CN113827779B - 一种生物多糖水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物多糖水凝胶及其制备方法和应用。本发明的生物多糖水凝胶是由两剂混合反应而成，第一剂是侧链具有醛基的多糖衍生物溶液，第二剂是主链或侧链具有伯氨基的多糖衍生物溶液，或是具有两个或两个以上的伯氨基的小分子化合物溶液。本发明的制备方法，包括第一剂侧链具有醛基的多糖衍生物溶液和第二剂具有两个或两个以上的伯氨基的小分子化合物溶液或主链具有伯氨基的多糖衍生物溶液或侧链具有伯氨基的多糖衍生物溶液的制备，再将其分别装入无菌双联注射器的A管和B管中，经注射器推出混合，第一剂和第二剂液体混合反应形成透明的生物多糖水凝胶。本发明提高了多糖水凝胶的抗生物降解性以及对视网膜的有效顶压时间，可以作为玻璃体替代物应用。

Description

一种生物多糖水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种眼科医用生物材料，特别是涉及一种生物多糖水凝胶及其制备方法和作为玻璃体替代物的应用。

背景技术

眼球内的玻璃体是填充于晶状体和视网膜之间的一种无色透明胶状体，占据超过2/3的眼球体积，主要成分包括水、胶原蛋白、透明质酸、蛋白多糖等，其中水约占玻璃体的99%。透明质酸与胶原蛋白相互作用，并与水形成结合状态，使玻璃体处于稳定状态。玻璃体具有高度透明性，允许90%以上的可见光透射。玻璃体在保持眼球形状、调节眼内氧分压、减震缓冲、保持视网膜和晶状体位置等方面发挥重要作用。玻璃体切除手术是用于治疗很多眼科疾病的常见手术，如视网膜病变、视网膜剥离、黄斑裂孔等。玻璃体切除后需要进行玻璃体腔填充，将玻璃体替代物填充在玻璃体腔内，顶压视网膜保持其在正确位置并保持眼球外形，因此玻璃体填充物成为影响手术效果的重要因素。

目前临床上使用的玻璃体替代物主要有气体、硅油、全氟化碳液体等。这些替代物适用于不同手术情况下的玻璃体填充，但仍存在诸多并发症。如气体玻璃体腔填充吸收较快，有效顶压时间短，并需要患者术后保持一定的体位等；全氟化碳液体也存在吸收较快，有效顶压时间4周左右；常用的硅油填充顶压时间长，但不被机体组织吸收，因硅油乳化引起的并发症较多，如青光眼、白内障等并发症，因此硅油需要二次手术移除。目前还没有理想的玻璃体替代物。

作为玻璃体替代物，高度透光性、良好的粘弹性、有效的顶压时间和对眼组织无毒副作用是极为重要的。公布号为CN 102762647 A的发明专利申请公开了一种包括水凝胶聚合物的组成物，该水凝胶聚合物包含氧化透明质酸和二酰肼，其中二酰肼与氧化透明质酸交联，形成透明无色、从液态转变成胶体，作为眼球玻璃体替代物。公布号为CN 110652610A的发明专利申请公开了一种高内聚双重交联人工玻璃体的成套原料，其第一组分为醛基化透明质酸，其醛基化透明质酸即氧化开环透明质酸，第二组分为氨基化透明质酸，第一剂与第二剂混合交联制备出高内聚双重交联人工玻璃体。上述两项发明专利申请，其共同特点是使用氧化开环的透明质酸作为醛基供体，与二酰肼或双氨基交联形成凝胶。

公布号为CN 105833344 A的发明专利申请公开了一种可注射水凝胶在制备眼内填充物中的应用，所述可注射水凝胶由两剂组成，第一剂是含氧化多糖的胶液，第二剂是含甲壳素衍生物和/或胶原蛋白的胶液，通过氧化多糖的双醛基与甲壳素衍生物和/或胶原蛋白的氨基发生交联反应，形成具有粘弹性的水凝胶。

上述现有技术都是采用氧化开环的透明质酸来形成凝胶，而氧化开环会造成透明质酸分子量大大降低，从而导致其在体内降解速度过快，作为玻璃体替代物的有效顶压时间缩短。而作为玻璃体替代物，延长体内降解时间，增加其对视网膜的有效顶压时间极为重要，以确保网膜顶压复位，避免造成网脱。

发明内容

针对上述问题，本发明的第一个目的是提供一种具有高度透光性、良好的粘弹性、降解时间长、有效提高顶压时间和对眼组织无毒副作用的适用于作为玻璃体替代物的生物多糖水凝胶，以弥补现有技术的不足。

本发明的另一个目的是提供一种生物多糖水凝胶的制备方法，以及所述生物多糖水凝胶用于制备玻璃体替代物的应用。

本发明的技术方案，在考虑作为玻璃体替代物的水凝胶的优良透光性、粘弹性、组织无毒性的同时，重点解决延长水凝胶的降解时间问题，以延长对视网膜的顶压时间。

本发明的生物多糖水凝胶是由两剂组成，第一剂是侧链具有醛基的多糖衍生物溶液，第二剂是主链或侧链具有伯氨基的多糖衍生物溶液，或是具有两个或两个以上伯氨基的小分子化合物溶液。

所述的第一剂侧链具有醛基的多糖衍生物，是由侧链接枝邻二羟基的多糖衍生物经氧化形成的侧链具有醛基的多糖衍生物；在控制反应条件下，氧化剂优先氧化多糖侧链的邻二羟基结构形成醛基，但不氧化多糖主链，从而保证了多糖分子不被开环降解，保持了多糖主链的完整性；同时，具有侧链接枝结构的多糖衍生物降低了生物酶对多糖的特异性识别，从而提高了多糖衍生物的抗生物降解性。

所述的第二剂主链或侧链具有伯氨基的多糖衍生物，包括主链具有伯氨基的多糖衍生物以及侧链接枝有伯氨基的多糖衍生物；所述的主链具有伯氨基的多糖衍生物，其特征是所述多糖衍生物主链具有伯氨基、同时具有侧链接枝结构；所述的侧链具有伯氨基的多糖衍生物，其特征是所述多糖衍生物的侧链接枝有伯氨基；即主链具有伯氨基的多糖衍生物以及侧链接枝有伯氨基的多糖衍生物，都具有侧链接枝结构，这些侧链接枝结构降低了生物酶对多糖的特异性识别，从而提高了多糖衍生物的抗生物降解性。

当第一剂侧链具有醛基的多糖衍生物溶液，与第二剂主链或侧链具有伯氨基的多糖衍生物溶液混合后发生交联反应，形成水凝胶，一方面由于作为醛基供体的多糖衍生物的主链没有氧化开环，没有分子链的氧化降解，另一方面由于作为醛基供体和氨基供体的多糖衍生物都具有侧链接枝结构，这些侧链接枝结构的存在降低了生物酶对多糖的特异性识别，从而提高了多糖衍生物的抗生物降解性。当第一剂侧链具有醛基的多糖衍生物溶液，与第二剂具有两个或两个以上的伯氨基的小分子化合物溶液混合交联，形成水凝胶，由于醛基供体的多糖衍生物的主链没有氧化开环，没有分子链的氧化降解，同时醛基供体的多糖衍生物具有侧链接枝结构，当醛基供体多糖衍生物与具有伯氨基的小分子化合物发生交联，小分子化合物的交联结构进一步降低了生物酶对多糖的特异性识别，从而提高了多糖衍生物的抗生物降解性。通过提高交联多糖水凝胶的抗生物降解性，从而提高水凝胶对视网膜的有效顶压时间，达到适用于作为玻璃体替代物的目的。

本发明的具体技术方案如下：

一种生物多糖水凝胶，其特征是由两剂混合反应而成，第一剂是侧链具有醛基的多糖衍生物溶液，第二剂是主链或侧链具有伯氨基的多糖衍生物溶液，或是具有两个或两个以上的伯氨基的小分子化合物溶液。

所述第一剂侧链具有醛基的多糖衍生物溶液，多糖衍生物中含有侧链醛基的糖单元占多糖分子总糖单元的百分数为1%～100%，多糖衍生物在溶液中的质量百分浓度为0.5%～15%；所述第二剂主链或侧链具有伯氨基的多糖衍生物溶液，多糖衍生物中含有主链伯氨基或侧链伯氨基的糖单元占多糖分子总糖单元的百分数为1%～100%，多糖衍生物在溶液中的质量百分浓度为0.5%～15%；所述第二剂具有两个或两个以上的伯氨基的小分子化合物溶液，小分子化合物在溶液中的质量百分浓度为0.2%～30%；所述第一剂和第二剂的溶液，其溶剂是无菌水、生理盐水、生理平衡液，或本领域技术人员知道的其它含水的医用液体，如葡萄糖液等。

所述第一剂侧链具有醛基的多糖衍生物，其特征是具有侧链醛基的氨基多糖衍生物或具有侧链醛基的羧基多糖衍生物；所述具有侧链醛基的氨基多糖衍生物或具有侧链醛基的羧基多糖衍生物，是由侧链接枝邻二羟基的氨基多糖衍生物或侧链接枝邻二羟基的羧基多糖衍生物经氧化形成。所述的氨基多糖是具有伯氨基的多糖，包括但不限于羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羧乙基壳聚糖及其它壳聚糖衍生物；所述的羧基多糖，包括但不限于具有羧基结构的壳聚糖衍生物、具有羧基结构的甲壳素衍生物、具有羧基结构的透明质酸或透明质酸衍生物，以及硫酸软骨素、肝素、海藻酸钠；所述的具有羧基结构的壳聚糖衍生物包括羧甲基壳聚糖、羧乙基壳聚糖、琥珀酰壳聚糖及其它具有羧基结构的壳聚糖衍生物，所述的具有羧基结构的甲壳素衍生物包括羧甲基甲壳素、羧乙基甲壳素及其它具有羧基结构的甲壳素衍生物，所述的具有羧基结构的透明质酸和透明质酸衍生物包括透明质酸、羟乙基透明质酸、羟丙基透明质酸、乙酰基透明质酸、丁酰基透明质酸、氨基乙酸透明质酸、氨基丙酸透明质酸、氨基丁酸透明质酸及其它透明质酸衍生物。所述的具有侧链醛基的氨基多糖衍生物，其特征是在氨基多糖的氨基上接枝邻二羟基结构，从而形成侧链邻二羟基结构，邻二羟基经氧化形成醛基，即生成具有侧链醛基的氨基多糖衍生物；所述的具有侧链醛基的羧基多糖衍生物，其特征是在羧基多糖的羧基上接枝邻二羟基结构，从而形成侧链邻二羟基结构，邻二羟基经氧化形成醛基，即生成具有侧链醛基的羧基多糖衍生物。所述氨基多糖或羧基多糖上接枝邻二羟基结构的接枝率，可以通过控制物料比、反应条件进行调节，理论上可以在1～100%。

所述的侧链邻二羟基结构，是在氨基多糖的氨基上或羧基多糖的羧基上接枝具有邻二羟基的结构。为氨基多糖提供邻二羟基结构的化合物是同时具有羧基和邻二羟基的小分子化合物，包括但不限于2,3-二羟基丙酸、2,3,4-三羟基丁酸、葡萄糖酸、苏糖酸、阿拉伯酸、木糖酸、粘酸，以及其它同时具有羧基结构和邻二羟基结构的化合物；氨基多糖与同时具有羧基结构和邻二羟基结构的化合物通过氨基与羧基的缩合反应，使氨基多糖接枝上邻二羟基结构的侧链，形成具有邻二羟基侧链的多糖衍生物。为羧基多糖提供邻二羟基结构的化合物是同时具有氨基结构和邻二羟基结构的小分子化合物，包括但不限于氨基丙二醇、氨基葡萄糖，以及其它同时具有氨基结构和邻二羟基结构的化合物；羧基多糖与同时具有氨基结构和邻二羟基结构的化合物通过羧基与氨基的缩合反应，使羧基多糖接枝上邻二羟基结构的侧链，形成具有邻二羟基侧链的多糖衍生物。具有侧链接枝邻二羟基结构的多糖衍生物，经氧化形成了侧链具有醛基的多糖衍生物。所述侧链邻二羟基结构的氧化可以在控制氧化剂的浓度、时间、温度等条件得到不同醛基含量，理论上可以在1～100%。

所述第二剂主链或侧链具有伯氨基的多糖衍生物，或具有两个或两个以上的伯氨基的小分子化合物，所述的主链具有伯氨基的多糖衍生物，其特征是主链具有伯氨基同时具有侧链接枝结构的多糖衍生物，包括但不限于羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羧乙基壳聚糖及其它壳聚糖衍生物；所述的侧链具有伯氨基的多糖衍生物，其特征是主链具有羧基结构、侧链具有伯氨基的多糖衍生物，是羧基多糖的羧基与具有两个或两个以上伯氨基的小分子化合物中的一个氨基缩合，形成的侧链具有伯氨基的多糖衍生物；所述的羧基多糖，包括但不限于具有羧基结构的壳聚糖衍生物、具有羧基结构的甲壳素衍生物、具有羧基结构的透明质酸和透明质酸衍生物，以及硫酸软骨素、肝素、海藻酸钠，同第一剂所述的羧基多糖；所述的具有两个或两个以上伯氨基的小分子化合物，其特征是具有两个或两个以上伯氨基的脂肪族或芳香族小分子化合物，包括但不限于乙二胺、丙二胺、丁二胺、氨基丁酰胺、谷氨酰胺、丙氨酰谷氨酰胺、赖氨酸及其它碱性氨基酸，具有二酰肼结构的小分子化合物，二氨基苯甲酸、二氨基苯乙酸，其中具有二酰肼结构的小分子化合物包括碳酰肼、乙二酸二酰肼、丙二酸二酰肼、丁二酸二酰肼、己二酸二酰肼、癸二酸二酰肼及其它具有二酰肼结构的化合物。羧基多糖接枝伯氨基结构，通过控制物料比、反应条件，可以调节伯氨基的接枝率，理论上可以在1～100%。

所述的生物多糖水凝胶，是第一剂侧链具有醛基的多糖衍生物溶液，和第二剂主链或侧链具有伯氨基的多糖衍生物，或具有两个或两个以上的伯氨基的小分子化合物溶液，进行混合，第一剂的醛基与第二剂的伯氨基发生交联反应，形成的具有高度透明性、粘弹性、生物相容性的水凝胶。

上述生物多糖水凝胶的制备方法，其特征是包括第一剂和第二剂的制备以及将两剂进行混合，具体制备方法包括以下步骤：

第一剂的制备：

（1）具有接枝邻二羟基结构的多糖衍生物的制备：1）分别配制质量浓度为0.5～15%的氨基多糖水溶液和质量浓度为0.2～30%的具有羧基结构和邻二羟基结构的小分子化合物水溶液，将羧基活化试剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）加入小分子化合物溶液中，调节pH为3.5~7，搅拌反应0.5~3h；将小分子化合物溶液加入到氨基多糖溶液中，搅拌调节反应体系pH为7~9，搅拌反应24 h；或2）分别配制质量浓度为0.5～15%的羧基多糖水溶液和质量浓度为0.2～30%的具有氨基结构和邻二羟基结构的小分子化合物水溶液，将羧基活化试剂EDC和 NHS加入羧基多糖溶液中，调节pH为3.5~7，搅拌0.5~3h；将小分子化合物溶液加入到羧基多糖溶液中，搅拌调节反应体系pH为7~9，搅拌反应24 h；3）将反应产物进行透析、冷冻干燥，或将反应产物进行乙醇沉淀、洗涤、沉淀、干燥，得到具有接枝邻二羟基结构的多糖衍生物，测定多糖衍生物的邻二羟基结构的接枝率；

（2）侧链具有醛基的多糖衍生物的制备：配制质量浓度为0.5～15%的具有接枝邻二羟基结构的多糖衍生物水溶液，按邻二羟基结构与氧化剂的摩尔比为1﹕（0.3～3）加入氧化剂，室温或低温，避光搅拌反应2min～5h，加入乙二醇溶液终止反应0.5～2h，将反应产物进行透析、冷冻干燥，或乙醇沉淀、洗涤、沉淀、干燥，得侧链具有醛基的多糖衍生物，测定醛基的摩尔百分含量；

（3）侧链具有醛基的多糖衍生物溶液的制备：配制质量浓度为0.5～15%的侧链具有醛基的多糖衍生物无菌溶液，调节pH为3.5~7；

第二剂的制备：

（1）具有两个或两个以上的伯氨基的小分子化合物溶液：配制质量百分浓度为0.2%～30%的具有两个或两个以上的伯氨基的小分子化合物无菌溶液，调节pH为7~9，测定伯氨基的摩尔百分含量；

或（2）主链具有伯氨基的多糖衍生物溶液：配制质量百分浓度为0.5%～15%的主链具有伯氨基的多糖衍生物无菌溶液，调节pH为7~9，测定伯氨基的摩尔百分含量。

或（3）侧链具有伯氨基的多糖衍生物溶液：配制质量浓度为0.5～15%的羧基多糖水溶液，配制质量浓度为0.2～30%的具有两个或两个以上伯氨基的小分子化合物水溶液，将羧基活化试剂EDC和 NHS加入羧基多糖溶液中，调节pH为3.5~7，搅拌0.5~3h；将小分子化合物溶液加入到羧基多糖溶液中，调节pH为 7~9，搅拌反应24 h；将反应产物进行透析、冷冻干燥，或将反应产物进行乙醇沉淀、洗涤、沉淀、干燥，得侧链具有伯氨基的多糖衍生物。配制质量百分浓度为0.5%～15%的侧链具有伯氨基的多糖衍生物无菌溶液，调节pH为7~9，测定伯氨基的摩尔百分含量；

第一剂与第二剂混合：

取第一剂侧链具有醛基的多糖衍生物溶液，第二剂具有两个或两个以上的伯氨基的小分子化合物溶液或主链具有伯氨基的多糖衍生物溶液或侧链具有伯氨基的多糖衍生物溶液，分别装入无菌双联注射器的A管和B管中，经注射器推出混合，第一剂和第二剂液体混合形成透明的生物多糖水凝胶。

在上述生物多糖水凝胶的制备方法中，具有羧基结构和邻二羟基结构的小分子化合物中的羧基或羧基多糖中的羧基与羧基活化试剂EDC、NHS的摩尔比为1﹕（0.5~6）﹕（0.5~6）；所述的氧化剂包括但不限于高碘酸钠、高碘酸钾。

上述生物多糖水凝胶在制备眼内玻璃体替代物中的应用。

本发明的生物多糖水凝胶的原材料是选择的生物相容性好的原材料，制备的多糖水凝胶具有优良透光性、粘弹性、组织无毒性；通过侧链接枝有醛基、保持醛基供体多糖分子结构的完整性，通过具有侧链接枝结构的氨基供体多糖分子、具有两个及以上伯氨基小分子化合物的进一步交联，从侧链接枝结构、保持多糖分子结构的完整性、小分子化合物的交联，降低生物酶对多糖的特异性识别，从而提高交联多糖水凝胶的抗生物降解性，提高水凝胶对视网膜的有效顶压时间，达到适用于作为玻璃体替代物的目的。本发明的生物多糖水凝胶作为玻璃体替代物可以保持眼球形状和顶压视网膜在原位，可以提高减震功能，具有良好的自愈合功能。

附图说明

图1是术后术眼与正常眼眼压检测图。

图2是术眼裂隙灯观察图。

图3是术眼眼底照相观察图。

图4是术眼B超检查图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例来进一步详细说明本发明。

实施例1：氨基多糖接枝邻二羟基结构的多糖衍生物的制备

称取具有羧基结构和邻二羟基结构的小分子化合物2,3,4-三羟基丁酸5.5 g溶于150 mL去离子水中，加入羧基活化剂EDC 11.4 g和NHS 7.0 g，搅拌溶解，调节pH为4，得溶液1；称取氨基多糖羟乙基壳聚糖4.1 g搅拌溶解于100 mL去离子水中，得溶液2；搅拌下将溶液1滴加到溶液2中，调节pH为7.5，室温下搅拌反应24 h。反应结束后，将反应产物装入截留分子量8000-14000的透析袋中去离子水透析48 h，冷冻干燥得氨基多糖接枝邻二羟基结构的多糖衍生物（三羟基丁酸-羟乙基壳聚糖）。测定多糖衍生物的邻二羟基结构的接枝率（摩尔比）为92%。

在实施例1的氨基多糖接枝邻二羟基结构的多糖衍生物的制备中，可以通过增加三羟基丁酸等同时具有羧基结构和邻二羟基结构的小分子化合物的摩尔比，使具有氨基结构的多糖接枝高比例的邻二羟基结构，制备的氨基多糖接枝邻二羟基结构的多糖衍生物具有高邻二羟基接枝率，以便减少氨基多糖中伯氨基的摩尔比，同时经氧化可获得高比例的醛基。

实施例2：羧基多糖接枝邻二羟基结构的多糖衍生物的制备

称取羧基多糖透明质酸钠4g搅拌溶于200 mL去离子水，加入羧基活化剂EDC 2.87g和NHS 1.73 g，室温下搅拌溶解，调节pH为5，得溶液1；取具有氨基结构和邻二羟基结构的小分子化合物氨基丙二醇1.2 mL（3-氨基-1,2-丙二醇）加入2 mL去离子水稀释，得溶液2；将溶液2加入到溶液1中，调反应体系pH为8.5，搅拌反应24 h。反应结束后，将反应产物用乙醇沉淀、洗涤、沉淀、干燥，得羧基多糖接枝邻二羟基结构的多糖衍生物（氨基丙二醇-透明质酸），测定多糖衍生物的邻二羟基结构接枝率为88%。

在实施例2的羧基多糖接枝邻二羟基结构的多糖衍生物的制备中，可以通过调节氨基丙二醇等同时具有氨基结构和邻二羟基结构的小分子化合物与羧基多糖的摩尔比，使具有羧基结构的多糖接枝不同比例的邻二羟基结构，形成具有不同摩尔比侧链邻二羟基结构的多糖衍生物，不同比例的邻二羟基结构经氧化可获得不同比例的醛基。

实施例3：侧链具有醛基的多糖衍生物1的制备

称取实施例1制备的氨基多糖接枝邻二羟基结构的多糖衍生物3.0 g，搅拌溶于100 mL去离子水，得溶液1；称取氧化剂高碘酸钠2.0 g搅拌溶于40 mL去离子水，得溶液2；搅拌下将溶液2滴加溶液1中，室温下氧化反应10～20 min。反应结束后加入终止剂乙二醇3mL终止反应，继续搅拌1 h，将反应产物用乙醇沉淀、洗涤、沉淀、干燥，得侧链具有醛基的氨基多糖衍生物（氧化三羟基丁酸-羟乙基壳聚糖），测定其醛基的摩尔百分含量为65%。

实施例4：侧链具有醛基的多糖衍生物2的制备

称取实施例2制备的羧基多糖接枝邻二羟基结构的多糖衍生物4.0 g，搅拌溶于200 mL去离子水，得溶液1；称取氧化剂高碘酸钠1.5 g搅拌溶于40 mL去离子水，得溶液2；搅拌下将溶液2滴加溶液1中，8～10℃下氧化反应40 min～2 h。反应结束后加入终止剂乙二醇4 mL终止反应，继续搅拌1 h，将反应产物用分子量8000-14000的透析袋去离子水透析48 h，冷冻干燥，得侧链具有醛基的羧基多糖衍生物2（氧化氨基丙二醇-透明质酸），测定其醛基的摩尔百分含量为46%。

在实施例3、实施例4的侧链具有醛基的多糖衍生物的制备中，侧链接枝了邻二羟基结构的多糖衍生物在氧化剂高碘酸钠的氧化作用下，调节反应温度、控制物料比和反应时间在数分钟至5小时，氧化剂优先氧化多糖侧链的邻二羟基结构形成醛基，不氧化多糖主链，从而保证了多糖分子主链不被开环降解，保持了多糖主链的完整性。使用的氧化剂包括但不限于高碘酸钠、高碘酸钾；通过控制氧化剂的加入量、控制氧化反应时间、反应温度，得到不同摩尔比的侧链醛基，而多糖主链不被氧化开环，制备的侧链具有醛基的多糖衍生物的侧链醛基单元与糖单元的摩尔百分比可以是≥1%，如5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%等，也可以是接近100%。

实施例5：侧链具有伯氨基的多糖衍生物1的制备

称取羧基多糖羧甲基甲壳素4.5 g搅拌溶解于150 mL去离子水中，加入羧基活化剂EDC 3.0 g和NHS 1.8 g，搅拌反应1 h，调节pH为6，得溶液1；称取具有两个或两个以上伯氨基的小分子化合物碳酰肼2.0 g搅拌溶解于30 mL去离子水，得溶液2；搅拌下将溶液2滴加至溶液中，调节pH为8，继续反应24 h。反应结束后将反应产物用乙醇沉淀、洗涤、沉淀、干燥，得侧链具有伯氨基的多糖衍生物1（碳酰肼-羧甲基甲壳素），测定伯氨基接枝率为62%。

实施例6：侧链具有伯氨基的多糖衍生物2的制备

称取羧基多糖透明质酸钠4 g搅拌溶解于100 mL去离子水，加入羧基活化剂EDC1.91 g和NHS 1.15 g，搅拌反应1 h，调节pH为6，得溶液1；称取具有两个或两个以上伯氨基的小分子化合物谷氨酰胺2.9 g，搅拌溶解于20 mL去离子水，得溶液2；搅拌下将溶液2滴加至溶液1中，调节pH为7，搅拌反应24 h。反应结束后将反应产物用乙醇沉淀、洗涤、沉淀、干燥，得侧链具有伯氨基的多糖衍生物2，测定伯氨基接枝率为43%。

在实施例5、实施例6的侧链具有伯氨基的多糖衍生物的制备中，通过控制碳酰肼、谷氨酰胺等具有两个或两个以上伯氨基的小分子化合物的摩尔比，控制反应时间，得到不同摩尔比的侧链接枝伯氨基结构，制备的侧链具有伯氨基的多糖衍生物的侧链伯氨基单元与糖单元的摩尔百分比可以是≥1%，如5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%等，也可以是接近100%。

实施例7：多糖水凝胶1的制备

第一剂：称取实施例3制备的侧链具有醛基的氨基多糖衍生物无菌样品1.0g，溶解于10 mL无菌生理盐水，配制成质量百分浓度为10%的溶液，调节pH为6。

第二剂：称取具有两个或两个以上伯氨基的小分子化合物丁二酸二酰肼无菌样品0.05 g，溶解于10 mL无菌生理盐水，配制成质量百分浓度为0.5%的溶液，调节pH为7.5。

分别将第一剂和第二剂装入无菌双联注射器的A管和B管中，第一剂和第二剂液体经注射器推出混合，形成透明的多糖水凝胶1，成胶时间约2分钟，形成的多糖水凝胶按压有粘性、回弹性好。

实施例8：多糖水凝胶2的制备

第一剂：称取实施例3制备的侧链具有醛基的氨基多糖衍生物无菌样品0.3g，溶解于10 mL无菌生理盐水，配制成质量百分浓度为3%的溶液，调节pH为5。

第二剂：称取实施例6制备的侧链具有伯氨基的多糖衍生物谷氨酰胺-透明质酸无菌样品0.2 g，溶解于10 mL无菌生理盐水，配制成质量百分浓度为2%的溶液，调节pH为8。

分别将第一剂和第二剂装入无菌双联注射器的A管和B管中，第一剂和第二剂液体经注射器推出混合，形成透明的多糖水凝胶2，成胶时间约5分钟，形成的多糖水凝胶按压有粘性、回弹性好。

实施例9：多糖水凝胶3的制备

第一剂：称取实施例4制备的侧链具有醛基的羧基多糖衍生物无菌样品0.3g，溶解于10 mL无菌去离子水，配制成质量百分浓度为4%的溶液，调节pH为4.0。

第二剂：称取主链具有伯氨基的多糖衍生物羟丙基壳聚糖无菌样品0.3 g，溶解于10 mL无菌去离子水，配制成质量百分浓度为5%的溶液，调节pH为8.5。

分别将第一剂和第二剂装入无菌双联注射器的A管和B管中，第一剂和第二剂液体经注射器推出混合，形成透明的多糖水凝胶3，成胶时间约6分钟，形成的多糖水凝胶按压有粘性、回弹性好。

实施例10：多糖水凝胶透光率测定

分别取实施例7~9制备的多糖水凝胶适量，置于生理盐水中充分溶胀，置于玻璃比色皿中，在可见光400-800 nm波长范围内测定吸光值（A），按公示

计算水凝胶透光率（%）。结果见表1，水凝胶的透光率与波长有关，透光率随着波长的增大而提高，在400 nm处各水凝胶的透光率均大于88%；在波长大于500 nm时，各水凝胶的透光率均大于90%，表明上述实施例所制备的多糖水凝胶具有优良透光性。

表1 多糖水凝胶的透光率

波长（nm）	400	500	600	700	800
						水凝胶1透光率（%）	88.5	90.8	92.4	93.7	94.8
水凝胶2透光率（%）	90.2	92.8	94.6	96.7	97.2
						水凝胶3透光率（%）	89.7	91.5	93.2	95.3	96.4

实施例11：多糖水凝胶的降解性测定

分别将实施例7~9制备的多糖水凝胶在直径为6 mm的小试管中成胶，取出胶条，切割成高度为5 mm的胶块。分别取3种不同水凝胶胶块各2块，干燥恒重，称重，计算降解前胶块的固形物含量。配制10000单位/mL的溶菌酶磷酸缓冲液，分装于3个小三角瓶中，每个三角瓶100 mL溶菌酶液，将3种多糖水凝胶各15个胶块分别放入装有溶菌酶溶液的三角瓶中，于37℃恒温箱中进行降解性测定。每10天各取2个胶块，干燥恒重，称重，计算降解胶块的固形物含量，计算降解率，结果见表2。3种多糖水凝胶在前20天相对较稳定，30天的降解率小于20%，40天的降解率在30%左右，随着降解时间的增加，降解速度加快，50天、60天的降解率明显加快，60天的降解率在70%左右。实验结果表明，本发明制备的多糖水凝胶具有较好的抗降解性，早期稳定性较好，降解时间超过60天。而公布号为CN 102762647 A的发明专利申请公开了其制备的水凝胶的体外降解在第3天的水凝胶剩余重量为86.67%，35天的水凝胶剩余重量为61.02%。与公布号为CN 102762647 A的发明专利申请比较，本发明的多糖水凝胶的体外降解时间更长，因此本发明的多糖水凝胶对视网膜的顶压时间更长。

表2 多糖水凝胶的降解率测定数据

时间（天）	10	20	30	40	50	60
							水凝胶1降解率（%）	3.2%	7.3%	16.5%	28.7%	50.6%	65.3%
水凝胶2降解率（%）	4.8%	9.1%	18.8%	32.2%	58.2%	73.7%
							水凝胶3降解率（%）	3.5%	8.8%	17.9%	30.7%	53.8%	70.2%

实施例12：多糖水凝胶在眼内玻璃体替代物中的应用

实验动物新西兰兔3只，雌性，体重2.5～3kg，兔左眼为术眼，右眼为对照眼，试验实施例9制备的多糖水凝胶3在眼内玻璃体替代物中的应用。

实验动物按常规进行动物麻醉、皮肤消毒，进行玻璃体切除手术，将实施例9制备的第一剂和第二剂经双联注射器注入实验兔的左眼玻璃体腔内，原位形成凝胶，闭合巩膜切口，实验兔术后护理，正常饲养。术后定期测眼压，90d进行眼部裂隙灯检测，眼底照相，B超检查，评价水凝胶在玻璃体腔内的填充情况。

术后术眼眼压与正常眼眼压检测结果见图1。术后3d，术眼眼压较正常眼低，是由于手术在巩膜上做的切口还没有完全愈合，导致眼压下降。7d术眼眼压基本恢复正常，此后眼压基本稳定，与正常眼眼压没有显著性差异，表明本发明的多糖水凝胶在眼内起到了较好的维持眼压作用。与公布号为CN 105833344 A的发明专利申请比较，术眼的眼压更稳定，表明本发明的多糖水凝胶具有更好维持眼压的作用。

术后90 d裂隙灯观察见图2，实验兔术眼无炎症反应，角膜正常无水肿，玻璃体保持透明，眼底清晰可见。眼底照相见图3，脉络膜上的血管清晰可见，呈网状分布，无视网膜及脉络膜出血等眼底病变。B超检查见图4，没有检测到玻璃体异物、混浊和出血、视网膜脱离等声像，与正常眼相比无明显差异。实验结果表明，本发明制备的生物多糖水凝胶眼内无刺激作用，具有良好的眼组织相容性，具有很好的玻璃体替代效果，能够顶压视网膜并保持眼球外形，光学性能好，可在眼内降解吸收，多糖水凝胶作为眼内玻璃体替代物应用具有很大的应用潜力。

Claims (9)

1.一种生物多糖水凝胶，其特征是由两剂混合反应而成，第一剂是侧链具有醛基的多糖衍生物溶液，第二剂是主链或侧链具有伯氨基的多糖衍生物溶液，或是具有两个或两个以上的伯氨基的小分子化合物溶液；第一剂侧链具有醛基的多糖衍生物是具有侧链醛基的氨基多糖衍生物或具有侧链醛基的羧基多糖衍生物；所述具有侧链醛基的氨基多糖衍生物或具有侧链醛基的羧基多糖衍生物，是由侧链接枝邻二羟基的氨基多糖或侧链接枝邻二羟基的羧基多糖经氧化形成；所述侧链接枝邻二羟基的氨基多糖是由氨基多糖与同时具有羧基结构和邻二羟基结构的化合物通过缩合反应，接枝上邻二羟基结构的侧链；所述侧链接枝邻二羟基的羧基多糖是由羧基多糖与同时具有氨基结构和邻二羟基结构的化合物通过缩合反应，接枝上邻二羟基结构的侧链。

2.如权利要求1所述生物多糖水凝胶，其特征是第一剂溶液中侧链具有醛基的多糖衍生物的质量百分浓度为0.5%～15%，第二剂溶液中主链或侧链具有伯氨基的多糖衍生物的质量百分浓度为0.5%～15%，或第二剂溶液中具有两个或两个以上伯氨基的小分子化合物的质量百分浓度为0.2%～30%；所述溶液的溶剂是无菌水、生理盐水、生理平衡液，或葡萄糖液。

3.如权利要求1所述的生物多糖水凝胶，其特征是所述的氨基多糖衍生物，选自羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖、羧甲基壳聚糖、或羧乙基壳聚糖；所述的羧基多糖，选自具有羧基结构的壳聚糖衍生物、具有羧基结构的甲壳素衍生物、具有羧基结构的透明质酸或透明质酸衍生物，以及硫酸软骨素、肝素、海藻酸钠；所述的具有羧基结构的壳聚糖衍生物选自羧甲基壳聚糖、羧乙基壳聚糖、或琥珀酰壳聚糖；所述的具有羧基结构的甲壳素衍生物选自羧甲基甲壳素、或羧乙基甲壳素；所述的具有羧基结构的透明质酸或透明质酸衍生物选自透明质酸、羟乙基透明质酸、羟丙基透明质酸、乙酰基透明质酸、丁酰基透明质酸、氨基乙酸透明质酸、氨基丙酸透明质酸或氨基丁酸透明质酸。

4.如权利要求1所述的生物多糖水凝胶，其特征是所述的主链具有伯氨基的多糖衍生物是主链具有伯氨基同时具有侧链接枝结构的氨基多糖衍生物；所述的侧链具有伯氨基的多糖衍生物主链具有羧基结构、侧链具有伯氨基的多糖衍生物，是羧基多糖的羧基与具有两个或两个以上伯氨基的小分子化合物中的一个氨基缩合，形成的侧链具有伯氨基的多糖衍生物。

5.如权利要求1所述的生物多糖水凝胶，其特征是所述的具有两个或两个以上伯氨基的小分子化合物是具有两个或两个以上伯氨基的脂肪族或芳香族小分子化合物，选自乙二胺、丙二胺、丁二胺、氨基丁酰胺、谷氨酰胺、丙氨酰谷氨酰胺、赖氨酸及其它碱性氨基酸，具有二酰肼结构的小分子化合物，二氨基苯甲酸、二氨基苯乙酸；所述的具有二酰肼结构的小分子化合物选自碳酰肼、乙二酸二酰肼、丙二酸二酰肼、丁二酸二酰肼、己二酸二酰肼或癸二酸二酰肼。

6.一种如权利要求1所述的生物多糖水凝胶的制备方法，其特征是包括第一剂的制备和第二剂的制备以及将两剂进行混合，步骤如下：

第一剂的制备：

（1）具有接枝邻二羟基结构的多糖衍生物的制备：1）分别配制质量浓度为0.5～15%的氨基多糖水溶液和质量浓度为0.2～30%的具有羧基结构和邻二羟基结构的小分子化合物水溶液，将羧基活化试剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和 N-羟基琥珀酰亚胺加入小分子化合物溶液中，调节pH为3.5～7，搅拌反应0.5～3 h；将小分子化合物溶液加入到氨基多糖溶液中，搅拌调节反应体系pH为7～9，搅拌反应24 h；或2）分别配制质量浓度为0.5～15%的羧基多糖水溶液和质量浓度为0.2～30%的具有氨基结构和邻二羟基结构的小分子化合物水溶液，将羧基活化试剂EDC和 NHS加入羧基多糖溶液中，调节pH为3.5～7，搅拌0.5～3 h；将小分子化合物溶液加入到羧基多糖溶液中，搅拌调节反应体系pH为7～9，搅拌反应24 h；3）将反应产物进行透析、冷冻干燥，或将反应产物进行乙醇沉淀、洗涤、沉淀、干燥，得到具有接枝邻二羟基结构的多糖衍生物，测定多糖衍生物的邻二羟基结构的接枝率；

（2）侧链具有醛基的多糖衍生物的制备：配制质量浓度为0.5～15%的具有接枝邻二羟基结构的多糖衍生物水溶液，按邻二羟基结构与氧化剂的摩尔比为1﹕（0.3～3）加入氧化剂，室温或低温，避光搅拌反应2 min～5 h，加入乙二醇溶液终止反应0.5～2 h，将反应产物进行透析、冷冻干燥，或乙醇沉淀、洗涤、沉淀、干燥，得侧链具有醛基的多糖衍生物，测定醛基的摩尔百分含量；

（3）侧链具有醛基的多糖衍生物溶液的制备：配制质量浓度为0.5～15%的侧链具有醛基的多糖衍生物无菌溶液，调节pH为3.5～7；

第二剂的制备：

（1）具有两个或两个以上的伯氨基的小分子化合物溶液：配制质量百分浓度为0.2%～30%的具有两个或两个以上的伯氨基的小分子化合物无菌溶液，调节pH为7~9，测定伯氨基的摩尔百分含量；

或（2）主链具有伯氨基的多糖衍生物溶液：配制质量百分浓度为0.5%～15%的主链具有伯氨基的多糖衍生物无菌溶液，调节pH为7～9，测定伯氨基的摩尔百分含量；

或（3）侧链具有伯氨基的多糖衍生物溶液：配制质量浓度为0.5～15%的羧基多糖水溶液，配制质量浓度为0.2～30%的具有两个或两个以上伯氨基的小分子化合物水溶液，将羧基活化试剂EDC和 NHS加入羧基多糖溶液中，调节pH为3.5～7，搅拌0.5～3h；将小分子化合物溶液加入到羧基多糖溶液中，调节pH为 7～9，搅拌反应24 h；将反应产物进行透析、冷冻干燥，或将反应产物进行乙醇沉淀、洗涤、沉淀、干燥，得侧链具有伯氨基的多糖衍生物；配制质量百分浓度为0.5%～15%的侧链具有伯氨基的多糖衍生物无菌溶液，调节pH为7～9，测定伯氨基的摩尔百分含量；

第一剂与第二剂混合：

取第一剂侧链具有醛基的多糖衍生物溶液，第二剂具有两个或两个以上的伯氨基的小分子化合物溶液或主链具有伯氨基的多糖衍生物溶液或侧链具有伯氨基的多糖衍生物溶液，分别装入无菌双联注射器的A管和B管中，经注射器推出混合，第一剂和第二剂液体混合形成透明的生物多糖水凝胶。

7.如权利要求6所述的生物多糖水凝胶的制备方法，其特征是所述的第一剂的制备过程中：所述的具有羧基结构和邻二羟基结构的小分子化合物，选自2,3-二羟基丙酸、2,3,4-三羟基丁酸、葡萄糖酸、苏糖酸、阿拉伯酸、木糖酸、或粘酸；所述的具有氨基结构和邻二羟基结构的小分子化合物，选自氨基丙二醇、或氨基葡萄糖。

8.如权利要求6所述的生物多糖水凝胶的制备方法，其特征是所述羧基与羧基活化试剂EDC、NHS的摩尔比为1﹕（0.5～6）﹕（0.5～6）；所述的氧化剂包括高碘酸钠或高碘酸钾。

9.如权利要求1所述的生物多糖水凝胶在制备眼内玻璃体替代物中的应用。

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