CN117279712A - 填充剂及其制造方法、以及尺寸排阻色谱用柱 - Google Patents
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Abstract
提供耐碱性高、抑制了非特异吸附的尺寸排阻色谱所使用的填充剂及其制造方法。一种填充剂，是下述式1所示的嵌段共聚物的一个末端经由来源于末端羟基的醚键而与多孔质有机高分子载体结合而成的，上述多孔质有机高分子载体含有由甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的重复单元60～95mol％、和由多官能性单体衍生的重复单元5～40mol％。(式1)HO‑(C2H4O)l‑(C3H6O)m‑(C2H4O)n‑H(式1中，l为5～140的整数，m为15～75的整数，n为5～140的整数。l、m、n的合计中的m的比例为5～85％)。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质精制用的尺寸排阻色谱的填充剂。进一步详细而言，涉及耐碱性高的填充剂。
背景技术
按照分子大小的顺序分离的尺寸排阻色谱在将多糖类、肽、蛋白质、DNA、RNA那样的水溶性高分子分离时被广泛利用。尺寸排阻色谱特别是在蛋白质等生物体高分子的分离、分选中，可以将生物体高分子在温和的条件下处理，因此具有可以在生物体高分子的变性少的状态下分离、分选这样的优点。被分离、分选了的生物体高分子在向生物化学反应的应用、食品、制药、化学等工业用途中被使用，近年来市场显著扩大成长。
为了应对该需求，期望符合工业规模的能够大量处理的分离、分选用的填充剂。特别是，在预计今后的市场扩大的基因治疗药领域中，为了以病毒载体、病毒样粒子等的精制工艺的生产性的大幅改善作为目标，进一步期望填充剂的功能改善。特别期望可以用于分子尺寸大的病毒载体、病毒样粒子的精密分离精制，经过从培养液到精制的一系列工序而精密尺寸分离简便。
因此对于填充剂，期望作为与分析柱不同的课题/要件的、可以回收被分离出的物质的分选效率良好，例如在包含来源于发酵生产物的生物药品所包含的杂质、不明成分等多种多样的成分的情况下也可以抑制它们的非特异吸附，进一步能够用高强度的碱进行洗涤再生。
然而，尚未提出这样的具有耐碱性的填充剂。
另外，本申请人在国际公开第2018/155241号(专利文献1)中，提出了使用了甲基丙烯酸酯系单体的尺寸排阻色谱用填充剂。在专利文献1中，虽然公开了经过了将由将具有缩水甘油基的单体和交联剂在聚合引发剂的存在下聚合而获得的共聚物构成的多孔质粒子用糖醇进行亲水化，然后将剩余缩水甘油基利用无机酸进行开环的工序的填充剂，但是关于耐碱性，要求更高度的耐碱性。
此外，在日本专利第5315691号公报(专利文献2)中，公开了对碱水溶液的耐性提高了的将使用了甲基丙烯酰基系单体之中的具有特殊结构的单体的交联聚合物粒子的表面进行了亲水化处理的填充剂。在专利文献2中被使用的单体由于不是通用的单体，因此具有难以容易且简单地获得，成本变高这样的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2018/155241号
专利文献2：日本专利第5315691号公报
发明内容
发明所要解决的课题
这样，虽然有各种报导，但依然期望耐碱性高、适于分选的填充剂。
本发明以解决上述发现的问题作为课题。如果更特定，则本发明的课题是提供耐碱性高的尺寸排阻色谱用的填充剂及其制造方法。
用于解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而反复进行了深入研究，结果发现，向由具有缩水甘油基的单体与交联剂的交联共聚物构成的多孔质粒子导入了规定的嵌段共聚物的填充剂的耐碱性高，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下事项。
[1]一种填充剂，是下述式1所示的嵌段共聚物的一个末端经由来源于末端羟基的醚键而与多孔质有机高分子载体结合而成的，上述多孔质有机高分子载体含有由甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的重复单元60～95mol％、和由多官能性单体衍生的重复单元5～40mol％。
(式1)
HO-(C2H4O)l-(C3H6O)m-(C2H4O)n-H
(在式1中，l为5～140的整数，m为15～75的整数，n为5～140的整数。l、m、n的合计中的m的比例为5～85％。)
[2]根据[1]所述的填充剂，上述嵌段共聚物的l、m、n的合计为30～330。
[3]根据[1]或[2]所述的填充剂，上述多官能性单体为含有2个以上(甲基)丙烯酰基的(甲基)丙烯酰基系单体。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的填充剂，上述多官能性单体为乙二醇二甲基丙烯酸酯、甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯中的任意者。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的填充剂，其排阻极限分子量为100万以上。
[6]一种填充剂的制造方法，是[1]～[5]中任一项所述的填充剂的制造方法，其具有下述工序：
工序(A)，上述工序(A)是将包含甲基丙烯酸缩水甘油酯和多官能性单体的原料单体在稀释剂和聚合引发剂的存在下聚合，获得多孔质有机高分子载体α的工序，
其中，使上述原料单体中的上述多官能性单体浓度为5mol％～40mol％，将上述稀释剂以相对于上述原料单体的合计体积为0.8倍～4.0倍的体积使用；以及
工序(B)，上述工序(B)是将上述多孔质有机高分子载体α的来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基用式1所示的嵌段共聚物进行开环，获得上述式1所示的嵌段共聚物的一个末端经由来源于末端羟基的醚键而与多孔质有机高分子载体α结合了的填充剂β。
(式1)
HO-(C2H4O)l-(C3H6O)m-(C2H4O)n-H
(在式1中，l为5～140的整数，m为15～75的整数，n为5～140的整数。l、m、n的合计中的m的比例为5～85％。)
[7]一种尺寸排阻色谱用柱，其中，[1]～[5]中任一项所述的填充剂被填充于液相色谱用壳体。
发明的效果
根据本发明，可获得耐碱性高、分选效率优异的填充剂。由此能够进行分离处理的高速化。进一步，该填充剂能够通过便宜的原料、简便的工序来制造，也容易在使用大量的填充剂的工业规模中应用。
具体实施方式
以下，详细地说明本发明的实施方式，但在以下说明中被例示的材料、尺寸等是一例，本实施方式不限定于它们，能够在不变更其主旨的范围适当变更而实施。
另外，所谓填充剂，是其能够单独作为填充剂而使用的物质，并且也包含也能够将表面根据目的进行改性而使用的物质。
此外，在本说明书中，“(甲基)丙烯酸”，是指丙烯酸和甲基丙烯酸，“(甲基)丙烯酰基”也同样。
[填充剂]
本实施方式的填充剂具有特定的骨架与以下所示的、多孔质有机高分子载体α结合了的结构。
(多孔质有机高分子载体α)
多孔质有机高分子载体α由含有由甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的重复单元60～95mol％、和由多官能性单体衍生的重复单元5～40mol％的共聚物构成。优选含有由甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的重复单元65～95mol％、和由多官能性单体衍生的重复单元5～35mol％，进一步优选含有由甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的重复单元75～92mol％、和由多官能性单体衍生的重复单元8～25mol％。在由多官能性单体衍生的重复单元的比率低的情况下，最终的填充剂有时背压变高而不适于使用，在由多官能性单体衍生的重复单元的比率高的情况下有时发生非特异吸附，不能进行目标的分选。另外，使用丙烯酸缩水甘油酯也能够获得本实施方式的多孔质有机高分子载体。
多官能性单体为分子内具有2个以上烯属双键的化合物。作为多官能性单体，优选为分子内具有2个以上(甲基)丙烯酰基的物质。具体而言，可举出烷二醇二(甲基)丙烯酸酯(烷烃的碳原子数为1～12)、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、双三羟甲基丙烷四(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇五(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇五(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇六(甲基)丙烯酸酯等，此外，也可举出多官能氨基甲酸酯(甲基)丙烯酸酯等。这些化合物可以仅使用1种，也可以并用2种以上。
优选至少包含乙二醇二甲基丙烯酸酯、甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯中的任一者。只要相对于多官能性单体的总量，50mol％以上为乙二醇二甲基丙烯酸酯、甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯即可，优选为80mol％以上，为了可以形成适于分选的细孔，全部量为乙二醇二甲基丙烯酸酯和/或甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯是最优选的。
上述共聚物如果包含合计为95mol％以上的上述甲基丙烯酸缩水甘油酯和多官能性单体作为单体单元，则在不使多孔质粒子的性质大幅变化的范围内可以包含其它单体单元。作为其它单体，作为具有缩水甘油基的单体，除了甲基丙烯酸3,4-环氧环己基甲基酯、4-羟基丁基丙烯酸酯缩水甘油基醚等以外，还可以使用(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯等。
共聚物的交联度为5mol％～40mol％，优选为5mol％～35mol％，更优选为8～25mol％。
上述交联度由
(多官能性单体的合计摩尔数/全部单体的合计摩尔数)×100
＝交联度(mol％)
表示。
在交联度低的情况下，最终的填充剂有时尺寸排阻色谱用柱的背压变高而不适于使用，如果交联度高，则有时发生非特异吸附，不能进行目标的分选。
(表面结构)
在本实施方式中，下述式1所示的嵌段共聚物经由来源于末端羟基的醚键而与上述多孔质有机高分子载体α结合。即，经由通过构成载体的共聚物中的来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基与嵌段共聚物末端羟基的反应而产生的醚键而结合。
(式1)
HO-(C2H4O)l-(C3H6O)m-(C2H4O)n-H
在式1中，l为5～140的整数，m为15～75的整数，n为5～140的整数。l、m、n的合计中的m的比例为5～85％。l与n可以为相同整数也可以为不同的整数，可以l＞n，也可以l＜n。l优选为6～135，m优选为16～70，n优选为6～135的整数。
构成(C3H6O)的C3烷基可以为正丙基、异丙基中的任一者，但为了提高疏水性，优选为异丙基。
即，在载体表面存在来源于(C2H4O)l或(C2H4O)n的亲水性高的嵌段部分、来源于(C3H8O)m的疏水性高的嵌段部分、来源于(C2H4O)l或(C2H4O)n(未与载体结合的一方)的亲水性高的嵌段部分。通过采用这样的结构，从而可以抑制非特异吸附，获得耐碱性高的填充剂。
上述嵌段共聚物的l、m、n的合计中的m的比例为5～85％，优选为10～75％，更优选为15～65％。如果在该范围，则可以获得耐碱性特别高、非特异吸附也被抑制了的填充剂。
上述嵌段共聚物的l、m、n的合计优选为30～330，更优选为35～200。如果在该范围，则可以获得耐碱性特别高、非特异吸附也被抑制了的填充剂。
另外，l、m、n可以基于日本油化学会志(日本油化学会誌)vol.49，No.10，1071的Fig2、Table1，例如参照各公司目录值，由(C2H4O)部分、(C3H8O)部分的重量算出l、m、n值。
作为这样的嵌段共聚物，可以使用(株)ADEKA、BASF公司制的プルロニック(注册商标)L、P、F系列，其中可以使用L35、F38、L42、L43、L44、L62、L63、L64、L72、P65、F68、P75、F77、P84、P85、F87、F88、L92、P94、F98、P103、P104、P105、F108、L122、P123、F127等。
(填充剂的特性)
例如以下显示这样的本实施方式的填充剂的示意性结构。
填充剂的平均粒径只要为10μm以上就没有特别限制，但从柱填充性等观点考虑，优选在15～100μm的范围。这里，平均粒径由体积换算平均粒径表示。所谓体积换算平均粒径，是通过图像解析式粒度分布测定装置而获得的值。在体积换算平均粒径使用图像解析式粒度分布测定装置的情况下，由将2000个以上交联聚合物粒子用图像解析式粒度分布测定装置进行拍摄而获得的二维的粒子图像(优选为静止图像)获得各粒子的等效圆直径(具有与粒子图像的投影面积相同的面积的圆的直径)，由该等效圆直径算出各粒子的体积，以体积作为基准进行了平均化的粒径。此时，各粒子视为具有与上述等效圆直径相同的直径的球体。作为图像解析式粒度分布测定装置，可以使用例如，流式粒子图像分析装置(商品名：FPIA-3000，シスメックス(株)制)。另外，填充剂的平均粒径能够根据载体制造时的聚合条件来调整。
优选本实施方式的填充剂的排阻极限分子量为100万以上。排阻极限分子量根据填充剂所具有的细孔的大小来调整。排阻极限分子量能够通过将填充了填充剂的柱与高效液相色谱连接，以离子交换水作为流动相以1.0mL每分钟的流速，将各种分子量的标准物质注入柱中，使用其洗脱容量，通过一般已知的方法而求出。在本实施方式中，检测使用差示折射率检测器(商品名：RI-201H、昭和电工公司制)，标准物质使用普鲁兰多糖标准品(商品名：Shodex(注册商标)STANDARD P-82，昭和电工公司制)。
为了将巨大的蛋白质用尺寸排阻色谱进行分离，优选排阻极限分子量为100万以上。例如在将分子量约90万的IgM与分子量约15万的IgG这样的巨大的蛋白质分离时，如果排阻极限小于100万，则IgM落入到排阻极限区域而不能分离。
排阻极限分子量能够通过后述制造时所使用的稀释剂的种类、量、或甲基丙烯酸缩水甘油酯和多官能性单体的比率来调整。另外，填充剂的平均粒径、细孔径不根据表面结构而变动。
(填充剂的制造方法)
本实施方式的填充剂的制造方法包含下述工序：
工序(A)，上述工序(A)是将包含甲基丙烯酸缩水甘油酯和多官能性单体的原料单体在稀释剂和聚合引发剂的存在下聚合而获得多孔质有机高分子载体α的工序，
并且使上述原料单体中的上述多官能性单体浓度为5mol％～40mol％，将上述稀释剂以上述原料单体的0.8倍～4.0倍的体积使用；以及
工序(B)，上述工序(B)是将上述多孔质有机高分子载体α的来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基用式1所示的嵌段共聚物进行开环，获得上述式1所示的嵌段共聚物的一个末端经由来源于末端羟基的醚键而与多孔质有机高分子载体α结合了的填充剂β。
[工序(A)]
调制由以甲基丙烯酸缩水甘油酯和多官能性作为单体单元的共聚物构成的多孔质有机高分子载体α。多孔质有机高分子载体α通过将这些单体在稀释剂和聚合引发剂的存在下共聚而获得。这些多孔质粒子可以以日本特开2007-170907、WO2006/132333等记载的方法作为参考而制造。
期望上述原料单体中的甲基丙烯酸缩水甘油酯浓度为60～95mol％，优选为70～95mol％。上述原料单体中的上述多官能性单体浓度优选为5mol％～40mol％，优选为5mol％～30mol％。
此外，如上述那样，可以包含其它单体成分。
为了向多孔质有机高分子载体α导入细孔，在工序(A)中在单体混合物中添加稀释剂进行聚合。所谓稀释剂，是虽然溶解于单体混合物但对聚合反应为非活性，不溶解进一步生成了的共聚物的性质的有机溶剂。在聚合结束后，将稀释剂通过洗涤等除去，从而稀释剂部分变为空洞，而在多孔质有机高分子载体α中形成多孔性细孔。
该稀释剂的添加量对填充剂的排阻极限分子量、细孔体积的体积％(表示细孔体积相对于填充剂粒子的总体积的比例)造成影响。因此，适当调节其量而加入。这些稀释剂的添加量以加入时温度下的原料单体的合计体积的0.8倍～4.0倍、优选为1.0～3.0倍的体积而使用。
作为稀释剂，可以使用例如甲苯、二甲苯、二乙基苯、十二烷基苯、氯苯那样的芳香族系烃类；己烷、庚烷、戊烷、辛烷、壬烷、癸烷那样的饱和烃类；异戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇那样的醇类；二氯甲烷、二氯乙烷、三氯乙烷那样的脂肪族卤代烃类；乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、琥珀酸二乙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸丙酯那样的脂肪族或芳香族酯等。这些稀释剂可以单独使用或2种以上混合使用。
聚合时所使用的聚合引发剂只要是产生自由基的公知的自由基聚合引发剂就没有特别限定，可以举出例如，2,2’-偶氮二异丁腈、2,2’-偶氮二(异丁酸甲酯)、2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)那样的偶氮系引发剂。其中，从化学结构的亲和性考虑，期望使用2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)。对聚合引发剂的浓度没有特别限定，但优选相对于单体的总量100质量份为0.1～5质量份。
通过原料单体混合物、稀释剂、聚合引发剂，准备包含原料单体的油相。使油相在包含适当的分散稳定剂的水性介质中搅拌悬浮，成为油滴的状态。通过在该状态下聚合(悬浮聚合)，从而共聚物作为具有适当的粒径的多孔质粒子而生成。在油滴的制作方法中，除了上述采用搅拌的制作方法以外，还可以应用使包含稀释剂的单体溶剂通过形成于多孔质膜、或石英基板的微流路而滴加到水性介质中的方法。
作为水性介质所包含的分散稳定剂，可以使用公知的物质。通常，使用明胶、聚丙烯酸钠、聚乙烯醇等水溶性高分子化合物。一般而言，使用聚乙烯醇。分散稳定剂的浓度优选相对于水性介质为0.1～5质量％。
水性介质除了水以外，还可以包含盐类以及其它水溶性成分。作为盐类，可举出氯化钠、氯化钙等一般使用的物质。由于根据所使用的盐类而溶解度有不同，因此浓度不能笼统地规定，例如对于氯化钠能够溶解0.1～15质量％而使用，对于氯化钙能够溶解1～40质量％而使用。盐类被添加用于盐析。
悬浮聚合反应在氮气置换后，通常在搅拌下加热到40～100℃，在大气压下进行5～16小时反应。此时各个油滴所包含的单体在包含稀释剂的状态下聚合，聚合物网状地生长，因此之后通过将稀释剂除去从而获得多孔质粒子。在反应后，多孔质粒子可以通过过滤等而从水性介质容易地分离。进一步，用丙酮、甲醇、二甘醇二甲基醚那样的溶剂进行洗涤，进行稀释剂的除去。在干燥后，所得的具有缩水甘油基的多孔质粒子通过筛子、风力分级装置而被分级。
这样操作而在工序(A)中获得的共聚物为具有来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基的多孔质有机高分子粒子，具有上述那样的平均粒径和细孔。
[工序(B)]
接着使多孔质有机高分子载体α的来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基与上述式1所示的嵌段共聚物进行开环反应。
由此，获得上述式1所示的嵌段共聚物的一个末端经由来源于末端羟基的醚键而与多孔质有机高分子载体α结合了的填充剂β。
作为这样的嵌段共聚物，如上述那样可以使用(株)ADEKA、BASF公司制的プルロニック(注册商标)L、P、F系列。
上述嵌段共聚物的l、m、n的合计中的m的比例、l、m、n的合计如上所述。
作为嵌段共聚物的使用量，优选相对于多孔质有机高分子载体α100质量份为100质量份～8000质量份。如果在该范围使用，则能够获得耐碱性高、抑制了非特异吸附的填充剂。
在开环反应中，作为催化剂，可以使用三氟化硼二乙基醚配位化合物、硼氟化锌、三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸、硫酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸、二氯乙酸等。催化剂相对于多孔质有机高分子载体α100质量份，优选为0.1质量份～100质量份，更优选为0.5质量份～20质量份。如果在该范围，则能够进行上述嵌段共聚物的导入，可以防止多孔质有机高分子载体α的酯基等反应。关于开环反应，通常在溶剂存在下进行反应。作为溶剂，可以使用二甘醇二甲基醚等。
所得的导入了嵌段共聚物的多孔质粒子(即填充剂β)通过用二甲亚砜等洗涤，从而除去多余的嵌段共聚物、催化剂等。
此外，在所得的填充剂β中有时残存未反应的缩水甘油基，如果缩水甘油基残存，则填充剂的疏水性上升，可能将例如蛋白质那样的疏水性高的水溶性化合物疏水性地吸附。因此为了进一步提高亲水性，期望将残存的缩水甘油基用无机酸开环。
作为无机酸，作为一例，可以例示硫酸、硝酸、盐酸等。其中，特别优选为硫酸。所使用的无机酸的浓度只要为0.01M～1.0M左右即可，特别优选为0.1～0.5M左右。如果无机酸为0.01M以上，则充分进行开环，此外如果无机酸为1.0M以下，则载体中的酯基等被水解，离子性的官能团也不会生成。所得的粒子通过用水进行洗涤，从而多余的无机酸容易被除去。
本实施方式的填充剂具有适合的亲水性和排阻极限分子量。因此，通过将该填充剂填充于液相色谱用壳体，从而可以获得高性能的尺寸排阻色谱用柱，进一步可以获得具备该尺寸排阻色谱用柱的色谱装置。此外，通过使用该尺寸排阻色谱用柱，从而可以提供可以用水系洗脱液将生物体高分子精度好地分离，进一步进行分选的生物体高分子的分离方法和分选方法。
此外，填充剂由于耐碱性高，因此能够进行洗涤再利用，能够长期连续使用。
实施例
以下，通过实施例使本发明的效果更明确。另外，本发明不限定于以下实施例，可以在不变更其主旨的范围内进行适当变更而实施。
[实施例1]
＜多孔质有机高分子载体α：具有缩水甘油基的共聚物的合成＞
在作为稀释剂的乙酸丁酯47.0g中溶解甲基丙烯酸缩水甘油酯(商品名：ブレンマーG(注册商标)日油(株)制)33.2g、乙二醇二甲基丙烯酸酯(商品名：NKエステル1G，新中村化学工业(株))5.9g、氯苯11.7g、2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)1.9g，将氮气鼓泡30分钟，准备了油相。
接下来，与油相单独地，准备使作为分散稳定剂的PVA-224((株)クラレ制，皂化度87.0％-89.0％的聚乙烯醇)10.0g、和作为盐析剂的氯化钠10.0g溶解在水480g中的水相。
将水相和油相转移到可拆式烧瓶，用安装了半月型搅拌叶片的搅拌棒以430rpm的旋转速度使其分散20分钟后，将反应器内用氮气置换，在60℃下反应了16小时。然后，将所得的聚合物转移到玻璃过滤器上，按照50～80℃左右的温水、丙酮、水的顺序充分洗涤，获得了125g作为多孔质有机高分子粒子的多孔质有机高分子载体α1。甲基丙烯酸缩水甘油酯的使用量相对于单体总量为88.7mol％，乙二醇二甲基丙烯酸酯的使用量相对于单体总量为11.3mol％。
＜缩水甘油基的开环反应＞
将上述多孔质有机高分子载体α1量取到100g玻璃过滤器上，用二甘醇二甲基醚充分地进行了洗涤。在洗涤后，将多孔质有机高分子载体α1转移到可拆式烧瓶中，将二甘醇二甲基醚400g、HO-(C2H4O)l-(C3H6O)m-(C2H4O)n-H所示的嵌段共聚物((株)ADEKA制アデカプルロニック(注册商标)L35，l为11，m为16，n为11，l+m+n为38，m/(l+m+n)为43％)400g转移到1L可拆式烧瓶中进行了搅拌分散。然后，加入三氟化硼二乙基醚配位化合物2.0ml，一边以200rpm搅拌一边向80℃升温，进行4小时反应，使缩水甘油基开环，获得了上述嵌段共聚物的一个末端经由来源于末端羟基的醚键而与多孔质有机高分子载体α1结合了的填充剂β1。在冷却后，将所得的填充剂β1过滤分离后，用水充分地洗涤，获得了138g填充剂β1。
开环反应的进行通过以下步骤而确认了。将导入了上述嵌段共聚物的填充剂β1的一部分与溴化钾混合，施加压力而制粒后用FT-IR(商品名：Nicolet(注册商标)iS10，サーモサイエンティフィック(株)制)测定，确认了红外吸收光谱中的由缩水甘油基得到的908cm-1的吸光度的峰高度。其结果，未观测到基于FT-IR的908cm-1的吸光度峰。
将所得的填充剂β1利用筛子分级为16～37μm的粒径范围，获得了117.3g的填充剂β1。
＜耐碱性评价＞
耐碱性的评价通过以下步骤，通过算出由氢氧化钠的水解得到的羧基生成量来进行。
首先，使填充剂4g分散在0.5mol/L氯化钾水溶液150mL中，将变为pH7.0的时刻设为中和点而用0.1mol/L氢氧化钠水溶液进行了滴定。因此，通过以下式子，算出填充剂所包含的水解前的羧基的量。
羧基的量(μmol/mL)＝0.1×中和点的氢氧化钠水溶液体积(μL)/填充剂的表观体积(mL)
这里，填充剂的表观体积是在使填充剂4g分散于水而调制浆料液，向量筒中转移了浆料液后，进行了充分的时间静置后测定的体积。
接着，将填充剂4g量取到可拆式烧瓶中，加入5mol/L氢氧化钠水溶液20mL，一边以200rpm搅拌一边在50℃下进行了20小时水解反应。冷却后，将用氢氧化钠进行了处理的填充剂过滤分离后，按照0.1mol/L HCl水溶液、水的顺序洗涤，将所得的填充剂所包含的羧基量通过与之前同样的方法而算出。由与5mol/L氢氧化钠水溶液反应前后的羧基的量的差，算出与5mol/L氢氧化钠水溶液的反应所得到的羧基生成量。其结果，羧基生成量为24.0μmol/mL。
另外，如果羧基生成量为40μmol/mL以下，则耐碱性评价为高。
＜非特异吸附评价＞
将所得的填充剂通过平衡浆料法填充到8mm内径、300mm长度的不锈钢柱((株)杉山商事制)。使用所得的柱，通过以下所示的方法，进行了非特异吸附试验。
将上述填充了填充剂的柱与岛津制作所HPLC系统(送液泵(商品名：LC-10AT、(株)岛津制作所制)，自动进样器(商品名：SIL-10AF、(株)岛津制作所制)，光电二极管阵列检测器(商品名：SPD-M10A、(株)岛津制作所制))连接，以50mmol/L磷酸钠缓冲液作为流动相以0.6mL/分钟的流速通水。使用与流动相相同的磷酸钠水溶液，制作0.7mg/mL的甲状腺球蛋白(Thyroglobulin)(Mw6.7×105)、0.6mg/mL的γ-球蛋白(γ-globurin)(Mw1.6×105)、0.96mg/mL的BSA(Mw6.65×104)、0.7mg/mL的核糖核酸酶(ribonuclease)(Mw1.3×104)、0.4mg/mL的抑肽酶(Aprotinin)(Mw6.5×103)、0.02mg/mL的尿苷(uridine)(Mw 244)(以上，メルク·シグマアルドリッチ制)的各样品溶液，分别从自动进样器注入10μL。将使用波长280nm的光电二极管阵列检测器观测到的各个样品的洗脱时间进行比较，确认洗脱容量的顺序、与分子量的大小的顺序没有矛盾。另外，在样品的分子量与洗脱容量的顺序没有矛盾的情况下，没有非特异吸附，在表1中，表述为〇，在有矛盾的情况下，诱发非特异吸附，因此表述为×。
其结果，各个样品从填充了填充剂β1的柱的洗脱容量为11.437mL、11.841mL、11.883mL、12.094mL、12.262mL、12.986mL，确认了样品的分子量与洗脱容量的顺序没有矛盾，未诱发非特异吸附。
[实施例2]
在缩水甘油基的开环反应中，作为HO-(C2H4O)l-(C3H6O)m-(C2H4O)n-H所示的嵌段共聚物，使用了アデカプルロニック(注册商标)L44(l为10，m为23，n为10，计算出l+m+n为43，且m/(l+m+n)为53％)400g，除此以外，与实施例1同样地操作而获得了填充剂β2。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β2的耐碱性评价。其结果，羧基生成量为23.2μmol/mL，确认了填充剂β2具有优异的耐碱性。
进一步，与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β2的非特异吸附评价。其结果，各个样品的洗脱容量为11.188mL、11.570mL、11.687mL、11.906mL、12.077mL、13.310mL，确认了样品的分子量与洗脱容量的顺序没有矛盾，未诱发非特异吸附。
[实施例3]
在缩水甘油基的开环反应时，代替アデカプルロニック(注册商标)L35，而使用了作为HO-(C2H4O)l-(C3H6O)m-(C2H4O)n-H所示的嵌段共聚物的アデカプルロニック(注册商标)P123(l为20，m为69，n为20，l+m+n为109，m/(l+m+n)为64％)400g，除此以外，与实施例1同样地操作而获得了填充剂β3。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β3的耐碱性评价。其结果，确认了羧基生成量为22.3μmol/mL，填充剂β3具有优异的耐碱性。
进一步，与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β3的非特异吸附评价。其结果，各个样品的洗脱容量为11.345mL、11.671mL、11.770mL、12.044mL、12.160mL、13.235mL，确认了样品的分子量与洗脱容量的顺序没有矛盾，未诱发非特异吸附。
[实施例4]
在缩水甘油基的开环反应时，代替アデカプルロニック(注册商标)L35，而使用了HO-(C2H4O)l-(C3H6O)m-(C2H4O)n-H所示的嵌段共聚物(アデカプルロニック(注册商标)F68(l为76，m为29，n为76，l+m+n为182，m/(l+m+n)为16％)800g，除此以外，与实施例1同样地操作而获得了填充剂β4。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β4的耐碱性评价。其结果，羧基生成量为27.6μmol/mL，确认了填充剂β4具有优异的耐碱性。
进一步，与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β4的非特异吸附评价。其结果，各个样品的洗脱容量为10.71mL、11.089mL、11.240mL、11.584mL、11.840mL、13.249mL，确认了样品的分子量与洗脱容量的顺序没有矛盾，未诱发非特异吸附。
[实施例5]
使用了以甲基丙烯酸缩水甘油酯(商品名：ブレンマーG(注册商标)日油(株)制)21.5g、乙二醇二甲基丙烯酸酯(商品名：NKエステル1G，新中村化学工业(株))17.6g、乙酸丁酯47.0g、氯苯11.7g、2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)1.9g作为油相，与实施例1同样地操作而合成出的多孔质有机高分子载体α5，除此以外，与实施例3同样地操作，获得了填充剂β5。甲基丙烯酸缩水甘油酯的使用量相对于单体总量为63.0mol％，乙二醇二甲基丙烯酸酯的使用量相对于单体总量为37.0mol％。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β5的耐碱性评价。其结果，羧基生成量为19.3μmol/mL，确认了填充剂β5具有优异的耐碱性。
进一步，与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β5的非特异吸附评价。其结果，各个样品的洗脱容量为11.387mL、11.734mL、11.775mL、12.043mL、12.44mL、12.945mL，确认了样品的分子量与洗脱容量的顺序没有矛盾，未诱发非特异吸附。
[实施例6]
在调制多孔质有机高分子载体α时，以甲基丙烯酸缩水甘油酯(商品名：ブレンマーG(注册商标)日油(株)制)27.8g、甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯(商品名：NKエステル701，新中村化学工业(株))11.3g、琥珀酸二乙酯58.7g、2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)1.9g作为油相，除此以外，与实施例1同样地操作，获得了填充剂β6。甲基丙烯酸缩水甘油酯的使用量相对于单体总量为79.8mol％，甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯的使用量相对于单体总量为20.2mol％。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β6的耐碱性评价。其结果，羧基生成量为25.0μmol/mL，确认了填充剂β6具有优异的耐碱性。
进一步，与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β6的非特异吸附评价。其结果，各个样品的洗脱容量为7.58mL、8.232mL、8.465mL、9.075mL、9.531mL、12.011mL，确认了样品的分子量与洗脱容量的顺序没有矛盾，未诱发非特异吸附。
[比较例1]
缩水甘油基的开环反应使用了HO-(C2H4O)l-(C3H6O)m-(C2H4O)n-H所示的嵌段共聚物(Pluronic(注册商标)L121(l为5，m为68，n为5，l+m+n为78，m/(l+m+n)为87％)，BASF公司制)400g，除此以外，与实施例1同样地操作而获得了填充剂β7。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β7的非特异吸附评价。其结果，各个样品的洗脱容量为11.557mL、11.584mL、11.585mL、11.866mL、14.750mL、12.487mL，确认了样品的分子量与洗脱容量的顺序产生矛盾，诱发了非特异吸附。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β7的耐碱性评价。其结果，羧基生成量为11.2μmol/mL。
[比较例2]
缩水甘油基的开环反应使用了作为聚乙二醇的PEG2000(关东化学(株)制，平均分子量1900～2100)400g，除此以外，与实施例1同样地操作而获得了填充剂β8。在该比较例2中，不包含相当于-(C3H6O)m-的嵌段结构。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β8的非特异吸附评价。其结果，各个样品的洗脱容量为11.1702mL、11.5425mL、11.6449mL、11.9073mL、12.0849mL、13.1952mL，确认了样品的分子量与洗脱容量的顺序没有矛盾，未诱发非特异吸附。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β8的耐碱性评价。其结果，填充剂β8的羧基生成量为148.3μmol/mL。
[比较例3]
在调制具有缩水甘油基的聚合物α时，以甲基丙烯酸缩水甘油酯(商品名：ブレンマーG(注册商标)日油(株)制)37.1g、乙二醇二甲基丙烯酸酯(商品名：NKエステル1G，新中村化学工业(株))2.0g、乙酸丁酯47.0g、氯苯11.7g、2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)1.9g作为油相，除此以外，与实施例1同样地操作而获得了填充剂β9。甲基丙烯酸缩水甘油酯的使用量相对于单体总量为96.3mol％，乙二醇二甲基丙烯酸酯的使用量相对于单体总量为3.7mol％。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β9的耐碱性评价。其结果，羧基生成量为20.5μmol/mL。使用所得的填充剂β9，尝试了对不锈钢柱的填充。然而，背压高，送液困难，不能进行填充。因此，不能进行非特异吸附评价。
[比较例4]
将甲基丙烯酸缩水甘油酯(商品名：ブレンマーG(注册商标)日油(株)制)13.7g、乙二醇二甲基丙烯酸酯(商品名：NKエステル1G，新中村化学工业(株))25.4g、乙酸丁酯47.0g、氯苯11.7g、2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)1.9g用于油相，除此以外，与实施例1同样地操作，获得了填充剂β10。甲基丙烯酸缩水甘油酯的使用量相对于单体总量为42.9mol％，乙二醇二甲基丙烯酸酯的使用量相对于单体总量为57.1mol％。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β10的耐碱性评价。其结果，羧基生成量为44.3μmol/mL。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂β10的非特异吸附评价。其结果，各个样品的洗脱容量为11.437mL、12.930mL、11.883mL、12.094mL、13.866mL、12.986mL，确认了样品的分子量与洗脱容量的顺序产生矛盾，诱发了非特异吸附。
另外，确认了在实施例1～6和比较例1、2和4中获得的填充剂的排阻极限分子量都为100万以上。
根据以上结果，通过采用本发明的构成，从而可获得非特异吸附被抑制了的耐碱性高的填充剂。
表明了l、m、n的任一比率超出了本发明的范围的比较例1中诱发非特异吸附，不包含相当于-(C3H6O)m-的嵌段的比较例2中耐碱性变低。
另外，表明了由多官能性单体衍生的重复单元的量过少的比较例3中尺寸排阻色谱用柱的背压变高，不能使用，由多官能性单体衍生的重复单元的量过多的比较例4中诱发非特异吸附。
表
1)PEG2000：聚乙二醇#2000由于不包含m，因此作为1+n的合计而表述
2)：○无非特异吸附，×：有非特异吸附，-：不能测定。
Claims (7)
1.一种填充剂，是下述式1所示的嵌段共聚物的一个末端经由来源于末端羟基的醚键而与多孔质有机高分子载体结合而成的，所述多孔质有机高分子载体含有由甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的重复单元60～95mol％、和由多官能性单体衍生的重复单元5～40mol％，
式1
HO-(C2H4O)l-(C3H6O)m-(C2H4O)n-H
在式1中，l为5～140的整数，m为15～75的整数，n为5～140的整数；l、m、n的合计中的m的比例为5～85％。
2.根据权利要求1所述的填充剂，所述嵌段共聚物的l、m、n的合计为30～330。
3.根据权利要求1所述的填充剂，所述多官能性单体为含有2个以上(甲基)丙烯酰基的(甲基)丙烯酰基系单体。
4.根据权利要求3所述的填充剂，所述多官能性单体为乙二醇二甲基丙烯酸酯、甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯中的任意者。
5.根据权利要求1所述的填充剂，其排阻极限分子量为100万以上。
6.权利要求1～5中任一项所述的填充剂的制造方法，其包含下述工序：
工序(A)，所述工序(A)是将包含甲基丙烯酸缩水甘油酯和多官能性单体的原料单体在稀释剂和聚合引发剂的存在下聚合，获得多孔质有机高分子载体α的工序，
其中，使所述原料单体中的所述多官能性单体浓度为5mol％～40mol％，将所述稀释剂以相对于所述原料单体的合计体积为0.8倍～4.0倍的体积使用；以及
工序(B)，所述工序(B)是将所述多孔质有机高分子载体α的来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基用式1所示的嵌段共聚物进行开环，获得所述式1所示的嵌段共聚物的一个末端经由来源于末端羟基的醚键而与多孔质有机高分子载体α结合了的填充剂β，
式1
HO-(C2H4O)l-(C3H6O)m-(C2H4O)n-H
在式1中，l为5～140的整数，m为15～75的整数，n为5～140的整数；l、m、n的合计中的m的比例为5～85％。
7.一种尺寸排阻色谱用柱，其中，权利要求1～5中任一项所述的填充剂被填充于液相色谱用壳体。
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