JPS58177140A - 液体クロマトグラフイ−用多孔質充填剤及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、第４級アンモニウム基を有する液体クロマト
グラフィー用多孔質充填剤及びその製造方法に関し、特
に糖、アミノ酸、タンパク實、核酸及びその関連物質、
有機酸、アミン類等の如き水溶性生化学関連物質の＾速
液体クロマトグラフィーに通した第４級アンモニウム基
を有する液体クロマトグラフィー用多孔質充填剤及びそ
の＃遣方法に関する。

従来、生化学関連物質に適用できる第４級アンモニウム
基含有充填剤としては、架橋デキストラン、セルロース
等を基材とし、これに第４級アンモニウム基を導入した
充填剤が知られていた。これらのグルはその基材が親水
性であるため、水溶性物質に対する疎水性吸着が少なく
、従って生化学関連物質の分離精製手段として広く用い
られてきた。しかし、これらの充填剤は機械的強度が小
さいため、高流速下で使用することができず分離に多大
な時間を必要とした。そこで、機械的強度の大きな充填
剤が要望され、近年スチレンとジビニルベンゼン系の共
重合体に第４級アンモニウム基を導入した充填剤、シリ
カ等の無機物に第４級アンモニウム基を付与した充填剤
が開発された。しかし、スチレンとジビニルベンゼン系
共重合体に第４級アンモニウム基を導入した充填剤は疎
水性吸着が著しく多く、そのため適用できる試料は限ら
れており、特にたん日の分離に関してはほとんど使用す
ることができなかった。

一方、シリカ等の無機物に第４級アンモニウム基を付与
した充填剤は疎水性の吸着は少ないが、付与された第４
級アンモニウム基の縦が少ないため、イオン交換能がか
さく、かつ、高いｐＢ、イオン強度では、使用できない
という欠点があった。

一般ｋ、水溶性生化学関連物質のイオン交換分離に適用
できる充填剤に要求される重要な性能としては、 ｌ）機械的強度が大きく、高速で使用できること、 ２）試料の疎水性吸着が少ないこと、 ３）イオン交換能（分離能）の大きいこと、等があけら
れるが、上記の望ましい性能を十分満足するような高性
能の第４級アンモニウム基を有する充填剤はいまだ得ら
れていない。

か＼る観点から本発明者らは、上記性能を充足する液体
クロマトグラフィー用多孔質充填剤を得るべく種々検討
した結果、エポキシ基を含む多孔質のグル状共重合体で
あって、かつ該エポキシ基が纂３１Ｍ七ノアき／で開環
変性されている第４級アンモニウム基を含む多孔質の共
重合体からなる充填剤は、前記の重要な性能を充分満足
し得ることを見出し本発明を達成した。

即ち、本発明は、、（１）　　（Ａｌグリシジルモノビ
ニルエステルまたはグリシジルモノビニルエーテル及ヒ
（８１多価アルコールの／　ＩＪビニルエステルを主成
分とし、該（Ａｔ成分が（Ｂｌ成分で架橋された分子中
に＃（４）成分忙基づく遊離のエポキシ基を含むグル状
共重合体であって、かつ該エポキシ基が第３級モノアミ
／で開環変性されている多孔質の共重合体からなること
を特徴とする第４級アンモニウム基含有粉体クロマトグ
ラフィー用多孔質光填剤、及び（２）　　（Ａ）ダリシ
ジルモノビニルエステルまたはグリシジルモノビニルエ
ーテルの１０〜９０モル・憾と（Ｂｌ　多（１ｆｆｉア
ルコールのＩリビニルエステルの９０〜１０モル憾とを
水不溶性の有機稀釈剤の存在下に水性懸濁重合せしめる
ことにより、（Ａｌ　ｂｘ分に基づくエポキシ基を分子
中に残留せしめると共に多孔質を有するグル状共重合体
粒子を生成せししめ、次いで生成グル伏兵１合体粒子Ｋ
ＩＥ３Ｎモノアミンを反応せしめて該エポキシ基を開場
変性せしめることを特徴とする第４級アンモニウム基含
有液体クロマトグラフィー用多孔質充填剤の製造方法に
関する。

本発明の液体クロマトグラフィー用多孔質充填剤は、高
速液体クロマトグラフィーに適した機械的強度を有する
ばかりでなく、使用可能なｐ）ｌ、イオン強度の範囲も
広く、上Ｆスチレンとジビニルベンゼン共重合体に第４
級アンモニウム基を導入した充填剤と同程度のイオン交
換能を有し、かつその疎水性吸着はスチレンとジビニル
ベンゼン共重合体に第４級アンモニウム基を導入した充
填剤よシはるかに少ないという特長を有する。

本発明の第４級アンモニウム基を有する液体クロマトグ
ラフィー組長孔質充填剤は、通常、保有水蓄が０．１〜
５ｗｔ／ｆ、イオン交換能カ０．１〜６　ｍ＠ｑ　／　
ｆのものであり、（３）グリシジルモノビニルエステル
首たはグリシジルモノビニルエーテル及び（Ｂｌ　多価
アルコールの？リビニルエステルを主成分とし、該（４
）成分が（Ｂｌ成分で架橋された分子中Ｋ１１ｉ（Ａｌ
成分に基づく遊離のエポキシ基を含むグル状共重合体を
母体とするも１／）で身、４゜ 出発原料として用いられる（元成分は、グリシジルモノ
ビニルエステルまたはモノビニルエーテルであり、炭素
数３〜１２のモノビニルカルダン酸のグリシジルエステ
ルまたは炭素数３〜１２のモノビニルアルコールのグリ
シジルエーテルが用いられる。これらのうち炭素数の少
ないものが特に好ましく用いられ。

その例の中にはメタクリル酸グリシジル、アクリル酸グ
リシジル、アリルグリシジルエーテル等が含まれる。一
方架橋成分として働（（Ｂｌ成分は、多価アルコールの
ポリビニルエステルであわ、これは炭素数２〜２ｏの多
価アルコールとアクリル酸もしくはメタクリル酸とのエ
ステルが好ましく用いられる。例としてエチレングリコ
ールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレ
ート、プロピレングリコールジアクリレート、プロピレ
ングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコー
ルジメタクリレート、Ｉリプロピレングリコールジメタ
クリレート、グリセリンジアクリレート、グリセリンジ
メタクリレート、テトラメチロールメタンジアクリレー
ト、テトラメチロールメタントリアクリレート、テトラ
メチロールメタンジメタクリレート、テトラメチロール
メタントリメタクリレート等があげられる。

（Ａｌ成分対（Ｂｌ成分の割合は、前者１０〜９０モル
ＩＫ対し後者９０〜１０モル憾とする。

好ましくは（４）成分４０〜８０モル憾、（Ｂｌ成分６
０〜２０モル傷である。（４）成分の半量以下をコモノ
マー即ちメチルメタクリレート、メ、′ｉ′ チルアクリレート、酢酸ビニルの如き低級のビニルエス
テルで置きかえることができる。

（Ａ）成分の割合が大きい程もちろん共重合体中のエポ
キシ基の含有量は増大する。（Ｂｌ成分の割合が大きい
程共重合体の架橋度は大となり、従って網目構造が密で
膨潤度が小さく硬くなる。上記両成分の割合の範凹外で
は所期の特徴と特性を充分にみたすグル状共重合体が得
Ｃ）　１１ない。

（４）成分と１８１成分とは、水不溶性の有機希釈剤の
存在下に水性懸濁重合され、所期のビーズ状グル共重合
体が製造される。即ち（Ａｌ、（Ｂ１１成分が有機希釈
剤中に溶解されて水中油型の懸濁重合が行なわれる。こ
の有機希釈剤の存在忙基づいて、（（転）成分のエポキ
シ基の開場及びそれによって生ずる架橋が抑制され、か
くして生成重合体中にエポキシ基が残留し保有される。

有機希釈剤を用いないと、エポキシ基が開環してしまう
ばかシでなく、機械的強度の大きな多孔質グルが得られ
ない。

用いられる有機希釈剤は、重合反応に不活性で、水に不
溶乃至難溶性であるが原料モノマーを溶解するものであ
ればよい。使用ｔＦｉモノマー成分と有機希釈剤との合
量に基づき少くとも３０容量鳴とし、好ましくは４０〜
８０容量鳴である。使用νが多い程重合過程におけるエ
ポキシ基の開環が抑制される。一般的に云って、使用Ｉ
ＡＩＡｌ成分込量中の含有ｘ４キシ基の６０〜９５憾程
度を容易に生成重合体中に残留せしめることができる。

残余は重合過程で加水分解されまた一部は架橋に費され
るものと思われる。

以上の如く生成グル中のエポキシ基の含量は、ｔＡｌＡ
ｌ成分用量即ち（Ｂｌ成分に対する割合またはコモノマ
ーによる部分的代替によって、そして着た有機希釈剤の
用量によって、調節することができるが、生成重合体中
にエポキシ酸素量として表わして１′Ｎｔ＃ｊ以上存在
せしめるようにすることが好ましく、最高約１０ｆｉｌ
憾である。

水性懸濁１合時における有機希釈剤の使用はまた、生成
多孔性グルの孔径調節にも役立つ。生成グルに対し膨潤
性の小さい有機希釈剤を使用すると、重合過程で懸濁粒
子内に相分離が起り、その結果孔径の大きいグル所非巨
大有孔構造を有するグルを得ることができる。これに対
し、膨潤性の大きい希釈剤を使用すると、重合過程で生
成物が膨潤状態でｌ。

合が進行するから、相分離は起り難く膨潤によって形成
された比較的小さい孔径の重合体が得られる。膨潤性の
大小は、有機希釈剤の溶解パラメーターに基づいて知る
ことができる。本発明において好適に用いつる有機希釈
剤の例として、生成グル忙対する膨潤性の大きいものの
順に桔げれば、シクロヘキサノンル、シクロヘキサノン
、クロロベンゼン、ベンゼン、トルエン、ｎ−プロピル
アセテート、ｎ−ブチルアセテート、ｈ−オクタン等で
ある。

水性懸濁重合は、遊離基発生触媒の存在下にそれ自体は
公知の常法に従って行なうことができる。水相の菫は有
機相の量に基づきほぼ同容量またはそれ以上とし、特に
制約はないが約１０倍容量までの倉で用いられる。生成
グル状共重合体は液体クロマト充填剤として好適な粒状
で得られる。

かくして得られるエポキシ基を含むグル状共重合体は、
平均粒子径が１〜１０００μ、好ましくは２〜２００１
１、排除限界分子量が１０００以上、保有水量力０．１
〜５ｓｄ／ｆ。

のものである。

上記工４キシ基を含むグル状共重合体に第４級アンモニ
ウム基を導入する方法は、エポキシ基を含むグル状共重
合体を第３級モノアミンを溶解した水溶液に分散し、−
５℃〜反応混合物の還流温度、好ましくＦｉｚｏｔ：〜
８０℃の温度で所定時間、撹拌下で行なわれる。また、
水溶液の代り忙水と有機溶媒との混合溶液に第３級モノ
アミンを溶解した溶液を使用して反応を行うこともでき
る。

エポキシ基を有するグル状共重合体と第３級モノアミン
との反応は、次の反応式によって表わされる。

こ＼でＮＲＩ　Ｒ１ＲＩ　Ｆｉ第３級モノアミンである
。

この反応では第４級アンモニウム基の他にＯＨ基が同時
に生成する。ＯＨ基は親水性基なのでグルの疎水性を下
げる。このことは、生化学関連物質を分離するための充
填剤として、好ましいことである。

用いられるｗｃ３級モノアミンとしては、大きな疎水基
のあるものは、水溶性物質との疎水性相互作用の原因と
なるので好ましくなく、水酸基、エーテル基、鎖長の短
い脂肪族基などで構成されているのが望ましい。

また、用いるｗｃ３級モノアミンの分子量が大き過ぎる
とグル内部の容積が減少しかつイオン交換容量も減少す
るため分子量は５００以下のものが好ましい。

上記条件を満たすａｇ３級モノアミンとして、トリエチ
ルアミン、トリエチルアミン、Ｎ−メチルジエチルアミ
ン、Ｎ、Ｎ−ジメチルエチルアミン、Ｎ−メチルジエタ
ノールアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチルエタノールアミン、ト
リエタノールアミン及びこれらの塩等があけられ、これ
らは単独Ｋｔたけ混合物として用いられる。

上記の第３級モノアミン及びその塙の代りに、他のアミ
ン、例えばアンモニア、第１級アミン及び第２級アミン
のようなアミンを使用することができるが、この場合の
生成物は、第３級モノアミンを用いた場合の生成物と異
なり、弱塩基性のアニオン交換体であるため、イオン交
換作用を有するｐＨ範囲が強塩基性アニオン交換体よ−
りも狭く、使用ｐＨ範囲が限定されるという欠点を有す
る。

また、ポリエチレンイミンのようなポリアミンを使用す
る場合には、架橋反応が生じてグルの内部容積、排除限
界分子量が減少するばかりでなく、グルの内部容積が少
ないため、イオン交換容１゛が著しく小さくなり、分離
能の大きなグルは得られない。

さらに、始めに弱塩基性のアニオン交換体に変性した後
にアミノ基をアルキル化して、強塩基性アニオン交換体
にすることもできるが、この場合には反応行程が長くな
るばかりかアルキル化も完全には進行せず、イオン交換
容量の大きな強塩基性アニオン交換体は得られない。

本発明の第４級アンモニウム基を有する多孔質充填剤は
、機械的強度が大きく、高速で使用できること、試料の
疎水性吸着が少ないこと、分離能が大きいこと等の特長
を有し、かつその塩基性アニオン交換作用により、イオ
ン性の試料の分離が可能であり、例えば糖、アミノ酸、
タンバク質、核識およびその関連物質等のごとき水溶性
生化学物質の高速液体りｔ２−ｆトゲラフイー用充填剤
として極めて有用である。

以下に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ グリ゛シジルメタクリレー）　５００　ｆ、エチレンダ
リコールジメタクリレー）　２００　ｆ。

ドデカノール１５０Ｆ、クロロベンゼン８００Ｖ及びア
ゾビスイソブチロニトリル１０ｆｔ−１５ｔのＩリビニ
ルアルコールを６１の水に溶解した溶液中Ｋｌ！Ｉ濁さ
せた。攪拌しながら６０℃で６時間加熱重合させた。反
応終了後、生成したグル状重合物をＰ遇した。重合物を
数回水洗した後アセトンで洗浄し乾燥した。

生成したグル状重合物中のエポキシ基の量を塩酸−ジメ
チルアミド法で定量したところ、仕込量の８１憾に相幽
するエポキシ基量が残っていた。また保有水量は１ｍｌ
／ｌであった。

次いでグル状重合物を分級し、２０〜３７μのものを集
めた。これを内径６−１長さ２５へのカラムに充填し、
デキストラン標準試料（ファーマシア社＃）を用いて排
除限界分子量を測定した結果、排除限界分子量は３０万
であった。

上記グル状重合物１００ｔをトリメチルアミン塩酸塩１
００ｆを溶解した水溶液１．５ｔＫ分散し、５０℃で４
時間反応を行った。反応終了後、生成物を炉遇し、水洗
した。得られた生成物のイオン交換容量は２．３　ｍｓ
ｑ　／ｆ（０，８ｒｎ＊ｑ／ｄ）、保有水量は１ｍｌ！
／ｆであった。分級して集めた２０〜３７μの生成物を
内径６ｍ、長さ１２．５ａｖ＋のステンレスカラムに充
填し、上記と同様な方法で排除限界分子量を求めたとこ
ろ、排除限界分子量は３０万であった。

次に、従来の充填剤のイオン交換能の代表的な値と本発
明の充填剤（実施例１の生成物）のイオン交換能の値を
比較してみたところ、表−１の如き結果を得た。

表−１ 充填剤の種類　　　商　品　名　　　　イオン交換容Ｉ
＃（ｍＩｑＡｔ）スチレン糸１）Ｄｏｔ＠Ｘ　２−Ｘ８
　　　　　１．０シリカ糸２）　　　　Ｖｙｄａｅ　　
３０１ＴＰ　　　　　　Ｏ，１本発明　３）　　　　　
　　　　　　　　　　　０．８（注） ｌ）スチレン−ジビニルベンゼン共ｉ合体忙第４級アン
モニウム基を尋人したもの２）シリカに第４級アンモニ
ウム基を付加したもの ３）実施例１の生成物 表−１から明らかな如く、本発明の充填剤のイオン交換
容量は従来のスチレン糸充填剤のそれとほとんど同等の
イオン交換能を有していることがわかる。

また、前記の多孔質グルを充填したカラムを用いて、純
水を溶離液として用いた場合のｎ−ブタノールとメタノ
ールの分配定数の比で較べた疎水性吸着は表−２の如く
であった。

表−２においてＫＤは分配定数を表わす。

表　　−２ 本発明　実施例１　　　　　１．１ （注）　１）　　スチレン−ジビニルベンゼン共重合体
に第４級アンモニウム基を導入した もの（日立カスタムイオン交換樹脂） 表−２において、分配定数の値が１に近い程、疎水性の
吸着は少ないものであり、従って本発明の充填剤は、疎
水的吸着性が従来のスチレン系充填剤のそれより著しく
小さいことがわかる。　　　　　　゛□゛ 次に、上記と同一のカラムを用い、アデノシン−リン酸
、アデノシンニリン酸及びアデノシンニリン酸の核酸関
連物質を試料として液体クロマトグラフィーを行なった
。そのり【マドグラムを第１図に示した。

測定条件 溶　離　液：０５モル　リン酸二水素カリウム水溶液 ポンプ流速：　２　ｍｌ　／　ｍｉｍ カラム圧カニ４Ｋｔ／ａｄ（室温） 検　出　器：吸光光度計 試料注入量：試料名０．０１蛎　４０μを核酸関連物質
の分離においては、スチレンーシヒニルベンゼン共ｆｆ
合体に第４級アンモニウム基を導入した充填剤では昇温
する必要があったが、本発明の充填剤は室温で分離が可
能であり、第１図から明らかなごとく、３成分の核酸関
連物質が極めて良好に分離した。

ｔ”Ｋ、同じ多孔質グル状共重合体を用いてミオゲロビ
／、卵プルプミンのたん白を試料として液体クロマトグ
ラフィーを行なった。

そのクロマトグラムを算２図忙示した。

測定条件 カ　ラ　ム：内径６曽×長さ１５０■ ポ／プ流速：　２　ｔｄ　／　ｍｌｎ カラム圧カニ４Ｋｆ／ｄ（室温） 検　出　器：吸光光度計 試量注入ｔ：試料各０．０５１！　　１００μを第２図
から明らかなごとく、２成分のたん白は極めて良好に分
離した。

実施例２ グリシジルメタクリレート５００ｆ、グリセリンジメタ
クリレート２０　Ｏｆ、クロルベンゼン６００　ｆ１シ
クロヘキサノール２５０ｔ、及びアゾビスインブチロニ
トリル１０９を１５ｆのポリビニルアルコールを６ｔの
水に溶解した溶液中に懸濁させた。以下実施例１と同様
に重合を行なってグル状重合物を得、た〇 排除限界分子量は５６０００．エポキシ基の残存量は仕
込量の７３憾であった。また、保有水量は１−／ｆであ
った。

上記のグル状重合物１００ｆをＮ、Ｎ−ジメチルエタノ
ールアミン１００ｆを溶解した０、５Ｎ＠Ｈα溶液１．
５ｔに分散し、５０℃で４時間反応を行った。反応終了
後、生成物を許過し水洗した。得られた生成物のイオン
交換容重は１．８１ＴＩ＠ｑ／　ｆ　（０，６ｍ＠ｑ　
／　ｄ　）、保有水量は０．９５ｄ！／ｆであった。

実施例３ アリルグリシジルエーテル５００　Ｆ、エチレングリコ
ールジメタクリレート２００ｔ。

クロルベンゼン８００を及びアゾビスイソブチロニトリ
ル１０ｆｔ−１５ｔのポリビニルアルコールを６ｔの水
に溶解した溶液中に懸濁させた。以下実施例１と同様に
重合を行なってグル状重合物を・得た。

排除限界分子量は１０万、工？キシ基の残存量は仕込み
量の６５憾であった。また保有水量はＩｍ／／ｆであっ
た。

上記のグル状重合物を実施例１と同様にトリメチルアミ
ン塩酸塩と反応させた。得られた生成物のイオン父換容
量は０．９　ｍ＠ｑ　／　ｆであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られた第４級アンモニウム基を
含有する多孔質グル伏兵重合体ヲカラムに充填してアデ
ノシン−リン酸、アデノシンニリン酸及びアデノシンニ
リン酸の核酸関連物質を試料とし、液体クロマトグラフ
ィーを行なった結果である。 １・・・アデノシン−リン酸、２・・・アデノシンニリ
ン酸、３・・・アデノシンニリン酸 第２図は実施例１で得られた第４級アンモニウム基を含
有する多孔質グル伏兵１合体をカラムに充填してミオグ
ロビン及び卵アルブミンのたん白を試料として液体クロ
マトグラフィーを行なった結果である。 １・・・ミオグロビン、２・・・卵アルプミンシ＠−出
時間（ガ） 第２図 洛山寮量（ｍｌ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１（Ａｔ　　グリシジルモノビニルエステルまたは
   グリシジルモノビニルエーテル及ヒ［Ｂｌ多価アルコー
   ルのポリビニルエステルを主成分とし、該圓成分が（Ｂ
   ｌ成分で架橋された　　３分子中に該［Ａｌ成分に基づ
   く遊離のエポキシ基を含むグル状共重合体であって、か
   つ該エポキシ基が第３級モノアミンで開場変性されてい
   る多孔質の共重合体からなることを特徴とする第４級ア
   ンモニウム基含有液体クロマトグラフィー用多孔質光填
   剤。 （２）　　＋ＡＩ　　グリシジル硲ノビニルエステルま
   たはグリシジルモノビニルエーテルの１０〜９０モル１
   　ト（Ｂｌ　　多価アルコールのポリビニルエステルの
   ９０〜１０モル１とｔ水不溶性の有機希釈剤の存在下に
   水性＠１ｍ重合せしめることＫより、（Ａｌ成分に基づ
   くエポキシ基を分子中に残留せしめると共に多孔質を有
   するグル伏兵１合体粒子を生成せししめ、次いで生成グ
   ル伏兵１合体粒子に第３級モノアミンを反応せしめて該
   エポキシ基を開環変性せしめることを特徴とする第４級
   アンモニウム基含有液体クロマトグラフィー用多孔質光
   填剤の製造方法。