CN105132459B - 人类ptx3重组蛋白的制备方法及应用 - Google Patents

人类ptx3重组蛋白的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种人类PTX3重组蛋白的制备方法及应用，包括：构建人类PTX3重组蛋白真核细胞表达载体、敲除CHO‑K1细胞中的促凋亡因子、磷酸钙转染程序以及人类PTX3重组蛋白富集和纯化，本发明构建了能在哺乳动物细胞中稳定高表达蛋白的载体，通过抗生素筛选以及培养液条件的改进，建立产量较高，表达稳定。

Description

人类PTX3重组蛋白的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种人类重组蛋白的制备方法，具体涉及到人类PTX3重组蛋白的制备方法及应用。
技术背景
五聚素3(PTX3)是五聚素蛋白家族成员之一，属于长链五聚体蛋白。PTX3是急性期反应蛋白的一种。研究表明，PTX3是一种可溶性病原模式识别受体(PRR)，可迅速选择性识别入侵的外源病原体并与之结合，这是激发机体先天性免疫和继发性免疫应答，从而清除入侵病原体的关键的第一步。同时，细胞培养和动物模型已证实，PTX3可以选择性地高亲和力地与某些病原体，包括巨细胞病毒(CMV)，流感病毒(Influenza)，鼠肝炎病毒(MHV)，鼠伤寒沙门菌和铜绿假单胞菌以及烟曲霉菌等结合，引起初次和二次免疫应答，刺激炎性细胞因子表达，激活补体系统，刺激炎性细胞的吞噬功能，进而导致入侵病原体的限制与清除，减轻病原体对身体的损伤。因此，PTX3被认为具有十分巨大临床治疗药用价值。
2003年，始于中国的病毒感染引起的严重急性呼吸综合症(SARS)导致了全球性的恐慌。此后，几次禽流感/猪流感大流行依然是全球公共健康最严重的威胁之一。其后，中国出现的新型H7N9禽流感病毒，以及最近在中东与东亚流行的MERS，均有潜力成为大流行病毒。这些病毒可从动物传染到人类，具有极高的死亡率。虽然已投入巨资，特异性抗病毒药物的研制却并没有取得显著的进展。应用小鼠感染MHV1病毒可诱发如SARS样的急性肺损伤模型。我们的研究证明重组表达的PTX3可直接与MHV病毒结合并显着性地抑制病毒复制。内源性PTX3或给予重组表达的PTX3可以增强被感染的动物的病毒清除，并保护他们免受严重的肺部损伤。其他的研究也表明内源性PTX3表达或给予外源性重组PTX3具有抗真菌和抗细菌作用。PTX3基因敲除导致转基因小鼠对肺病毒与真菌感染的易感性增高，给予重组表达的PTX3则恢复其对病毒与真菌感染抵抗力。提高PTX3表达水平(基因敲入)已证明可提高动物对内毒素血症和败血症的存活率。
利用重组DNA来表达多种生物活性的蛋白质，是一种先进的分子生物学技术，它被广泛应用于生物和医学研究。而保证重组蛋白质具有充分的生物活性与功能的关键则完全依赖于其合成后正确的折叠(Folding)和翻译后修饰(Post translationalmodification)例如磷酸化、二硫键的形成以及人类特异的糖基化。
目前PTX3主要靠原核蛋白重组表达获得，虽然利用原核细胞表达重组PTX3有较高的得率，但其因缺乏真核细胞的后期折叠修饰机制，因此其生物活性有限。而由哺乳动物细胞表达的重组蛋白则能很好地弥补这些缺陷，使其所表达的重组蛋白具有类似于天然蛋白的生物活性。为了表达结构修饰完善，具有高生物活性的PTX3，我们选择中华仓鼠卵巢细胞(CHO)作为表达靶细胞，并对其进行了基因改造使之成为可长时间高密度持续培养的抗凋亡细胞。我们还构建了含抗新霉素基因的可在哺乳动物细胞系统中表达人类PTX3重组蛋白的DNA载体，建立了可稳定表达重组人类PTX3蛋白的哺乳动物(CHO-K1)细胞株。初步提纯后经细胞与动物实验检测表明，重组人类PTX3蛋白具有很高的生物功能活性，对治疗呼吸道SARS样病毒感染具有药理治疗价值。
在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO-K1细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题：
①构建的重组CHO-K1细胞生产效率低，产物浓度亦低；
②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化；
③重组CHO-K1细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高效表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少；
④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。
发明内容
本发明提供了一种人类PTX3重组蛋白的制备方法，提高了人类PTX3重组蛋白的产出率。
本发明提供了一种从人类的原代上皮细胞中提取携带人类PTX3蛋白信息mRNA进而制备PTX3重组蛋白的方法。人类的原代上皮细胞类型单一极其接近自然状态，RNA酶活性低，提取的RNA产量高，纯度高，无降解，保证了核苷酸序列的完整性，使反转录合成cDNA的成功率大大提高。
本发明通过重组载体转化至大肠杆菌，氨苄青霉素选择培育扩增阳性转化菌落提取所构建的PTX3表达质粒，并以特异性内切酶消化与核苷酸测序相结合的方法确定所构建的正确性。
本发明提供了一种对CHO-K1细胞的内源性基因进行特异性改造，敲除其促凋亡因子bax和bak基因的方法。建立了具有抗凋亡特性的重组CHO-K1细胞，提高了重组蛋白表达细胞持续存活时间与细胞培养密度，有利于重组蛋白的积累，进而提高了重组蛋白产出率。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种人类PTX3重组蛋白的制备方法，所述方法包括以下步骤：
S1、从人类的原代上皮细胞中提取携带PTX3蛋白翻译信息的mRNA，设计特异性引物，以所述mRNA为模板，合成cDNA，并在所述cDNA的两端分别引入限制性酶切位点BamH I和Bg1 II；
S2、用内切酶暴露出真核细胞表达载体pSG5上的BamH I和Bg1 II粘性末端，将上述带有BamH I和Bg1 II末端的所述cDNA克隆到所述表达载体上构建pSG5/PTX3载体，在所述pSG5/PTX3载体中插入新霉素抗性基因，构建重组载体pSG5/neo/PTX3；
S3、将所述重组表达载体转化至大肠杆菌中，用氨苄青霉素培养基筛选出阳性菌落，扩增阳性转化菌落，提取所述重组载体进行测序鉴定；
S4、敲除CHO-K1细胞中Bax和Bak基因，得到具有抗凋亡特性的目标细胞并冷藏；
S5、以纯化并测序鉴定后的所述重组载体转染所述目标细胞中以得到表达细胞，培育并筛选稳定高产的PTX3重组蛋白表达细胞株，从所述表达细胞的培养液中富集并纯化人类PTX3重组蛋白。
优选地，对所述CHO-K1细胞进行基因敲除的步骤具体包括：
S41、合成编码Bak锌指蛋白的第一基因和编码Bax锌指蛋白的第二基因，并分别与非特异性核酸内切酶基因Fok I杂合；
S42、将所述第一基因、第二基因以及所融合的非特异性核酸内切酶Fok I基因片段一并插入带有抗卡那霉素基因的pVAX1载体中，构建特异性内源性基因敲除载体；
S43、将所述特异性内源性基因敲除载体转入所述CHO-K1细胞中，所述转染的CHO-K1细胞表达的所述带有非特异性核酸内切酶Fok I的Bak锌指蛋白和Bax锌指蛋白，分别特异性的锚定到所述CHO-K1细胞自身的Bak和Bax基因，进而敲除所述促凋亡因子，得到所述目标细胞。
优选地，所述步骤S4中所述目标细胞转染所述重组载体之前还包括以下步骤：
S44、在转染前7天，将所述目标细胞用添加有体积分数为10％的胎牛血清的F12培养液培养于24孔板中；
S45、在转染前6天至转染前1天的期间，每天更换培养液的同时丢弃一半数目的所述目标细胞，使用由CD-CHO无血清培养液和含有体积分数为10％的胎牛血清的F12培养液组成的混合培养液培养，其中所述混合培养液中的胎牛血清的体积分数每天递减2％，直至为0，在转染前1天将所述目标细胞转移至6孔培养板中，每孔装有2mL的所述目标细胞悬浮液。
优选地，所述F12培养液中添加4.76g/L的HEPES和125mg/L L-glutamine。
优选地，所述6孔板中每孔细胞数为2.7×105个。
优选地，所述步骤S5中所述目标细胞转染所述重组载体之后，表达细胞的筛选培育具体步骤如下：
S51、将所述重组载体转染的目标细胞转移至T25培养瓶中，并在培养液中添加700μg/mL的G418；
S52、待表达细胞在含有700μg/mL G418的培养液中扩增至培养瓶底面积的80％时，将一瓶中的所述表达细胞均分至3瓶培养，并将培养液中G418的浓度减少至200μg/mL；
S53、待表达细胞繁殖融合至培养瓶底面积的50％时，将这3瓶中的细胞汇总并记录细胞的总数。
优选地，所述步骤S5中筛选表达细胞具体包括以下步骤：
S54、取步骤S53中的经G418选择培养的阳性表达细胞进行序列稀释后培养于3块96孔培养板上，每个孔加200μL细胞悬液约含5个表达细胞；待细胞繁殖融合至底面积1/3时，取上清做PTX3 Dot-Blot检测，选择PTX3强阳性孔的细胞集落进行再次亚克隆筛选；
S55、待亚克隆细胞融合度达底面积1/3时，取细胞上清液重复PTX3 Dot-Blot检测，挑选强阳性的细胞克隆做进一步筛选扩增，如此反复进行多次筛选，直至所有细胞克隆孔的上清培养液PTX3 Dot-Blot检测均达强阳性后，再次从亚克隆培养板中以Dot-Blot的阳性强度挑选数株阳性强度最高的CHO细胞克隆孔，重复Dot-Blot检测，用已知浓度的纯化PTX3蛋白样本经序列稀释后制备标准曲线，通过阳性强度对比，评估各阳性细胞株的重组蛋白产量，建立稳定高产的CHO细胞克隆株。
优选地，所述步骤S5中纯化人类PTX3重组蛋白的方法为依次采用阴离子交换法、羟磷灰石法以及排阻色谱法纯化法。
一种如权利要求1所述的人类PTX3重组蛋白在制备抗SARS的药物组合物中的用途。
本发明的有益效果
1、从人类的原代上皮细胞中提取携带人类PTX3蛋白信息mRNA。由于本方法mRNA是从类型单一极其接近自然状态人类原代上皮细胞中所提取，因而具有RNA酶活性低，RNA提取产量高，纯度高，无降解等优点。保证了核苷酸序列的完整性，使反转录合成cDNA的成功率大大提高。
2、将所述重组表达载体转化至大肠杆菌中，用氨苄青霉素培养基筛选出阳性菌落，扩增阳性转化菌落，提取所述重组载体进行特异性内切酶消化和核苷酸测序双重鉴定，确保所构建的pSG5/neo/PTX3载体正确无误；通过先将重组载体转化至大肠杆菌中培育转化体，以达到蓄积大量测序正确的重组表达载体pSG5/neo/PTX3的目的。
3、通过将CHO-K1细胞中的促凋亡因子bax和bak基因敲除，建立了具有抗凋亡功能的CHO细胞，提高了重组蛋白表达细胞持续存活时间与细胞培养密度，进一步提高了重组蛋白的产出率。
4、本发明构建了能在哺乳动物细胞中稳定高表达蛋白的载体，通过抗生素筛选以及培养液条件的改进，建立产量较高，表达稳定，适合悬浮培养的细胞株，初选出来的细胞株的人类PTX3重组蛋白产量＞50mg/L，同时，我们采用阴离子交换法、羟磷灰石法以及排阻色谱法纯化法等三种方法纯化PTX3重组蛋白，使得重组蛋白回收率达到69％，纯度达到95％。
5、本发明所制备的人类PTX3重组蛋白经体外细胞测试与体内动物模型应用，证明其能与SARS样病毒结合，并抑制病毒复制，对病毒的呼吸道感染具有治疗药理价值。
附图说明
图1：本发明的pSG5/PTX3的构建示意图；
图2：本发明的pSG5/PTX3/neo的构建示意图；
图3：本发明的锌指蛋白制备及其基因敲除结构示意图；
图4：本发明的重组蛋白PTX3纯化后的Western Blot检测结果示意图；
图5：本发明的PTX3对小鼠MHV1的亲和力测定示意图；
图6：本发明的PTX3对小鼠MHV1繁殖的抑制作用的示意图；
图7：本发明的PTX3重组蛋白对病毒感染引起的肺损伤程度示意图；
图8：本发明的PTX3重组蛋白对病毒的清除作用示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明一种人类PTX3重组蛋白的制备方法，所述方法包括以下步骤：
S1、从人类的原代上皮细胞中提取携带PTX3蛋白翻译信息的mRNA，设计特异性引物，以所述mRNA为模板，合成cDNA，并在所述cDNA的两端分别引入限制性酶切位点BamH I和Bg1 II；
S2、用内切酶暴露出真核细胞表达载体pSG5上的BamH I和Bg1 II粘性末端，将上述带有BamH I和Bg1 II末端的所述cDNA克隆到所述表达载体上构建pSG5/PTX3载体，在所述pSG5/PTX3载体中插入新霉素抗性基因，构建重组载体pSG5/neo-/PTX3；
在表达载体pSG5/PTX3中插入新霉素抗性基因，形成pSG5/PTX3/neo重组表达载体，以新霉素抗性筛选稳定的转染CHO-K1细胞。只有表达载体转染阳性的细胞，才能够合成并分泌新霉素抗性蛋白，从而帮助细胞抵抗G418的攻击。在pSG5载体的BamH I和Bg1 II这两个酶切位点间没有其他有用序列，酶切以后不会影响本身的功能，能够最大限度的保持pSG5载体的功能完整性；
S3、将所述重组载体转化至大肠杆菌宿主菌株DH5α中，通过在补充有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基上培育筛选出阳性转化菌落；小批量培养阳性菌落并提取载体，并用BamH I和Bg1 II对载体进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定插入片段大小，并切胶回收，测序鉴定；鉴定无误后，将所述重组载体转化阳性的菌落扩大培养；
S4、敲除CHO-K1细胞中Bax和Bak基因，为切除CHO-K1细胞中的促调亡基因Bak和Bax，设计8个锌指蛋白模块基因，将其分成两组，4个连接在一起构成一个大锌指蛋白结构基因，每个大锌指蛋白结构基因跟一个Fok I核酸内切酶基因连接。两个Fok I连接后将基因切断，非同源基因片段末端连接，造成CHO-K1细胞中的促凋亡基因Bak和Bax的敲除。得到具有抗凋亡特性的目标细胞并冷藏；
如图3所示，为切除CHO-K1细胞中的促调亡基因Bak和Bax，设计8个锌指蛋白模块基因，将其分成两组，4个连接在一起构成一个大锌指蛋白结构基因，每个大锌指蛋白结构基因跟一个Fok I核酸内切酶基因连接。两个Fok I连接后将基因切断，非同源基因片段末端连接，造成CHO-K1细胞中的促凋亡基因Bak和Bax的敲除。
S5、以纯化并测序鉴定后的所述重组载体转染所述目标细胞中以得到表达细胞，培育并筛选稳定高产的PTX3重组蛋白表达细胞株，从所述表达细胞的培养液中富集并纯化人类PTX3重组蛋白。
所述步骤S4中，对所述CHO-K1细胞进行基因敲除的步骤，当两个锌指蛋白核酸酶(ZFN)切割靶位点，制造出双链断裂以后，细胞的修复机制被激活，DNA的非同源的末端连接，会有70％的概率通过随机删减或添加可以引起移码突变的碱基，或无义突变引起蛋白质长度变化，从而导致基因敲除，再通过细胞筛选和基因测序鉴定从而得到基因敲除细胞，其具体敲除步骤包括：
S41、合成编码Bak锌指蛋白的第一基因和编码Bax锌指蛋白的第二基因，并分别与非特异性核酸内切酶Fok I融合；
S42、将所述第一基因、第二基因以及所融合的非特异性核酸内切酶Fok I基因片段一并插入带有抗卡那霉素基因的pVAX1载体中，构建特异性内源性基因敲除载体；
S43、将所述特异性内源性基因敲除载体转入所述CHO-K1细胞中，所述转染的CHO-K1细胞表达的所述带有非特异性核酸内切酶Fok I的Bak锌指蛋白和Bax锌指蛋白，分别特异性的锚定到所述CHO-K1细胞自身的Bak和Bax基因，进而敲除所述促凋亡因子，得到所述目标细胞。本发明中的Bak锌指蛋白和Bax锌指蛋白结合得更加紧密，不会出现抛锚现象，酶切位点比较准确，并且锌指蛋白是偶数对。
所述步骤S4中所述目标细胞转染所述重组载体之前还包括以下步骤：
S44、在转染前7天，将所述目标细胞用添加有体积分数为10％的胎牛血清的F12培养液培养于24孔板中；
S45、在转染前6天至转染前1天的期间，每天更换培养液的同时丢弃一半数目的所述目标细胞，使用由CD-CHO无血清培养液和含有体积分数为10％的胎牛血清的F12培养液组成的混合培养液培养，其中所述混合培养液中的胎牛血清的体积分数每天递减2％，直至为0，在转染前1天将所述目标细胞转移至6孔培养板中，每孔装有2mL的所述目标细胞悬浮液。
所述F12培养液中添加4.76g/L的HEPES和125mg/L L-glutamine。添加的HEPES有很强pH值调节缓冲作用，使培养液的pH值能稳定在有利于细胞生长范围内。L-glutamine是左旋谷氨酰胺，在细胞培养时是重要的。它是核酸碱基从头合成的途径的重要原料，如果缺失就会造成细胞合成DNA的效率下降，造成细胞分裂的减少。同时，脱掉氨基后，L-glutamine可作为培养细胞的能量来源，参与蛋白质的合成。
所述6孔板中每孔细胞数为2.7×105个。细胞融合度约为30-40％，此时细胞量不是太多，营养充分，状态较好，为转染的最佳时机。于转染前3小时更换培养液，取纯化后重组载体5μg以磷酸钙法转染细胞。
所述步骤S5中所述目标细胞转染所述重组载体之后，表达细胞的筛选培育具体步骤如下：
S51、将所述重组载体转染的目标细胞转移至T25培养瓶中，并在培养液中添加700μg/mL的G418；
S52、待表达细胞在含有700μg/mL G418的培养液中扩增至培养瓶底面积的80％时，将一瓶中的所述表达细胞均分至3瓶培养，并将培养液中G418的浓度减少至200μg/mL；
S53、待表达细胞繁殖融合至培养瓶底面积的50％时，将这3瓶中的细胞汇总并记录细胞的总数。
所述步骤S5中筛选表达细胞具体包括以下步骤：
S54、取步骤S5-3中的经G418选择培养的阳性表达细胞进行序列稀释后培养于3块96孔培养板上，每个孔加200μL细胞悬液约含5个表达细胞；待细胞繁殖融合至底面积1/3时，取上清做PTX3 Dot-Blot检测，选择PTX3强阳性孔的细胞集落进行再次亚克隆筛选；
S55、待亚克隆细胞融合度达底面积1/3时，取细胞上清液重复PTX3 Dot-Blot检测，挑选强阳性的细胞克隆做进一步筛选扩增，如此反复进行多次筛选，直至所有细胞克隆孔的上清培养液PTX3 Dot-Blot检测均达强阳性后，再次从亚克隆培养板中以Dot-Blot的阳性强度挑选数株阳性强度最高的CHO细胞克隆孔，重复Dot-Blot检测，用已知浓度的纯化PTX3蛋白样本经序列稀释后制备标准曲线，通过阳性强度对比，评估各阳性细胞株的重组蛋白产量，建立稳定高产的CHO细胞克隆株。
所述步骤S5中纯化人类PTX3重组蛋白的方法为依次采用阴离子交换法、羟磷灰石法以及排阻色谱法纯化法。
所述步骤S5中细胞亚克隆筛选时还需做到：亚克隆之前，先在显微镜底下对细胞的位置进行定位，并用记号笔标记细胞集落比较集中的强阳性孔进行亚克隆。亚克隆时，依然选用无血清培养液，G418浓度保持在200μg/mL。用200μL无菌移液器根据标记定点从集落正中间吸出细胞，共挑选约20个集落进行亚克隆。每个集落悬浮于3mL含G418(200μg/mL)的无血清培养液中。此为亚克隆初始细胞浓度，从上往下依次作序列稀释亚克隆，每个集落均亚克隆半块96孔板(6行*8列)。
最后筛选并建株的CHO-K1细胞株为：3D12。
步骤S5中纯化人类PTX3蛋白的方法为依次采用阴离子交换法、羟磷灰石法以及排阻色谱法纯化法纯化PTX3重组蛋白。
一种如权利要求1所述的人类PTX3重组蛋白在制备抗SARS的药物组合物中的用途。
实施例1：载体pSG5/PTX3/neo的构建
1.pSG5/PTX3的构建
1.1PTX3基因片段的制备
TRIzol法从人类的原代上皮细胞中提取总RNA。该总RNA中包含有携带人PTX3蛋白信息的mRNA；根据基因库网上公布的人PTX3的mRNA序列，设计特异性引物，以总RNA中的PTX3 mRNA为模板，合成cDNA。并在cDNA的两端分别引入限制性酶切位点BamH I和Bg1 II，具体步骤如下：
逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
设计一对引物(P1和P2)，在上游引物中引入限制性酶切位点BamH I，下游引物中引入限制性酶切位点Bg1 II。在反转录酶的作用下，以PTX3 mRNA为模板在引物的牵引下合成cDNA的第一条链(SEQ ID 3)。引物序列设计如下：
P1：5’CGGGATCCCTCCGCTCAAACTCAG 3’(24聚物；SEQ ID 1)
P2：5’GAAGATCTTTTCTTTCTTTGGCTTC 3’(25聚物；SEQ ID 2)
扩增的方案如下：第一条链cDNA 2μL，25mM MgCl2 2μL，2.5mM dNTP2μL，80pmol/L引物各1μL，10×反应的缓冲液(不含Mg2+)2.5μL和0.625U/μL的Taq DNA聚合酶(SigmaGenosys)0.3μL，最后用三蒸水定容至25μL；温度曲线(temperature profile)：预热94℃4min，聚合反应94℃30s，46℃30s，72℃2min，共循环30次，72℃5min，冷却至4℃。
1.2pSG5/PTX3的制备
使用内切酶BamH I和Bg1 II酶切真核细胞表达载体pSG5，暴露出同样的粘性克隆末端，进而在T4连接酶的作用下将目的基因片段PTX3 cDNA定向克隆到pSG5表达载体上，以此重组pSG5/PTX3表达载体转化至大肠杆菌宿主菌株DH5α中，在含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基上培育选择阳性菌落，小量制备pSG5/PTX3重组载体。
此流程如图1所示：从人原代上皮细胞中获取总RNA，里边含有人PTX3的mRNA序列，根据基因库网上公布的人PTX3的mRNA序列，设计一对特异性引物P1，P2，引入两个酶切位点：BamH I和Bg1 II从总RNA中逆转录出人PTX3的cDNA。同时，用BamH I和Bg1 II对pSG5载体进行酶切，暴露出跟人的PTX3 cDNA相同的酶切位点，在T4连接酶的作用下，形成pSG5/PTX3载体(SEQ ID 4)。
以BamH I和Bg1 II双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，确认为克隆片段(1270bp)，切胶回收，测序鉴定为我们所需要的PTX3片段。
通过测序显示PTX3cDNA基因已经正确连接入pSG5载体。
2.pSG5/PTX3/neo的制备
2.1表达载体pSG5/PTX3制备连接片段
表达载体pSG5/PTX3用限制性内切酶Stu I(Sigma)和Apa I(Sigma)切割，去掉bGlob_int基因；所得酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分离纯化，将含有pSG5/PTX3主链的4754bp片段用DNA抽提试剂盒提取。
2.2neo基因片段的制备
通过用PCR扩增，从pUB110载体取得neo基因片段，neo基因片段即新霉素抗性基因片段。作为克隆策略的一部分，在两个末端引入限制性核酸内切酶的识别序列。在上游扩增引物中构造Stu I位点，在下游引物中构造Apa I位点。扩增的区域对应于pUB110载体序列中的第2112～2977位核苷酸。
寡核苷酸设计如下：
P3：5’AAGGCCTAAAAGGGAATGAGAATAG 3’(25聚物；SEQ ID 5)
P4：5’CCGGGCCCCACCCTTTATTCCGTTA 3’(25聚物；SEQ ID 6)
扩增方案类似于PTX3cDNA，最终获得含有Stu I和Apa I酶切位点的neo的cDNA片段(SEQ ID 7)。
2.3pSG5/PTX3/neo的制备
扩增产物通过SiO2离心柱纯化，与酶切后pSG5/PTX3主链的4779bp片段连接，并且转化至大肠杆菌宿主菌株DH5α。在含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基上培育选择阳性菌落，小量制备pSG5/PTX3/neo质粒。以Stu I和Apa I双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，测序鉴定。确认neo新霉素基因已经正确连接入pSG5/PTX3载体。将测序正确的菌落扩大培养提取质粒，保留菌种。
此流程如图2所示：设计一对特异性引物(P3和P4)，以载体pUB110中抗新霉素neo具有为模板，PCR合成cDNA并引入两个酶切位点：Stu I和Apa I。同时，用Stu I和Apa I对pSG5/PTX3重组载体进行酶切，去掉bGlob_int基因，暴露出跟neo基因cDNA相同的酶切位点，在T4连接酶的作用下，形成pSG5/PTX3/neo载体(SEQ ID 8)。
实施例2：纯化重组人PTX3蛋白的方法：
把来自发酵罐中的培养上清液加载到Q-Sepharose TM Fast Flow(GEHealthcare，UK)装填柱上。使用非线性梯度洗脱留下的物质。将含有PTX3的洗脱液直接施加至陶瓷羟基磷灰石(BioRad，Hercules，CA，USA)中，装柱。以非线性方式通过增加磷酸盐浓度洗脱留下的物质。将含有PTX3的洗脱液浓缩并且在超滤膜(Pellicon-Biomax 100，Millipore)上进行缓冲液交换，随后通过Biosep-SEC-S4000(Phenomenex)上的尺寸排阻层析法纯化。最后再用超滤膜(Pellicon-Biomax 100，Millipore)对PTX3洗脱液进行浓缩。
经过Western blot(WB)结果分析，纯化以后，PTX3重组蛋白的回收率达到69％，纯度达到95％，如图4所示：PTX3强阳性细胞株3D12无血清悬浮培养72小时后，收集细胞培养上清并为纯化后电泳分离转膜，以PTX3抗体检测纯化的PTX3重组蛋白。样本1和2为取自不同培养瓶的细胞培养液纯化后的重组蛋白，由图可知，两批培养液纯化结果均良好，说明3种方法联合的纯化重复性比较好。
实施例3：PTX3重组蛋白对MHV1(SARS样冠状病毒)的亲和力测定：
选用两个不同的MHV病毒变种(MHV1和MHV3)，按照一定浓度梯度(0、102、103、104、105PFU/mL)将MHV病毒包被在96孔酶标板上，与生物素标记的PTX3重组蛋白(Bio-PTX35μg/mL)室温孵育1小时，反复清洗除去未与病毒结合的PTX3，再与HRP-streptavidin室温孵育30分钟，加入底物显色并于波长450nm处检测吸光度，检测PTX3重组蛋白对MHV病毒的亲和率。实验结果如图5所示，OD450nm值在无病毒对照孔接近为0，随着病毒浓度的增加而逐渐增高，至PFU为105时达到最高值。这说明PTX3对这两种MHV病毒均具有很高的亲和力。
实施例4：PTX3重组蛋白对MHV1(SARS样病毒)繁殖的抑制：
以同等浓度的MHV1病毒感染单层L2细胞，并加入不同浓度的PTX3重组蛋白37℃孵育72h后，计数MHV1病毒引起的细胞溶解所形成染色空斑数。以无PTX3孔的染色空斑数为对照，计算PTX3重组蛋白对MHV1病毒的抑制率。其中，PTX3重组蛋白的浓度梯度分别为：0μg/mL、5μg/mL、50μg/mL，每孔100μL，0μg/mL为空白对照孔，仅加入PTX3重组蛋白稀释液。实验结果如图6所示。
由图6可知：PTX3重组蛋白的浓度为50μg/mL时，病毒斑的抑制率达到最高值：34％。这说明PTX3重组蛋白对MHV1病毒的繁殖有明显的抑制作用。
实施例5：PTX3重组蛋白对感染MHV1病毒的小鼠体内的病毒清除以及治疗作用：
选用PTX3基因敲除(PTX3-KO)小鼠以及同基因背景野生型(PTX3-WT)小鼠，分别通过鼻内滴入5000PFU/mL的MHV1病毒。在两个品系小鼠感染MHV1以后，通过鼻内滴入给药，分别滴入重组蛋白PTX3(2mg/kg)，或相同体积的PBS作为空白对照，分别在病毒感染后的15分钟，6小时和24小时以相同剂量重复给药三次。于48h后查看结果发现：在PTX3-KO小鼠组，MHV1表达呼吸道感染所引起SARS样急性肺损伤(肺损伤积分：6.3)明显较PTX-WT小鼠(肺损伤积分：4.4)为严重。给予PTX3重组蛋白治疗后，MHV1表达呼吸道感染所引起SARS样急性肺损伤无论在PTX3-WT组(肺损伤积分：4.4：2.6)还是PTX-KO组(肺损伤积分：6.3：3.8)均显著减轻(图7)。PTX3重组蛋白治疗组的病毒清除率则显著增高(图8)。上述结果说明重组PTX3蛋白能够能够直接与MHV1病毒结合，抑制病毒复制，增强小鼠体内的MHV1病毒的清除，减轻呼吸道病毒感染所致的小鼠肺损伤程度。可发展成为新的抗病毒药物。
本发明的工业实用性
1、通过将CHO-K1细胞的促凋亡因子bax和bak基因敲除，建立了具有抗细胞凋亡CHO细胞，提高了重组蛋白表达细胞持续存活率与细胞培养密度，进一步提高了重组蛋白的产出率。
2、本发明构建了能在哺乳动物细胞中稳定高表达蛋白的载体，通过抗生素筛选以及培养液条件的改进，建立产量较高，表达稳定，适合悬浮培养的细胞株，初选出来的细胞株的人类PTX3重组蛋白产量＞50mg/L，同时，我们采用阴离子交换法、羟磷灰石法以及排阻色谱法纯化法等三种方法纯化PTX3重组蛋白，使得重组蛋白回收率达到69％，纯度达到95％。
3、通过先将重组载体转化至大肠杆菌中培育转化体，以达到蓄积大量经过测序已正确转入neo以及PTX3基因的载体的目的。
4、本发明构建了能在哺乳动物细胞中稳定高表达蛋白的载体，通过抗生素筛选以及培养液条件的改进，建立产量较高，表达稳定，适合悬浮培养的细胞株，初选出来的细胞株的人类PTX3重组蛋白产量＞50mg/L，同时，我们采用阴离子交换法、羟磷灰石法以及排阻色谱法纯化法等三种方法纯化PTX3重组蛋白，使得重组蛋白回收率达到69％，纯度达到95％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (7)

1.一种人类PTX3重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、从人类的原代上皮细胞中提取携带PTX3蛋白翻译信息的mRNA，设计特异性引物，以所述mRNA为模板，合成cDNA，并在所述cDNA的两端分别引入限制性酶切位点BamH I和BglⅡ；
S2、用内切酶暴露出真核细胞表达载体pSG5上的BamH I和Bgl II粘性末端，将带有BamH I和Bgl II末端的cDNA克隆到表达载体上构建pSG5/PTX3载体，在所述pSG5/PTX3载体中插入新霉素抗性基因，构建重组载体pSG5/neo/PTX3；
S3、将重组表达载体转化至大肠杆菌中，用氨苄青霉素培养基筛选出阳性菌落，扩增阳性转化菌落，提取重组载体进行测序鉴定；
S4、敲除CHO-K1细胞中Bax和Bak基因，得到具有抗凋亡特性的目标细胞并冷藏；
S5、以纯化并测序鉴定后的重组载体转染所述目标细胞中以得到表达细胞，培育并筛选稳定高产的PTX3重组蛋白表达细胞株，从表达细胞的培养液中富集并纯化人类PTX3重组蛋白；
对所述CHO-K1细胞进行基因敲除的步骤具体包括：
S41、合成编码Bak锌指蛋白的第一基因和编码Bax锌指蛋白的第二基因，并分别与非特异性核酸内切酶基因Fok I杂合；
S42、将所述第一基因、第二基因以及所融合的非特异性核酸内切酶Fok I基因片段一并插入带有抗卡那霉素基因的pVAX1载体中，构建特异性内源性基因敲除载体；
S43、将所述特异性内源性基因敲除载体转入所述CHO-K1细胞中，转染的CHO-K1细胞表达的带有非特异性核酸内切酶Fok I的Bak锌指蛋白和Bax锌指蛋白，分别特异性的锚定到CHO-K1细胞自身的Bak和Bax基因，进而敲除促凋亡因子，得到所述目标细胞。
2.如权利要求1所述的人类PTX3重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S4中还包括以下步骤：
S44、在转染前7天，将所述目标细胞用添加有体积分数为10％的胎牛血清的F12培养液培养于24孔板中；
S45、在转染前6天至转染前1天的期间，每天更换培养液的同时丢弃一半数目的所述目标细胞，使用由CD-CHO无血清培养液和含有体积分数为10％的胎牛血清的F12培养液组成的混合培养液培养，其中所述混合培养液中的胎牛血清的体积分数每天递减2％，直至为0，在转染前1天将所述目标细胞转移至6孔培养板中，每孔装有2mL的目标细胞悬浮液。
3.如权利要求2所述的人类PTX3重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述F12培养液中添加4.76g/L的HEPES和125mg/L L-glutamine。
4.如权利要求2所述的人类PTX3重组蛋白的制备方法，其特征在于，6孔板中每孔细胞数为2.7×105个。
5.如权利要求1所述的人类PTX3重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述目标细胞转染重组载体之后，表达细胞的筛选培育具体步骤如下：
S51、将重组载体转染的目标细胞转移至T25培养瓶中，并在培养液中添加700μg/mL的G418；
S52、待表达细胞在含有700μg/mL G418的培养液中扩增至培养瓶底面积的80％时，将一瓶中的所述表达细胞均分至3瓶培养，并将培养液中G418的浓度减少至200μg/mL；
S53、待表达细胞繁殖融合至培养瓶底面积的50％时，将这3瓶中的细胞汇总并记录细胞的总数。
6.如权利要求5所述的人类PTX3重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S5中筛选表达细胞具体包括以下步骤：
S54、取步骤S53中的经G418选择培养的阳性表达细胞进行序列稀释后培养于3块96孔培养板上，每个孔加200μL细胞悬液约含5个表达细胞；待细胞繁殖融合至底面积1/3时，取上清做PTX3 Dot-Blot检测，选择PTX3强阳性孔的细胞集落进行再次亚克隆筛选；
S55、待亚克隆细胞融合度达底面积1/3时，取细胞上清液重复PTX3 Dot-Blot检测，挑选强阳性的细胞克隆做进一步筛选扩增，如此反复进行多次筛选，直至所有细胞克隆孔的上清培养液PTX3 Dot-Blot检测均达强阳性以后，再次从亚克隆培养板中以Dot-Blot的阳性强度挑选数株阳性强度最高的细胞克隆孔，重复Dot-Blot检测，用已知浓度的纯化PTX3蛋白样本经序列稀释后制备标准曲线，通过阳性强度对比，评估各阳性细胞株的重组蛋白产量，建立稳定高产的细胞克隆株。
7.如权利要求1所述的人类PTX3重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S5中纯化人类PTX3重组蛋白的方法为依次采用阴离子交换法、羟磷灰石法以及排阻色谱法纯化法。
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