CN102770538A

CN102770538A - 调节血糖血脂的融合蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102770538A
Application number: CN2010800369675A
Authority: CN
Inventors: 范开; 赵志全; 张淳; 陈勇; 罗华; 杨黎; 刘洪洪
Original assignee: Chongqing Fagen Biomedical Inc
Current assignee: Chongqing Fagen Biomedical Inc
Priority date: 2009-08-20
Filing date: 2010-03-12
Publication date: 2012-11-07
Also published as: EP2468858A4; EP2468858A1; CN101993496A; CN101993496B; EP2468858B1

Abstract

提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包含人成纤维细胞生长因子21和胰高血糖类似肽1或其类似物。还提供了含有该融合蛋白的药物组合物，所述的药物组合物可用于治疗或预防肥胖症，糖尿病、高血糖症和高血脂症等。

Description

说明书

调节血糖血脂的融合蛋白及其制备方法和应用技术领域

本发明涉及重组蛋白及其在制药领域的应用，特别是涉及一种人成纤维细胞生长因子 21与人胰高血糖素类似肽 1或其类似物的融合蛋白，及其在制备抗肥胖、 2型糖尿病和高血脂的药物中的应用和制备方法。

背景技术

成纤维细胞生长因子（FGF ) 是一类多功能活性多肽，目前已经发现了 18种哺乳动物成纤维细胞生长因子（FGF1-FGF10，FGF 16-FGF23 )。根据序列同源性不同，它们可被细分为 6个不同的亚科（Andrew Beenken等， Nat Rev Drug Discov，2009，8(3):235-253 )。成纤维细胞生长因子 21 (以下称 FGF-21 ) 是由 Nishimura等（Nishimura T等， Biochim Biophys Acta, 2000, 1492： 203-206) 于 2000年首次在小鼠胚胎中发现，与 FGF-19、 FGF-23属同一亚科，不具有与肝素结合的功能，它们均在调节内分泌方面起作用，可以调节胆汁酸、胆固醇、葡萄糖、维生素 D等的代谢。

人源 FGF-21基因位于 19号染色体，全长 FGF-21蛋白由 181个氨基酸的成熟 FGF-21蛋白和位于 N端的 28个氨基酸的信号肽组成。成熟的人 FGF-21蛋白 N末端和 C末端都具有生物学功能： N末端氨基酸参与与 FGF受体的相互作用， C末端氨基酸参与与 beta-Klotho蛋白的相互作用（Micanovic R等， J Cell Phys, 2009, 219(2)： 227-234)。 FGF-21的组织细胞分布的研究主要集中在 mR A水平，内源性的 FGF-21 mRNA首先在胸腺和肝脏中被发现，接着在胰脏、脂肪组织和肌肉组织同样发现了 FGF-21 的 mRNA (Inagaki T等， Cell Metab, 2007, 5 ( 6)： 415-425 )。人 FGF-21生物学功能是在利用葡萄糖摄取分析法筛选可能用于治疗糖尿病的新蛋白质时发现的（Kharitonenkov A等， J Clin Invest, 2005， 115 (6)： 1627-1635)。重组人 FGF-21蛋白可以刺激分化的小鼠 3T3-L1细胞和人前脂肪细胞的葡萄糖摄取。与胰岛素介导的快速利用葡萄糖不同， FGF-21在葡萄糖摄取方面的效应可持续几个小时。更重要的是， FGF-21作用下的葡萄糖摄取是非胰岛素依赖性的，而且在与胰岛素共同存在时可以增加摄取葡萄糖的效应（Alexei Kharitonenkov等， Biodrugs, 2008, 22 ( 1 )： 37-44)。随后的实验表明： FGF-21 通过增加 3T3-L1细胞和人前脂肪细胞中葡萄糖载体 -1 ( GLUT-1 )的表达来增加非胰岛素依赖的葡萄糖摄取（Amer P等， FEB S Lett, 2008, 582 ( 12)： 1725-1730)。 Wolf WenTe等（Wente W等， Diabetes, 2006, 55： 2470-2478 ) 发现，在分离的小鼠胰岛和 INS-IE细胞中， FGF-21可以增加胰岛素的转录、表达和分泌，阻止糖脂毒性和细胞因子介导的编程性细胞死亡，保护胰岛 β细胞的数量和功能，抑制葡萄糖介导的胰高血糖素的释放。在 FGF-21 高表达（转基因小鼠 FGF-21 mRNA浓度比对照组动物高 50-150 倍）的转基因小鼠中，其体内的血清胆固醇、葡萄糖、甘油三酯的含量显著降低，空腹胰岛素水平也下降，胰岛素敏感度和葡萄糖清除率得到改善 (Inagaki T, Cell Metab, 2007， 5 ( 6)： 415-425)。相反的，在由腺病毒介导的 FGF-21基因沉默的小鼠中出现了严重的代谢异常，包括脂肪肝，高甘油三酯血症，血清中游离脂肪酸和总胆固醇含量明显增高以及血清中酮类的减少等（Badman MK等， Cell Metab, 2007， 5 ( 6)： 426-437)。在非人类灵长类糖尿病动物模型方面，注射重组人 FGF-21可以降低 LDL 胆固醇含量，增加 HDL 胆固醇含量，降低患心血管方面疾病的风险（Kharitonenkov A等， Endocrinology, 2007, 148： 774-781 )。在目前进行的重组人 FGF-21动物体内药效学实验中，未发现有低血糖、水肿和肥胖增多等其他糖尿病经常出现的副反应出现，显示出了良好的应用前景和安全性。

鉴于人 FGF-21的潜在治疗糖尿病的价值， Lilly公司和 Ambrx公司正在进行相关药物研究： Lilly 公司的重组人 FGF-21突变体蛋白（LP10152) 正处在 I期临床阶段（Frye CC等， WO2006/028595), Ambrx 公司和 Merck 公司的经 PEG修饰的人 FGF-21 蛋白正处在临床前研究阶段 (Thomas P等， US2008/025045)。

人源 FGF-21经 N末端缺失 4个氨基酸后仍具有生物学作用（Micanovic R等， J Cell Phys, 2009, 219(2)： 227-234)；经局部氨基酸突变或（和）去糖基化后未发现其生物活性的降低（Frye CC 等， WO2006/028595)。因此，进行人源 FGF-21氨基酸序列的改造已成为该蛋白研究开发的一个重要方向。 GLP-1

胰高血糖素样肽 -1 (GLP-1) 作为胰高血糖素原（proglucagon) 基因的翻译加工后产物于 1984 年被首次发现（MajaovS等， JBiolChem, 1986， 261： 11880-11889)。人胰高血糖素原基因位于 17号染色体，不仅可以在胰腺的 α细胞中表达，还可以在肠道中的 L细胞中表达。在这两种细胞中，基因的转录和翻译产物均相同，但基因的翻译后加工过程不同。在胰腺的 α细胞中，胰高血糖素原被剪切为胰高血糖素、肠高血糖素相关性多肽和胰高血糖素原主要片段。在肠道的 L细胞中，胰高血糖素原被剪切为胰高血糖素样肽 -1 (GLP-1 )、胰高血糖素样肽 -2 (GLP-2)和肠高血糖素（Nielsen LL等， Regul Pept, 2004, 117： 77-88)。

肠道最初产生的 GLP-1为无活性的 37肽，需要切除 N末端 6肽后，形成具有生物活性的 GLP-1 (7-37)，其 C末端甘氨酸可以作为酰胺化酶的底物，降解为 GLP-1 (7-36)酰胺形式， C末端酰胺化增加了 GLP-1 的体内稳定性。肠道中天然产生的 GLP-1有 80%左右以后一种形式存在（KiefferTJ等， Endocr Rev， 1999, 25： 876-913)。食物在肠道的消化吸收过程中，刺激肠道 L细胞分泌 GLP-1, 其中糖类和脂类的刺激作用最强。正常人餐后 5-30分钟内，血浆 GLP-1浓度即显著上升。 GLP-1作为一种重要的肠降血糖素，其主要的生物学功能包括：（1)与胰岛 β细胞上的特异受体 GLP-1R结合，刺激胰岛素的生成与释放。该效应与葡萄糖浓度高低有关，当葡萄糖浓度高时，促胰岛素分泌的作用明显，当葡萄糖浓度降低时， GLP-1促胰岛素分泌的作用降低。（2)抑制胰岛 α细胞中胰高血糖素的释放，从而减少肝脏中葡萄糖原的分解释放。（3)提高胰岛素敏感度，改善胰岛中 β细胞的功能，促进 β细胞的增殖，减少细胞凋亡。（4)促进胰岛前体细胞分化为成熟的胰岛细胞。（5)降低胃排空的速度、抑制食欲 (Vaidya, HB 等， Curr Drug Targets, 2008, 9： 911-920)。

尽管天然 GLP-1在治疗糖尿病上有诸多优点，但在体内血浆半衰期很短限制了其临床上的直接应用。体内二肽酰基肽酶 IV (dipeptidyl peptidase IV，DPP IV)可特异性识别 GLP-1 N末端第二位的 Ala残基，从肽链的 N末端切除二肽，使 GLP-1在体内很快被降解为无活性的 GLP-1 (9-36)和 GLP- 1(9-37)，其生物半衰期仅为 2分钟左右。为了延长 GLP-1在体内的生物半衰期，以使其更好地作为治疗药物应用于临床，目前的研究热点是针对 GLP-1 进行结构改造，寻找能抵抗 DPP IV降解的特异性突变体 (ArulmozhiDK等， Eur J Pharm Sci， 2006, 28： 96-108)。

美国 Amylin公司和 Lilly公司在 GLP-1基础上开发的糖尿病药物 Exenatide成为第一个在 GLP-1 受体功能上衍生出来的治疗药物。 Exenatide是人工合成的 Exendin-4, 后者是一种在美洲毒蜥唾液中发现的含有 39个氨基酸的短肽，是一种有效的 GLP-1R激动剂（Eng J等， J Biol Chem, 1992， 267： 7402-7405 Exendin-4作为 GLP-1类似物，与 GLP-1具有 53%的同源性， N端第二位氨基酸为甘氨酸，可以防止被 DPP IV降解，延长了血浆半衰期。 GLP-1的 22位甘氨酸破坏了 GLP-1的空间螺旋结构，而在 Exendin-4中 16位的谷氨酸，对稳定 a螺旋起了重要作用。另 C末端含有 9个 GLP-1所没有的氨基酸（PSSGAPPPS), 不易被肽链内切酶降解，并可与 GLP-1R的 N末端结合，增强与 GLP-1受体亲和力（KoltermanOG, J Clin Endocrinol Metab, 2003,88:3082-3089 Exendin-4与 GLP-1的结构优势，使得 Exendin-4降低血糖的能力比 GLP-1强 5530倍。此外，由 Exendin-4衍生的 GLP-1 类似肽 ZP10, 同样表现出血中半衰期延长，可实现每日给药一次的治疗目的。 ZP 10是在 Exendin-4的 C末端增加了五个赖氨酸残基（KKKKK) (Petersen JS, Diabetologia, 2002, 45： A147 ) 的 Exendin-4衍生肽。

丹麦的 Novo Nordisk公司开发的酰胺化的 GLP-1衍生物 Liraglutide(Vilsb0ll T， Diabetes Care, 2007, 30： 1608-1610 ), 与天然的 GLP-1相比 34位 Lys被 Arg所替代，同时含有 16个碳的脂肪酸侧链通过谷氨酰基连接到 GLP-1的 26位 Lys上。 Liraglutide可与血浆中白蛋白形成非共价连接的衍生物，保留了 GLP-1的功能，拮抗 DPP IV的降解，其半衰期延长到 11-15小时，适合每天一次的给药方式 (Elbrond B， Diabetes Care, 2002, 25： 1398-1404)。正在开发的另一个 GLP-1类似物 CJC-1131中 C末端 37位赖氨酸经体外修饰后，可以与血浆中白蛋白中 34位半胱氨酸残基形成共价连接，同样可以实现一天给药一次的目标（Kim， JG， Diabetes, 2003 , 52： 751-759 )。由此可见，通过化学或基因工程手段，将 GLP-1 和 exendin-4经突变（1个或几个氨基酸）、缺失或添加氨基酸于 C末端的 GLP-1类似物，可以较好地保留生物活性。

在众多有关 GLP-1和人 FGF-21的公开专利和文献中（Christopher P. Prior PCT US03/26818, Craig A Rosen US2006/0194735 Al, Wolfgang Glaesner US2007/0036806, Wolfgang Glaesner PCT/US04/16611, Thomas P. CUJEC, US2008/0255045 Al ), 通过 GLP-1或者 FGF-21分别与人血白蛋白、人 IgG的 Fc片段、人转铁蛋白的融合表达（GLP-1-HAS、 GLP-1 -Fc、 GLP-1 -Transferrin, FGF-21 -HAS、 FGF-21 -Fc ), 能实现 GLP-1或 FGF-21在体内的半衰期延长，达到最长一周注射一次的功效；通过与聚乙二醇的化学修饰而形成的 PEG-GLP-1和 PEG-FGF-21同样实现了两者在体内半衰期的延长。

综上所述， GLP-1与 FGF-21是近年受关注度比较高的治疗糖尿病的多肽药物，前者结构和功能的研究已较充分，已有经 FDA批准上市的药物；后者降血糖的功效于 2004年被首次发现，在动物实验中显示了非常好的降血糖、降血脂的功效。由于临床上高血糖、高血脂往往伴随发生，但目前尚未见到综合运用二者生物活性、并克服了其血清半衰期短的缺陷而制成的具有双重调节血糖血脂作用的药物。发明内容

本发明根据上述领域的空白，提供一种将 GLP-1或其类似物 Exendin-4和人 FGF-21融合成双重调节肽，实现了双重调节血糖血脂的功能，还有效延长 GLP-1或 exendin-4血液半衰期，该融合肽可用于制备治疗高血糖和高血脂相关疾病如糖尿病、肥胖、脂肪肝、高脂血症代谢综合征或心血管疾病的药物。

双重调节血糖血脂融合蛋白，其肽链从 N端到 C端有如下几种连接方式： R1-R2, R2-R1 , R1-L-R2, R2-L-R1 ; 其中： R1为人成纤维细胞生长因子 21蛋白、或其突变体或活性片段； R2为胰高血糖素类似肽 1或其类似物，或其突变体或活性片段； L为连接肽。

所述肽链从 N端到 C端的连接方式优选 R2-R1或 R2-L-R1。

所述人成纤维细胞生长因子 21蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No: 1所示，其突变体或活性片段为具有如 SEQ ID No: 1所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被取代、缺失或添加而获得但不改变生物活性和功能的肽链。

所述胰高血糖素类似肽 1的氨基酸序列如 SEQ ID No: 2所示，其突变体或活性片段为具有如 SEQ ID No: 2所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被取代、缺失或添加而获得的但不改变生物活性和功能的肽链。

所述胰高血糖素类似肽 1的类似物为 Exendin-4, 其氨基酸序列如 SEQ ID No: 3所示。

所述胰高血糖素类似肽 1的类似物（Exendin-4) 的衍生物，为具有如 SEQ ID No: 3所示氨基酸序列中的一个或几个氨基酸残基被取代、缺失或添加得到的且与具有 SEQ ID No: 2所示氨基酸序列的肽链相同生物活性或功能的蛋白质。

所述连接肽由 5~30个氨基酸组成。

所述连接肽为：

( a) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n-(Ser)_m， n是 1-5之间的整数， m为 0或 1 ;

(b ) (Gly-Gly-Gly-Gly- Gly)_n-(Ser)_m, n是 1~5之间的整数， m为 0或 1 ;

( c ) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n-(Ser-Pro)_m, n是 5之间的整数， m为 0或 1；

(d) ( Pro-Glu-Ala-Pro-Thr-Asp)_n, n是 5之间的整数；

或 /和（e) ( Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)_n-(Ser-Pro)_m, n是 1~5之间的整数， m为 0或 1。

编码上述融合蛋白的基因片段。

包含上述基因片段的表达载体。

宿主细胞，其特征在于，它含有上述表达载体。

所述宿主细胞指大肠杆菌细胞、酵母细胞或 CHO细胞。

上述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

( a) 在所述宿主细胞中表达所述融合蛋白；

(b ) 分离、纯化所述融合蛋白。

上述融合蛋白在制备治疗糖尿病、肥胖、脂肪肝和高血脂症代谢综合症的药物中的应用。一种药物，其活性成分为上述融合蛋白。

在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，它包括：人成纤维细胞生长因子 21 (FGF-21 ) 的氨基酸序列、胰高血糖素类似肽（GLP-1或 Exendin-4 ) 的氨基酸序列以及两者之间的 5-30个氨基酸组成的连接肽序列。人成纤维细胞生长因子 21 (FGF-21 ) 氨基酸序列可以位于融合蛋白的 N末端，也可以位于融合蛋白的 C末端。较佳地，人 FGF-21位于融合蛋白的 C端。通过融合实现了 GLP-1与 FGF-21 在生物活性方面相辅相成的作用（1 ) 抑制胰高血糖素的生成，减少肝脏中糖原的分解释放；（2 ) 改善胰岛中 β细胞的功能，促进 β细胞的增殖；（3 )提高胰岛素敏感性，无低血糖和体重增加等不良反应的风险；（4 )改善脂代谢。两者通过不同的靶细胞上的相应受体或相同靶细胞上的不同受体而发挥调节血糖的作用。 FGF-21 降低血糖不依赖于胰岛素，同时可调节脂肪细胞中的脂代谢，起到降血脂的作用。而 GLP-1在调节肠道排空和降低食欲方面的生物作用可加强 FGF-21的调节血糖血脂的功能。

用于连接人 FGF-21和 GLP-1或 exendin-4的连接肽包括多种序列，如 ( GGGGG) _n， ( GGGGS ) _n、 ( SGGGG) _n、（SSSSG) _n等，其中 n代表 1-5的整数，形成由 5到 30个氨基酸组成的连接肽，连接肽序列中可以加入 Ser、 Pro的序列，该连接肽还可以是以上几种形式序列的任意组合，同样实现本发明延长融合蛋白半衰期的目的。

GLP-1除具有天然人 GLP-1的序列（SEQID No: 2 ) 夕卜，还包含由此经突变衍生出的突变体或衍生物，以及与 SEQID No: 2具有 40%以上同源性、保留了 GLP-1生物学功能的类似肽。 GLP-1的类似物主要指 Exendin-4，具有 SEQ ID No: 3的氨基酸序列特征。 Exendin-4具有优于天然 GLP-1的生物特异性，可抵抗 DDP IV和其他内肽酶的酶解，同时增强与 GLP-1受体的亲和性。

在本发明的第二方面，提供了一种克隆编码上述本发明上述融合蛋白的 DNA分子的方法，并提供该 DNA分子的核苷酸序列，如 SEQ ID No: 10所示。在本发明的第三方面，提供了含有上述 DNA分子的表达载体及其制备方法。

在本发明的第四方面，提供了包含上述表达载体的宿主细胞。在本发明的第五方面，提供了一种产生本发明融合蛋白的方法，它包括以下步骤：在合适表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；及分离所述的融合蛋白的方法。

本发明的融合蛋白实现了 GLP-1或 exendin-4和人 FGF-21的双重调节血糖血脂的功能，还实现了有效延长 GLP-1或 exendin-4血液半衰期的目的，其主要用途是作为治疗高血糖，高血脂等代谢障碍疾病的药物的活性成分，可添加药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂制成药物。

定义

如本文所用，术语" FGF-21和 GLP-1的融合蛋白"，指由人成纤维细胞生长因子 21氨基酸序列和胰高血糖素类似肽（GLP-1或 Exendin-4 )氨基酸序列融合而成的蛋白，其中人成纤维细胞生长因子 21 氨基酸序列可以位于融合蛋白的 N末端，也可以位于融合蛋白的 C末端；两者之间可以有或者无连接肽序列。

如本文所用，术语融合蛋白中"人成纤维细胞生长因子 21氨基酸序列"指所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，可以是序列表中 SEQ ID No: 1的氨基酸残基序列，或者是将 SEQ ID No: 1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与 SEQ ID No: 1的氨基酸残基序列相同活性的由 SEQ ID No: 1衍生的氨基酸序列。

如本文所引用，术语融合蛋白中"胰高血糖素类似肽（GLP-1或 Exendin-4 ) 氨基酸序列"指所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，可以是序列表中 SEQ ID No: 2或 SEQ ID No : 3的氨基酸残基序列，或者是将 SEQ ID No: 2或 SEQ ID No: 3的的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与 SEQ ID No: 2相同活性或功能的由 SEQ ID No: 2或 SEQ ID No: 3衍生的氨基酸序列。

如本文所引用，术语"连接肽 "指位于人成纤维细胞生长因子 21 氨基酸序列和胰高血糖素类似肽 (GLP-1或 Exendin-4) 氨基酸序列之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度通常为 5-30个氨基酸。技术人员可按照本领域常规方法设计连接肽。通常，连接肽不影响或严重影响成纤维细胞生长因子 21 和胰高血糖素类似肽氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。

编码本发明融合蛋白的 cDNA序列，可以全部人工合成。也可以用 PCR扩增或合成的方法获得 FGF-21和或 GLP-1的编码 DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的 cDNA序列。

在获得了本发明融合蛋白的 DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分析纯化得到本发明的融合蛋白。

如本文所用，术语"载体"包括质粒、表达载体、克隆载体、病毒载体。

在本文所用，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、 CHO细胞、 HEK293 细胞。可以通过公知的方法将含有目的基因的 DNA序列的载体转移到宿主细胞内，所采用的方法取决于细胞宿主的类型。例如，对原核细胞通常采用氯化钙转化法，而对于其他宿主细胞可以采用电穿孔法。

在本文所用，术语"纯化方法"包括常用的为本领域公知的纯化方法，包括离子交换层析、疏水作用层析、反相层析、透析、超滤、分子排阻层析；用 SDS-PAGE和 RP-HPLC检验，获得纯度大于 95%的融合蛋白。

至此已对本发明进行了详细的描述，通过参考下列实例，能够对本发明有更清楚地理解，所述实例仅为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。

附图说明

附图 1 : 人 FGF-21氨基酸序列 ( SEQ ID No: ! ) 附图 2: GLP-1 (7-37 ) 氨基酸序列（SEQ ID No:2 ) 与 Exendin-4氨基酸序列（SEQ ID No:3 ) 比对图附图 3 : Exendin4-GGGGGS-FGF21融合蛋白（代号： Ex4-L₆-F21 )氨基酸序列和相应的 cDNA序列（SEQ ID No: 10 )

附图 4: pET-3C- Ex4-L₆-F21构建示意图

附图 5 : pGAPZaA- Ex4-L₆-F21构建示意图

附图 6: _PET-3C-Ex4-L₆-F21重组表达 SDS-PAGE电泳图谱

(从左起，条带 1 : 诱导 4小时，条带 2: 诱导 3小时，条带 3 : 诱导前对照，条带 4: marker) 附图 7: 纯化后 Ex4-L₆-F21反相 HPLC图谱（A)和 SDS-PAGE电泳图谱（B，从左起，条带 1 : marker, 条带 2： Exendin4-FGF21纯化后蛋白）

附图 8 : D-Ex4-F21、 D-Ex4-L₆-F21、 D-Ex4-L₁₅-F21、 G-Ex4-F21、 G-Ex4-L₆-F21和 G-Ex4-L₁₅-F21 ) 和 Exendin-4在小鼠体内降血糖实验结果

具体实施方式

实例 1融合蛋白 Met-Exendin4-GGGGGS-FGF21 ( 代号： D-Ex4-L₆-F21 )在大肠杆菌中的重组表达和制备

在本实施例中，所涉及的 GLP-1和 FGF-21融合蛋白具有 Met-Exendin4-GGGGGS-FGF21结构。根据 Exendin-4和 FGF-21 的氨基酸序列，并按照大肠杆菌和酵母皆偏爱的密码子，委托宝生物（大连）有限公司进行全基因合成 Fgf-21的 cDNA序列如 SEQ ID NO:4所示； Exendin-4的 cDNA序列如 SEQ ID NO:5所示

根据设计要求合成引物，合成 4条引物 Pl、 P2、 P3、 P4。

PI : 5'- GC CAT ATG CAT GGT GAA GGTACC -3'(SEQ ID NO:6)

P2: 5'- GAGAACCACCGCCGCCACCAGATGGAGGTGGGGCACCAG-3'(SEQ ID NO:7)

P3: 5'-CTGGTGGCGGCGGTGGTTCTCACCCAATCCCAGATTCTA-3'(SEQ ID NO:8)

P4: 5' -GC GGA TCC TTA TCA TGA TGC ATA A -3'(SEQ ID NO:9)

注： PI中 GC为引物保护碱基 CATATG为 Nde I酶切位点； P4中 GC为引物保护碱基 GGATCC为 BamH I 酶切位点。

以 Exendin-4 cDNA序列为模板，用引物 P1和 P2扩增 Exendin-4基因（P1头部含有 Nde I酶切位点， P2尾部含有编码接头 GGGGGS的核苷酸序列），以 FGF-21 DNA序列为模板，用引物 P3和 P4扩增 FGF-21基因（P3头部含有编码接头 GGGGGS的核苷酸序列， P4尾部含有终止密码子和 BamH I酶切位点）；再以上部扩增的 Exendin-4、 FGF-21 片段为模板，用引物 P1 和 P4 扩增 Met-Exendin4-GGGGGS-FGF21基因。扩增的 M-Exendin4-GGGGGS-FGF21基因首尾分别加入 Nde I和 BamH I酶切位点，插入原核表达载体 pET-3C。

重叠延伸 PCR方法扩增 Met-Exendin4-GGGGGS-FGF21基因的反应体系均采用 PCR反应试剂盒 (TAKARA, 大连），按商家的说明书设置。 PCR反应条件为： 94°C lmin， 56 °C lmin, 72 °C lmin, 共 30个循环，第一个循环 94°C变性 10min，最后一个循环 72°C延伸 10min，结果显示分别获得了 120bp (Exendin-4), 560bp (FGF-21 ), 700bp ( Met-Exendin4-GGGGGS-FGF21 ) (SEQ ID NO: 10)的目标条带。

PCR产物经低熔点琼脂糖纯化后，用 Nde I和 BamH I双酶切后，回收目的片段，用 T4 DNA连接酶与同样经 Nde I和 BamH I酶切回收的质粒 pET-3C (购于 Invitrogen) 连接，转化大肠杆菌克隆宿主菌 DH5a，用酶切和 PCR验证的方法筛选重组质粒 pET-3C-Exendin4-GGGGGS-FGF21(附图 4)，经 DNA测序（TAKARA,大连）后表明，扩增的 Exendin4-GGGGGS-FGF21基因与设计完全一致（SEQ ID NO:10 将上述测序正确的质粒转化大肠杆菌表达宿主菌 BL21 Star (DE3 ) plysS (Novagen), 成功构建 pET-3C-Exendin4-GGGGGS-FGF21/BL21 Star ( DE3 ) plysS重组工程菌。

将表达最佳工程菌株划线接种于 LA琼脂平板， 37°C培养过夜。从过夜培养的 LA平板上挑取菌苔接种于含 LB液体培养基（胰蛋白胨 10g，酵母提取物 5g， NaCl 10g, 加水定溶至 1000mL， 121 °C , 高压灭菌 30min即可）试管中， 37°C培养 12小时，然后按 1%的比例转接到含 200mL LB培养液的 lOOOmL 三角瓶中， 37°C培养过夜即成为上罐种子液。将上罐种子液按 5%的比例接种于含 YT培养液的 30L发酵罐中， 37°C培养，整过发酵过程中，通过调节转速、通空气量、通纯氧量来保持溶氧在 30%以上，用 28%的氨水调节 pH并保持在 7.0。至菌液 OD600=10〜14时，加入终浓度为 0.5mmol/L IPTG, 继续培养 4小时后停止发酵（附图 6)，收集菌液， 8000rpm离心 10分钟，弃上清，收集菌体放入 -20°C冰箱保存备用。

从 -20°C冰箱中取出菌体，放入细菌裂解液（50mmol/L Tris-HCl pH10， 10mmol/L EDTA, 0.2 mg/mL 溶菌酶）， 37°C下搅拌 1小时，冷却后超声（400W，工作时间 5s，间歇 5s，超声 40个循环）， 12000rpm 离心 10分钟，弃上清，沉淀用洗涤液 A (20mmol/L Tris-HCl pH 10， 10 mmol/L EDTA, 2mol/L Urea, l%TritonX-100)溶解， 37°C搅拌 30min， 12000rpm离心 10分钟，弃上清，沉淀用溶液 B(20mmol/L Tris-HCl pH 10, 4mol/L Urea, l.Omol/L NaCl) 洗涤， 37°C搅拌 30min，再 12000rpm离心 10分钟，收集包涵体 (沉淀）。

包涵体的溶解和纯化：加入包涵体溶解液（8M尿素， 5 mM乙醇胺 pH11.5， 1/1000 β-ΜΕ, 2mmol/L EDTA)溶解包涵体，离心去除不溶物后溶解液用 Q-Sepharose FF柱分离。用 Q-Sepharose FF平衡液（8M 尿素， 5 mM 乙醇胺 ρΗ11.5， 1/1000β-ΜΕ, 2mmol/L EDTA) 平衡后，上溶解液样品，复平衡。用 0-500mmol/L的 NaCl线性洗脱，收集含融合蛋白的洗脱峰。

复性：经 Q-sepharose纯化的融合蛋白置于 4°C复性液（20mmol/L Tris-HCl pH9.0) 中进行透析复性，或者按 1 : 8加入复性液稀释复性 12小时。

精纯化：复性液再经过 RP-HPLC(Waters公司 C₁₈柱）（流动相 A液（0.1%三氟乙酸、 5%乙腈），流动相 B 液（0.1%三氟乙酸、 95%乙腈）， 0-100%B线性洗脱进行纯化。经 RP-HPLC纯化的目的样品再经 Superdex-75 ( Amersham Biosciences ) (缓冲为 PBS， pH7.4 ) 凝胶柱层析获得重组 Met-Exendin4-GGGGGS-FGF21融合蛋白，纯度大于 95.0% (附图 7)。实例 2融合蛋白 Met-Exendin4-(GGGGS)₃ -FGF21(代号： D-Ex4-L₁₅-F21)在大肠杆菌中的重组表达和制备

在本实施例中，所涉及的 GLP-1和 FGF-21融合蛋白具有 Met-Exendin4-(GGGGS)₃ -FGF21结构。将实例 1中鉴定序列正确的重组质粒 pET-3C-Exendin4-(GGGGS)-FGF21作为模板， PCR扩增融合蛋白具有 Met-Exendin4-(GGGGS)₃ -FGF21结构，根据设计要求合成 4条引物 Pl、 P5、 P6、 P4。

PI: 5'- GC CATATGCATGGTGAAGGTACC -3'(SEQ ID NO:6)

P5: 5'- GCC AGA GCC ACC GCC ACC GCT ACC GCC GCC ACC TGG AGG TG -3'(SEQ ID NO: 11) P6: 5'- AGC GGT GGC GGT GGC TCT GGC GGC GGT GGT TCT CAC CCA -3'(SEQ ID NO: 12)

P4: 5' -GC GGA TCC TTA TCA TGA TGC ATA A -3'(SEQ ID NO:9)

用引物 PI和 P5扩增 Exendin-4基因 [PI头部含有 Nde I酶切位点， P5尾部含有编码接头 (GGGGS)₃ 的核苷酸序列]，用引物 P6和 P4扩增 FGF-21基因（P6头部含有编码接头 (GGGGS)₃的核苷酸序列， P4尾部含有终止密码子和 BamH l酶切位点）；再以上部扩增的 E_Xendin-4、 FGF-21片段为模板，用引物 PI和 P4扩增 Met-Exendin4-(GGGGGS)₃-FGF21基因。扩增的 M-Exendin4-(GGGGGS)₃ -FGF21 基因首尾分别加入 Nde I和 BamH I酶切位点，插入原核表达载体 pET-3C。

扩增、表达，纯化同实例 1，得到纯度大于 95.0%的 Ex4-L₁₅-F21融合蛋白。实例 3融合蛋白 Met-Exendin4- -FGF21 (代号： D-Ex4 -F21 ) 在大肠杆菌中的重组表达和制备在本实施例中，所涉及的 GLP-1和 FGF-21融合蛋白具有 Met-Exendin4- -FGF21结构，根据设计要求合成 4条引物 Pl、 P7、 P8、 P4:

PI: 5' -GC CATATGCATGGTGAAGGTACC -3'(SEQ ID NO:6)

P7: 5' -AGAATC TGG GAT TGG GTG TGG AGG TGG TGC ACC AGA-3'(SEQ ID NO: 13)

P8: 5'- CAC CCAATC CCA GAT TCT AGT CCA CTG TTA CAA TTC -3'(SEQ ID NO: 14)

P4: 5' -GC GGA TCC TTA TCA TGA TGC ATA A-3'(SEQ ID NO:9)

以 Exendin-4 cDNA序列为模板，用引物 PI和 P7扩增 Exendin-4基因（PI头部含有 Nde I酶切位点， P2尾部含有编码 FGF-21的核苷酸序列），以 FGF-21 DNA序列为模板，用引物 P8和 P4扩增 FGF-21 基因（P8头部含有编码 Exendin-4的核苷酸序列， P4尾部含有终止密码子和 BamH I酶切位点）；再以上部扩增的 Exendin-4、 FGF-21片段为模板，用引物 P1和 P4扩增 Met-Exendin4- FGF21基因。扩增的 M-Exendin4- FGF21基因首尾分别加入 Nde I和 BamH I酶切位点，插入原核表达载体 pET-3C。

扩增、表达，纯化同实例 1，得到纯度大于 95.0%的 Ex4-F21融合蛋白。

实例 4融合蛋白 Met-Exendin4-GGGGGS-FGF21 ( 代号： G-Ex4-L₆-F21 ) 在酵母中的重组表达和制备

在本实施例中，所涉及的 GLP-1和 FGF-21融合蛋白具有 Exendin4-GGGGGS -FGF21结构，根据设计要求合成 4条引物 P9、 P2、 P3、 P10:

P9

P2 ' GAGAACCACCGCCGCCACCAGATGGAGGTGGGGCACCAG-3'(SEQ ID NO:7)

以 Exendin-4 cDNA序列为模板，用引物 P9和 P2扩增 Exendin-4基因（P9头部含有 Xho I酶切位点， P2尾部含有编码接头 GGGGGS的核苷酸序列），以 FGF-21 DNA序列为模板，用引物 P3和 P10 扩增 FGF-21基因（P3头部含有编码接头 GGGGGS的核苷酸序列， P10尾部含有终止密码子和 Not I 酶切位点）；再以上部扩增的 Exendin-4、 FGF-21 片段为模板，用引物 P9 和 P10 扩增 Exendin4-GGGGGS-FGF21基因。扩增其含 Xho I和 Not I酶切位点的 PCR片段，用 Xho I和 Not I双酶切后与 pGAPZaA (Invitrogen)连接，得到重组质粒 pGAPZaA-Exendin4-GGGGGS -FGF21 (附图 5 )。

将重组质粒用 Avr II线性化，用电转仪将线性化的重组质粒 pGAPZaA- Exendin4-GGGGGS-FGF21 导入 GS 115毕赤酵母（Invitrogen)中，经 His+和 Zeocin筛选，获得抗 Zeocin 1000mg/ml的高拷贝克隆菌。挑表达菌，接种于 5ml YPD培养基中， 3CTC过夜培养，转接入 250ml YPD培养基中表达 96小时。收集上清，经超滤后，用 Sepharose Q FF、 C₁₈柱和 Superdex-75纯化制备重组融合蛋白，纯度大于 95.0%。实例 5 融合蛋白 Ex4- (GGGGS) ₃-F21 (代号 G-Ex4-L₁₅-F21 ) 在酵母中的重组表达和制备

在本实施例中，所涉及的 GLP-1和 FGF-21融合蛋白具有 Exendin4- (GGGGS) ₃ -FGF21结构，根据设计要求合成引物。

合成 4条引物 P9、 P5、 P6 、 P10 P5: 5'- GCC AGA GCC ACC GCC ACC GCT ACC GCC GCC ACC TGG AGG TG -3'(SEQ ID NO: 11) P6: 5'- AGC GGT GGC GGT GGC TCT GGC GGC GGT GGT TCT CAC CCA -3'(SEQ ID NO: 12) 以实例 1中鉴定序列正确的重组质粒 pET-3C-Exendin4-(GGGGS) -FGF21作为模板， PCR扩增融合蛋白具有 Met-Exendin4-(GGGGS)₃ -FGF21结构。，用引物 P9和 P5扩增 Exendin-4基因， [P9头部含有 Xho I酶切位点， P5尾部含有编码接头 (GGGGS)₃的核苷酸序列]，用引物 P6和 P10扩增 FGF-21 基因（P6头部含有编码接头 (GGGGS)₃的核苷酸序列， P10尾部含有终止密码子和 Not I酶切位点）；再以上部扩增的 Exendin-4、 FGF-21片段为模板，用引物 P9和 P10扩增 Exendin4-(GGGGGS)₃-FGF21 基因。扩增的 E_Xendin4- FGF21 基因首尾分别加入 Xhol 和 Not I 酶切位点，插入真核表达载体 pGAPZaA。

将重组质粒用 Avr II线性化，用电转仪将线性化的重组质粒 pGAPZaA- Exendin4-FGF21 导入 GS115毕赤酵母（Invitrogen) 中，经 His+和 Zeocin筛选，获得抗 Zeocin 1000mg/ml的高拷贝克隆菌。挑表达菌，接种于 5ml YPD培养基中， 30°C过夜培养，转接入 250ml YPD培养基中表达 96小时。收集上清，经超滤后，用 Sepharose Q FF、 C₁₈柱和 Superdex-75纯化制备重组融合蛋白，纯度大于 95.0%。实例 6融合蛋白 Ex4-F21 (代号 G-Ex4-F21 ) 在酵母中的重组表达和制备

在本实施例中，所涉及的 GLP-1和 FGF-21融合蛋白具有 Exendin4-FGF21结构，根据设计要求合成引物。

合成 4条引物 P9、 P7、 P8 、 P10

P9 : 5' CTC GAG AAA AGA GAT GGT GGA GGT ACT TTT ACC GAT TCT 3' (SEQ ID NO : 15)

P7 : 5' -TTT AGA CAG ATC AGA GGT AAA GGT ACC TTC ACC ATG TGA TGC ATA AGA AGG— 3' (SEQ ID NO : 13) P8 : 5' - GGT CCA TCT CAA GGT CGT AGT CCT TCT TAT GCA TCA CAT GGT GAA GGT ACC TTT ACC -3' (SEQ ID NO : 14)

P10 : 5' GC GGCC GC TTA TCA TGA TGA TGC ATA AGA AGG ACT ACG ACC 3' (SEQ ID NO : 16)

以 Exendin-4 cDNA序列为模板，用引物 P9和 P7扩增 Exendin-4基因（P9头部含有 Xhol酶切位点， P7尾部含有编码 FGF-21的核苷酸序列），以 FGF-21 DNA序列为模板，用引物 P8和 P10扩增 FGF-21 基因（P8头部含有编码 Exendin-4的核苷酸序列， P10尾部含有终止密码子和 Not I酶切位点）；再以上部扩增的 Exendin-4、FGF-21片段为模板，用引物 P9和 P10扩增 Exendin4- FGF21基因。扩增的 Exendin4- FGF21基因首尾分别加入 Xhol和 Not I酶切位点，插入真核表达载体 pGAPZaA。

将重组质粒用 Avr II线性化，用电转仪将线性化的重组质粒 pGAPZaA- Exendin4-FGF21导入 GS115 毕赤酵母（Invitrogen) 中，经 His+和 Zeocin筛选，获得抗 Zeocin 1000mg/ml的高拷贝克隆菌。挑表达菌，接种于 5ml YPD培养基中， 30°C过夜培养，转接入 250ml YPD培养基中，表达 96小时。收集上清，经超滤后，用 Sepharose Q FF、 C₁₈柱和 Superdex-75纯化制备重组融合蛋白，纯度大于 95.0%。

实例 7 大肠杆菌表达的融合蛋白（代号分别为： D-Ex4-F21、 D-Ex4-L₆-F21和 D-Ex4-L₁₅-F21 ) 以及酵母表达的融合蛋白（代号分别为： G-Ex4-F21、 G-Ex4-L₆-F21和 G-Ex4-L₁₅-F21 ) 与 GLP-1受体结合功能检测

口服葡萄糖耐受实验：取 8-10周 Balb/cH (重庆医科大学动物中心，清洁级)，随机分为八组，每组 15 只：空白对照组、 Exendin-4 (由成都迅提生物技术公司合成，以下同）对照组、融合蛋白 D-Ex4-F21、 D-Ex4-L₆-F21、 D-Ex4-L₁₅-F21和 G-Ex4-F21、 G-Ex4-L₆-F21、 G-Ex4-L₁₅-F21组。实验前 1 天禁食 (不禁水) 16-18小时后，腹腔分别注射 25ug/kg 的 D-Ex4-F21、 D-Ex4-L₆-F21、 D-Ex4-L₁₅-F21、 G-Ex4-F21、 G-Ex4-L₆-F21、 G-Ex4-L₁₅-F21和 5ug/kg Exendin-4(具有相同摩尔浓度 1ηΜ)。给药后 0.5小时灌胃 1.5mg/kg体重的葡萄糖，在给糖后 30min、 lh、 2h、 4h、 6h后取血，检测血糖浓度。结果显示，给药后 Exendin-4和各种融合蛋白均匀有较好的降血糖作用。相同结构，不同表达系统，酵母表达的融合蛋白降糖作用明显强于大肠杆菌表达。 G-Ex4-L₆-F21的降糖作用与 Exendin-4无明显差异。 G-Ex4-F21 的降糖作用约为 G-Ex4-L₆-F21 的 60%。 G-Ex4-L₁₅-F21 的降糖作用比 G-Ex4-L₆-F21 约强 10%。 G-Ex4-L₁₅-F2和 G-Ex4-L₆-F21在体内降糖作用维持时间最长，在给药 2小时后仍具有明显的降血糖效果（附图 8 )。

诱导产生 cAMP实验：将 INS- 1细胞以每孔 5χ 10⁴个细胞的密度在 24孔细胞培养板中培养，先让细胞在加有 100um/L IBMX 的 450ul 的无血清 SF-RPMI培养基内培养 5h。然后加入含不同浓度的 Exendin-4 或 D-Ex4-F21 或 D-Ex4-L₆-F21 或 D-Ex4-L₁₅-F21 或 G-Ex4-F21 或 G-Ex4-L₆-F21 或 G-Ex4-L₁₅-F21的 SF-RPMI培养基（每个浓度 3个复孔），培养 10分钟，每孔加入 1ml冰冻乙醇终止反应。细胞培养液上清经冷冻干燥后，用原培养液 1/8体积的醋酸钠缓冲复溶，再用 cAMP EIA(R& D公司)试剂盒检测。结果表明，以葡萄糖含量为零时， D-Ex4-L₆-F21处理的 INS- 1细胞内 cAMP水平作为基线水平测量 cAMP。在 5mM葡萄糖存在的情况下，经 Exendin-4或各种融合蛋白处理的 INS- 1细胞 cAMP水平显著增加，相同结构，不同表达系统，酵母表达的融合蛋白降糖作用明显强于大肠杆菌表达的蛋白。 G-Ex4-L₆-F21与相同摩尔浓度的 Exendin-4处理的细胞中 cAMP水平几乎相同。 G-Ex4-F21弱约 30%, G-Ex4-L₁₅-F21约强。

实例 8大肠杆菌表达的融合蛋白以及酵母表达的融合蛋白与 FGF-21受体结合功能检测细胞培养及诱导分化：在 37°C、5%C02 的条件下， 3T3-L1前脂肪细胞在含 10%FBS 的高糖 DMEM 中培养， 2天后加入含 0.5mmol/L IBMX、 Ι μπιοΐ/L地塞米松、 10mg/L人胰岛素的高糖 DMEM培养 48 hr，再换含 10mg/L人胰岛素的高糖 DMEM培养 48hr，诱导分化 8~12天的 3T3-L1细胞 90%左右呈脂肪细胞表型，用于以下实验。

葡萄糖转运分析： 24 孔板中 3T3-L1脂肪细胞，同时分别加入含重组人 FGF-21 (重庆富进生物医药有限公司提供，以下同）或 D-Ex4-F21或 D-Ex4-L₆-F21或 D-Ex4-L₁₅-F21或 G-Ex4-F21或 G-Ex4-L₆-F21 或 G-Ex4-L₁₅-F21 的培养基 ( 0.2%BSA的高糖 DMEM ) , 使终浓度分别为 0、 0.03、 0.15、 0.8、 4、 20 和 ΙΟΟηΜ (每个浓度 3复孔）， 37°C下培养 24小时。

葡萄糖被摄取检测：用加热（37°C ) 的 KRP缓冲液（NaCl 131.2 mmol/L，KC1 4.7 mmol/L，MgS04

1.2 mmol/L, CaC12 2.5 mmol/L, NaH2P04 2.5 mmol/L, pH 7.4)，洗涤两次； 37°C下，在含有 1%BSA、

0.2μοί/?ί 2-脱氧- 〔14C〕 -葡萄糖（ΙΟΟμΙ ) 的 KRP缓冲液孵育 lhr，加入 lOumol/1细胞松弛素 B终止葡萄糖的摄取。另设一组加 ΙΟμπιοΙ/L细胞松弛素 B ( cytochalasin B ) 作为 2-脱氧- ( 14C ) -葡萄糖的非特异摄取率，所有数据减去此值，作为各组细胞的葡萄糖摄取率。

表 1不同蛋白终浓度（nm) 下的葡萄糖摄取率 CPM

不同蛋白终浓度（nm) 下的葡萄糖摄取率 CPM

分组

OnM 0.03nM 0.15nM 0.8nM 4nM 20nM lOOnM

FGF-21 1875土 215 1801土 247 2107土 167 2203土 233 3300±251 ^ 5132土 280 T 5325土 263 T

D-Ex4-F21 1903土 222 1989土 249 2032土 198 2103土 218 2686土 247· 3542土 218* 3903土 229*

G-Ex4-F21 1945土 227 2199土 193 2188土 172 2206土 185 3108土 234 4006土 233* 4319土 241 *

D-Ex4-L₆-F21 2083土 204 1990土 188 2157土 183 2252土 170 3685土 266 T 4579土 257 T 4874土 273 T G-Ex4-L₆-F21 2028土 187 2087土 229 2274土 218 2411土 170 4193土 276 5237土 268， 5239土 269 T D-Ex4-L₁₅-F21 1849土 173 1896土 202 2209土 198 2315土 207 3838土 252 4796土 246 T 4882土 256 T G-Ex4-L₁₅-F21 2126土 190 2031土 204 2244土 191 2396土 236 4332土 281 5390土 262 T 5506土 275，与 FGF-21比较 ·Ρ<0.05， *P<0.01，与 0.8nM浓度比较 P<0.05， TP<0.01

结果表明各种融合蛋白与重组人 FGF-21在浓度在 0.8ηΜ以上时，均可促进脂肪细胞摄取葡萄糖。相同结构，不同表达系统，酵母表达的融合蛋白作用明显强于大肠杆菌表达的蛋白。 G-Ex4-L₆-F21 与 FGF-21无明显差异。 G-Ex4-F21的作用弱于 G-Ex4-L₆-F21。 G-Ex4-L₁₅-F21的作用比 G-Ex4-L₆-F21约强。

实例 9 ₀6/₀6小鼠模型实验

使用雄性 ob/ob 小鼠肥胖症模型评价经重组人 FGF-21、 Exendin-4和融合蛋白 G-Ex4-L₆-F21 和 G-Ex4-L₁₅-F21治疗后， ob/ob小鼠的血糖水平和甘油三酯水平。

取 8周大的 ob/ob小鼠 (成都达硕实验动物中心)随机分成五组，每组 16只。模型对照组、 FGF-21 组、 Exendin-4组、 G-Ex4-L₆-F21和 G-Ex4-L₁₅-F21组。对照组皮下注射生理盐水，连续注射 7天； FGF-21 组按 5.(^g/kg/day 连续注射 7 天； Exendin-4 组按 l.(^g/kg/day 连续注射 7 天； G-Ex4-L₆-F21 和 G-Ex4-L₁₅-F21组按 5.(^g/kg/day，连续注射 7天。给药后 1小时通过小鼠尾部取血，测其血糖或血脂浓度。

表 2: 连续给药 7天的血糖变化结果 ( ±S，n=8)

. . 给药后 ob/ob小鼠的血糖浓度（mMol/L)

0天 2天 4天 6天 7天

模型对照组 15.9土 2.1 15.6土 1.9 15.7土 2.5 16.1土 2.2 16.5土1.9

FGF-21 15.8土 2.0 15.1土 2.0 14.9土1.7 14.0土 13.4土 1.4*

Exendin-4 16.2土 2.3 15.2土 2.0 13.7土 2.1☆ 12.3土 1.5* 12.1土 1.7*

G-Ex4-L₆-F21 16.5土1.8 14.4土1.3 10.8土 1.2* 9.72土 1.3* 9.0土 1.0*

G-Ex4-L₁₅-F21 16.0土 1.9 14.0土 1.8 10.1土 1.4* 9.38土 U* 9.1土 1.0*

与模型对照组比较irP<0.05， *P<0.01

表 3 : 连续给药 7天的血脂变化结果 ( ±S，n=8)

给药后 ob/ob小鼠的血甘油三脂浓度（mg/dl )

分组

4天 7天

模型对照组 124土 13.1 132土 15.2

FGF-21 93土 14.4* 82土 11.3*

Exendin-4组 136土 19.3 124土 17.8

G-Ex4-L₆-F21 87土 15.5* 65土 10.0*

G-Ex4-L₁₅-F21 78土 13.3* 57土 9.6*

与对照组比较 *P<0.01

结果表明 G-Ex4-L₆-F21和 G-Ex4-L₁₅-F21在连续给药 7天的实验过程中，可有效地降低 ob/ob小鼠的血糖和血脂水平。

实例 10 融合蛋白（G-Ex4-L₆-F21和 G-Ex4-L₁₅-F21 )对高脂饮食引起 C57BL/6J小鼠脂肪肝模型的影响实验用 C57BL/6J小鼠，体重约 20 g，词料为 reaserch diets 公司 60%脂肪热能的啮齿动物词料（货号： D 12492 ) ; 配方成分为：酪蛋白 200 g 、胱氨酸 3 g、麦芽糊精 125 g 、蔗糖 68.8 g 、纤维素 50 g 、豆油 25 g、猪油 245 g、复合矿物质 10 g、磷酸氢钙 13 g、碳酸钙 5.5 g 、柠檬酸钾 16.5 g、复合维生素 10 g、酒石酸氢胆碱 2 g。连续喂养 8周后，称重，体重超过正常体重的 20 %为成模小鼠，随机分成 5组，每组 10只。模型对照组、 FGF-21组、 Exendin-4组、 G-Ex4-L₆-F21和 G-Ex4-L₁₅-F21组，同时设正常 C57BL/6J 小鼠为空白对照。模型组对照组和空白对照组皮下注射生理盐水； FGF-21 组按 5.(^g/kg/day皮下注射； Exendin-4组按 l.O g/kg/day皮下注射； G-Ex4-L₆-F21和 G-Ex4-L₁₅-F21组按 5.(^g/kg/day，皮下注射，均连续给药 30天。继续高指饮食，正常饮水。最后 1次给药后 1小时取血，测甘油三酯（TG)、总胆固醇（TC ) 低密度脂蛋白（LDL)、高密度脂蛋白（HDL)。取肝脏行病理检査。

肝脏病理结果显示：正常组大鼠肝小叶结构正常，以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞索排列正常，胞核呈圆形，形态规则，肝细胞内无脂滴堆积。模型对照组和 Exendin-4组肝小叶结构模糊不清，部分肝细胞索结构消失，肝细胞排列紊乱，肝细胞弥漫性脂肪变性，并有灶性坏死、较多慢性炎症细胞浸润和少数中性粒细胞浸润。 G-Ex4-L₆-F21、 G-Ex4-L₁₅-F21和 FGF21组脂肪肝的变性程度减轻，肝小叶结构尚存，肝组织结构大致正常，部分肝细胞索排列紊乱，肝窦变狭，汇管区周围少数肝细胞现轻度水肿和脂肪变。

表 4: 连续给药 30天的血脂变化结果 ( ±S，n=10)

分组 TG(mmol/l) TC (匪 ol/l) LDL(mmol/l) HDL(mmol/l) 空白对照 0.63土 0.15^s " 1.36土 0.28* 0.30土 0.11* 1.12±0.36* 模型对照组 9.38土 2.24 3.11土 1.03 2.45土0.61 0.56土 0.18

FGF-21 3.53土 1.21^s ¹⁵ 1.95土 1.26土 0.92土

Exendin-4组 9.03土 2.45 3.31土 1.25 2.18土 0.78 0.43土 0.11

G-Ex4-L₆-F21 2.95土 0.83^s " 2.12土0.77 0.97土 0.25* 1.23土 0.40*

G-Ex4-L₁₅-F21 2.65土 0.78^s " 1.76土 0.68* 0.90土 0.28* 1.28土 0.39*

与模型对照组比较irP<0.05， *P<0.01

以上结果表明 G-Ex4-L₆-F21、 G-Ex4-L₁₅-F21和 FGF-21在连续给药 30天后，可有效的降低模型动物的甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白，升高高密度脂蛋白，对脂肪肝有很好的治疗作用。 Exendin-4 对脂代谢无明显影响。

Claims

权利要求书

1.双重调节血糖血脂融合蛋白，其肽链从 N 端到 C 端有如下几种连接方式：

R1-R2, R2-R1 , R1-L-R2, R2-L-R1；其中： R1为人成纤维细胞生长因子 21 蛋白、或其突变体或活性片段； R2为胰高血糖素类似肽 1或其类似物，或其突变体或活性片段； L为连接肽。

2. 根据权利要求书 1所述的融合蛋白，所述肽链的结构为 R2-R1或 R2-L-R1。

3. 根据权利要求书 1所述的融合蛋白，所述人成纤维细胞生长因子 21蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No: 1所示，其突变体或活性片段指具有如 SEQ ID No: 1 所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被取代、缺失或添加而获得但不改变生物活性和功能的肽链。

4.根据权利要求书 1所述的融合蛋白，所述胰高血糖素类似肽 1的氨基酸序列如

SEQ ID No: 2所示，其突变体或活性片段指具有如 SEQ ID No: 2所示氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被取代、缺失或添加而获得的但不改变生物活性和功能的肽链。

5.根据权利要求书 1 所述的融合蛋白，所述胰高血糖素类似肽 1 的类似物为

Exendin-4, 其氨基酸序列如 SEQ ID No: 3所示。

6.根据权利要求书 5 所述的融合蛋白，所述胰高血糖素类似肽 1 的类似物

(Exendin-4) 的衍生物，为具有如 SEQ ID No: 3所示氨基酸序列中的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加得到的且与具有 SEQ ID No: 2所示氨基酸序列的肽链相同生物活性或功能的蛋白质。

7.根据权利要求书 1所述的融合蛋白，所述连接肽由 5~30个氨基酸组成。

8.根据权利要求书 7所述的融合蛋白，所述连接肽为：

(a) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n-(Ser)_m, n是 1~5之间的整数， m为 0或 1 ;

(b) (Gly-Gly-Gly-Gly- Gly)_n-(Ser)_m， n是 1~5之间的整数， m为 0或 1 ;

(c) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n-(Ser-Pro)_m, n是 1~5之间的整数， m为 0或 1 ;

(d) ( Pro-Glu-Ala-Pro-Thr-Asp)_n, n是 1~5之间的整数；

或 /和 (e) ( Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)_n-(Ser-Pro)_m, n是 1~5之间的整数， m为 0 或 1。

9.编码权利要求 1~8所述任一融合蛋白的基因片段。

10.包含权利要求 9所述的基因片段的表达载体。

11宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求 10所述的表达载体。

12.根据权利要求 11所述的宿主细胞，指大肠杆菌细胞、酵母细胞或 CHO细胞。

13.权利要求 1~8所述任一融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(a) 培养权利要求 11或 12所述的宿主细胞，使其表达所述融合蛋白；

(b ) 分离、纯化所述融合蛋白。

14.权利要求 1~8所述任一融合蛋白在制备治疗肥胖症、糖尿病、高血糖症或高血脂症代谢综合症的药物中的应用。

15.—种药物，其活性成分为权利要求 1~8所述任一融合蛋白。