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Abstract

本发明涉及一种治疗糖尿病的长效化胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物。通过对天然的GLP-1的进行改造得到具有更长药理作用时间的GLP-1类似物，通过实验证明其具有较好的糖尿病治疗效果。

Description

一种用于治疗糖尿病的多肽
技术领域
本发明涉及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其应用。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。糖尿病是继肿瘤、心血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病。目前，全球约有3亿糖尿病患者，预计到2025年将增加至5亿。2010年，中国有9200万糖尿病患者，中国已经成为仅次于印度的糖尿病第二大国，其中2型糖尿病约占糖尿病患者总人数的90％。现在治疗2型糖尿病最有效的方法是注射胰岛素。在临床上采用胰岛素强化治疗的方法来延缓糖尿病进程，胰岛素治疗在降低血糖的同时可以一定程度上逆转胰岛β-细胞功能损害。但是使用胰岛素会出现低血糖的危险。受到剂量大小、注射部位、注射途径、个体差异或注射后未进食等因素的影响，如果使用胰岛素稍有不慎，就会出现严重的低血糖副作用。
1984年，胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1，GLP-1)被发现，它是一种具有30个氨基酸的肠降血糖素，具有促进胰岛素分泌和生物合成，抑制胰高血糖素的分泌，促进胰岛细胞增殖，抑制胰岛细胞凋亡，保存细胞对血糖的敏感性等多种生理功能。G LP-1与其受体结合后能够增加细胞内cAMP浓度并激活蛋白激酶A(PKA)，通过cAMP/PKA激酶通路增强细胞内胰岛素基因的转录和翻译，并提高对葡萄糖刺激信号的敏感性，从而增加胰岛素分泌量。GLP-1还通过与细胞上的胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)作用抑制胰高血糖素的分泌，或者间接通过促进胰岛素和生长抑素的分泌来抑制胰高血糖素的分泌。GLP-1作为降血糖药物受到限制的主要原因是GLP-1在体内能够迅速的被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)所降解而失去活性。
肠促胰岛素类似物(Exendin-4)是一条39个氨基酸组成的直链多肽，最初由南美巨蜥的唾液分离获得。它与人源GLP-1序列有53％的同源性。
Exendin-4同样能够和GLP-1受体结合，产生促进胰岛素分泌等生理作用，且Exendin-4的N端第二个氨基酸为甘氨酸，能够耐受血浆中DPP-IV的分解，故Exendin-4被吸收入血后的半衰期较长(t1/2＝2.4小时)；C端比GLP-1多9个氨基酸，结构上形成了“色氨酸笼”(“Trp-cage”)，能够和GLP-1受体更紧密的结合。
由于GLP-1为人源多肽，没有Exendin-4的免疫源性问题，根据其设计的GLP-1类似物在临床试验中副作用较为轻微，已成为设计用于治疗2型糖尿病的GLP-1受体激动剂的理想原型，开发潜力巨大。2010年，诺和诺德公司以GLP-1为原型设计的Liraglutide(中文名利拉鲁肽，商名)在美国上市，因其良好的临床效果、较低的副作用以及更好的患者依从度(一天注射一次)赢得了广泛关注，从而掀起了GLP-1受体激动剂的开发热潮。虽然现在上市的Liraglutide等GLP-1受体激动剂延长了半衰期，但仍需患者每天注射药物，在药物使用舒适度上仍有改进空间。因此有必要进一步提高GLP-1类多肽药物的体内半衰期，提高患者依从度。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)主要由末端空肠、回肠和结肠的L细胞所分泌的葡萄糖依赖性肠降血糖多肽激素，在体内有多种存在形式。胰高血糖素原基因位于2号染色体长臂，由6个外显子和5个内含子组成，在胰腺和肠道L细胞内表达，生成由160个氨基酸组成的胰高血糖素原(proglucagon，PG)。胰高血糖素原在胰腺和肠道中裂解后转化的产物不同。PG在肠道中主要裂解为：肠高血糖素(Glicentin：PG1～69)，肠高血糖素分子继续裂解为GRPP(PG1～30)和胃泌酸调节素(Oxyntomodulin：PG33～69)；插入肽-2(IP-2：PG111～123)；胰高血糖素样肽-2(GLP-2：PG126～158)；和GLP-1(1～37)-OH(PG72～108)。GLP-1(1～37)-OH是无活性的肽链，需酶解切除N端6肽，成为具有生理活性的GLP-1(7～37)-OH，其C末端甘氨酸可以作为酰胺化酶的底物，因此GLP-1(7～37)-OH的C末端酰胺化后即生成具有高度活性的GLP-1(7～36)-NH2，氨基酸序列是HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2；GLP-1(7～37)-OH的氨基酸序列是
HAEGTFTSDVSSLEGQAAKEFIAWLVKGRG-COOH。GLP-1(7～36)-NH2是人体内GLP-1主要的天然形式，约占80％，其促进胰岛素分泌的作用在GLP-1肽中最强。另外GLP-1(7～37)-OH约占20％，两者具有相同的生理功能。
然而，虽然天然GLP-1在治疗糖尿病上有以上诸多优点，但它在体内却会被二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV，DPPIV)快速降解。所以这需要我们对天然GLP-1进行改造，以期望寻找到能够抵抗DPP-1V降解，避免肾脏快速滤过代谢的GLP-1类似物。
发明内容
一方面本发明涉及一类胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物。其结构具有以下形式：
HAEGTFTSSVSSYLEGQAAKEFSAWLVKGRGSS-PSSGAPPPSPSSGAPPPS(SEQ ID NO：1)，名称：N2010-GLP-0923；
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGC-PSSGAPPPSPSSGAPPPS(SEQ ID NO：2)名称：N2010-GLP-0745：
HAEGTFTSCVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGCPSSGAPPPSPSSGAPPPSPS(SEQ IDNO：3)名称：N2011-GLP-0653；
HAEGTFTSRVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGCPSSGAPPPSPSSGAPPPSPS(SEQ ID NO：4)名称：N2011-GLP-0849；
HAEGTFTSRVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGCPSSGAPPPSPSSTAPPPSPS(SEQ ID NO：5)名称：N2011-GLP-3542；
HAEGTFTSSVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGCPSSGAPPPSPSSGRPPPSPS(SEQ ID NO：6)名称：N2011-GLP-8731；
HAEGTQTSCVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGCPSSGAPPPSPSSGAPPPS(SEQ ID NO：7)名称：N2012-GLP-4319；
HAESTFTSCVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGCPSSGAPPPSPSSGAPPPSP(SEQ ID NO：8)名称：N2012-GLP-3111；
HAEGIFTSCVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGCPSSGAPPPSPSSGAPPPS(SEQ ID NO：9)名称：N2012-GLP-1243；
HAEGTFTQCVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGCPSSGAPPPSPSSGAPPPSPS(SEQ ID NO：10)名称：N2012-GLP-2153；
HAEGTFTWCVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGCPSSGAPPPSPSSGAPPPSPS(SEQ ID NO：11)名称：N2012-GLP-3148；
HAEGTFTSCVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGCPSSGAPPPSPSSGAPPGSP(SEQ ID NO：12)名称：N2012-GLP-4440。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，所述的组合物含有如上所述的胰高血糖素样肽-1突变体多肽。
如上所述的药物组合物，其还含有还包含一种或多种药学上可接受的载体；优选地，所述药学上可接受的载体选自：水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂；
更优选地，所述水溶性填充剂选自以下的一种或几种：甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖；
更优选地，所述pH调节剂为生理可接受的酸、碱和/或盐，优选选自以下的一种或几种：
非挥发性酸如枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸或盐酸，碱如氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化钾或氢氧化铵，盐如碳酸钠或碳酸钾或碳酸铵盐，碳酸氢钠或碳酸氢钾或碳酸氢铵盐；
更优选地，所述稳定剂为选自以下的一种或几种：EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等，进一步优选自：焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000、三羟甲基氨基甲烷中的一种或几种；
更优选地，所述渗透压调节剂选自氯化钠和/或氯化钾。
本发明的技术方案也可进一步表述如下：
本发明一方面提供一种GLP-1突变体多肽，所述GLP-1突变体多肽具有SEQ ID NO：1-12所示的序列。
本发明另一方面还提供上述GLP-1突变体串联多肽在制备治疗糖尿病的药物中的应用，以及该多肽复合物在制备治疗和/或预防肥胖症的药物中的应用。
并且，所述药物组合物优选为注射剂，更优选地为冻干粉针或溶液注射剂。
本发明的又一方面还提供一种药物组合物，包含上述所述的GLP-1突变体串联多肽。
优选地，还包含可接受的辅料成分。
发明的优点在于：
.提供了一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物不仅能够提高降糖活性，同时具有抗肾脏滤过消除和抗DPP-IV酶解作用，生物半率期较GLP-1原型长，提高GLP-1的稳定性，延长作用时间。
因此用本发明提供的微波促进固相合成技术制备的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，
收率高、合成周期短、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。制备得到的胰
高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，比天然GLP-1更加稳定，适合作为治疗糖尿病药物的活性成分。
具体实施方式
实施例1
SEQ ID NO：1-12多肽的固相合成
采用本领域常规的多肽合成的方法，合成了SEQ ID NO：1-12的多肽。
根据相应的序列合成得到的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，通过电喷雾质谱(ESI-MS)确证各自的分子量，证实分子量大小正确，说明合成成功。
实施例2 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的体内降血糖活性
同时给予葡萄糖、受试化合物：11周龄雄性昆明小鼠，随机3组，每组8只。只给饮水，禁食过夜。一组按照小鼠体重每千克腹腔注射18mmol的葡萄糖溶液(浓度20％)和生理盐水；其他组按照小鼠体重每千克腹腔注射18mmol的葡萄糖溶液和20nmol的GLP-1类化合物溶液(15μmol/L)。在0，15，30，45，60min用血糖仪测定血糖水平，血糖。
如表1所示，由于修饰后的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物具有抗酶解和抗肾脏滤过作用，其生物半衰期大大延长，所以体内降血糖实验显示其促胰岛素分泌作用比未经改造的天然GLP-1更强。
表1：

Claims (5)

1.胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，其序列为SEQ ID NO：1-12所示。
2.一种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1中任一所述的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物和其药学上可接受的盐。
3.一种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1中任一所述的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物和药学上可接受的载体或稀释剂。
4.权利要求2所述的药物组合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的运用。
5.权利要求3所述的药物组合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的运用。
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