WO2013172266A1 - ポリマー粒子の製造方法、ポリマー粒子、クロマトグラフィーカラム用充填剤、及びクロマトグラフィーカラム - Google Patents

ポリマー粒子の製造方法、ポリマー粒子、クロマトグラフィーカラム用充填剤、及びクロマトグラフィーカラム Download PDF

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幸子 津田
良 土井
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    • B01J2220/80—Aspects related to sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing polymer particles, polymer particles, a filler for a chromatography column using the particles, and a chromatography column.
  • synthetic polymers such as poly (meth) acrylic esters and poly (meth) acrylamides and particles of natural polymers such as polysaccharides have been used as chromatographic carriers.
  • the synthetic polymer particles are either a method of polymerizing a monomer hydrophobized with a protecting group or the like, or normal phase suspension polymerization (O / W type) or reverse phase suspension polymerization (W / O type). Manufactured by the method.
  • hydrophobization treatment a secondary treatment for converting to a hydrophilic group must be performed after the polymerization, and the reverse phase suspension polymerization requires a large amount of an organic solvent, and the particle preparation process is complicated.
  • Patent Documents 4 and 5 disclose the use of a polymer using a tertiary acrylamide-based crosslinking monomer as a dental material, but both of these disclose compositions that compensate for tooth defects. It does not relate to polymer particles.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method for producing polymer particles from an acrylamide monomer by a normal phase suspension polymerization method, a polymer particle, a packing material for a chromatography column using the particle, and a chromatography column. It is in.
  • the present inventors have dispersed a monomer composition containing a polyfunctional monomer having a plurality of N-substituted acrylamide groups in an aqueous medium, and polymerized the monomer composition, so that the acrylamide monomer can be polymerized.
  • the present inventors have found that polymer particles can be produced by a normal phase suspension polymerization method.
  • the present invention includes a step of dispersing a monomer composition containing a polyfunctional monomer having a plurality of N-substituted acrylamide groups in an aqueous medium, and a step of polymerizing the dispersed monomer composition.
  • the present invention provides a method for producing polymer particles.
  • the present invention also provides polymer particles produced by the above production method.
  • this invention provides the polymer particle containing the structure represented by following formula (2).
  • R 1 represents an alkylene group having 2 to 8 carbon atoms
  • R 2 and R 3 represent an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 2 and R 3 are adjacent together.
  • a heterocycle may be formed together with the nitrogen atom and R 1 .
  • the total number of carbon atoms of R 1 , R 2 and R 3 is 5 or more.
  • the present invention provides a packing material for a chromatography column using the polymer particles as a carrier. Furthermore, the present invention provides a packing material for affinity chromatography in which a ligand is immobilized on the polymer particles. Furthermore, this invention provides the chromatography column with which the said filler is packed.
  • polymer particles can be produced from an acrylamide monomer by a normal phase suspension polymerization method.
  • the polymer particles containing the structure represented by the formula (2) of the present invention are excellent in alkali resistance and antifouling property, and have a large binding capacity to a biopolymer when a ligand is immobilized, and thus a chromatography carrier. Useful as.
  • Example 2 is a SEM photograph of polymer particles of Example 1.
  • the method for producing polymer particles of the present invention comprises a step of dispersing a monomer composition (also referred to as a polymerizable composition) containing a polyfunctional monomer having a plurality of N-substituted acrylamide groups in an aqueous medium and polymerizing the monomer composition. It is characterized by including.
  • the said monomer composition means the composition containing a monomer.
  • the polymer particle means a particulate polymer.
  • the polyfunctional monomer used in the present invention has a plurality of N-substituted acrylamide groups.
  • the N-substituted acrylamide group possessed by the polyfunctional monomer is preferably an acrylamide group in which an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is substituted with a nitrogen atom from the viewpoint of obtaining polymer particles with less gel adhesion.
  • the number of N-substituted acrylamide groups is preferably 2 to 6 per molecule, more preferably 2 to 4 and particularly preferably 2 from the viewpoint of obtaining polymer particles with little gel adhesion.
  • polyfunctional monomer examples include those represented by the following formula (1).
  • R 1 represents an alkylene group having 2 to 8 carbon atoms
  • R 2 and R 3 represent an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 2 and R 3 are adjacent together.
  • a heterocycle may be formed together with the nitrogen atom and R 1 .
  • the total number of carbon atoms of R 1 , R 2 and R 3 is 5 or more.
  • the alkylene group having 2 to 8 carbon atoms represented by R 1 may be linear or branched.
  • the alkylene group preferably has 3 to 8 carbon atoms, more preferably 3 to 6 carbon
  • R 2 and R 3 together may form a heterocyclic ring with the adjacent nitrogen atom and R 1 .
  • heterocyclic groups include 2-methylpiperazine-1,4-diyl group, 2-ethylpiperazine-1,4-diyl group, 2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl group, 2,5- Diethylpiperazine-1,4-diyl group, 1,4-perhydrodiazepine-1,4-diyl group, 6-methyl-1,4-perhydrodiazepine-1,4-diyl group, 6-ethyl- Examples include 1,4-perhydrodiazepine-1,4-diyl group.
  • the total number of carbon atoms of R 1 , R 2 and R 3 is 5 or more, preferably from the viewpoint of obtaining polymer particles efficiently by the normal phase suspension polymerization method, from the viewpoint of alkali resistance and antifouling property, etc. It is 5 to 15, more preferably 5 to 12, further preferably 6 to 10, and particularly preferably 7 to 9.
  • N, N′-diethyl-1,3-bis (acrylamide) propane (DEAAP) [solubility parameter: 22.6 (MPa) 1/2 ]
  • N, N′-diethyl-1,6-bis (acrylamide) hexane (DEAAH) [21.7 (MPa) 1/2 ]
  • 1,4-bis (acryloyl) piperazine (BAP) [23.6 (MPa) ) 1/2
  • N, N′-diethyl-1,4-bis (acrylamide) butane [22.3 (MPa) 1/2 ]
  • N, N′-dimethyl-1,6 -Bis (acrylamide) hexane [22.3 ( Pa) 1/2]
  • N, N′-diethyl-1,3-bis (acrylamide) is used to obtain polymer particles having excellent alkali resistance and antifouling properties and having a large binding capacity to a biopolymer when a ligand is immobilized.
  • DEAAP Propane
  • DEAAH N, N′-diethyl-1,6-bis (acrylamide) hexane
  • DEAAH N, N′-diethyl-1,4-bis (acrylamide) butane
  • N, N′-diethyl- 1,5-bis (acrylamide) pentane N, N′-dimethyl-1,3-bis (acrylamide) propane, N, N′-dimethyl-1,6-bis (acrylamide) hexane, N, N′-dimethyl 1,4-bis (acrylamide) butane and N, N′-dimethyl-1,5-bis (acrylamide) pentane are preferred.
  • solubility parameter means an SP value calculated by the fedors method
  • solubility parameter ⁇ of the compound is obtained by the following equation.
  • ⁇ E represents the evaporation energy (J / mol)
  • ⁇ V represents the molar volume (cm 3 / mol) at 25 ° C.
  • the solubility parameter ⁇ of the polyfunctional monomer is preferably 10.0 (MPa) 1/2 or more and 30.0 (MPa) 1/2 or less from the viewpoint of obtaining polymer particles with little gel adhesion.
  • (MPa) 1/2 or more and 25.0 (MPa) 1/2 or less are more preferable, 17.5 (MPa) 1/2 or more and less than 24.0 (MPa) 1/2 are more preferable, and 20.0 (MPa) ) 1/2 or more and 23.5 (MPa) 1/2 or less are more preferable, and 21.0 (MPa) 1/2 or more and 23.0 (MPa) 1/2 or less are more preferable.
  • the amount of the polyfunctional monomer used is preferably 20 to 99% by mass, preferably 50 to 90% by mass with respect to the total amount of monomers, from the viewpoint of the mechanical strength of the polymer particles, particularly the pressure performance when used as chromatographic column particles. % Is more preferable.
  • the monomer composition used in the present invention may contain another monomer copolymerizable with the polyfunctional monomer having a plurality of N-substituted acrylamide groups.
  • any of a non-crosslinkable (monofunctional) monomer and a crosslinkable (polyfunctional) monomer can be used, and these may be used in combination.
  • the solubility parameter ⁇ of the other monomer is preferably 10.0 (MPa) 1/2 or more and 29.0 (MPa) 1/2 or less, more preferably 15 from the viewpoint of obtaining polymer particles with less gel adhesion.
  • the non-crosslinkable monomer is preferably a (meth) acrylamide monomer, a styrene monomer, an N-vinylamide monomer, a vinyl ketone monomer, or an acrylonitrile monomer.
  • Examples of the (meth) acrylamide monomer include dimethylacrylamide (DMAAM) [23.9 (MPa) 1/2 ], diethylacrylamide (DEAAM) [20.7 (MPa) 1/2 ], and propylacrylamide [22.0. (MPa) 1/2 ], isopropylacrylamide [21.6 (MPa) 1/2 ], acryloylmorpholine [28.0 (MPa) 1/2 ], acryloylpyrrolidine [27.9 (MPa) 1/2 ], And acryloylpiperidine [25.8 (MPa) 1/2 ].
  • DMAAM dimethylacrylamide
  • DEAAM diethylacrylamide
  • propylacrylamide [22.0.
  • MPa) 1/2 isopropylacrylamide [21.6 (MPa) 1/2 ]
  • acryloylmorpholine 28.0 (MPa) 1/2
  • acryloylpyrrolidine 27.9 (MPa) 1/2
  • And acryloylpiperidine 25.8 (MPa) 1/2 ].
  • R 4 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 5 and R 6 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • R 4 is preferably a hydrogen atom.
  • R 5 and R 6 are preferably alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms. Examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, and an isopropyl group. The number of carbon atoms of the alkyl group is preferably 1 or 2.
  • styrene monomer examples include styrene [18.9 (MPa) 1/2 ], ⁇ -methylstyrene [18.8 (MPa) 1/2 ], and halogenated styrene [20.0-21.8 ( MPa) 1/2 ] (fluorostyrene [20.0 (MPa) 1/2 ], chlorostyrene [21.0 (MPa) 1/2 ], bromostyrene [21.2 (MPa) 1/2 ], iodine Styrene [21.8 (MPa) 1/2 ]), 4-methoxystyrene [19.2 (MPa) 1/2 ], 4-ethoxystyrene [19.0 (MPa) 1/2 ], 1,2- And dihydroxy-3- (4-vinylbenzyloxy) propane [28.0 (MPa) 1/2 ].
  • N-vinylamide monomer examples include N-vinylformamide [26.1 (MPa) 1/2 ], N-vinylacetamide [23.5 (MPa) 1/2 ], N-vinylpropamide [22 .6 (MPa) 1/2 ], N-vinylbutamide [22.0 (MPa) 1/2 ], N-methyl-N-vinylformamide [21.7 (MPa) 1/2 ], N-methyl-N -Vinylacetamide [19.5 (MPa) 1/2 ], N-methyl-N-vinylpropamide [19.3 (MPa) 1/2 ], N-methyl-N-vinylbutamide [19.1 (MPa) 1/2 ], N-ethyl-N-vinylformamide [21.1 (MPa) 1/2 ], N-ethyl-N-vinylacetamide [19.3 (MPa) 1/2 ], N-ethyl-N -Vinylpropamide [19.1 (MPa) 1/2 ], N-eth Ru-N-viny
  • Examples of the vinyl ketone monomer include acrolein [21.6 (MPa) 1/2 ], methyl vinyl ketone [17.7 (MPa) 1/2 ], and ethyl vinyl ketone [17.7 (MPa) 1/2]. ], Propyl vinyl ketone [17.7 (MPa) 1/2 ], isopropyl vinyl ketone [17.2 (MPa) 1/2 ], methacrylolein [21.0 (MPa) 1/2 ], isopropenyl methyl ketone [17.8 (MPa) 1/2 ], isopropenyl ethyl ketone [17.7 (MPa) 1/2 ], isopropenyl propyl ketone [17.7 (MPa) 1/2 ], isopropenyl isopropyl ketone [17 .3 (MPa) 1/2 ] and the like.
  • acrylonitrile-based monomer examples include acrylonitrile [22.7 (MPa) 1/2 ], methacrylonitrile [22.0 (MPa) 1/2 ], and the like.
  • (meth) acrylamide monomers are preferable when improving alkali resistance.
  • a bifunctional monomer is preferable and an epoxy group containing unsaturated monomer is more preferable.
  • GMA glycidyl methacrylate
  • M100 3,4-epoxycyclohexylmethyl methacrylate
  • VBGE (4-vinylbenzyl) glycidyl ether
  • 19.9 (MPa) 1/2 glycidyl acrylate [19.7 (MPa) 1/2 ]
  • allyl glycidyl ether [16.9 (MPa) 1/2 ] and the like.
  • hydroxyl-containing unsaturated monomers such as hydroxyethyl acrylamide [28.3 (MPa) 1/2 ], hydroxypropyl acrylamide [28.1 (MPa) 1/2 ]; diacetone acrylamide [21.9 ( MPa) 1/2 ], carbonyl group-containing unsaturated monomers such as 2-acetoacetoxyethyl methacrylate [21.1 (MPa) 1/2 ]; methacrylic acid [22.0 (MPa) 1/2 ], 4-vinyl Carboxylic acid group-containing unsaturated monomers such as benzoic acid [23.6 (MPa) 1/2 ]; crosslinkable unsaturated monomers such as divinylbenzene [19.0 (MPa) 1/2 ] can also be used.
  • the combination of the monomers is preferably a combination of the polyfunctional monomer having a plurality of N-substituted acrylamide groups, the non-crosslinkable monomer, and the crosslinkable monomer.
  • a combination of a polyfunctional monomer having a plurality of N-substituted acrylamide groups, a (meth) acrylamide monomer, and an epoxy group-containing unsaturated monomer, a polyfunctional monomer having a plurality of N-substituted acrylamide groups, an N-vinylamide monomer, and an epoxy is preferably a combination of the polyfunctional monomer having a plurality of N-substituted acrylamide groups, the non-crosslinkable monomer, and the crosslinkable monomer.
  • a combination of a (meth) acrylamide monomer and an epoxy group-containing unsaturated monomer is more preferred.
  • the amount of the non-crosslinkable monomer used is 1 to 80 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the polyfunctional monomer having a plurality of N-substituted acrylamide groups.
  • the amount is preferably 1.5 to 50 parts by mass, more preferably 10 to 40 parts by mass.
  • the use amount of the crosslinkable monomer is preferably 1 to 80 parts by mass, more preferably 5 to 25 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the polyfunctional monomer having a plurality of N-substituted acrylamide groups. Further preferred.
  • the monomer composition preferably contains an organic solvent. Any organic solvent may be used as long as it contains at least one polyfunctional monomer having a plurality of N-substituted acrylamide groups.
  • organic solvent that acts as a porous agent porous polymer particles can be used. Can be manufactured.
  • the porosifying agent is used to produce porous particles, and has a role of forming pores as a non-polymerized component by being present together with a monomer in polymerization in oil droplets. In the case of producing smooth particles, a porosifying agent is usually not used.
  • Such organic solvents include hexane [solubility parameter: 15.0 (MPa) 1/2 ], heptane [15.2 (MPa) 1/2 ], octane [15.5 (MPa) 1/2 ], Aliphatic hydrocarbons such as nonane [15.6 (MPa) 1/2 ], decane [15.8 (MPa) 1/2 ], undecane [15.9 (MPa) 1/2 ]; cyclohexane [8.
  • Alicyclic hydrocarbons such as 1 (MPa) 1/2 ] and cyclopentane [8.1 (MPa) 1/2 ]; benzene [21.2 (MPa) 1/2 ], toluene [18.2 ( MPa) 1/2 ], xylene [18.6 (MPa) 1/2 ], naphthalene [21.2 (MPa) 1/2 ], ethylbenzene [18.5 (MPa) 1/2 ], etc.
  • the organic solvent is preferably one containing at least one organic solvent having a solubility parameter ⁇ of 15 (MPa) 1/2 or more, from the viewpoint of obtaining polymer particles with little gel adhesion, and 17 (MPa) 1/2.
  • Those containing at least one organic solvent as described above are more preferable, and those containing at least one organic solvent at 17 to 30 (MPa) 1/2 are more preferable.
  • an organic solvent having a solubility parameter ⁇ of 19 (MPa) 1/2 or more and an organic solvent having a solubility parameter ⁇ of less than 19 (MPa) 1/2 A mixed liquid of an organic solvent having a solubility parameter ⁇ of 17 to 19 (MPa) 1/2 or more and an organic solvent having a solubility parameter ⁇ of less than 20 to 30 (MPa) 1/2 is more preferable.
  • the solubility parameter ⁇ of the organic solvent is preferably 15 to 30 (MPa) 1/2, more preferably 17 to 30 (MPa) 1/2 , and 17 to 26 (MPa). ) 1/2 is more preferable, and 17 to 22 (MPa) 1/2 is more preferable.
  • the upper limit of the absolute value of the difference between the solubility parameter ⁇ of a polyfunctional monomer having a plurality of N-substituted acrylamide groups and the solubility parameter ⁇ of an organic solvent ( ⁇ mix described later in the case of a mixed solution) is a porous material with little gel adhesion
  • 5.8 (MPa) 1/2 or less is more preferable, less than 5.2 (MPa) 1/2 is more preferable, and less than 4.9 (MPa) 1/2 is more preferable. .5 (MPa) 1/2 or less is particularly preferable.
  • the lower limit thereof is preferably 1.7 (MPa) 1/2 or more, more preferably 2.5 (MPa) 1/2 or more, from the viewpoint of obtaining porous particles.
  • the solubility parameter of the organic solvent can be calculated in the same manner as in the polyfunctional monomer.
  • the solubility parameter ⁇ mix is obtained by the following equation.
  • phi i denotes the volume fraction of the organic solvent.
  • the amount used is usually about 50 to 1000 parts by weight, preferably 100 to 600 parts by weight, and more preferably 100 to 500 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the total amount of monomers. More preferably, it is 150 to 400 parts by mass.
  • the manufacturing method of this invention disperse
  • the aqueous medium is not particularly limited as long as it contains water, and examples thereof include a water-soluble polymer aqueous solution.
  • the water-soluble polymer include hydroxyethyl cellulose, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, starch, gelatin and the like.
  • the amount of the aqueous medium used is usually about 10 to 10,000 parts by weight, preferably 100 to 10000 parts by weight, more preferably 500 to 6000 parts by weight, and still more preferably 500 parts per 100 parts by weight of the total amount of the monomer composition. To 3000 parts by mass, particularly preferably 500 to 2000 parts by mass.
  • a dispersion stabilizer such as calcium carbonate, sodium sulfate, sodium nitrite, calcium phosphate, sodium chloride may be used.
  • the amount of the dispersion stabilizer used is usually about 0.1 to 5 parts by mass with respect to 100 parts by mass of water.
  • the production method of the present invention polymerizes the monomer composition dispersed as described above.
  • “Polymerize the monomer composition” means that the monomer contained in the monomer composition is polymerized. Such polymerization is usually performed in the presence of a polymerization initiator.
  • a radical polymerization initiator is preferable.
  • the radical polymerization initiator include azo initiators, peroxide initiators, redox initiators, and the like. Specifically, azobisisobutyronitrile, methyl azobisisobutyrate, azobis-2, Examples include 4-dimethylvaleronitrile, benzoyl oxide, di-tert-butyl peroxide, benzoyl peroxide-dimethylaniline, and the like.
  • the amount of the polymerization initiator used is usually about 0.1 to 5 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the total amount of monomers.
  • an anionic surfactant such as an alkyl sulfate ester salt, an alkylaryl sulfate ester salt, an alkyl phosphate ester salt, and a fatty acid salt as well as various surfactants can be added as an emulsifier in the reaction system. It is also possible to add a polymerization inhibitor such as tert-butylpyrocatechol, benzoquinone, picric acid, hydroquinone, copper chloride or ferric chloride, and a polymerization aid such as dodecyl mercaptan.
  • a polymerization inhibitor such as tert-butylpyrocatechol, benzoquinone, picric acid, hydroquinone, copper chloride or ferric chloride, and a polymerization aid such as dodecyl mercaptan.
  • the polymerization temperature may be determined according to the polymerization initiator.
  • a preferable polymerization temperature is preferably within 20 ° C in the upper and lower directions, more preferably within 10 ° C in the upper and lower directions around the 10-hour half-life temperature + 20 ° C.
  • the 10-hour half-life is about 60 ° C., so that it is preferably 60 to 100 ° C. within 20 ° C. around 80 ° C., preferably 70 to 90 ° C. is more preferable.
  • a polymerization initiator may be added before a heating and may be added after a heating.
  • the polymerization time is usually 2 to 20 hours, preferably 3 to 10 hours, more preferably 4 to 10 hours.
  • polymerize can be obtained by removing a porous agent and an unreacted monomer by distillation, extraction, washing
  • polymer particles can be produced from an acrylamide monomer by a normal phase suspension polymerization method. That is, according to the production method of the present invention, the particle size and pore size of the polymer particles derived from the acrylamide monomer can be easily adjusted as compared with the case of polymerization by reverse phase suspension polymerization, and the complicated procedure is not followed. There is an advantage that it can be easily manufactured.
  • porous polymer particles can be produced, and such porous polymer particles are highly hydrophilic and are difficult to cause nonspecific adsorption of biopolymers and the like, so that they are useful as a carrier for chromatography. is there.
  • the polymer particles obtained by the production method of the present invention are useful as protein-binding particles to which a protein (for example, an immunoglobulin-binding protein such as protein A) as a primary probe such as an antigen or antibody is bound.
  • the polymer particles containing a structure (tertiary crosslinked acrylamide group) represented by the following formula (2) are resistant to alkali and resistance. It is excellent in soiling property (particularly coloring resistance) and is useful as a carrier for chromatography. In addition, it has a large binding capacity for biopolymers when a ligand is immobilized, and is a carrier for affinity chromatography in the field of biochemistry, a protein as a primary probe such as an antigen or an antibody (for example, an immunoglobulin-binding protein such as protein A) ) Is extremely useful as protein-binding particles.
  • a protein as a primary probe such as an antigen or an antibody (for example, an immunoglobulin-binding protein such as protein A) ) Is extremely useful as protein-binding particles.
  • R ⁇ 1 >, R ⁇ 2 > and R ⁇ 3 > are synonymous with the above.
  • the total content of the tertiary crosslinked acrylamide group represented by the formula (2) is 20 to 99% by mass in the polymer particle from the viewpoint of the balance between the binding capacity and the column pressure when the ligand is immobilized. Is preferable, and 50 to 90% by mass is more preferable.
  • the total content of the structural units derived from the non-crosslinkable monomer in the polymer particle is The amount is preferably 1 to 80 parts by mass, more preferably 1.5 to 50 parts by mass, and still more preferably 10 to 40 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the crosslinked acrylamide group.
  • the total content of structural units derived from the crosslinkable monomer in the polymer particles is preferably 1 to 80 parts by mass, and more preferably 5 to 25 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the crosslinked acrylamide group.
  • grains) of the polymer particle obtained by the manufacturing method of this invention, and the polymer particle containing the structure represented by Formula (2) (henceforth these polymer particles of this invention collectively).
  • the diameter is preferably 0.03 to 1000 ⁇ m, more preferably 10 to 600 ⁇ m, and still more preferably 40 to 100 ⁇ m.
  • the coefficient of variation of the average particle diameter of the polymer particles of the present invention is preferably 30% or less, more preferably 25% or less, and further preferably 1 to 20%.
  • the polymer particles of the present invention may be either smooth particles or porous particles. The specific surface area is naturally defined from the average particle diameter in the case of smooth particles, but can be adjusted from the pore distribution in the case of porous particles.
  • the specific surface area of the porous particles of the present invention is preferably 1 to 1000 m 2 / g, more preferably 30 to 150 m 2 / g.
  • An average particle diameter and a specific surface area can be measured by the method as described in the Example mentioned later with a flow type particle image analyzer, a mercury porosimeter, etc.
  • the polymer particles of the present invention include all organic carbon measured by a combustion catalyst oxidation type TOC meter in an eluate when immersed in a 0.5 N aqueous sodium hydroxide solution at 23 ° C. for 22 hours in a packed state. What is 200 ppm or less is preferable.
  • the packing material for a chromatography column of the present invention uses the polymer particles of the present invention as a carrier. Such fillers are suitable for use in affinity chromatography.
  • the type of the ligand is not particularly limited as long as it has an appropriate affinity for the target.
  • proteins such as protein A, protein G, and avidin; peptides such as insulin; antibodies such as monoclonal antibodies Enzyme; hormone; DNA; RNA; carbohydrate such as heparin, Lewis X, ganglioside; iminodiacetic acid, synthetic dye, 2-aminophenylboronic acid, 4-aminobenzamidine, glutathione, biotin and derivatives thereof Compounds can be used.
  • the ligand illustrated above may use the whole, the fragment and fusion obtained by a recombinant, an enzyme treatment, etc. may be used. Further, it may be an artificially synthesized peptide or peptide derivative.
  • Suitable ligands for the separation or purification of immunoglobulins are, for example, protein A and protein G, and more preferably the immunoglobulin binding domain of protein A.
  • the chromatography column of the present invention is filled with the above-mentioned packing material. The column is suitable for use in affinity chromatography.
  • those using polymer particles containing the structure represented by formula (2) as a carrier are excellent in alkali resistance and antifouling properties and have a large binding capacity for biopolymers. Therefore, it is very suitable for use in affinity chromatography.
  • Each analysis condition in the examples is as follows.
  • ⁇ Average particle size, coefficient of variation> For the average particle size (volume average particle size) and coefficient of variation, a flow-type particle image analyzer (model number FPIA-3000) manufactured by Sysmex Corporation was used for a sample diluted with water so that the solid concentration was about 2.5%. It was determined by setting the total count to 500.
  • ⁇ Specific surface area> The specific surface area of the specimen obtained by vacuum drying in a tert-butyl alcohol solvent was measured using Autopore IV9520 manufactured by Shimadzu Corporation under the condition that the pore diameter range was 10 to 5000 nm.
  • Example 1 0.9 g of (4-vinylbenzyl) glycidyl ether (manufactured by Toray Fine Chemical Co., Ltd.), 0.9 g of N, N-dimethylacrylamide (manufactured by Kojin Co., Ltd.), 0.9 g of N, N-diethylacrylamide (manufactured by Kojin Co., Ltd.) 6.1 g of N, N′-diethyl-1,3-bis (acrylamide) propane (manufactured by JSR) was added to 7: 3 of 2-octanone (manufactured by Toyo Gosei Co., Ltd.) and acetophenone (manufactured by Inoue Fragrance Co., Ltd.).
  • An organic monomer solution was prepared by dissolving in 18.1 g of a mixed solution (mass ratio).
  • a mixed solution mass ratio
  • 2.5 g of polyvinyl alcohol manufactured by Kuraray Co., Ltd .: PVA-217
  • 0.2 g of sodium dodecyl sulfate manufactured by Kao Corporation: Emar 10G
  • 2.5 g of sodium sulfate manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • sodium nitrite 1.2 g of Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • This aqueous solution was put into a 500 mL separable flask, a thermometer, a stirring blade and a cooling tube were attached, set in a hot water bath, and stirring was started at 360 rpm in a nitrogen atmosphere.
  • the above organic monomer solution was added to the separable flask and heated with a hot water bath.
  • 2,2′-azobisisobutyronitrile manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the reaction product was cooled, it was transferred to a 500 mL polypropylene bottle, the polymer particles were allowed to settle, the supernatant was discarded by decantation, and the remaining polymer particles were washed with water and ethanol.
  • the obtained polymer particles were porous particles having an average particle size of 46 ⁇ m, a coefficient of variation of 15%, and a specific surface area of 94 m 2 / g.
  • An SEM photograph of the obtained polymer particles is shown in FIG.
  • Example 2 Instead of N, N'-diethyl-1,3-bis (acrylamide) propane, N, N'-diethyl-1,6-bis (acrylamide) hexane (manufactured by JSR) was used, and 2-octanone and acetophenone Polymer particles were produced in the same manner as in Example 1 except that 2-octanone was used in place of the mixed solution and the stirring speed was changed to 280 rpm. The obtained polymer particles were porous particles having an average particle size of 39 ⁇ m, a coefficient of variation of 14%, and a specific surface area of 62 m 2 / g.
  • Example 3 Instead of (4-vinylbenzyl) glycidyl ether, 3,4-epoxycyclohexylmethyl methacrylate (manufactured by Daicel: Cyclomer M100) was used, and the mass ratio of the mixed liquid of 2-octanone and acetophenone was changed from 7: 3 to 6: 4.
  • an aqueous solution is prepared using 0.5 g of polyvinyl alcohol (Kuraray Co., Ltd .: PVA-405), and an organic monomer solution is added.
  • Polymer particles were produced in the same manner as in Example 1 except that the temperature was changed from room temperature to 85 ° C. and the stirring speed was changed to 375 rpm.
  • the obtained polymer particles were porous particles having an average particle size of 52 ⁇ m, a coefficient of variation of 15%, and a specific surface area of 94 m 2 / g.
  • Example 4 Instead of 3,4-epoxycyclohexylmethyl methacrylate, 0.4 g of glycidyl methacrylate (manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd.) was used, and the amount of N, N-dimethylacrylamide was changed to 1.1 g.
  • Example 3 was repeated except that the amount used was changed to 1.1 g, the mass ratio of the mixed liquid of 2-octanone and acetophenone was changed from 6: 4 to 4: 6, and the stirring speed was changed to 345 rpm. Polymer particles were produced. The obtained polymer particles were porous particles having an average particle size of 56 ⁇ m, a coefficient of variation of 12%, and a specific surface area of 97 m 2 / g.
  • Example 5 The monomer was changed to 0.9 g of (4-vinylbenzyl) glycidyl ether, 1.8 g of N, N-dimethylacrylamide, and 6.1 g of N, N′-diethyl-1,3-bis (acrylamide) propane.
  • -Use acetophenone instead of a mixture of octanone and acetophenone, change the amount of polyvinyl alcohol used to 0.5 g, change the amount of sodium dodecyl sulfate and sodium sulfate to 0.1 g, and stirrer speed at 330 rpm
  • Polymer particles were produced in the same manner as in Example 1 except for changing to.
  • the obtained polymer particles were porous particles having an average particle size of 103 ⁇ m, a coefficient of variation of 39%, and a specific surface area of 21.3 m 2 / g.
  • Example 6 0.6 g of (4-vinylbenzyl) glycidyl ether, 1.3 g of N, N-diethylacrylamide and 4.4 g of 1,4-bis (acryloyl) piperazine (manufactured by Bio-Rad) were dissolved in 26.0 g of acetophenone, An organic monomer solution was prepared. On the other hand, 1.5 g of polyvinyl alcohol, 0.1 g of sodium dodecyl sulfate, 2.6 g of sodium sulfate and 1.3 g of sodium nitrite were added to 263 g of pure water and stirred to prepare an aqueous solution.
  • Polymer particles were produced in the same manner as in Example 1, except that the organic monomer solution and the aqueous solution were used, and the stirring speed was changed to 450 rpm.
  • the polymer particles obtained had an average particle size of 55 ⁇ m, a coefficient of variation of 26%, and a specific surface area of 100 m 2 / g.
  • Example 7 N, N-dimethylacrylamide is used in place of N, N-dimethylacrylamide, and 8-octanone (manufactured by Toyo Gosei Co., Ltd.) and acetophenone (manufactured by Inoue Fragrance Co., Ltd.) are used instead of acetophenone.
  • Polymer particles were produced in the same manner as in Example 5 except that (mass ratio) was used. The obtained polymer particles had an average particle size of 70 ⁇ m, a coefficient of variation of 38%, and a specific surface area of 100 m 2 / g.
  • Example 8 Polymer particles were produced in the same manner as in Example 7, except that 2-octanone was used instead of the mixed liquid of 2-octanone and acetophenone.
  • the polymer particles obtained had an average particle size of 76 ⁇ m, a coefficient of variation of 48%, and a specific surface area of 27.5 m 2 / g.
  • Example 9 Polymer particles were produced in the same manner as in Example 8, except that diisobutyl ketone was used instead of 2-octanone.
  • the obtained polymer particles had an average particle size of 90 ⁇ m, a coefficient of variation of 35%, and a specific surface area of 36.3 m 2 / g.
  • Example 10 Polymer particles were produced in the same manner as in Example 8, except that isopentyl acetate was used instead of 2-octanone.
  • the obtained polymer particles had an average particle size of 79.0 ⁇ m, a coefficient of variation of 42%, and a specific surface area of 25.3 m 2 / g.
  • Example 11 Polymer particles were produced in the same manner as in Example 2, except that diisobutyl ketone was used instead of 2-octanone.
  • the obtained polymer particles had an average particle size of 70.3 ⁇ m, a coefficient of variation of 29.1%, and a specific surface area of 8.5 m 2 / g.
  • Test example 1 The surfaces of the polymer particles obtained in Examples 1 to 11 were observed with an SEM and evaluated according to the following criteria.
  • the “absolute value” in the table means the absolute value of the difference between the solubility parameter of the polyfunctional monomer and the solubility parameter of the organic solvent.
  • Comparative Example 2 0.9 g of (4-vinylbenzyl) glycidyl ether, 0.9 g of N, N-dimethylacrylamide, 0.9 g of N, N-diethylacrylamide and 6.1 g of bis (acrylamide) methane (manufactured by Alfa Aesar) When added to 18.1 g of a 7: 3 mixture (mass ratio) of octanone and acetophenone, the organic monomer was not dissolved in the mixture and normal phase suspension polymerization could not be performed.
  • Reference example 1 1.0 g of glycidyl methacrylate (Mitsubishi Rayon Co., Ltd.), 2.0 g of glycerin 1-methacrylate (Nissho Co., Ltd.) and 6.9 g of glycerol 1,3-dimethacrylate (Shin Nakamura Chemical Co., Ltd.) were added to 2-octanone and acetophenone. was dissolved in 20.3 g of a 3: 7 mixed solution (mass ratio) to prepare an organic monomer solution.
  • polyvinyl alcohol 0.1 g of sodium dodecyl sulfate, 0.2 g of sodium carbonate and 1.2 g of sodium nitrite were added to 248 g of pure water and stirred to prepare an aqueous solution.
  • Polymer particles were produced in the same manner as in Example 1 except that the organic monomer solution and the aqueous solution were used, and the stirring speed was changed to 400 rpm.
  • the polymer particles obtained had an average particle size of 50 ⁇ m, a coefficient of variation of 17%, and a specific surface area of 104 m 2 / g.
  • Test Example 2 Biopolymer Binding Capacity Measurement Test Protein A was immobilized on each polymer particle shown in Table 2 below, and the dynamic binding volume for human polyclonal IgG was measured using a linear flow rate of 300 cm using AK Health Prime plus manufactured by GE Healthcare Biosciences. / Hr, column volume 4 mL (5 mm ⁇ ⁇ 200 mm length), measured by the amount of adsorption at the elution tip 10% breakthrough. The results are shown in Table 2.
  • the polymer particles of Example 1 have a large biopolymer binding capacity when Protein A is immobilized.
  • Test Example 3 Alkali Resistance Test A GE Healthcare tricorn column (inner diameter 0.5 cm) was filled with polymer particles shown in Table 3 below so that the packed bed height would be 4 cm, and installed in a thermostatic chamber at 23 ° C. The column was connected to the chromatography system (trade name AKTAprime) manufactured by GE Healthcare. Next, 10 mL of pure water was passed through and washed at a rate of 1 mL / min, and then 10 mL of 0.5N aqueous sodium hydroxide solution was passed through at a rate of 1 mL / min to stop it. The alkaline decomposition component was eluted by placing.
  • aqueous sodium hydroxide solution was passed at a rate of 1 mL / min to collect 0.8 mL of the eluate in the column, and immediately acidified with 9.2 mL of 0.1 N hydrochloric acid.
  • a combustion catalyst oxidation type TOC meter (model number TOC-5000) manufactured by Shimadzu Corporation, the total organic carbon content in the acidified liquid was measured with an injection volume of 30 ⁇ L, and this value was multiplied by 12.5 to be acidic. Dilution due to crystallization was corrected. The results are shown in Table 3.
  • the polymer particles of Example 1 are excellent in alkali resistance.
  • Test Example 4 Coloring Resistance Test A GE Healthcare tricorn column (inner diameter 0.5 cm) was filled with polymer particles shown in Table 4 below so that the packed bed height was 4 cm, and placed in a thermostatic chamber at 23 ° C. The column was connected to the installed chromatography system (trade name AKTAprime) manufactured by GE Healthcare. Next, 4 mL of 20 mM Na phosphate / 150 mM NaCl aqueous solution (pH 7.5) containing 0.0015% by mass of phenol red was passed, and then 4 mL of 20 mM Na phosphate / 150 mM NaCl (pH 7.5) was passed. Then, it was recorded as ⁇ when the column was not colored by visual observation, and x when it was colored.
  • AKTAprime chromatography system
  • the polymer particles of Example 1 are excellent in coloration resistance.

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Abstract

　アクリルアミドモノマーから順相懸濁重合法によりポリマー粒子を製造する方法、ポリマー粒子、該粒子を用いたクロマトグラフィーカラム用充填剤、及びクロマトグラフィーカラムを提供すること。　Ｎ置換アクリルアミド基を複数有する多官能モノマーを含有するモノマー組成物を水系媒体中に分散させる工程と、前記分散させたモノマー組成物を重合させる工程と、を含むことを特徴とするポリマー粒子の製造方法。

Description

ポリマー粒子の製造方法、ポリマー粒子、クロマトグラフィーカラム用充填剤、及びクロマトグラフィーカラム
　本発明はポリマー粒子の製造方法、ポリマー粒子、該粒子を用いたクロマトグラフィーカラム用充填剤、及びクロマトグラフィーカラムに関する。
　従来、クロマトグラフィー用担体として、ポリ（メタ）アクリルエステル類、ポリ（メタ）アクリルアミド類等の合成ポリマーや、多糖類等の天然ポリマーの粒子が用いられている。このうち合成ポリマーの粒子は、保護基等で疎水化処理したモノマーを重合させる方法や、順相懸濁重合（Ｏ／Ｗ型）および逆相懸濁重合（Ｗ／Ｏ型）のいずれかの方法で製造される。
　疎水化処理した場合には重合後に親水性基に変換する二次処理を行わなければならず、逆相懸濁重合は、多量の有機溶媒を必要とし、粒子調製の工程が複雑であるという問題があるものの、アクリルアミドモノマーは一般に有機溶媒への溶解性が低いため、これを用いた順相懸濁重合はこれまで行われておらず、アクリルアミドモノマーを用いたポリアクリルアミド粒子の調製には、一般的に、保護基等で疎水化処理したモノマーを重合する方法、或いは逆相懸濁により重合する方法が採用されている（特許文献１～３）。斯かる逆相懸濁重合は、多量の有機溶剤を必要とし、粒子調製の工程が複雑であるという問題があり、疎水化処理した場合には重合後に親水性基に変換する二次処理を行わなければならなかった。
　なお、特許文献４および５には、三級アクリルアミド系架橋モノマーを用いた重合体の歯科材料としての利用が報告されているものの、これらは何れも歯の欠損を補う組成物を開示するものであって、ポリマー粒子に関するものではない。
特表２００３－５１１６５９号公報 特表２００９－５０３２０３号公報 特開２００６－１１１７１７号公報 特開２００２－２１２０１９号公報 特表２００９－５４２７４０号公報
　本発明が解決しようとする課題は、アクリルアミドモノマーから順相懸濁重合法によりポリマー粒子を製造する方法、ポリマー粒子、該粒子を用いたクロマトグラフィーカラム用充填剤、及びクロマトグラフィーカラムを提供することにある。
　そこで、本発明者らは、鋭意検討した結果、Ｎ置換アクリルアミド基を複数有する多官能モノマーを含有するモノマー組成物を水系媒体中に分散させ、前記モノマー組成物を重合させることにより、アクリルアミドモノマーから順相懸濁重合法によりポリマー粒子を製造できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、Ｎ置換アクリルアミド基を複数有する多官能モノマーを含有するモノマー組成物を水系媒体中に分散させる工程と、前記分散させたモノマー組成物を重合させる工程とを含むことを特徴とするポリマー粒子の製造方法を提供するものである。
　また、本発明は、上記製造方法により製造されたポリマー粒子を提供するものである。
　更に、本発明は、下記式（２）で表される構造を含むポリマー粒子を提供するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
〔式（２）中、Ｒ1は炭素数２～８のアルキレン基を示し、Ｒ2及びＲ3は炭素数１～３のアルキル基を示し、Ｒ2及びＲ3が一緒になって隣接する窒素原子及びＲ1と共に複素環を形成していてもよい。但し、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の炭素数の合計は５以上である。〕
　更に、本発明は、上記ポリマー粒子を担体とするクロマトグラフィーカラム用充填剤を提供するものである。
　更に、本発明は、上記ポリマー粒子にリガンドを固定化したアフィニティクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
　更に、本発明は、上記充填剤が充填されているクロマトグラフィーカラムを提供するものである。
　本発明によれば、アクリルアミドモノマーから順相懸濁重合法によりポリマー粒子を製造できる。
　また、本発明の式（２）で表される構造を含むポリマー粒子は、耐アルカリ性及び防汚性に優れ、且つリガンドを固定化した場合の生体高分子に対する結合容量が大きく、クロマトグラフィー用担体として有用である。
実施例１のポリマー粒子のＳＥＭ写真である。
　本発明のポリマー粒子の製造方法は、Ｎ置換アクリルアミド基を複数有する多官能モノマーを含有するモノマー組成物（重合性組成物ともいう）を水系媒体中に分散させ、前記モノマー組成物を重合させる工程を含むことを特徴とするものである。上記モノマー組成物は、モノマーを含有する組成物を意味する。なお、ポリマー粒子とは粒子状のポリマーを意味する。
　本発明で用いる多官能モノマーは、Ｎ置換アクリルアミド基を複数有するものである。多官能モノマーが有するＮ置換アクリルアミド基としては、ゲル付着の少ないポリマー粒子を得る観点から、炭素数１～３のアルキル基が窒素原子に置換しているアクリルアミド基が好ましい。
　また、Ｎ置換アクリルアミド基の個数としては、ゲル付着の少ないポリマー粒子を得る観点から、一分子あたり２～６個が好ましく、２～４個がより好ましく、２個が特に好ましい。
　上記多官能モノマーの好適な具体例としては、下記式（１）で表されるものが挙げられる。斯様な多官能モノマーを用いることにより、順相懸濁重合法によりポリマー粒子を効率よく得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
〔式（１）中、Ｒ1は炭素数２～８のアルキレン基を示し、Ｒ2及びＲ3は炭素数１～３のアルキル基を示し、Ｒ2及びＲ3が一緒になって隣接する窒素原子及びＲ1と共に複素環を形成していてもよい。但し、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の炭素数の合計は５以上である。〕
　ここで、Ｒ1で示される炭素数２～８のアルキレン基は直鎖状でも分岐状でもよく、例えばエタン－１，１－ジイル基、エタン－１，２－ジイル基、プロパン－１，１－ジイル基、プロパン－１，２－ジイル基、プロパン－１，３－ジイル基、プロパン－２，２－ジイル基、ブタン－１，２－ジイル基、ブタン－１，３－ジイル基、ブタン－１，４－ジイル基、ペンタン－１，４－ジイル基、ペンタン－１，５－ジイル基、ヘキサン－１，５－ジイル基、ヘキサン－１，６－ジイル基、ヘプタン－１，７－ジイル基、オクタン－１，８－ジイル基等が挙げられる。アルキレン基の炭素数は好ましくは３～８であり、より好ましくは３～６である。
　Ｒ2及びＲ3で示される炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基又はエチル基が好ましく、Ｒ2及びＲ3が共にメチル基又はエチル基であるのがより好ましく、エチル基であるのが更に好ましい。
　また、Ｒ2及びＲ3は一緒になって隣接する窒素原子及びＲ1と共に複素環を形成していてもよい。斯かる複素環基としては、２－メチルピペラジン－１，４－ジイル基、２－エチルピペラジン－１，４－ジイル基、２，５－ジメチルピペラジン－１，４－ジイル基、２，５－ジエチルピペラジン－１，４－ジイル基、１，４－パーヒドロジアゼピン－１，４－ジイル基、６－メチル－１，４－パーヒドロジアゼピン－１，４－ジイル基、６－エチル－１，４－パーヒドロジアゼピン－１，４－ジイル基等が挙げられる。
　また、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の炭素数の合計は５以上であるが、順相懸濁重合法によりポリマー粒子を効率よく得る観点、耐アルカリ性及び防汚性等の観点から、好ましくは５～１５であり、より好ましくは５～１２であり、更に好ましくは６～１０であり、特に好ましくは７～９である。
　また、本発明で用いる多官能モノマーの好適な具体例としては、Ｎ，Ｎ’－ジエチル－１，３－ビス（アクリルアミド）プロパン（ＤＥＡＡＰ）〔溶解度パラメータ：２２．６（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ，Ｎ’－ジエチル－１，６－ビス（アクリルアミド）ヘキサン（ＤＥＡＡＨ）〔２１．７（ＭＰａ）1/2〕、１，４－ビス（アクリロイル）ピペラジン（ＢＡＰ）〔２３．６（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ，Ｎ’－ジエチル－１，４－ビス（アクリルアミド）ブタン〔２２．３（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ，Ｎ’－ジエチル－１，５－ビス（アクリルアミド）ペンタン〔２２．０（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－１，３－ビス（アクリルアミド）プロパン〔２３．４（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－１，６－ビス（アクリルアミド）ヘキサン〔２２．３（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－１，４－ビス（アクリルアミド）ブタン〔２３．０（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－１，５－ビス（アクリルアミド）ペンタン〔２２．６（ＭＰａ）1/2〕等が挙げられ、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
　これらの中でも、耐アルカリ性及び防汚性に優れ、且つリガンドを固定化した場合の生体高分子に対する結合容量が大きいポリマー粒子を得る場合は、Ｎ，Ｎ’－ジエチル－１，３－ビス（アクリルアミド）プロパン（ＤＥＡＡＰ）、Ｎ，Ｎ’－ジエチル－１，６－ビス（アクリルアミド）ヘキサン（ＤＥＡＡＨ）、Ｎ，Ｎ’－ジエチル－１，４－ビス（アクリルアミド）ブタン、Ｎ，Ｎ’－ジエチル－１，５－ビス（アクリルアミド）ペンタン、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－１，３－ビス（アクリルアミド）プロパン、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－１，６－ビス（アクリルアミド）ヘキサン、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－１，４－ビス（アクリルアミド）ブタン、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－１，５－ビス（アクリルアミド）ペンタンが好ましい。
　ここで、本明細書において溶解度パラメータはfedors法で算出されるＳＰ値を意味し、化合物の溶解度パラメータδは次式で求められる。
　δ＝（ΔＥ／ΔＶ）1/2（ＭＰａ）1/2
（式中、ΔＥは蒸発エネルギー（Ｊ／ｍｏｌ）を示し、ΔＶは２５℃におけるモル体積（ｃｍ3／ｍｏｌ）を示す。）
　また、上記多官能モノマーの溶解度パラメータδとしては、ゲル付着の少ないポリマー粒子を得る観点から、１０．０（ＭＰａ）1/2以上３０．０（ＭＰａ）1/2以下が好ましく、１５．０（ＭＰａ）1/2以上２５．０（ＭＰａ）1/2以下がより好ましく、１７．５（ＭＰａ）1/2以上２４．０（ＭＰａ）1/2未満が更に好ましく、２０．０（ＭＰａ）1/2以上２３．５（ＭＰａ）1/2以下が更に好ましく、２１．０（ＭＰａ）1/2以上２３．０（ＭＰａ）1/2以下が更に好ましい。
　また、上記多官能モノマーの使用量は、ポリマー粒子の力学的強度、特にクロマトカラム粒子として使用した場合の圧力性能の観点から、モノマー総量に対し、２０～９９質量％が好ましく、５０～９０質量％がより好ましい。
　また、本発明で用いるモノマー組成物は、上記Ｎ置換アクリルアミド基を複数有する多官能モノマーと共重合可能な他のモノマーを含んでいてもよい。斯かる他のモノマーとしては、非架橋性（単官能）モノマー、架橋性（多官能）モノマーのいずれも使用することができ、これらを併用してもよい。該他のモノマーの溶解度パラメータδは、ゲル付着の少ないポリマー粒子を得る観点から、好ましくは１０．０（ＭＰａ）1/2以上２９．０（ＭＰａ）1/2以下であり、より好ましくは１５．０（ＭＰａ）1/2以上２７．５（ＭＰａ）1/2以下であり、更に好ましくは１６．５（ＭＰａ）1/2以上２６．０（ＭＰａ）1/2以下であり、更に好ましくは１７．５（ＭＰａ）1/2以上２４．０（ＭＰａ）1/2以下である。
　上記非架橋性モノマーとしては、（メタ）アクリルアミド系モノマー、スチレン系モノマー、Ｎ－ビニルアミド系モノマー、ビニルケトン系モノマー、アクリロニトリル系モノマーが好ましい。
　上記（メタ）アクリルアミド系モノマーとしては、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡＭ）〔２３．９（ＭＰａ）1/2〕、ジエチルアクリルアミド（ＤＥＡＡＭ）〔２０．７（ＭＰａ）1/2〕、プロピルアクリルアミド〔２２．０（ＭＰａ）1/2〕、イソプロピルアクリルアミド〔２１．６（ＭＰａ）1/2〕、アクリロイルモルホリン〔２８．０（ＭＰａ）1/2〕、アクリロイルピロリジン〔２７．９（ＭＰａ）1/2〕、アクリロイルピペリジン〔２５．８（ＭＰａ）1/2〕等が挙げられる。
　上記（メタ）アクリルアミド系モノマーの中でも、下記式（３）で表されるものが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
〔式（３）中、Ｒ4は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ5及びＲ6はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を示す。〕
　上記Ｒ4としては水素原子が好ましい。また、Ｒ5及びＲ6としては炭素数１～４のアルキル基が好ましい。該アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基等が挙げられる。アルキル基の炭素数は好ましくは１又は２である。
　また、上記スチレン系モノマーとしては、スチレン〔１８．９（ＭＰａ）1/2〕、α－メチルスチレン〔１８．８（ＭＰａ）1/2〕、ハロゲン化スチレン〔２０．０－２１．８（ＭＰａ）1/2〕（フルオロスチレン〔２０．０（ＭＰａ）1/2〕、クロロスチレン〔２１．０（ＭＰａ）1/2〕、ブロモスチレン〔２１．２（ＭＰａ）1/2〕、ヨードスチレン〔２１．８（ＭＰａ）1/2〕）、４－メトキシスチレン〔１９．２（ＭＰａ）1/2〕、４－エトキシスチレン〔１９．０（ＭＰａ）1/2〕、１，２－ジヒドロキシ－３－（４－ビニルベンジルオキシ）プロパン〔２８．０（ＭＰａ）1/2〕等が挙げられる。
　また、上記Ｎ－ビニルアミド系モノマーとしては、Ｎ－ビニルホルムアミド〔２６．１（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－ビニルアセトアミド〔２３．５（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－ビニルプロパミド〔２２．６（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－ビニルブタミド〔２２．０（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－メチル－Ｎ－ビニルホルムアミド〔２１．７（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－メチル－Ｎ－ビニルアセトアミド〔１９．５（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－メチル－Ｎ－ビニルプロパミド〔１９．３（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－メチル－Ｎ－ビニルブタミド〔１９．１（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－エチル－Ｎ－ビニルホルムアミド〔２１．１（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－エチル－Ｎ－ビニルアセトアミド〔１９．３（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－エチル－Ｎ－ビニルプロパミド〔１９．１（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－エチル－Ｎ－ビニルブタミド〔１８．９（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－プロピル－Ｎ－ビニルホルムアミド〔２０．７（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－プロピル－Ｎ－ビニルアセトアミド〔１９．１（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－プロピル－Ｎ－ビニルプロパミド〔１８．９（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－プロピル－Ｎ－ビニルブタミド〔１８．８（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－イソプロピル－Ｎ－ビニルホルムアミド〔２０．３（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－イソプロピル－Ｎ－ビニルアセトアミド〔１８．８（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－イソプロピル－Ｎ－ビニルプロパミド〔１８．７（ＭＰａ）1/2〕、Ｎ－イソプロピル－Ｎ－ビニルブタミド〔１８．６（ＭＰａ）1/2〕等が挙げられる。
　また、上記ビニルケトン系モノマーとしては、アクロレイン〔２１．６（ＭＰａ）1/2〕、メチルビニルケトン〔１７．７（ＭＰａ）1/2〕、エチルビニルケトン〔１７．７（ＭＰａ）1/2〕、プロピルビニルケトン〔１７．７（ＭＰａ）1/2〕、イソプロピルビニルケトン〔１７．２（ＭＰａ）1/2〕、メタクリロレイン〔２１．０（ＭＰａ）1/2〕、イソプロペニルメチルケトン〔１７．８（ＭＰａ）1/2〕、イソプロペニルエチルケトン〔１７．７（ＭＰａ）1/2〕、イソプロペニルプロピルケトン〔１７．７（ＭＰａ）1/2〕、イソプロペニルイソプロピルケトン〔１７．３（ＭＰａ）1/2〕等が挙げられる。
　また、上記アクリロニトリル系モノマーとしては、アクリロニトリル〔２２．７（ＭＰａ）1/2〕、メタクリロニトリル〔２２．０（ＭＰａ）1/2〕等が挙げられる。
　これら非架橋性モノマーの中でも、耐アルカリ性を向上させる場合には、（メタ）アクリルアミド系モノマーが好ましい。
　また、上記架橋性モノマーとしては、二官能モノマーが好ましく、エポキシ基含有不飽和モノマーがより好ましい。例えば、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）〔１９．５（ＭＰａ）1/2〕、３，４－エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート（Ｍ１００）〔１８．５（ＭＰａ）1/2〕、（４－ビニルベンジル）グリシジルエーテル（ＶＢＧＥ）〔１９．９（ＭＰａ）1/2〕、グリシジルアクリレート〔１９．７（ＭＰａ）1/2〕、アリルグリシジルエーテル〔１６．９（ＭＰａ）1/2〕等が挙げられる。二官能モノマーとして、ヒドロキシエチルアクリルアミド〔２８．３（ＭＰａ）1/2〕、ヒドロキシプロピルアクリルアミド〔２８．１（ＭＰａ）1/2〕などの水酸基含有不飽和モノマー；ダイアセトンアクリルアミド〔２１．９（ＭＰａ）1/2〕、２－アセトアセトキシエチルメタクリレート〔２１．１（ＭＰａ）1/2〕などのカルボニル基含有不飽和モノマー；メタクリル酸〔２２．０（ＭＰａ）1/2〕、４－ビニル安息香酸〔２３．６（ＭＰａ）1/2〕などのカルボン酸基含有不飽和モノマー；ジビニルベンゼン〔１９．０（ＭＰａ）1/2〕などの架橋性不飽和モノマーも使用することができる。
　なお、粒子のアルカリ耐性を向上させる場合には、上述のような多官能モノマーと共重合可能な他のモノマーの中でも、カルボン酸エステル結合を有さないものが好ましい。
　また、モノマーの組み合わせとしては、上記Ｎ置換アクリルアミド基を複数有する多官能モノマーと上記非架橋性モノマーと上記架橋性モノマーとの組み合わせが好ましい。中でも、上記Ｎ置換アクリルアミド基を複数有する多官能モノマーと（メタ）アクリルアミド系モノマーとエポキシ基含有不飽和モノマーとの組み合わせ、上記Ｎ置換アクリルアミド基を複数有する多官能モノマーとＮ－ビニルアミド系モノマーとエポキシ基含有不飽和モノマーとの組み合わせ、上記Ｎ置換アクリルアミド基を複数有する多官能モノマーとビニルケトン系モノマーとエポキシ基含有不飽和モノマーとの組み合わせが好ましく、上記Ｎ置換アクリルアミド基を複数有する多官能モノマーと（メタ）アクリルアミド系モノマーとエポキシ基含有不飽和モノマーとの組み合わせがより好ましい。
　また、斯様に非架橋性モノマーと架橋性モノマーを併用する場合、非架橋性モノマーの使用量は、上記Ｎ置換アクリルアミド基を複数有する多官能モノマー１００質量部に対し、１～８０質量部が好ましく、１．５～５０質量部がより好ましく、１０～４０質量部が更に好ましい。
　一方、架橋性モノマーの使用量は、上記Ｎ置換アクリルアミド基を複数有する多官能モノマー１００質量部に対し、１～８０質量部が好ましく、５～２５質量部がより好ましく、５～２０質量部が更に好ましい。
　また、上記モノマー組成物としては、有機溶媒を含むものが好ましい。有機溶媒は、上記Ｎ置換アクリルアミド基を複数有する多官能モノマーを溶解するものを１種以上含むものであればよいが、多孔化剤として作用する有機溶媒を使用することにより、多孔質のポリマー粒子を製造できる。多孔化剤は、多孔質粒子を製造するために使用され、油滴内の重合において、モノマーと共に存在し、非重合成分として孔を形成する役割を有する。なお、平滑粒子を製造する場合は、通常、多孔化剤は使用しない。
　斯様な有機溶媒としては、ヘキサン〔溶解度パラメータ：１５．０（ＭＰａ）1/2〕、ヘプタン〔１５．２（ＭＰａ）1/2〕、オクタン〔１５．５（ＭＰａ）1/2〕、ノナン〔１５．６（ＭＰａ）1/2〕、デカン〔１５．８（ＭＰａ）1/2〕、ウンデカン〔１５．９（ＭＰａ）1/2〕等の脂肪族炭化水素類；シクロヘキサン〔８．１（ＭＰａ）1/2〕、シクロペンタン〔８．１（ＭＰａ）1/2〕等の脂環式炭化水素類；ベンゼン〔２１．２（ＭＰａ）1/2〕、トルエン〔１８．２（ＭＰａ）1/2〕、キシレン〔１８．６（ＭＰａ）1/2〕、ナフタレン〔２１．２（ＭＰａ）1/2〕、エチルベンゼン〔１８．５（ＭＰａ）1/2〕等の芳香族炭化水素類；四塩化炭素〔２４．９（ＭＰａ）1/2〕、テトラクロロエタン〔２３．８（ＭＰａ）1/2〕等のハロゲン化炭化水素類；１－ブタノール〔２３．２（ＭＰａ）1/2〕、１－ペンタノール〔２２．４（ＭＰａ）1/2〕、１－ヘキサノール〔２１．９（ＭＰａ）1/2〕、１－ヘプタノール〔２１．４（ＭＰａ）1/2〕、１－オクタノール〔２０．０（ＭＰａ）1/2〕、４－メチル－２－ペンタノール〔１８．９（ＭＰａ）1/2〕、２－エチル－１－ヘキサノール〔１８．８（ＭＰａ）1/2〕等の脂肪族アルコール類；シクロヘキサノール〔３４．４（ＭＰａ）1/2〕等の脂環式アルコール類；２－フェニルエチルアルコール〔２２．５（ＭＰａ）1/2〕、ベンジルアルコール〔２３．３（ＭＰａ）1/2〕等の芳香族アルコール類；ジエチルケトン〔１７．２（ＭＰａ）1/2〕、メチルイソブチルケトン〔１６．９（ＭＰａ）1/2〕、ジイソブチルケトン〔１６．８（ＭＰａ）1/2〕、アセトフェノン〔２０．９（ＭＰａ）1/2〕、２－オクタノン〔１７．４（ＭＰａ）1/2〕、シクロヘキサノン〔２０．１（ＭＰａ）1/2〕等のケトン類；ジブチルエーテル〔１５．６（ＭＰａ）1/2〕、ジイソブチルエーテル〔１５．２（ＭＰａ）1/2〕、アニソール〔１９．２（ＭＰａ）1/2〕、エトキシベンゼン〔１９．０（ＭＰａ）1/2〕等のエーテル類；酢酸ブチル〔１７．６（ＭＰａ）1/2〕、酢酸イソペンチル〔１７．４（ＭＰａ）1/2〕、酢酸－３－メトキシブチル〔１９．４（ＭＰａ）1/2〕、マロン酸ジエチル〔１９．５（ＭＰａ）1/2〕等のエステル類の他、非架橋性ビニルモノマーのホモポリマー等の線状重合物が挙げられる。これら有機溶媒は単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
　これらの中でも、順相懸濁重合法によりポリマー粒子を効率よく得る観点から、ケトン類、芳香族アルコール類、脂環式炭化水素類が好ましい。
　また、有機溶媒としては、ゲル付着の少ないポリマー粒子を得る観点から、溶解度パラメータδが１５（ＭＰａ）1/2以上である有機溶媒を１種以上含むものが好ましく、１７（ＭＰａ）1/2以上である有機溶媒を１種以上含むものがより好ましく、１７～３０（ＭＰａ）1/2である有機溶媒を１種以上含むものがより好ましい。また、上記と同様にゲル付着の少ないポリマー粒子を得る観点から、溶解度パラメータδが１９（ＭＰａ）1/2以上である有機溶媒と溶解度パラメータδが１９（ＭＰａ）1/2未満である有機溶媒との混液が好ましく、溶解度パラメータδが１７～１９（ＭＰａ）1/2以上である有機溶媒と溶解度パラメータδが２０～３０（ＭＰａ）1/2未満である有機溶媒との混液がより好ましい。
　上記有機溶媒の溶解度パラメータδ（混液の場合は後述するδmix）としては、１５～３０（ＭＰａ）1/2が好ましく、１７～３０（ＭＰａ）1/2がより好ましく、１７～２６（ＭＰａ）1/2が更に好ましく、１７～２２（ＭＰａ）1/2が更に好ましい。
　また、Ｎ置換アクリルアミド基を複数有する多官能モノマーの溶解度パラメータδと有機溶媒の溶解度パラメータδ（混液の場合は後述するδmix）との差の絶対値の上限としては、ゲル付着の少ない多孔質ポリマー粒子を得る観点から、５．８（ＭＰａ）1/2以下がより好ましく、５．２（ＭＰａ）1/2未満が更に好ましく、４．９（ＭＰａ）1/2未満が更に好ましく、４．５（ＭＰａ）1/2以下が特に好ましい。一方、その下限としては、多孔質粒子を得る観点から、１．７（ＭＰａ）1/2以上が好ましく、２．５（ＭＰａ）1/2以上がより好ましい。
　上記有機溶媒の溶解度パラメータは、多官能モノマーと同様にして算出できるが、有機溶媒が２種以上で構成される混液である場合、その溶解度パラメータδmixは次式で求められる。
δmix＝(Σδi 2φi)1/2（ＭＰａ）1/2
（式中、δiは混液を構成する各有機溶媒の溶解度パラメータを示し、φiはその有機溶媒の体積分率を示す。なお、φiは溶媒の体積には加成性があるものとして算出し、溶媒の総体積＝各溶媒の体積の和の関係が成立するものとして計算した。）
　有機溶媒を使用する場合、その使用量は、モノマー総量１００質量部に対して、通常、５０～１０００質量部程度であり、好ましくは１００～６００質量部であり、より好ましくは１００～５００質量部であり、更に好ましくは１５０～４００質量部である。
　また、本発明の製造方法は、上記モノマー組成物を水系媒体中に分散させるものである。
　水系媒体としては、水を含んでいれば特に限定されないが、例えば、水溶性高分子水溶液等が挙げられる。水溶性高分子としては、例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、デンプン、ゼラチン等が挙げられる。
　水系媒体の使用量は、モノマー組成物総量１００質量部に対して、通常、１０～１００００質量部程度であり、好ましくは１００～１００００質量部、より好ましくは５００～６０００質量部、更に好ましくは５００～３０００質量部、特に好ましくは５００～２０００質量部である。
　また、水系媒体の分散媒として水を用いる場合、例えば、炭酸カルシウム、硫酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、燐酸カルシウム、塩化ナトリウム等の分散安定剤を使用してもよい。分散安定剤の使用量は、水１００質量部に対して、通常、０．１～５質量部程度である。
　また、本発明の製造方法は、上記で分散させたモノマー組成物を重合させるものである。「モノマー組成物を重合させる」とは、モノマー組成物に含まれるモノマーを重合させることを意味する。斯かる重合は通常、重合開始剤存在下で行われる。
　上記重合開始剤としてはラジカル重合開始剤が好ましい。ラジカル重合開始剤としては、例えば、アゾ系開始剤、過酸化物系開始剤、レドックス系開始剤等が挙げられ、具体的には、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソ酪酸メチル、アゾビス－２，４－ジメチルバレロニトリル、酸化ベンゾイル、過酸化ジ－ｔｅｒｔ－ブチル、過酸化ベンゾイル－ジメチルアニリン等が挙げられる。重合開始剤の使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して０．１～５質量部程度である。
　また、反応系内には、アルキル硫酸エステル塩、アルキルアリール硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、脂肪酸塩などのアニオン性界面活性剤を始め、各種界面活性剤を乳化剤として添加することもできる。
　また、ｔｅｒｔ－ブチルピロカテコール、ベンゾキノン、ピクリン酸、ハイドロキノン、塩化銅又は塩化第二鉄等の重合禁止剤、ドデシルメルカプタン等の重合補助剤を添加することも可能である。
　また、重合温度は重合開始剤に応じて決定すればよい。好ましい重合温度は、１０時間半減期温度＋２０℃を中心に、上下２０℃以内が好ましく、さらに好ましくは上下１０℃以内である。例えば、アゾビスイソブチロニトリルを重合開始剤として用いた場合には、１０時間半減期が約６０℃であるため、８０℃を中心とし上下２０℃以内の６０～１００℃が好ましく、７０～９０℃がさらに好ましい。なお、加熱する場合、重合開始剤は加熱前に添加してもよく、加熱後に添加してもよい。
　また、重合時間は通常２～２０時間、好ましくは３～１０時間、より好ましくは４～１０時間である。
　なお、上記重合させることにより生成したポリマー粒子は、必要に応じて多孔化剤や未反応モノマーを蒸留、抽出、洗浄等により除去することで得ることができる。
　そして、本発明の製造方法によれば、アクリルアミドモノマーから順相懸濁重合法によりポリマー粒子を製造できる。すなわち、本発明の製造方法によれば、逆相懸濁重合により重合した場合と比べて、アクリルアミドモノマーから誘導されるポリマー粒子の粒径やポアサイズを容易に調整でき、複雑な手順を踏まずに簡易に製造できるという利点がある。
　また、斯かる製造方法によれば多孔質ポリマー粒子が製造でき、斯かる多孔質ポリマー粒子は親水性が高く、生体高分子などの非特異的吸着が生じにくいため、クロマトグラフィー用担体として有用である。また、本発明の製造方法で得られるポリマー粒子は、抗原又は抗体等の一次プローブとしてのタンパク（例えば、プロテインＡ等のイムノグロブリン結合タンパク質）を結合させたタンパク結合粒子として有用である。
　特に、後述する実施例に示すとおり、上記製造方法で製造可能なポリマー粒子のうち、下記式（２）で表される構造（三級の架橋アクリルアミド基）を含むポリマー粒子は、耐アルカリ性及び防汚性（特に耐着色性）に優れ、クロマトグラフィー用担体として有用である。また、リガンドを固定化した場合の生体高分子に対する結合容量が大きく、生化学分野でのアフィニティクロマトグラフィー用担体、抗原又は抗体等の一次プローブとしてのタンパク（例えば、プロテインＡ等のイムノグロブリン結合タンパク質）を結合させたタンパク結合粒子として極めて有用である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
〔式（２）中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は前記と同義である。〕
　また、式（２）で表される三級の架橋アクリルアミド基の合計含有量は、リガンドを固定化した場合の結合容量とカラム圧力とのバランスの観点から、ポリマー粒子中、２０～９９質量％が好ましく、５０～９０質量％がより好ましい。
　また、式（２）で表される構造を含むポリマー粒子にあたり、上記非架橋性モノマーと上記架橋性モノマーを併用した場合、ポリマー粒子中の非架橋性モノマーに由来する構造単位の合計含有量は、上記架橋アクリルアミド基１００質量部に対し、１～８０質量部が好ましく、１．５～５０質量部がより好ましく、１０～４０質量部が更に好ましい。
　一方、ポリマー粒子中の架橋性モノマーに由来する構造単位の合計含有量は、上記架橋アクリルアミド基１００質量部に対し、１～８０質量部が好ましく、５～２５質量部がより好ましい。
　また、本発明の製造方法で得られるポリマー粒子、式（２）で表される構造を含むポリマー粒子（以下、これらをあわせて本発明のポリマー粒子ともいう。）の平均粒径（体積平均粒径）は、好ましくは０．０３～１０００μｍであり、より好ましくは１０～６００μｍであり、さらに好ましくは４０～１００μｍである。また、本発明のポリマー粒子の平均粒径の変動係数は、好ましくは３０％以下であり、より好ましくは２５％以下であり、さらに好ましくは１～２０％である。
　また、本発明のポリマー粒子は、平滑粒子、多孔質粒子のいずれでもよい。比表面積は、平滑粒子の場合は、その平均粒径から自ずと規定されるが、多孔質粒子の場合は、その細孔分布から調整することができる。本発明の多孔質粒子の比表面積は、好ましくは１～１０００ｍ2／ｇであり、より好ましくは３０～１５０ｍ2／ｇである。
　平均粒径及び比表面積は、フロー式粒子像分析装置や水銀ポロシメータ等により後述する実施例に記載の方法で測定できる。
　なお、本発明のポリマー粒子としては、カラムに充填した状態で、０．５規定水酸化ナトリウム水溶液で２３℃、２２時間浸漬したときの溶出液中の燃焼触媒酸化方式ＴＯＣ計による全有機炭素が２００ｐｐｍ以下であるものが好ましい。
　本発明のクロマトグラフィーカラム用充填剤は、上記本発明のポリマー粒子を担体とするものである。斯かる充填剤はアフィニティクロマトグラフィーへの使用に適する。
　また、上記充填剤としては、上記本発明のポリマー粒子にリガンドを固定化したものが挙げられる。リガンドとしては、標的物に対して適度なアフィニティーを有するものであれば、その種類は特に限定されないが、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；モノクローナル抗体等の抗体；酵素；ホルモン；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド等の糖質；イミノジ酢酸、合成色素、２－アミノフェニル硼素酸、４－アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物を用いることができる。上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントや融合体を用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。イムノグロブリンの分離または精製に好適なリガンドとしては、例えばプロテインＡおよびプロテインＧであり、さらに好ましくはプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインである。
　また、本発明のクロマトグラフィーカラムは上記充填剤が充填されているものである。該カラムはアフィニティクロマトグラフィーへの使用に適する。
　また、上記充填剤、クロマトグラフィーカラムのうち、式（２）で表される構造を含むポリマー粒子を担体とするものは、耐アルカリ性及び防汚性に優れ、且つ生体高分子に対する結合容量が大きいため、アフィニティクロマトグラフィーへの使用に非常に適する。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　実施例における各分析条件は以下に示すとおりである。
　＜平均粒径、変動係数＞
　平均粒径（体積平均粒径）および変動係数は、固形分濃度が２．５％程度となるように水で希釈した検体について、シスメックス社製フロー式粒子像分析装置（型番　ＦＰＩＡ－３０００）を用いてトータルカウント５００個にセットして求めた。
　＜比表面積＞
　比表面積は、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール溶媒中で真空乾燥して得られた検体について、島津製作所社製オートポアＩＶ９５２０を用いて、細孔径範囲で１０～５０００ｎｍを測定範囲とする条件により測定した。
実施例１
　（４－ビニルベンジル）グリシジルエーテル（東レファインケミカル社製）０．９ｇ、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド（興人社製）０．９ｇ、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド（興人社製）０．９ｇ及びＮ，Ｎ’－ジエチル－１，３－ビス（アクリルアミド）プロパン（ＪＳＲ社製）６．１ｇを、２－オクタノン（東洋合成工業社製）とアセトフェノン（井上香料製造所社製）の７：３混合液（質量比）１８．１ｇに溶解させ、有機モノマー溶液を調製した。
　一方、ポリビニルアルコール（クラレ社製：ＰＶＡ－２１７）２．５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製：エマール１０Ｇ）０．２ｇ、硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）２．５ｇ及び亜硝酸ナトリウム（和光純薬工業社製）１．２ｇを純水２４５ｇに添加し、攪拌して水溶液を調製した。この水溶液を５００ｍＬセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、攪拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下３６０ｒｐｍで攪拌を開始した。次いで、セパラブルフラスコに上記有機モノマー溶液を添加し、温水バスにより加熱し、液温が８５℃になったところで２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．１ｇを添加し、３．５時間攪拌を行った。反応物を冷却した後、５００ｍＬポリプロピレン製ビンに移しポリマー粒子を沈降させ、デカンテーションにより上澄み液を捨て、残ったポリマー粒子を水とエタノールで洗浄した。
　得られたポリマー粒子は、平均粒径４６μｍ、変動係数１５％、比表面積９４ｍ2／ｇの多孔質粒子であった。得られたポリマー粒子のＳＥＭ写真を図１に示す。
実施例２
　Ｎ，Ｎ’－ジエチル－１，３－ビス（アクリルアミド）プロパンの代わりにＮ，Ｎ’－ジエチル－１，６－ビス（アクリルアミド）ヘキサン（ＪＳＲ社製）を使用し、２－オクタノンとアセトフェノンの混合液の代わりに２－オクタノンを使用し、攪拌速度を２８０ｒｐｍに変更した以外は、実施例１と同様にしてポリマー粒子を製造した。
　得られたポリマー粒子は、平均粒径３９μｍ、変動係数１４％、比表面積６２ｍ2／ｇの多孔質粒子であった。
実施例３
　（４－ビニルベンジル）グリシジルエーテルの代わりに３，４－エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート（ダイセル製：サイクロマーＭ１００）を使用し、２－オクタノンとアセトフェノンの混合液の質量比を７：３から６：４に変更し、上記ポリビニルアルコール、ドデシル硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム及び亜硝酸ナトリウムに加えて更にポリビニルアルコール（クラレ社製：ＰＶＡ－４０５）０．５ｇを用いて水溶液を調製し、有機モノマー溶液を添加する温度を室温から８５℃に変更し、攪拌速度を３７５ｒｐｍに変更した以外は、実施例１と同様にしてポリマー粒子を製造した。
　得られたポリマー粒子は、平均粒径５２μｍ、変動係数１５％、比表面積９４ｍ2／ｇの多孔質粒子であった。
実施例４
　３，４－エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレートの代わりにグリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）０．４ｇを使用し、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドの使用量を１．１ｇに変更し、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミドの使用量を１．１ｇに変更し、２－オクタノンとアセトフェノンの混合液の質量比を６：４から４：６に変更し、攪拌速度を３４５ｒｐｍに変更した以外は、実施例３と同様にしてポリマー粒子を製造した。
　得られたポリマー粒子は、平均粒径５６μｍ、変動係数１２％、比表面積９７ｍ2／ｇの多孔質粒子であった。
実施例５
　モノマーを、（４－ビニルベンジル）グリシジルエーテル０．９ｇ、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド１．８ｇ、及びＮ，Ｎ’－ジエチル－１，３－ビス（アクリルアミド）プロパン６．１ｇに変更し、２－オクタノンとアセトフェノンの混合液の代わりにアセトフェノンを使用し、ポリビニルアルコールの使用量を０．５ｇに変更し、ドデシル硫酸ナトリウムと硫酸ナトリウムの使用量をそれぞれ０．１ｇに変更し、攪拌速度を３３０ｒｐｍに変更した以外は、実施例１と同様にしてポリマー粒子を製造した。
　得られたポリマー粒子は、平均粒径１０３μｍ、変動係数３９％、比表面積２１．３ｍ2／ｇの多孔質粒子であった。
実施例６
　（４－ビニルベンジル）グリシジルエーテル０．６ｇ、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド１．３ｇ及び１，４－ビス（アクリロイル）ピペラジン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）４．４ｇをアセトフェノン２６．０ｇに溶解させ、有機モノマー溶液を調製した。
　一方、ポリビニルアルコール１．５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム０．１ｇ、硫酸ナトリウム２．６ｇ及び亜硝酸ナトリウム１．３ｇを純水２６３ｇに添加し、攪拌して水溶液を調製した。
　上記有機モノマー溶液と水溶液を用いたこと、および攪拌速度を４５０ｒｐｍに変更したこと以外は、実施例１と同様にしてポリマー粒子を製造した。
　得られたポリマー粒子は、平均粒径５５μｍ、変動係数２６％、比表面積１００ｍ2／ｇであった。
実施例７
　Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドの代わりにＮ，Ｎ－ジエチルアクリルアミドを使用し、アセトフェノンの代わりに２－オクタノン（東洋合成工業社製）とアセトフェノン（井上香料製造所社製）の８：２混合液（質量比）を使用した以外は、実施例５と同様にしてポリマー粒子を製造した。
　得られたポリマー粒子は、平均粒径７０μｍ、変動係数３８％、比表面積１００ｍ2／ｇであった。
実施例８
　２－オクタノンとアセトフェノンの混合液の代わりに２－オクタノンを使用した以外は、実施例７と同様にしてポリマー粒子を製造した。
　得られたポリマー粒子は、平均粒径７６μｍ、変動係数４８％、比表面積２７．５ｍ2／ｇであった。
実施例９
　２－オクタノンの代わりにジイソブチルケトンを使用した以外は、実施例８と同様にしてポリマー粒子を製造した。
　得られたポリマー粒子は、平均粒径９０μｍ、変動係数３５％、比表面積３６．３ｍ2／ｇであった。
実施例１０
　２－オクタノンの代わりに酢酸イソペンチルを使用した以外は、実施例８と同様にしてポリマー粒子を製造した。
　得られたポリマー粒子は、平均粒径７９．０μｍ、変動係数４２％、比表面積２５．３ｍ2／ｇであった。
実施例１１
　２－オクタノンの代わりにジイソブチルケトンを使用した以外は、実施例２と同様にしてポリマー粒子を製造した。
　得られたポリマー粒子は、平均粒径７０．３μｍ、変動係数２９．１％、比表面積８．５ｍ2／ｇであった。
試験例１
　実施例１～１１で得られたポリマー粒子の表面をＳＥＭで観察し、以下の基準に従い評価した。なお、表中の「絶対値」とは、多官能モノマーの溶解度パラメータと有機溶媒の溶解度パラメータとの差の絶対値を意味する。
　（ポリマー粒子評価基準）
　◎：ゲルの付着がほとんどみられず、且つ多孔質である。
　○：ゲルの付着はほとんどみられないものの、細孔がほとんど確認できない。
　△：ゲルの付着がみられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
比較例１
　Ｎ，Ｎ’－ジエチル－１，３－ビス（アクリルアミド）プロパンの代わりにＮ，Ｎ’－ジメチル－ビス（アクリルアミド）エタン（ＪＳＲ社製）を使用し、２－オクタノンとアセトフェノンの混合液の質量比を７：３から５：５に変更した以外は、実施例１と同様にして有機モノマー溶液を調製した。
　次いで、実施例１と同様にして調製した水溶液を５００ｍＬセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、攪拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下３００ｒｐｍで攪拌を開始し、これに上記有機モノマー溶液を添加し、温水バスにより加熱し、液温が８５℃になったところで２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．１ｇを添加した。
　その結果、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－ビス（アクリルアミド）エタンが水溶液に分散せずに溶解し、順相懸濁重合をすることができなかった。
比較例２
　（４－ビニルベンジル）グリシジルエーテル０．９ｇ、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド０．９ｇ、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド０．９ｇ及びビス（アクリルアミド）メタン（Ａｌｆａ　Ａｅｓａｒ社製）６．１ｇを、２－オクタノンとアセトフェノンの７：３混合液（質量比）１８．１ｇに添加したところ、有機モノマーが混合液に溶解せず、順相懸濁重合を行うことができなかった。
参考例１
　グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１．０ｇ、グリセリン１－メタクリレート（日油社製）２．０ｇ及びグリセロール１，３－ジメタクリレート（新中村化学工業社製）６．９ｇを２－オクタノンとアセトフェノンの３：７混合液（質量比）２０．３ｇに溶解させ、有機モノマー溶液を調製した。
　一方、ポリビニルアルコール０．５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム０．１ｇ、炭酸ナトリウム０．２ｇ及び亜硝酸ナトリウム１．２ｇを純水２４８ｇに添加し、攪拌して水溶液を調製した。
　上記有機モノマー溶液と水溶液を用いたこと、および攪拌速度を４００ｒｐｍに変更したこと以外は、実施例１と同様にしてポリマー粒子を製造した。
　得られたポリマー粒子は、平均粒径が５０μｍ、変動係数１７％、比表面積は１０４ｍ2／ｇであった。
　試験例２　生体高分子結合容量測定試験
　以下の表２に示す各ポリマー粒子にＰｒｏｔｅｉｎＡを固定化し、ヒトポリクローナルＩｇＧに対する動的結合容積をＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒ、カラム容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）、溶出先端１０％ブレークスルーのときの吸着量により測定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表２に示すように、実施例１のポリマー粒子は、ＰｒｏｔｅｉｎＡを固定化した場合の生体高分子結合容量が大きい。
　試験例３　耐アルカリ性試験
　ＧＥヘルスケア社製ｔｒｉｃｏｒｎカラム（内径０．５ｃｍ）に、充填層高さが４ｃｍとなるように以下の表３に示すポリマー粒子を充填し、２３℃の恒温室に設置したＧＥヘルスケア社製クロマトグラフィーシステム（商品名ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ）にカラムを接続した。次いで、１０ｍＬの純水を１ｍＬ／分の速度で通液して洗浄した後、１０ｍＬの０．５規定水酸化ナトリウム水溶液を１ｍＬ／分の速度で通液して停止させ、そのまま、２２時間静置することによりアルカリ分解成分を溶出させた。次いで、０．５規定水酸化ナトリウム水溶液を１ｍＬ／分の速度で通液してカラム内の溶出液０．８ｍＬを採取し、直ちに０．１規定塩酸９．２ｍＬで酸性化した。島津製作所社製燃焼触媒酸化方式ＴＯＣ計（型番ＴＯＣ－５０００）を用いて、３０μＬのインジェクション容量で前記酸性化した液中の全有機炭素量を測定し、この値を１２．５倍して酸性化による希釈を補正した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表３に示すように、実施例１のポリマー粒子は耐アルカリ性に優れる。
　試験例４　耐着色性試験
　ＧＥヘルスケア社製ｔｒｉｃｏｒｎカラム（内径０．５ｃｍ）に、充填層高さが４ｃｍとなるように以下の表４に示すポリマー粒子を充填し、２３℃の恒温室に設置したＧＥヘルスケア社製クロマトグラフィーシステム（商品名ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ）にカラムを接続した。次いで、０．００１５質量％のフェノールレッドを含む２０ｍＭリン酸Ｎａ／１５０ｍＭ　ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ　７．５）を４ｍＬ通液した後、２０ｍＭリン酸Ｎａ／１５０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ　７．５）を４ｍＬ通液して洗浄し、目視観察でカラムが着色してないものを○、着色しているものを×と記録した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表４に示すように、実施例１のポリマー粒子は耐着色性に優れる。

Claims (18)

  1. 　Ｎ置換アクリルアミド基を複数有する多官能モノマーを含有するモノマー組成物を水系媒体中に分散させる工程と、
    　前記分散させたモノマー組成物を重合させる工程と、を含むことを特徴とする
    　ポリマー粒子の製造方法。
  2. 　前記Ｎ置換アクリルアミド基が、炭素数１～３のアルキル基が窒素原子に置換しているアクリルアミド基である請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記多官能モノマーが、前記Ｎ置換アクリルアミド基を２～６個有するものである請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記多官能モノマーが下記式（１）で表されるものである請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式（１）中、Ｒ1は炭素数２～８のアルキレン基を示し、Ｒ2及びＲ3は炭素数１～３のアルキル基を示し、Ｒ2及びＲ3が一緒になって隣接する窒素原子及びＲ1と共に複素環を形成していてもよい。但し、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の炭素数の合計は５以上である。〕
  5. 　前記モノマー組成物が、前記多官能モノマーを溶解する有機溶媒を１種以上含むものである請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　前記有機溶媒の溶解度パラメータが１７（ＭＰａ）1/2以上である請求項５に記載の製造方法。
  7. 　前記多官能モノマーの溶解度パラメータと前記有機溶媒の溶解度パラメータとの差の絶対値が５．８（ＭＰａ）1/2以下である請求項５又は６に記載の製造方法。
  8. 　前記有機溶媒が、溶解度パラメータが１９（ＭＰａ）1/2以上である有機溶媒と溶解度パラメータが１９（ＭＰａ）1/2未満である有機溶媒との混液である請求項５～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　前記モノマー組成物が、（メタ）アクリルアミド系モノマー、スチレン系モノマー、Ｎ－ビニルアミド系モノマー、ビニルケトン系モノマー、アクリロニトリル系モノマー及びエポキシ基含有不飽和モノマーから選ばれるモノマーを含有する請求項１～８のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 　前記（メタ）アクリルアミド系モノマーが、下記式（３）で表されるものである請求項９に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     〔式（３）中、Ｒ4は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ5及びＲ6はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を示す。〕
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法により製造されたポリマー粒子。
  12. 　下記式（２）で表される構造を含むポリマー粒子。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     〔式（２）中、Ｒ1は炭素数２～８のアルキレン基を示し、Ｒ2及びＲ3は炭素数１～３のアルキル基を示し、Ｒ2及びＲ3が一緒になって隣接する窒素原子及びＲ1と共に複素環を形成していてもよい。但し、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の炭素数の合計は５以上である。〕
  13. 　前記ポリマー粒子が、（メタ）アクリルアミド系モノマー、スチレン系モノマー、Ｎ－ビニルアミド系モノマー、ビニルケトン系モノマー、アクリロニトリル系モノマー及びエポキシ基含有不飽和モノマーから選ばれるモノマーに由来する構造単位を更に有する請求項１２に記載のポリマー粒子。
  14. 　前記（メタ）アクリルアミド系モノマーが、下記式（３）で表されるものである請求項１３に記載のポリマー粒子。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     〔式（３）中、Ｒ4は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ5及びＲ6はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を示す。〕
  15. 　請求項１１～１４のいずれか１項に記載のポリマー粒子を担体とするクロマトグラフィーカラム用充填剤。
  16. 　請求項１１～１４のいずれか１項に記載のポリマー粒子にリガンドを固定化したアフィニティクロマトグラフィー用充填剤。
  17. 　前記リガンドが、イムノグロブリン結合タンパク質である請求項１６に記載のアフィニティクロマトグラフィー用充填剤。
  18. 　請求項１５～１７のいずれか１項に記載の充填剤が充填されているクロマトグラフィーカラム。
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