CN103060335A - 门冬胰岛素前体基因的优化及其高效表达 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了优化的门冬胰岛素前体基因序列及其在酵母的高效表达。本发明优化的门冬胰岛素前体基因所编码的氨基酸序列与原基因序列一致，但在酵母内的表达水平远高于原基因序列。通过摇瓶发酵试验对表达结果进行检测发现：优化后门冬胰岛素前体的蛋白表达量提高了1.8～7.5倍；在30L发酵罐中，摇瓶结果最佳的改造序列重组子的产量比原来可提高10.8倍。本发明还公开了上述基因序列的改造方法。
Description
技术领域
本发明涉及基因改造与蛋白表达。通过优化密码子，获得可以用于高表达的门冬胰岛素前体基因序列。应用分子生物学技术进行目的基因合成和表达载体构建，并对目的蛋白的表达进行评价。
背景技术
胰岛素(insulin，Ins)是主要应用于所有I型糖尿病和大多数II型糖尿病患者的治疗药物。胰岛素的理想应用模式是模拟生理性胰岛素分泌的情况来满足能量代谢的需要。对于糖尿病(diabetes mellitus，DM)来说，通过胰岛素的治疗能有效的减少或缓解I型和II型糖尿病症状的发生和发展，因此，胰岛素已成为较为理想的治疗方法。虽然普通的短效人胰岛素应用比较广泛，但也存在一些缺点，特别是在是皮下注射之后，吸收和达到峰值速度与正常个体餐后胰岛素的分泌状态不同，进而使得药物浓度的峰值不能与餐后血糖高峰吻合，因此容易导致餐后高血糖和药物吸收后低血糖的发生。为了使胰岛素对糖尿病的治疗更为安全有效，新的短效胰岛素类似物不断得以开发。门冬胰岛素(insulin aspart，IAsp)便是其中一种快速作用的重组胰岛素类似物。
“诺和锐”是由丹麦诺和诺德公司研制的重组门冬胰岛素注射液。1999年9月得到欧盟批准；同年8月，9月和10月分别在瑞士、英国和德国上市。2000年6月得到美国食品药品监督管理局(FDA)批准，2002年8月获得中国国家医药管理局(SFDA)的批准，应用于I型和II型糖尿病患者的临床治疗。目前，门冬胰岛素作为一种常见的速效胰岛素类似物已经得到广泛应用。
与普通人胰岛素相比，门冬胰岛素由于B链28位的脯氨酸被门冬氨酸替代，减弱了溶液中胰岛素分子间的结合强度[Osterberg O，Erichsen L，Ingwersen S H，etal.Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of insulin aspart and human insulin.JPharmacokinet Pharmacodyn，2003，30(3)：221-235]，从而导致其迅速解离为二聚体或单体 [Lindholm A，Jacobsen L V.Clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of insulin aspart.Clin Pharmacokinet，2001，40(9)：641-659]。皮下给药吸收快于以同样方式给药的普通人胰岛素，因此可以更快达到最大血药浓度而且迅速回复到基线水平。而血浆清除率和生物利用度等参数与可溶性人胰岛素相比没有明显差异。主要通过胰岛素蛋白酶途径进行代谢，其代谢产物氨基酸和多肽随后用于合成其他蛋白质。
目前门冬胰岛素主要利用酿酒酵母来表达生产，该系统并不是十分理想。虽然酿酒酵母的产物的后期处理相对简单，但表达量较低[Zhang Y S.Hu H M.Cai R R.Secretory expression of a single-chain insulin precursor in yeast and its conversion intohuman insulin.Science in China，1996，39：225-233.]。相比之下，毕赤酵母可将甲醇作为唯一碳源进行高密度发酵，其乙醇氧化酶的启动子(AOX1)可控制异源蛋白大量表达，且其表达可通过甲醇供给进行严格调控。同时外源蛋白大都以分泌形式释放到胞外，产物后期处理同样简单。因此毕赤酵母是目前最为理想的真核表达系统之
胰岛素密码子优化的相关文献很多，如Gurramkonda等人优化的人胰岛素前体基因序列并在毕赤酵母的表达研究[Application of simple fed-batch technique to high-levelsecretory production of insulin precursor using Pichia pastoris with subsequentpurification and conversion to human insulin.Microbial Cell Factories 2010，9：31]。门冬胰岛素前体基因序列很少报道，我们在以往的研究中参照了Gurramkonda等人优化胰岛素序列，并将其用于门冬胰岛素前体基因序列的优化，但是在毕赤酵母的表达效果仍然欠佳。因此，优化门冬胰岛素前体基因序列以提高目前门冬胰岛素前体的表达量，在产业化需求上具有重要的现实意义。
本发明的目的在于优化门冬胰岛素前体基因序列，构建表达效率高、表达产物便于加工的产门冬胰岛素前体的毕赤酵母工程菌株，为低成本生产门冬胰岛素探索一条新的途径。
发明内容
本发明公开了密码子优化的门冬胰岛素前体基因序列，所述优化的门冬胰岛素前体基因为Sequence NO.2、Sequence NO.3、Sequence NO.4、Sequence NO.5、Sequence NO.6、Sequence NO.7、Sequence NO.8、Sequence NO.9或equence NO.10。所述优化的门冬胰岛素前体基因可用于生产治疗糖尿病相关疾病药物。
本发明公开了一种表达载体与一种宿主细胞，所述载体含有门冬胰岛素前体基因序列Sequence NO.2、Sequence NO.3、Sequence NO.4、Sequence NO.5、Sequence NO.6、Sequence NO.7、Sequence NO.8、Sequence NO.9或equence NO.10。所述宿主细胞为毕赤酵母菌，如X33、GS115、SDM1168、SMD1165等，且被该表达载体所转化。
本发明的门冬胰岛素前体基因序列优化方案：
第一组实验：将Sequence NO.1中的B链4位氨基酸密码子进行替换得到SequenceNO.2；替换Sequence NO.2序列中B链12位氨基酸密码子得到Sequence NO.3；替换Sequence NO.2序列中B链13位氨基酸密码子得到Sequence NO.4。
第二组实验：将Sequence NO.1中的B链5位氨基酸密码子进行替换得到SequenceNO.5；替换Sequence NO.5序列中B链12位氨基酸密码子得到Sequence NO.6；替换Sequence NO.2序列中B链13位氨基酸密码子得到Sequence NO.7。
第三组实验：将Sequence NO.1中的B链4位和5位氨基酸密码子进行替换得到SequenceNO.8；替换SequenceNO.8序列中B12位氨基酸密码子得到SequenceNO.9；替换Sequence NO.8序列中B链13位氨基酸密码子得到Sequence NO.10。SequenceNO.1～NO.10所对应的氨基酸序列为Sequence NO.11。
本发明还公开了一种门冬胰岛素前体基因的改造方法，其特征在于包括以下步骤：
1)根据毕赤酵母偏好密码子和相关研究结果对原基因序列进行优化，获得经过优化的门冬胰岛素前体基因序列；
2)利用PCR技术合成经过优化的门冬胰岛素前体基因；
3)对门冬胰岛素前体基因的进行鉴定；
4)经过优化的门冬胰岛素前体基因向酵母的转化及高效表达。
下面参照上述步骤详细描述经过优化的门冬胰岛素前体基因设计及制备过程。设计及制备本发明基因的方法仅仅是说明相关方法，并非是限制性的；也可以采用其他已知的方法，或者采用修改的方法。
1)根据毕赤酵母偏好密码子对原基因序列进行优化，获得经过优化的门冬胰岛素前体基因序列；
根据原门冬胰岛素前体基因序列，将其中个别氨基酸的密码子替换为毕赤酵母中偏爱的密码子，通过生物信息学技术合理优化，增加基因的稳定性及其在毕赤酵母中的表达水平，获得相应的经过优化的门冬胰岛素前体基因序列。
2)利用PCR技术合成经过优化的门冬胰岛素前体基因；
设计两条包括突变位点密码子的引物。以含有原门冬胰岛素前体基因序列的表达载体为模板，分别以Primer NO.5(5’AOX通用引物)和下游引物，上游引物和PrimerNO.6(3’AOX通用引物)为引物扩增出两条具有互补序列的片段。再以这两个片段互为模板和引物进行扩增得到含有经过优化的门冬胰岛素前体基因的目的片段。最后以次片段为模板，以5’AOX和3’AOX为引物得到足够浓度的目的片段。
3)含有经过优化的门冬胰岛素前体基因表达载体构建和鉴定；
a)含有经过优化的门冬胰岛素前体基因表达载体的构建：将PCR扩增得到的目的片段用限制性内切酶PstI和SalI进行双酶切，回收目的片段。将原表达载体用限制性内切酶PstI和SalI进行双酶切，回收目的片段。将两个目的片段用Solution I DNA连接酶于16℃连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含有一定浓度的zeocin抗性的平板上过夜培养，筛选重组子。
b)含有经过优化的门冬岛素原的基因表达载体的鉴定：将长出的重组子划线培养后，进行快抽质粒鉴定，质粒大小为3724bp的重组子定义为阳性重组子。用限制性内切酶XhoI和notI进行质粒酶切鉴定，送样测序。
4)经过优化的门冬胰岛素前体基因向毕赤酵母的转化及表达。
a)经过优化的门冬胰岛素前体基因向毕赤酵母的转化：将阳性重组质粒用限制性内切酶SacI线性化后，电击转化毕赤酵母，在含有zeocin抗性的YPD平板上筛选重组子，并对重组子进行菌落PCR鉴定。
b)经过优化的门冬胰岛素前体基因在摇瓶培养基中的诱导表达：将菌落PCR鉴定为阳性的重组子接种于50ml摇瓶培养基中培养24h后，每天补加1％无水甲醇进行诱导表达，120h后结束培养。将1ml菌液离心后取上清对目的蛋白进行液相检测。
附图说明
图1重组质粒XhoI，NotI酶切图。M：5000bpMaker；1：含有门冬胰岛素前体SequenceNO.2的质粒酶切结果；2：含有门冬胰岛素前体Sequence NO.3的质粒酶切结果；3：含有门冬胰岛素前体Sequence NO.4的质粒酶切结果。
图2重组质粒XhoI，NotI酶切图。M：5000bpMaker；1：含有门冬胰岛素前体SequenceNO.5的质粒酶切结果；2：含有门冬胰岛素前体Sequence NO.6的质粒酶切结果；3：含有门冬胰岛素前体Sequence NO.7的质粒酶切结果。
图3重组质粒XhoI，NotI酶切图。M：5000bpMaker；1：含有门冬胰岛素前体SequenceNO.8的质粒酶切结果；2：含有门冬胰岛素前体Sequence NO.9的质粒酶切结果；3：含有门冬胰岛素前体Sequence NO.10的质粒酶切结果。
图4门冬胰岛素前体质粒电转化毕赤酵母后菌落PCR鉴定重组子(用5’AOX上游引物和门冬胰岛素前体基因下游引物Primer NO.7鉴定)。M：5000bpMaker；1～5：Sequence NO.2阳性重组子；6～10：Sequence NO.3阳性重组子；11～15：Sequence NO.4阳性重组子。
图5门冬胰岛素前体质粒电转化毕赤酵母后菌落PCR鉴定重组子(用5’AOX上游引物和门冬胰岛素前体基因下游引物Primer NO.7鉴定)。M：5000bpMaker；1～5：Sequence NO.5阳性重组子；6～10：Sequence NO.6阳性重组子；11～15：Sequence NO.7阳性重组子。
图6门冬胰岛素前体质粒电转化毕赤酵母后菌落PCR鉴定重组子(用5’AOX上游引物和门冬胰岛素前体基因下游引物Primer NO.7鉴定)。M：5000bpMaker；1～5：Sequence NO.8阳性重组子；6～10：Sequence NO.9阳性重组子；11～15：Sequence NO.10阳性重组子。
图7摇瓶实验诱导前液相图谱。进样量100μl，36分钟左右并没有目的峰出现。图8门冬胰岛素前体原始菌株Sequence NO.1摇瓶实验诱导120h液相图谱。进样量100μl，出峰时间为36.768分钟，峰面积为2510.7，表达量为0.03g/L。
图9门冬胰岛素前体Sequence NO.2菌株摇瓶实验诱导120h液相图谱。进样量100μl，出峰时间为36.598分钟，峰面积为4379.5，表达量为0.053g/L。
图10门冬胰岛素前体Sequence NO.3菌株摇瓶实验诱导120h液相图谱。进样量100μl，出峰时间为36.541分钟，峰面积为5657，表达量为0.068g/L。
图11门冬胰岛素前体Sequence NO.4菌株摇瓶实验诱导120h液相图谱。进样量100μl，出峰时间为36.772分钟，峰面积为5924.4，表达量为0.071g/L。
图12门冬胰岛素前体Sequence NO.5菌株摇瓶实验诱导120h液相图谱。进样量100μl，出峰时间为36.620分钟，峰面积为4777.8，表达量为0.058g/L。
图13门冬胰岛素前体Sequence NO.6菌株摇瓶实验诱导120h液相图谱。进样量100μl，出峰时间为36.900分钟，峰面积为8249.5，表达量为0.099g/L。
图14门冬胰岛素前体Sequence NO.7菌株摇瓶实验诱导120h液相图谱。进样量100μl，出峰时间为36.382分钟，峰面积为9044.6，表达量为0.101g/L。
图15门冬胰岛素前体Sequence NO.8菌株摇瓶实验诱导120h液相图谱。进样量100μl，出峰时间为36.926分钟，峰面积为11164.6，表达量为0.135g/L。
图16门冬胰岛素前体Sequence NO.9菌株摇瓶实验诱导120h液相图谱。进样量100μl，出峰时间为36.800分钟，峰面积为17926.3，表达量为0.216g/L。
图17门冬胰岛素前体Sequence NO.10菌株摇瓶实验诱导120h液相图谱。进样量100μl，出峰时间为36.863分钟，峰面积为18625，表达量为0.224g/L。
图18门冬胰岛素前体Sequence NO.1菌株30L发酵培养200h放罐样品液相图谱。进样量20μl，出峰时间为37.506分钟，峰面积为6106.5，表达量为0.37g/L。
图19门冬胰岛素前体Sequence NO.10菌株30L发酵培养200h放罐样品液相图谱。进样量5μl，出峰时间为37.321分钟，峰面积为16517，表达量为3.98g/L。
图20pPICZαA载体质粒图谱。
图21门冬胰岛素前体基因序列优化前后蛋白表达情况。
图22门冬胰岛素前体基因序列优化前后门冬胰岛素前体Sequence NO.1菌株与Sequence NO.10菌株30L发酵的表达情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。
实施例1优化的门冬胰岛素前体基因的合理设计及载体构建第一组实验
一实验材料
引物设计软件为DNASTAR软件，引物由上海博尚生物技术有限公司合成；实验中所用到的DNA聚合酶、DNA连接酶和限制性内切酶均为TAKARA公司产品；pPICZαA载体购自Invitrogen公司；质粒抽提试剂盒与胶回收试剂盒均为杭州爱思进生物技术有限公司产品；基因测序由上海博尚生物技术有限公司完成；其他相关试 剂均为市购。
二方法结果
1经过优化的门冬胰岛素前体基因获得
以Gurramkonda等人[Application of simple fed-batch technique to high-levelsecretory production of insulin precursor using Pichia pastoris with subsequentpurification and conversion to human insulin.Microbial Cell Factories 2010，9：31]报道的人胰岛素前体基因序列(Sequence NO.12)为基础(其对应的人胰岛素前体氨基酸序列为Sequence NO.13)，将其中B链28位的脯氨酸改变为天门冬氨酸后得到门冬胰岛素前体原始基因序列(Sequence NO.1)，将其中个别氨基酸的密码子替换为毕赤酵母中偏好的密码子，并适当组合，通过生物信息学技术合理优化，增加基因的稳定性及其在毕赤酵母中的表达水平，获得3种经过优化的门冬胰岛素前体基因序列(Sequence NO.2、Sequence NO.3与Sequence NO.4)。
2引物设计
利用计算机辅助设计软件DNASTAR，设计引物，考虑引物的二级结构、GC含量等相关参数。设计包括突变位点密码子的上游引物Primer NO.1、Primer NO.2、PrimerNO.3和下游Primer NO.4。
表1 第一组实验引物序列表
3基因合成
1)引物处理：取引物管10000RPM离心5min，引物按10uM的浓度稀释，-20℃保存备用；
2)基因合成，采用Pyrobest DNA polymerase，方法如下：
a)以含有原门冬胰岛素前体基因序列的表达载体为模板，以5’AOX和PrimerNO.4为引物扩增出402bp片段，分别以Primer NO.1、Primer NO.2、Primer NO.3和3’AOX为引物扩增出同为340bp的三条片段。后三条片段与第一条片段具有相同的互补序列。反应体系为40μl，包括：10×Pyrobest buffer 4μl，dNTPs 4μl，上下游引物各2μl，模板(原门冬胰岛素前体的表达载体质粒)1μl，Pyrobest DNA polymerase0.4μl，ddH2O27μl。反应条件为：94℃4min，94℃40s，55℃40s，72℃30s，反应30个循环后，72℃10min。
b)以第一步合成的具有互补序列的片段互为引物和模板，合成3条728bp包含经过优化的门冬胰岛素前体基因的目的片段。反应体系为40μl，包括：10×Pyrobestbuffer4μl，dNTPs 4μl，两条互补片段各2μl，Pyrobest DNA polymerase 0.4μl，ddH2O 28μl。反应条件为：94℃4min，94℃40s，55℃40s，72℃1min，反应30个循环后，72℃10min。
c)以第二步合成的基因片段为模板，以5’AOX和3’AOX为引物，扩增出足够浓度的3条728bp目的片段，用于下步实验。反应体系为40μl，包括：10×Pyrobestbuffer4μl，dNTPs 4μl，上下游引物各2μl，模板(上一步扩增片段)1μl，Pyrobest DNApolymerase 0.4μl，ddH2O 27μl。反应条件为：94℃4min，94℃40s，55℃40s，72℃1min，反应30个循环后72℃10min。
d)分别将PCR回收的目的基因片段和原表达载体pPICZαA-IPD用限制性内切酶PstI和SalI进行双酶切，反应体系为40μl，包括：10×H buffer 4μl，Pst I 1μl，Sal I 1μl，目的基因/载体片段15μl，ddH2O 19μl。反应条件为37℃酶切2.5h。
0.8％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，前者胶回收478bp小片段，后者胶回收3256bp大片段。
e)取上步酶切回收的目的基因片段1.5μl与载体片段3.5μl混合后，加入5μl Solution I DNA连接酶于16℃连接2h。
将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，于zeocin抗性平板上37℃过夜培养筛选阳性重组子。将长出的重组子划线到平板上，37℃培养4～5h后，取少量菌体进行快抽质粒鉴定，将质粒大小为3724bp的重组子初步定义为阳性重组子。将阳性重组子接种到3ml含有zeocin抗性的LB液体培基中37℃过夜培养，抽取质粒进行酶切鉴定，并送样测序。新的载体命名为pPICZαA-IPDI/2/3。
实施例2目的基因的合理设计及载体构建第二组实验
一实验材料
引物设计软件为DNASTAR软件，引物由上海博尚生物技术有限公司合成；实验中所用到的DNA聚合酶、DNA连接酶和限制性内切酶均为TAKARA公司产品；pPICZαA载体购自Invitrogen公司；质粒抽提试剂盒与胶回收试剂盒均为杭州爱思进生物技术有限公司产品；基因测序由上海博尚生物技术有限公司完成；其他相关试剂均为市购。
二方法结果
1经过优化的门冬胰岛素前体基因获得
以Gurramkonda等人报道的人胰岛素前体基因序列为基础，将其中B链28位的脯氨酸改变为天门冬氨酸后得到门冬胰岛素前体原始基因序列，将其中个别氨基酸的密码子替换为毕赤酵母中偏好的密码子，并适当组合，通过生物信息学技术合理优化，增加基因的稳定性及其在毕赤酵母中的表达水平，获得3种经过优化的门冬胰岛素前体基因序列。
2引物设计
利用计算机辅助设计软件DNASTAR，设计引物，考虑引物的二级结构、GC含量等相关参数。设计包括突变位点密码子的上游引物Primer NO.5、Primer NO.6、PrimerNO.7和下游引物PrimerNO.4。
表2第二组实验引物序列表
3基因合成
1)引物处理：取引物管10000RPM离心5min，引物按10uM的浓度稀释，-20℃保存备用；
2)基因合成，采用Pyrobest DNA polymerase，方法如下：
a)以含有原门冬胰岛素前体基因序列的表达载体为模板，以5’AOX和PrimerNO.4为引物扩增出402bp片段，分别以Primer NO.8、Primer NO.9、Primer NO.10和3’AOX为引物扩增出同为340bp的三条片段。后三条片段与第一条片段具有相同的互补序列。反应体系为40μl，包括：10×Pyrobest buffer 4μl，dNTPs 4μl，上下游引物各2μl，模板(原门冬胰岛素前体的表达载体质粒)1μl，Pyrobest DNA polymerase 0.4μl，ddH2O27μl。反应条件为：94℃4min，94℃40s，55℃40s，72℃30s，反应30个循环后，72℃10min。
b)以第一步合成的具有互补序列的片段互为引物和模板，合成3条728bp包含经过优化的门冬胰岛素前体基因的目的片段。反应体系为40μl，包括：10×Pyrobestbuffer 4μl，dNTPs 4μl，两条互补片段各2μl，Pyrobest DNA polymerase 0.4μl，ddH2O 28μl。反应条件为：94℃4min，94℃40s，55℃40s，72℃1min，反应30个循环后，72℃10min。
c)以第二步合成的基因片段为模板，以5’AOX和3’AOX为引物，扩增出足够浓度的3条728bp目的片段，用于下步实验。反应体系为40μl，包括：10×Pyrobest buffer4μl，dNTPs 4μl，上下游引物各2μl，模板(上一步扩增片段)1μl，Pyrobest DNA polymerase0.4μl，ddH2O 27μl。反应条件为：94℃4min，94℃40s，55℃40s，72℃1min，反应30个循环后72℃10min。
d)分别将PCR回收的目的基因片段和原表达载体pPICZαA-IPD用限制性内切酶PstI和SalI进行双酶切，反应体系为40μl，包括：10×H buffer 4μl，Pst I 1μl，Sal I 1μl，目的基因/载体片段15μl，ddH2O 19μl。反应条件为37℃酶切2.5h。
0.8％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，前者胶回收478bp小片段，后者胶回收3256bp大片段。
e)取上步酶切回收的目的基因片段1.5μl与载体片段3.5μl混合后，加入5μlSolution I DNA连接酶于16℃连接2h。
将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，于zeocin抗性平板上37℃过夜培养筛选阳性重组子。将长出的重组子划线到平板上，37℃培养4～5h后，取少量菌体进行快抽质粒鉴定，将质粒大小为3724bp的重组子初步定义为阳性重组子。将阳性重组子接种到3ml含有zeocin抗性的LB液体培基中37℃过夜培养，抽取质粒进行酶切鉴定，并送样测序。新的载体命名为pPICZαA-IPD4/5/6。
实施例3目的基因的合理设计及载体构建第三组实验
一实验材料
引物设计软件为DNASTAR软件，引物由上海博尚生物技术有限公司合成；实验中所用到的DNA聚合酶、DNA连接酶和限制性内切酶均为TAKARA公司产品；pPICZαA载体购自Invitrogen公司；质粒抽提试剂盒与胶回收试剂盒均为杭州爱思进生物技术有限公司产品；基因测序由上海博尚生物技术有限公司完成；其他相关试剂均为市购。
二方法结果
1经过优化的门冬胰岛素前体基因获得
以Gurramkonda等人报道的人胰岛素前体基因序列为基础，将其中B链28位的脯氨酸改变为天门冬氨酸后得到门冬胰岛素前体原始基因序列，将其中个别氨基酸的密码子替换为毕赤酵母中偏好的密码子，并适当组合，通过生物信息学技术合理优化，增加基因的稳定性及其在毕赤酵母中的表达水平，获得3种经过优化的门冬胰岛素前体基因序列。
2引物设计
利用计算机辅助设计软件DNASTAR，设计引物，考虑引物的二级结构、GC含量等相关参数。设计包括突变位点密码子的上游引物Primer NO.8、Primer NO.9、PrimerNO.10和下游引物Primer NO.4。
表3第三组实验引物序列表
3基因合成
1)引物处理：取引物管10000RPM离心5min，引物按10uM的浓度稀释，-20℃保存备用；
2)基因合成，采用Pyrobest DNA polymerase，方法如下：
a)以含有原门冬胰岛素前体基因序列的表达载体为模板，以5’AOX和PrimerNO.4为引物扩增出402bp片段，分别以Primer NO.11、Primer NO.12、Primer NO.13和3’AOX为引物扩增出同为340bp的三条片段。后三条片段与第一条片段具有相同的互补序列。反应体系为40μl，包括：10×Pyrobest buffer 4μl，dNTPs 4μl，上下游引物各2μl，模板(原门冬胰岛素前体的表达载体质粒)1μl，Pyrobest DNA polymerase 0.4μl，ddH2O 27μl。反应条件为：94℃4min，94℃40s，55℃40s，72℃30s，反应30个循环后，72℃10min。
b)以第一步合成的具有互补序列的片段互为引物和模板，合成3条728bp含有经过优化的门冬胰岛素前体基因的目的片段。反应体系为40μl，包括：10×Pyrobestbuffer 4μl，dNTPs 4μl，两条互补片段各2μl，Pyrobest DNA polymerase 0.4μl，ddH2O 28μl。反应条件为：94℃4min，94℃40s，55℃40s，72℃1min，反应30个循环后，72℃10min。
c)以第二步合成的基因片段为模板，以5’AOX和3’AOX为引物，扩增出足够浓度的3条728bp目的片段，用于下步实验。反应体系为40μl，包括：10×Pyrobestbuffer4μl，dNTPs 4μl，上下游引物各2μl，模板(上一步扩增片段)1μl，Pyrobest DNApolymerase 0.4μl，ddH2O 27μl。反应条件为：94℃4min，94℃40s，55℃40s，72℃1min，反应30个循环后72℃10min。
d)分别将PCR回收的目的基因片段和原表达载体pPICZαA-IPD用限制性内切酶PstI和SalI进行双酶切，反应体系为40μl，包括：10×H buffer 4μl，Pst I 1μl，Sal I 1μl，目的基因/载体片段15μl，ddH2O 19μl。反应条件为37℃酶切2.5h。
0.8％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，前者胶回收478bp小片段，后者胶回收3256bp大片段。
e)取上步酶切回收的目的基因片段1.5μl与载体片段3.5μl混合后，加入5μlSolution I DNA连接酶于16℃连接2h。
将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，于zeocin抗性平板上37℃过夜培养筛选阳性重组子。将长出的重组子划线到平板上，37℃培养4～5h后，取少量菌体进行快抽质粒鉴定，将质粒大小为3724bp的重组子初步定义为阳性重组子。将阳性重组子接种到3ml含有zeocin抗性的LB液体培基中37℃过夜培养，抽取质粒进行酶切鉴定，并送样测序。新的载体命名为pPICZαA-IPD7/8/9。
实施例4经过优化的门冬胰岛素前体基因在毕赤酵母中的表达及鉴定
一实验材料
毕赤酵母菌株购自Invitrogen公司；限制性内切酶SacI为TAKARA公司产品；质粒抽提试剂盒与胶回收试剂盒为杭州爱思进生物技术有限公司产品；其他试剂为市购产品。
二方法结果
1经过优化的门冬胰岛素前体基因向毕赤酵母的转化
a)将含有经过优化的门冬胰岛素前体基因表达载体pPZpPICZαA-IPDaIPD1/b2/c3/asp4/5/6/7/8/9用限制性内切酶SacI进行线性化，反应体系为40μl，包括：10×L buffer 4μl，Sac I 1μl，pPZpPICZαA-IPDaIPD1/b2/c3/asp4/5/6/7/8/9表达载体15μl，ddH2O20μl。反应条件为37℃酶切2.5h。DNA纯化回收3724bp目的片段。
b)根据毕赤酵母表达操作手册上的电击转化方法将线性化表达载体pPZpPICZαA-IPDaIPD1/b2/c3/asp4/5/6/7/8/9转入毕赤酵母基因组中。在含有zeocin抗性的平板上30℃培养48小时筛选阳性重组子。将长出的重组子划线后用5’AOX和Primer NO.7作为上下游引物进行菌落PCR鉴定。将扩增出547bp目的片段的重组 子定为阳性重组子。反应体系为20μl，包括：10×buffer 2μl，d NTP 2μl，上下游引物各1μl，模板为重组子单菌落，rTaq DNA polymerase0.2μl。反应条件为：94℃4min，94℃40s，55℃40s，72℃40s，反应30个循环后72℃10min。
2经过优化的门冬胰岛素前体基因在摇瓶培养基中的表达
将鉴定为阳性的重组子从划线平板上取少许接种于50ml BMGY培养基中30℃培养24h，当OD600达到6左右的时候，补加1％的无水甲醇进行诱导。诱导120小时后结束培养。取样离心后对上清用Kromasil 100-5C4液相色谱柱柱对目的蛋白进行液相检测，在36.5分钟左右目的蛋白出峰。
从液相检测结果计算得出，原基因序列(Sequence NO.1)的表达量只有0.03g/L，而经过优化的序列Sequence NO.2、Sequence NO.3、Sequence NO.4、Sequence NO.5、Sequence NO.6、Sequence NO.7、Sequence NO.8、Sequence NO.9和equence NO.10的表达量分别为0.053、0.068、0.071、0.058、0.099、0.101g、0.135、0.216、0.224g/L，表达量分别提高了1.8、2.3、2.4、1.9、3.3、3.4、4.5、7.2和7.5倍。
3经过优化的门冬胰岛素前体基因在30L发酵罐中的表达
将在摇瓶培养基中表达最高的Sequence NO.10重组子在30L发酵罐中进行发酵培养，同时以原基因序列Sequence NO.1菌株作为为对照。将菌种按0.5％的比例接种于BMGY培养基中作为种子，30℃培养24h，OD600达到15左右，再按3％～5％的比例接种到30L发酵罐中。罐上的培养基为Invitrogen公司毕赤酵母发酵手册上提供的BSM基础盐培养基，培养工艺及补料工艺完全参照Invitrogen公司毕赤酵母发酵手册上进行，培养200h左右放罐。培养过程中定时取样，离心后收集上清，对上清用Kromasil 100-5C4液相色谱柱柱对目的蛋白进行液相检测，由于发酵培养基中含有盐分，所以液相检测中目的蛋白的出峰时间与摇瓶培养时有略微的差异，在37.5分钟左右目的蛋白出峰。
从液相检测结果计算得出，原基因序列(Sequence NO.1)的30L发酵罐表达量只有0.37g/L，而经过优化的序列Sequnence NO.10的表达量可达到3.98g/L，表达量提高了10.8倍。由此可见，本发明经过一系列的密码子优化，达到了提高门冬胰岛素前体蛋白表达量的目的，为今后进行大规模生产奠定了良好的基础，同时也为其他蛋白在毕赤酵母中提高产量提供了良好的借鉴。
序列表
Claims (5)
1.一种密码子优化的门冬胰岛素前体基因序列，其特征在于，所述优化门冬胰岛素前体的基因为Sequence NO.2、Sequence NO.3、Sequence NO.4、SequenceNO.5、Sequence NO.6、Sequence NO.7、Sequence NO.8、Sequence NO.9或Sequence NO.10之一。
2.根据权利要求1所述优化的门冬胰岛素前体基因在生产用于治疗糖尿病相关疾病药物中的用途。
3.一种表达载体，其特征在于，所述载体含有门冬胰岛素前体基因序列，其中基因序列选自Sequence NO.2、Sequence NO.3、Sequence NO.4、SequenceNO.5、Sequence NO.6、Sequence NO.7、Sequence NO.8、Sequence NO.9或equenceNO.10。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞为毕赤酵母菌，且被权利要求3所述的表达载体所转化。
5.一种门冬胰岛素前体基因的改造方法，其特征在于包括以下步骤：
1)根据毕赤酵母偏好密码子对原基因序列进行优化，获得经过优化的门冬胰岛素前体基因序列；
2)利用PCR技术合成经过优化的门冬胰岛素前体基因；
3)对经过优化的门冬胰岛素前体基因的进行鉴定；
4)经过优化的门冬胰岛素前体基因向酵母的转化及高效表达。
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