可包含马来酰亚胺、降冰片烯、炔烃、烯烃、硫醇、叠氮化物或其他反应性基团，或者其他生物正交交联化学物质和“点击”化学物质，诸如叠氮化物/炔烃(包括SPAAC)和硫醇-烯化学物质。

在一些实施方案中，交联点可包含偶联剂或由偶联剂介导形成，例如碳二亚胺，诸如N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，以促进酯或酰胺键的形成，其可以不成为连接的一部分或者成为连接的一部分。

在某些实施方案中，交联点可以含有酶促或蛋白水解可降解的基团，选自二硫键、酯、酸酐、酶促裂解肽(诸如基质金属蛋白酶[MMP]可裂解的肽基序)或对外部刺激(诸如光或热)有响应的化学物质。

在某些优选的实施方案中，聚两性离子组分的一部分与多糖组分化学交联，多糖组分自身先前已通过光引发或热引发的自由基介导的聚合反应用诸如甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺或丙烯酰胺基团等可聚合的侧基部分修饰。

反应条件

交联反应混合物可以反应形成交联的大分子基质。在一些实施方案中，所有组分均溶解在反应前水溶液中，其中所有组分均是可溶的。这些组分可以包括两性离子单体或聚合物、修饰或天然的多糖(诸如基于透明质酸的多糖)、光活性自由基引发分子和其他添加剂。可以调节反应条件(诸如HA、官能化或修饰的HA、两性离子单体、两性离子聚合物、引发剂、催化剂或添加剂的浓度，以及溶液的pH、溶液温度和盐浓度)以帮助防止聚离子络合物形成或任何组分在反应溶液中不溶。该反应前溶液的pH、盐度和缓冲物种可以从许多可用选项中选择。

在一些实施方案中，可以先使用本领域技术人员已知的交联化学(例如，在碱性水溶液条件下通过1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE))使多糖基组分(诸如HA)交联，然后在进一步交联至聚两性离子组分之前通过冻干或沉淀进行加工和/或干燥。初级或次级反应溶液中包含的有机溶剂、pH、盐度和缓冲物种可以从许多可用选项中选择。

在一些实施方案中，在引发自由基介导的交联或聚合反应之前，可将反应前溶液在真空下脱气或用惰性气体(诸如氮气或氩气)吹扫。在一些实施方案中，可能不需要对反应前溶液进行脱气或吹扫。

在一些实施方案中，水性反应前溶液或交联反应混合物还可以包含约1％至约50％的有机溶剂，诸如乙醇、甲醇、异丙醇、DMSO或类似物。

在一些实施方案中，将包含光活性自由基引发剂的反应前溶液暴露于紫外或可见光辐射以引发形成期望组合物的反应。该光活性引发剂可选自本领域技术人员已知的各种可商购的或定制合成的分子。在示例性的实施方案中，该活性引发剂可以是水溶性和生物相容性物种2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基丙烷-1-酮，也称为Irgacure2959、Darocur 2959或简称为“2959”。

在一些实施方案中，将包含热活性自由基引发剂的反应前溶液暴露于高温以引发形成期望组合物的反应。该热引发剂可选自本领域技术人员已知的各种可商购的或定制合成的分子，诸如2,2'-偶氮二异丁腈，也称为AIBN。

在一方面，反应前溶液中聚两性离子基组分或前体与多糖基组分或前体的重量比为约0.01至约1000。例如，聚两性离子组分与多糖组分的重量比可以为约1:10、1:1、5:1、10:1、100:1或500:1。

在一些实施方案中，组合物在设计的水合含量下在最终产物中具有约10mg/mL至300mg/mL的总聚合物浓度。例如，组合物中的总聚合物浓度可以为约25mg/mL、33Mg/mL、50mg/mL、75mg/mL、100mg/mL或250mg/mL。

在某些实施方案中，组合物具有约90mg/mL的聚两性离子组分浓度和约10mg/mL的多糖基组分浓度，或者约99mg/mL的聚两性离子组分浓度和约1mg/mL的多糖基组分浓度，或者约40mg/mL的聚两性离子组分浓度和约15mg/mL的多糖基组分浓度，或者约20的聚两性离子组分浓度和约10mg/mL的多糖基组分浓度。

在某些实施方案中，交联反应混合物可以包含浓度约10mg/mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的HA，浓度约20mg/mL的羧基甜菜碱丙烯酰胺单体，浓度约0.5mg/mL的Irgacure2959，以及浓度约0.9wt％或约150mM的氯化钠。

在某些实施方案中，交联反应混合物可以包含浓度约10mg/mL的、悬浮的、甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的、BDDE交联的HA微凝胶，浓度约20mg/mL的羧基甜菜碱丙烯酰胺单体，浓度约0.5mg/mL的Irgacure 2959，以及浓度约0.9wt％或约150mM的氯化钠。

在某些实施方案中，交联反应混合物可以包含浓度约10mg/mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的HA，浓度约80mg/mL的羧基甜菜碱丙烯酰胺单体，浓度约0.5mg/mL的Irgacure2959，以及浓度约0.9wt％或约150mM的氯化钠。

在某些实施方案中，交联反应混合物可以包含浓度约3mg/mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的HA，浓度约500mg/mL的羧基甜菜碱丙烯酰胺单体，浓度约0.5mg/mL的Irgacure2959，以及浓度约0.9wt％或约150mM的氯化钠。

在某些实施方案中，可以将反应混合物转移或注入玻璃或其他足够UV透明的铸模中并暴露于紫外光约10秒至约1小时，或约30秒至约30分钟，或约1分钟至约10分钟。

在某些实施方案中，可以在高度为约1mm至约10cm一个或多个敞口容器中转移或制备反应混合物，并将其暴露于紫外光下以便利用称为“光前端聚合(photo-frontalpolymerization)”的几何现象。

在某些实施方案中，可以将反应混合物暴露于任何波长或波长组合的紫外光，诸如约254纳米(nm)、约300nm或约365nm。这种光源可以是紫外光交联炉、手持式紫外灯、紫外光发光二极管(LED)装置，或任何其他工业、商业或定制制造的紫外光光源，或者天然紫外光光源(诸如太阳)。

加工

在一些实施方案中，将反应后水凝胶产物从其铸模或其他容器中移除并在具有期望pH、盐度和缓冲物种含量的水溶液中平衡约24小时至约两周或更长时间。通常，该平衡溶液每天更新一次或多次，以促进水凝胶溶胀至其平衡水合状态，以及促进任何未反应或不需要的杂质的扩散或透析以将它们从水凝胶组合物中去除。

在优选的实施方案中，缓冲溶液可以是磷酸盐缓冲盐溶液，其可以包含磷酸盐缓冲液、氯化钾和氯化钠，并且具有约7至约8的pH。磷酸盐缓冲溶液相对于人生理流体可以是基本上等渗的。

在某些实施方案中，使用通过诸如振荡、摇动、搅拌或流体循环等过程的温和搅动或流体对流来提高反应后水凝胶产物在平衡溶液中平衡和纯化的速度或效率。

在某些实施方案中，在发生交联反应和附加的处理步骤(诸如平衡)之后，可以将交联的大分子基质微粒化或均化。例如，该颗粒化或均化过程可以通过能够将块体水凝胶研磨、挤出、切碎、切割、剪切或造粒成较小单元的任何加工步骤来进行。该颗粒化步骤可以在潮湿(过度水合、不足水合或平衡水合)或干燥(冻干、脱水或沉淀)的水凝胶材料上进行。该微粒化步骤可以设计成能够通过针头注射最终组合物。

在示例性的实施方案中，用于均化交联大分子基质的颗粒化步骤是通过筛网挤出。用于使基质颗粒化的筛网可以根据期望颗粒的大小具有任何合适的孔径。在一些实施方案中，筛网可具有约10微米至约500微米、约40微米至约100微米或约50至约70微米的孔径。可以使用能够产生足够的力或压力的任何技术将组合物通过该筛网挤出一次或多次。

在一些实施方案中，最终组合物可以是微凝胶的团聚集合，该微凝胶在聚合反应期间(例如在诸如微乳液聚合等过程中)以其最终大小或接近其最终大小产生。备选地，在从块体水凝胶衍生之后，可以使用上述任何微粒化或均化方法将微凝胶大小调整为其最终尺寸。

在一些实施方案中，水凝胶组合物或颗粒化制剂可通过透析进行处理以用于灭菌、进一步纯化、盐或离子交换或其他目的。可以通过在水凝胶和另一种液体之间放置半透膜以允许水凝胶和液体交换可在膜之间通过的分子或盐来进行透析。可以针对缓冲溶液或无菌缓冲溶液进行透析。

在优选的实施方案中，缓冲溶液可以是无菌磷酸盐缓冲盐溶液，其可以包含磷酸盐缓冲液、氯化钾和氯化钠。因此，当透析完成时，水凝胶的液体组分相对于人生理流体可以是基本上等渗的。

在一些实施方案中，在选定的合成或加工步骤后，将组合物冻干(冷冻干燥)成脱水粉末，以用于储存、运输、灭菌或进一步加工。在某些实施方案中，用任何水性流体将冻干的组合物再水化，该水性流体包括但不限于水、盐水或离子溶液、相对于人生理流体的等渗溶液、人血浆或其他血液组分、含有或不含细胞的细胞生长或保存培养基，或者可包含药物、蛋白质治疗剂、核酸治疗剂、细胞、纳米颗粒或微粒的任何其他生理相关的溶液。

在一些实施方案中，一个乃至所有合成和/或加工步骤可以在无菌条件下进行，包括反应前溶液的无菌过滤、无菌操作以及无菌平衡或透析缓冲液的使用。在组合物的制备和加工期间，包括在冻干期间和之后，可以使用专门的过滤器、屏障和容器。

在一些实施方案中，组合物可以在被包装到其最终容器(诸如预充式注射器)中之前或之后进行最终灭菌。最终组合物可以采取冻干粉末或基质的形式，或者可以采取含水量低于、等于或高于其平衡含水量的水合凝胶制剂的形式。

材料特性

粘弹性或流变特性的测量可以量化或预测特定制剂的临床效用，例如水凝胶组合物是否可以通过针头注射、涂抹在表面或组织上，或者预期在注射或植入人体后产生支持性的组织模拟结构。在一些实施方案中，可注射组合物特别期望用于非侵入性临床应用，其可包括药物贮库、生物制剂或赋形剂、细胞保护支架或细胞外基质模拟材料或者美容或重建程序。

在某些实施方案中，水凝胶组合物可表现出约1Pa至约10,000Pa、约50Pa至5,000Pa、约100Pa至约1000Pa、约200Pa至约600Pa的储能模量或G′值，或者由这些值中的任何值所界定或在这些值中的任何值之间的范围内的任何值。

在某些实施方案中，水凝胶组合物可表现出约1Pa至约1000Pa、约5Pa至约1000Pa、约10Pa至约200Pa、约20Pa、约50Pa、约100Pa的损耗模量G″值，或者由这些值中的任何值所界定或在这些值中的任何值之间的范围内的任何值。

在某些实施方案中，水凝胶组合物可表现出约0.01至1.5、约0.05至0.5、约0.07至0.4、约0.1的tanδ值(定义为特定组合物在特定条件下的G″/G′)，或者由这些值中的任何值所界定或在这些值中的任何值之间的任何值或范围。在示例性的实施方案中，在振荡应变扫描流变实验期间，tanδ值通常在约1％的应变和约10rad/s的恒定角频率下记录。

在某些实施方案中，水凝胶组合物可表现出约30％至约10,000％、约50％至约2000％、约70％至约1500％，或者约100％、约400％、约700％或约1200％的交叉应变值(也称为“xStrain”或当tanδ＝1时并进一步定义为当G″＝G′时的应变)，或者由这些值中的任何值所界定或在这些值中的任何值之间的任何值或范围。在示例性的优选实施方案中，在振荡应变扫描流变实验期间记录的交叉应变值大于100％。

在一些实施方案中，当通过以100mm/分钟的速度移动装有水凝胶的1mL注射器的柱塞约10mm迫使水凝胶通过30G针头注射器，并在稳定后测量平均力时，水凝胶组合物可具有约15N至40N或约30N的平均挤出力。

在一些实施方案中，水凝胶组合物还可以包含液体。例如，组合物可以吸收水性液体从而形成水凝胶。水性液体可以包括其中溶解有盐的水，诸如磷酸盐缓冲液、氯化钠、氯化钾等。在一些实施方案中，水性液体可以包含水、浓度约100mM至约200mM的氯化钠、浓度约2mM至约3mM的氯化钾和浓度约5mM至约15mM的磷酸盐缓冲液，其中该液体的pH为约7至约8。

在一些实施方案中，被称为“两性离子融合”的现象可能有助于所公开组合物的材料或流变特性。两性离子融合可以整合强水合作用、分子间两性离子对吸引力以及侧链和主链酰胺之间的氢键以促进某些两性离子材料的独立于时间的自修复，如Jiang等人,Biomaterials,35,2014,3926和Jiang等人,Advanced Materials.30,2018,1803087所述。

在一些实施方案中，任何类型的物理相互作用，包括离子相互作用、氢键、疏水相互作用、与天然或合成来源的生物分子或纳米颗粒的相互作用或者任何其他可逆或不可逆的物理相互作用都可能有助于所公开组合物的材料或流变特性。

产物和应用

真皮填充剂

一些实施方案可以包括软组织填充物产物；例如，可注射的真皮或皮下填充剂。包含水凝胶组合物的填充剂可以是适于注射到人体组织中以改善软组织的美学质量的任何种类的填充剂，诸如真皮填充剂、隆胸或重建填充剂、唇部填充剂或适于其他软组织修复或增强的填充剂。

一些实施方案包括包含装有水凝胶组合物的注射器和针头的包装产物。注射器可以包装或装配有适于将水凝胶注射到感兴趣的软组织中的任何大小的针头，诸如具有约#25、约#27或约#30规格的针头。注射器可以包含各种配件或附件以促进符合人体工程学、安全和良好控制的注射技术，其可以包括延长的指形法兰、扩大的柱塞杆、颜色编码的包装或者诸如橡胶化、弯曲或凹槽的几何形状或注射器特征的其他组件。

如果包含水凝胶组合物的组织填充剂可以在没有不合理困难的情况下注射到感兴趣的软组织中(包括在正常手动压力和平滑挤出平台下，可从具有低至约30G或约25G规格的插管分配的填充剂)，则其可能适于注射。

药物递送

在一些实施方案中，包含交联的聚两性离子和多糖组分的水凝胶组合物可以补充或掺入具有美容或治疗效用的一种或多种添加剂，诸如局部麻醉剂、肽、核酸、蛋白质、其他生物分子、纳米颗粒、微粒、胶束、脂质体、聚合物囊泡、药物、药物前体或其他药理学或生化活性物种。

在一些实施方案中，水凝胶组合物可用于向受试者提供美容剂的递送机制，包括使受试者接触所公开组合物的实施方案，其中该组合物包含交联的聚两性离子和多糖组分以及任选地有效量的美容剂(例如，防腐剂、维生素、激素、抗炎剂、抗生素、保湿剂、抗粉刺剂(过氧化苯甲酰、维甲酸、红霉素和其他抗生素、壬二酸、亚油酸、水杨酸、激素、果酸、氧化锌)、抗过敏剂或抗湿疹剂(类皮质激素、抗组胺剂、局部麻醉剂)、紧致剂(维甲酸、抗生素，包括米诺环素、多西环素、甲硝唑、壬二酸)、抗褥疮(bedsore)剂或抗褥疮(decubitus)剂(D-泛醇、抗生素、抗炎药、复肥乳膏基质(re-fattening cream base))或者抗炎剂(抗生素、抗真菌剂、抗组胺药、免疫抑制剂、类皮质激素、洋甘菊、金盏花、D-泛醇)或治疗物种)。

细胞和组织工程

在另一方面，提供了一种包含水合或冻干形式的水凝胶组合物的产物，该水合或冻干形式创造了适于离体细胞或组织培养、可注射细胞治疗制剂组分或该两者的细胞或组织培养支架。

在一些实施方案中，所提供的水凝胶组合物包含用于细胞或组织培养和扩增应用的全部或部分生物相容性材料；例如，在小型或大型环境以及任何容器或生物反应器中作为支架、基质或其他生长基质，特别是当必须控制细胞生长或分化时，当期望在没有分化或表型变化的情况下进行扩增时，或者当细胞和支架或基质材料必须通过基于大小的洗涤而无需任何额外试剂进行分离时。

在一些实施方案中，所提供的水凝胶组合物包含用于细胞或组织储存或保存应用的生物相容性材料组合物；例如，作为防腐添加剂、制剂、支架、基质、表面涂层、冷冻保护剂或类似应用。

所提供的水凝胶组合物可用作细胞、组织或器官的生长、维持或扩增的支架、基质或其他基质，其中生物材料和水凝胶组合物的构建体可以使用任何培养或维护方法或设备(包括任何类型的生物反应器)进行维护，并且可以源自谱系，包括但不限于：

(a)多能和专能干细胞和祖细胞，包括(1)胚胎干细胞(ESC)、组织来源的干细胞(例如，来自皮肤、血液或眼睛)、源自或纯化自脐带血或骨髓的造血干细胞和祖细胞(HSPC)、间充质干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)，(2)转基因或转染的干细胞和祖细胞；以及(3)癌症干细胞(CSC)；

(b)通常在人血液中循环的造血细胞，包括红细胞(红血球)、白细胞(白血球)和血小板(凝血细胞)；

(c)免疫细胞和祖细胞或其分化谱系，包括(1)表达CD8表面糖蛋白的T细胞，特别是包括初始细胞毒性T淋巴细胞(CTL或T_C)及其分化或激活的谱系，包括中央记忆(T_CM)T细胞；(2)表达CD4表面糖蛋白的T细胞，特别是包括初始辅助T淋巴细胞(T_H0)及其分化或激活的谱系，包括T_H1、T_H2、T_H9、T_H17、T_FH、T_REG和中央记忆T细胞(T_CM)；(3)来自任何来源的调节性T细胞(T_REG)，无论是天然Treg还是诱导Treg；(4)自然杀伤T细胞(NKT细胞)；(5)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)；以及(6)基因修饰T细胞；(6)B细胞；(7)树突状细胞，以及(8)上面未具体列出的其他抗原呈递细胞(APC)或免疫细胞；

(d)用于治疗和管理糖尿病的胰岛或其他产生胰岛素的细胞和β细胞；

(e)神经系统细胞和祖细胞；

(f)心血管系统细胞和祖细胞；以及

(g)其他细胞，特别是在免疫疗法、再生医学、血液病或恶性肿瘤、癌症疫苗或治疗领域有用的细胞。

(h)组织，包括肌肉(骨骼肌、平滑肌、心肌、包括血管在内的脉管系统)、神经组织(外周神经组织、中枢神经组织，包括由星形胶质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞、少突胶质细胞、卫星细胞或施万(Schwann)细胞等神经胶质细胞组成的组织)、结缔组织(软骨、弹性软骨、纤维软骨、骨组织、白色脂肪组织、棕色脂肪组织、筋膜、血液)、皮下组织或上皮组织(鳞状上皮、立方上皮、柱状上皮、复层上皮、假复层上皮、变移上皮)；

(i)器官，包括肾脏、心脏、脑(大脑、大脑半球、间脑)、脑干(中脑、脑桥、延髓、小脑、脊髓、脑室系统、脉络丛)、食道、咽、唾液腺(腮腺、下颌下腺、舌下腺)、胃、小肠(十二指肠、空肠、回肠)、大肠、肝脏、胆囊、胰腺、鼻(鼻腔、咽、喉、气管、支气管、肺)、输尿管、膀胱、尿道、动脉、静脉、毛细血管、淋巴管、淋巴结、骨髓、胸腺、脾脏、肠道相关淋巴组织(扁桃体)、眼睛、耳朵、嗅觉上皮、舌头或皮肤。

所提供的水凝胶组合物可用作用于保存细胞或组织或保留其生物学功能以用于临床或军事用途的任何方法的生物相容性材料、支架、制剂组分或接触材料，特别是用于使用传统方法难以在室温或低温下、在全血或保存溶液中，以及在存在或不存在DMSO、甘油、甘氨酸甜菜碱或其他渗透剂或冷冻保护剂的情况下长时间保存的细胞类型，诸如血细胞(例如，血小板和红细胞)。

其他应用

在一些实施方案中，水凝胶组合物可用于提供具有非牛顿特性(例如，表现出粘弹性、流变、触变、剪切增稠(膨胀)、剪切稀化(假塑性)和/或宾汉(Bingham)塑性特性)的材料或产物。

在一些实施方案中。水凝胶组合物可用于提供自修复材料和/或形状记忆材料，或者在损坏或外部刺激后能够修复损坏或恢复其特性的相似类别的“智能”材料。

在一些实施方案中，水凝胶组合物可用于提供防污材料或表面涂层，以防止非特异性蛋白质或其他生物分子吸附(例如，用于海洋应用、药物递送平台、生物传感器和其他医疗装置、血管移植物、血管内支架、心脏瓣膜、关节置换以及其他与生理环境接触的材料和装置)。

在一些实施方案中，水凝胶组合物可用于提供用于诸如外科手术程序或伤口愈合等生物医学应用的可注射或可涂抹材料。

在一些实施方案中，水凝胶组合物可用于提供用于生物医学应用，特别是在需要非牛顿流体特性和高生物相容性的应用的可注射或可涂抹材料，诸如(a)能够提供机械支撑的可注射或可涂抹材料，例如用于美容或重建手术、血管假体、皮肤修复装置、耳蜗替代品、可注射玻璃体物质、人造软骨、人造脂肪、胶原模拟物和其他软组织模拟物或支持物的可注射或可涂抹材料；(b)与表面或组织具有期望或特定的生物相互作用(特别是在应避免非特异性相互作用或必须实现非特异性/特异性相互作用的期望平衡时)的可注射或可涂抹材料；以及用于递送和/或保护或屏蔽药物、生物分子(例如，核酸、肽、蛋白质、多糖)、细胞(例如，胰岛、心血管细胞、干细胞、免疫细胞、血细胞)、纳米颗粒或微粒(例如，PLGA/药物制剂)、胶束、脂质体、聚合物囊泡或其他治疗物种或药物递送方式的可注射或可涂抹载体，以用于外科应用、治疗应用、伤口愈合和药物递送制剂。

实施例

出于说明而非限制本发明的目的提供以下实施例：

分析方法的实施例

实施例1-组合物的总聚合物浓度的测定

为了测定每个水凝胶组合物的总聚合物浓度，将已知体积的水合凝胶的重量与干燥或冻干后的相同样品的重量进行比较。例如，称量1mL凝胶样品并通过例如以下过程干燥：1)在诸如乙醇的有机溶剂中沉淀，然后真空干燥；或2)在液体N₂中快速冷冻，然后在-54℃和0.04托(Torr)下冻干。也以相同方式称重和干燥含有存在于组合物中的任何其他添加剂的适当缓冲液的溶液以计算凝胶的盐含量。通过将干重除以湿体积来计算凝胶的总固体含量得出以mg/mL为单位的值(假设湿凝胶的密度为1g/mL)。然后从该值中减去盐固体和任何其他添加剂的含量以确定水凝胶组合物中的总聚合物浓度。

实施例2-组合物的流变学表征

组合物的流变测量如下进行。配备有用于温度控制的珀耳帖板(Peltier plate)和平行板几何形状(直径20-mm，板间间隙距离为800μm)的TA仪器DHR-2流变仪用于所有测量。振荡模式用于所有实验。在每个实验中，在每个测量点记录G′、G″、复数粘度(η)和tanδ(G″/G′)。弹性模量(G′)根据组合物对弹性变形的物理阻力来描述水凝胶强度。粘性模量(G″)根据组合物对粘性变形的物理阻力来描述水凝胶强度。

在典型的水凝胶表征实验中，在2分钟的样品平衡时间后，在25℃下进行振荡频率扫描，应变(γ)恒定为1％，频率范围为0.1-100rad/s，频率呈对数增加。在2分钟的样品平衡时间后，在25℃下进行振荡应变扫描，频率恒定为10rad/s，应变范围为0.1％至1000％，应变呈对数增加。

还进行了一些组合物的酶促或蛋白水解降解的流变学跟踪。在这些实验中，将在适当缓冲液中的50μL 25mg/mL酶溶液(即，透明质酸酶)添加到1000μL水凝胶组合物中，并轻轻机械混合10秒以将酶分散到整个组合物中。然后将组合物转移到流变仪中，在30秒内测量G′和G″的五个实例(1％应变，10rad/s)，然后休息5分钟。重复该序列直至G′<(0.1)*G′_初始。在这些条件下，完全降解通常需要2至10小时。从代表性的实验获得的数据如图5所示。

实施例3-组合物的挤出测试

为了测定通过类似于组合物的一些实施方案的典型产物的注射器和针头组合挤出凝胶所需的力，将凝胶装载到附着至1/2”30G TSK或Terumo鲁尔锁(Luer-lock)针头的1mL BD Hylok玻璃注射器中。然后，使用Instron 5543A机械测试仪器，将注射器柱塞以100mm/分钟的速度推动约10mm或直至达到明显的力平台。记录每个柱塞位置施加的力的分布。在典型的制剂中，从4至10mm的平均挤出力为25-40N。

合成和加工方法的实施例

实施例4-甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的透明质酸的制备方法

在组合物的一些实施方案中，将透明质酸钠(HA)用甲基丙烯酸酯基团修饰或官能化以制备甲基丙烯酸酯化的HA(MeHA)，以促进随后与聚两性离子组分(单体或聚合物)的交联反应。在示例甲基丙烯酸化反应中，将500mg HA溶于50mL纯水中，添加1.8克四丁基溴化铵(TBAB)、1.8mL三乙胺(TEA)和1.8mL甲基丙烯酸缩水甘油酯并搅拌混合。在磁力搅拌下，使反应在25℃下进行18小时，然后在60℃下进行1小时。将产物在丙酮中沉淀3次，然后用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)或其他水性缓冲液透析2天，每天更换两次透析缓冲液。然后将纯化的MeHA产物在-54℃和0.04托下冻干。

实施例5-可注射组合物的制作方法(一锅法)

在示例组合物中，通过在pH 7.4的0.9wt％(150mM)缓冲盐水溶液中溶解1MDaMeHA(10mg/mL)、CBAA(20mg/mL)和光引发剂2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(I2959，0.5mg/mL)(I2959，0.5mg/mL)来产生甲基丙烯酸酯化的透明质酸钠(MeHA)和羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)单体的反应前溶液。使该反应前溶液在黑暗中平衡长达60分钟，直到均匀混合。

然后将反应前溶液浇铸到例如具有医用级PDMS垫圈的1mm厚的硼硅酸盐玻璃模具中，并在UVP CL-1000M交联炉中聚合(15分钟，1J/cm²，302nm)。将所得水凝胶从模具中移除并置于无菌磷酸盐缓冲盐水(150mM)中2-5天，以去除任何未反应的组分并使其溶胀。然后将平衡的凝胶转移到由一段钢筛网覆盖的由紧密配合的活塞和气缸组成的挤出装置中，并通过筛网挤压形成微粒。该筛网挤出或凝胶颗粒化过程通常重复使用渐减孔径的筛网；例如，250μm，120μm，然后60μm。在使用的最终筛网大小下，将组合物挤出至少三次以提高颗粒化凝胶大小的均匀性。将颗粒化凝胶在70％乙醇/30％水中沉淀，然后(1)真空干燥或(2)用水或缓冲液再水化，并在-54℃和0.04托下冻干。然后将干燥的颗粒化凝胶用无菌注射用水(WFI)再水化至期望的聚合物浓度，并在无菌条件下分配到注射器中通过如上所述的流变分析和注射器挤出力测试表征最终组合物。

下面的表1示出了与以此方式制备的示例制剂的合成和表征相关的数据。在该实施例中，反应前溶液中每种组分的浓度保持恒定，并且最终组合物中的总聚合物浓度在33mg/mL和100mg/mL之间变化。示出了对每个样品进行测量的流变数据。

表1

实施例6-双交联(BDDE和聚两性离子)透明质酸组合物的制备方法

在一些实施方案中，在与一些实施方案中的聚两性离子组分交联或反应之前、期间或之后，将透明质酸钠(HA)或甲基丙烯酸酯化的HA(MeHA)与1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)或其他双环氧化物化合物交联。为了制备BDDE交联的HA或MeHA，将1g HA或MeHA溶解在7g 0.25M NaOH中直至完全溶解。然后，添加在0.2g的0.25M NaOH溶液中的50mg BDDE，并使反应在50℃下搅拌进行2小时。在该反应的最后1小时内，将两性离子单体(例如，CBAA)和光引发剂(例如，2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(I2959，0.5mg/mL)添加至反应混合物至期望浓度。当BDDE交联反应完成后，将含有两性离子单体和光引发剂的交联材料转移到玻璃铸模或其他容器中，并在交联炉中暴露于UV辐射下(15分钟，1J/cm²，302nm)。将双交联材料通过筛网进行颗粒化并在有机溶剂中沉淀或冻干。

实施例7-组合物和中间产物的冻干方法

组合物的冻干或冷冻干燥是储存、运输和将它们恢复到期望水合水平的实用方法。虽然重要的是要注意在某些条件下冻干多糖基制剂可能导致分子量降低或结构损坏，但组合物的一些实施方案的聚两性离子组分可在该过程中提供一定保护。该效果也可通过两性离子材料的特别强的水合作用来增强。如果组合物的制剂保留以下特性中的一个或优选所有特性：透明度、均匀性、水合能力和流变学属性，则确定它是“冻干稳定的”。

尽管已经说明和描述了说明性实施方案，但是应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在其中进行各种改变。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的所有表示成分数量、性质(诸如分子量、反应条件等)的数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。如本文所用，术语“约”是指指定值的±5％。因此，除非另有说明，否则说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是可根据寻求获得的期望特性而变化的近似值。至少，而不是试图将等同原则的应用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一”、“一个”、“该”以及类似指代应被解释为涵盖单数和复数。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明并且不对任何权利要求的范围构成限制。说明书中的任何语言均不应被解释为表示对于本发明的实践必不可少的任何未要求保护的元素。

Claims

1.一种包含多个聚两性离子组分(Z*)和多糖基组分(C*)的水凝胶组合物，其中一个或多个所述Z*和所述C*组分通过一种或多种类型的化学或物理缔合或键连接。

2.如权利要求1所述的组合物，如以下结构所示：

其中，

所述C*表示多糖组分；

C₂是所述多糖组分的一部分，包含由一个或多个化学或结构修饰修饰的多糖或多糖盐的一个或多个结构单元，并且通过连接组分X₁连接至所述聚两性离子组分Z*；

m是从1至约10,000的整数，描述代表性多糖基组分C*的分子量，其可以是每组分C*重复m次的C₁和C₂结构单元的随机或结构化组合；

X₁是将所述多糖基组分连接至所述聚两性离子组分的化学或物理缔合或键；

所述Z*表示所述聚两性离子组分；

Z₂是所述聚两性离子组分的一部分，其可沿聚合物主链、在一个或多个聚合物链末端存在，或者并入聚合物侧链中，包含两性离子聚合物或低聚物的一个或多个结构单元，通过所述连接组分X₁连接至所述多糖组分C*；

n是从1至约10,000的整数，描述代表性聚两性离子组分Z*的分子量或聚合度，其可以是每组分Z*重复n次的Z₁和Z₂结构单元的随机或结构化组合；

R₁和R₂是聚两性离子(Z_n)、多糖基(C_m)性质或任何其他性质(N)的其他组分，其可通过连接组分X₂或X₃连接至任何代表性所述C*或所述Z*；或者为空。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚两性离子组分基本上包括聚羧基甜菜碱、聚磷酰胆碱、聚磺基甜菜碱、聚磷酸甜菜碱、聚N-氧化物或聚四氢嘧啶，包括其官能化衍生物、共聚物或药学上可接受的盐。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚两性离子组分基本上包括聚羧基甜菜碱，包括其官能化或酯化衍生物、共聚物或药学上可接受的盐。

5.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚两性离子组分包括基于氨基酸或氨基酸衍生物的聚合物或共聚物，包括肽、类肽或基于氨基酸单体的丙烯酰衍生物的聚合物。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚两性离子组分包括具有阳离子和阴离子重复单元的基本上电中性的共聚物(混合电荷共聚物)或具有等效功能(即，亲水行为和高生物相容性)的其他聚合物。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚两性离子组分包括共聚物或两种混合聚合物的组合，包含任何所提及的两性离子重复单元以及聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚甲基丙烯酸酯(PMA)、聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸(PMAA)、聚甲基丙烯酸2,3-二羟丙酯(PDHPM)、聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)、聚噁唑啉(POZ)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其衍生物的亲水重复单元。

8.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚两性离子组分的水合源自与水分子的静电诱导相互作用和/或与水分子的氢键缔合。

9.如权利要求1所述的组合物，其中所述R₁、所述R₂、所述X₁或所述N组分基本上包括基本上基于聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚甲基丙烯酸酯(PMA)、聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸(PMAA)、聚甲基丙烯酸2,3-二羟丙酯(PDHPM)、聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)、聚噁唑啉(POZ)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)或其衍生物的亲水重复单元的聚合物、共聚物或低聚物。

10.如权利要求1所述的组合物，其中所述多糖组分基于天然或化学修饰的琼脂、藻酸盐、卡拉胶、纤维素、壳聚糖、甲壳素、环糊精、葡聚糖、结冷胶、糖原、糖胺聚糖、刺梧桐胶、菊粉、果胶、聚葡萄糖、黄原胶或任何其他淀粉、树胶或其他多糖，包括其官能化衍生物、糊精化、水解、氧化、烷基化、羟烷基化、乙酰化、分馏和物理修饰的淀粉及其任何药学上可接受的盐。

11.如权利要求1所述的组合物，其中所述多糖组分基于糖胺聚糖。

12.如权利要求1所述的组合物，其中所述多糖组分基于透明质酸(HA)或任何其药学上可接受的透明质酸盐，带有或不带有不同程度的化学修饰。

13.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚两性离子组分的一部分通过沿聚合物主链、在聚合物末端存在或者并入所述聚两性离子组分或其共聚物的聚合物侧链中的化学官能度而化学交联至所述多糖基组分。

14.如权利要求1所述的组合物，其中所述多糖组分用能够参与共价交联反应的化学基团修饰。

15.如权利要求1所述的组合物，其中所述多糖组分用诸如甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺或丙烯酰胺基团的能够参与自由基介导的聚合反应的化学基团修饰。

16.如权利要求1所述的组合物，其中所述多糖组分用能够参与诸如炔-叠氮或硫醇-烯反应的“点击(click)”型反应的化学基团修饰。

17.如权利要求1所述的组合物，其中所述多糖组分是双交联的。

18.如权利要求1所述的组合物，其中所述多糖或所述聚两性离子组分先交联至其他多糖或聚两性离子组分，然后进一步交联至聚两性离子、多糖或其他组分。

19.如权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶组合物中所述聚两性离子组分与所述多糖基组分的重量比为约0.001至约1000。

20.如权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶组合物中所述聚两性离子组分与所述多糖基组分的重量比为约0.03至约100。

21.如权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶组合物中所述聚两性离子组分与所述多糖基组分的重量比为约0.1至约10。

22.如权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶组合物在指定的水合度下具有约10mg/mL至300mg/mL的总聚合物浓度。

23.如权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶组合物在指定的水合度下具有约20mg/mL至100mg/mL的总聚合物浓度。

24.如权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶组合物还可以包含一种或多种附加的试剂，诸如提供治疗、防腐、材料或美容效用的药物或添加剂。

25.如权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶组合物可以补充或掺入具有美容或治疗效用的一种或多种添加剂，诸如局部麻醉剂、肽、核酸、蛋白质、其他生物分子、纳米颗粒、微粒、胶束、脂质体、聚合物囊泡、药物、药物前体或其他药理学或生化活性物种。

26.如权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶组合物包含未交联或以其他方式化学键合至网络的交联主体的附加的聚两性离子和/或多糖组分，用于包括粘度调节或促进局部麻醉剂递送的目的。

27.如权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶组合物以水合或干燥形式提供，包括通过沉淀或冻干获得的形式。

28.如权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶组合物包含适于增加或替换丢失或损坏的组织，或者用于提供另一种美容或再生功能的可注射材料。

29.如权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶组合物包含适于用作细胞或组织培养支架、细胞保存方法、细胞储存方法、可注射细胞疗法制剂的组分或者用于组织工程或基于细胞的治疗的另一方面的材料或添加剂。

30.如权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶组合物包含含有药物或生物分子的可注射材料制剂，所述药物或生物分子适于形成药物贮库或用于程序化释放所述药物或生物分子的其他此类保护性或稳定化环境。

31.如权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶组合物可以包含如上所述的微米级水凝胶(微凝胶)以及相同或不同组合物的连续水凝胶或聚合物相。

32.如权利要求1所述的组合物，其中：

所述组合物可以被部分或完全降解成比包含原始组合物的物种分子量更低的物种；

并且与仅由所述组合物的天然存在形式的所述多糖基组分组成的参照水凝胶材料相比，所述组合物表现出延迟或降低的降解速率。

33.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的部分或完全降解可由透明质酸酶类的酶催化，并且所述组合物的所述多糖基组分源自透明质酸。

34.一种制备如权利要求1所述的水凝胶组合物的方法，包括以下步骤：

(a)将反应前组分溶解或悬浮在溶液或混合物中以形成反应前溶液，所述反应前组分包括：

两性离子单体或聚合物，包括官能化或酯化衍生物、共聚物或带电单体或聚合物的基本上电中性的组合；以及

化学修饰或天然的多糖或交联的多糖基网络，包括基于透明质酸的多糖或交联的多糖基网络；以及

(b)将此类反应前溶液或混合物暴露在适于引发形成期望组合物的反应的条件下。

35.如权利要求34所述的制备水凝胶组合物的方法，其中所述反应前组分还包括选自以下的至少一种组分：(a)用于控制水性反应缓冲液的pH、渗透强度或其他特性的分子或盐，(b)用于控制聚合反应速率或动力学的分子或盐，以及(c)在合适的引发条件下能够产生自由基的分子。

36.如权利要求34所述的制备水凝胶组合物的方法，其中所述反应前组分还包括选自以下的至少两种组分：(a)用于控制水性反应缓冲液的pH、渗透强度或其他特性的分子或盐，(b)用于控制聚合反应速率或动力学的分子或盐，以及(c)在合适的引发条件下能够产生自由基的分子。

37.如权利要求34所述的制备水凝胶组合物的方法，其中所述反应前组分还包括以下中的每一种：(a)用于控制水性反应缓冲液的pH、渗透强度或其他特性的分子或盐，(b)用于控制聚合反应速率或动力学的分子或盐，以及(c)在合适的引发条件下能够产生自由基的分子。

38.如权利要求34所述的制备水凝胶组合物的方法，其中所述反应前溶液或任何中间体或最终制剂的pH、盐度、溶剂和缓冲物种中的任何一种或多种是变化的。

39.如权利要求34所述的制备水凝胶组合物的方法，其中将反应后水凝胶组合物在具有期望pH、盐度、溶剂含量和缓冲物种含量的水溶液中平衡约一小时至两周的时间，以使水凝胶溶胀至平衡状态。

40.如权利要求34所述的制备水凝胶组合物的方法，其中将所述组合物或组合物组分用具有期望pH、盐度、溶剂含量和缓冲物种的任何水溶液或一组溶液透析约一小时至两周的时间，以使任何未反应或小分子组分扩散或透析以将它们从所述水凝胶组合物中去除。

41.如权利要求34所述的制备水凝胶组合物的方法，其中一个或多个合成或加工步骤在灭菌或无菌条件下或使用无菌试剂、工具、容器或缓冲液进行。

42.如权利要求34所述的制备水凝胶组合物的方法，其中作为任何合成或制备加工步骤的一部分，将所述组合物冻干。

43.如权利要求34所述的制备水凝胶组合物的方法，其中作为任何合成或制备加工步骤的一部分，将所述组合物沉淀成溶剂或油。

44.如权利要求34所述的制备水凝胶组合物的方法，其中作为任何合成或制备加工步骤的一部分，将所述组合物浓缩。

45.如权利要求34所述的制备水凝胶组合物的方法，其中在制剂或包装之前、期间或之后对所述组合物进行灭菌。

46.如权利要求34所述的制备水凝胶组合物的方法，其中所述包装的水凝胶组合物可以采取冻干、沉淀或干燥的粉末或基质的形式。

47.如权利要求34所述的制备水凝胶组合物的方法，其中所述包装的水凝胶组合物可以采取含水量低于、等于或高于其平衡含水量的水合大分子基质的形式。

48.一种增加、支持、增强或替换人或动物受试者的软组织的方法，所述方法包括：

将水凝胶组合物引入受试者，其中所述水凝胶组合物包含水相和大分子网络，所述大分子网络包含

聚两性离子组分；

多糖基组分；

以及连接所述聚两性离子和所述多糖组分的交联组分。

49.如权利要求45所述的方法，其中注射的所述组合物旨在赋予所述受试者美学、美容或重建益处。

50.一种将具有治疗或美容效用的药物或其他添加剂递送至受试者的方法，所述方法包括：

将制剂引入受试者，所述制剂包括

如权利要求1所述的水凝胶组合物；以及

药物、添加剂、药物组合、药理学活性物种或生化活性物种，选自局部麻醉剂、肽、蛋白质、抗体、核酸、生物分子、纳米颗粒、微粒、胶束、脂质体、聚合物囊泡、药物前体、前药、基于细胞的治疗剂或其他。

51.如权利要求47所述的方法，其中所述组合物是注射的。

52.一种培养细胞、组织或器官的方法，所述方法包括：

制备细胞或组织培养支架、基质或介质，包括

如权利要求1所述的水凝胶组合物，

以及期望体外培养的细胞、组织或器官的任何组合。

53.一种储存、保存或运输细胞、组织或器官的方法，所述方法包括将如权利要求1所述的水凝胶组合物与任何细胞、组织或器官缔合或组合。

54.一种通过外科手术修复、保护、保存或保护人体任何组织、器官或其他部分的方法，所述方法包括向需要外科手术干预的身体部分施用如权利要求1所述的水凝胶组合物，作为外科手术程序的一部分。

55.如权利要求1所述的水凝胶组合物在制造用于美学或重建程序或治疗的可注射真皮或其他组织填充剂中的用途。

56.如权利要求1所述的水凝胶组合物在制造用于递送治疗剂、细胞、生物剂或用于医学治疗的其他化学或生物物种的可注射组合物中的用途。

57.如权利要求1所述的水凝胶组合物在制造用于基于细胞的疗法治疗的细胞或组织培养制剂中的用途。

58.如权利要求1所述的水凝胶组合物在制造用于癌症的免疫疗法治疗中的用途。