TW201731592A - 親和層析用多孔質擔體、配體結合多孔質擔體、標的物之純化方法、及抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供硬度與韌性之均衡優異之親和層析用多孔質擔體。一種親和層析用多孔質擔體，其特徵係包含具有(成分A)源自多乙烯基單體之單體單位、與(成分B)於側鏈具有碳數1~8之烷基之單體單位之聚合物，前述聚合物中之成分A與成分B之含有比例[(A)：(B)]以質量比計為95：5~50：50，成分A之含量對於前述聚合物中之總單體單位為0.5~40質量%。

Description

親和層析用多孔質擔體、配體結合多孔質擔體、標的物之純化方法、及抗體
本發明有關親和層析用多孔質擔體、配體結合多孔質擔體、標的物之純化方法、及抗體。
親和層析在含單株抗體之蛋白質之研究、開發及製造中扮演重要角色。親和層析由於固體擔體上之配體對於標的物具有高的選擇性，故與離子層析、凝膠過濾層析、逆相液體層析等之其他層析相比，可以優異收率且高速經濟地製造。且，抗體醫藥品的主成分即單株抗體主要使用哺乳類培養細胞等作為重組蛋白質於培養液中被發現，藉由數段層析或膜步驟高純度純化後被製劑化。隨著近幾年之抗體醫藥之生產量增大，而要求耐於高流速處理之多孔質擔體。
且，該培養、純化、製劑化之步驟所形成或殘留之凝集體(二聚物以上之多聚體)成為副作用之主要原因，故其減低成為抗體醫藥品生產之重要課題。凝集體生成抑制或其去除於培養、純化、製劑化步驟中，已嘗試 藉由複雜管理方法或使用添加劑加以控制。尤其於純化步驟中，除了抑制凝集體生成以外，其去除亦具重要性。因此，對於純化步驟要求簡單且效率地去除凝集體技術之開發(專利文獻1~5)。
〔先前技術文獻〕 〔專利文獻〕
[專利文獻1]國際公開第2008/085988號公報
[專利文獻2]日本特表2010-507583號公報
[專利文獻3]國際公開第2010/019493號公報
[專利文獻4]國際公開第2010/141039號公報
[專利文獻5]國際公開第2014/034457號公報
抗體之純化中以高流速之處理成為必要，在高流速下不會潰散之耐壓性優異之多孔質粒子變為必要。單純使用硬質多孔質擔體時，以一定流速以下雖不會潰散，但超過一定流速時，或急速壓饋或會塑性變形而有無法作為層析擔體再利用之問題。
本發明欲解決之課題，在於提供硬度與韌性之均衡優異之親和層析用多孔質擔體。
且，如上述，抗體醫藥之製造時，期望去除凝集體。
本發明欲解決之一個課題在於提供硬度及韌性之均衡優異、進而可獲得優異之凝集體去除效率之親和層析用多孔質擔體或配體結合多孔質擔體、純化方法。
本發明欲解決之課題，可藉由下述手段解決。
[1]一種親和層析用多孔質擔體(以下亦稱為「本發明之親和層析用多孔質擔體」)，其特徵係包含具有(成分A)源自多乙烯基單體之單體單位、與(成分B)於側鏈具有碳數1~8之烷基之單體單位之聚合物，前述聚合物中之成分A與成分B之含有比例[(A)：(B)]以質量比計為95：5~50：50，成分A之含量對於前述聚合物中之總單體單位為0.5~40質量%。
[2]如上述[1]之多孔質擔體，其中成分A係選自源自芳香族系多官能單體之單體單位及源自多官能(甲基)丙烯酸酯類之單體單位中之1種以上。
[3]如上述[1]或[2]之多孔質擔體，其中成分A係選自源自二乙烯基苯之單體單位、源自三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯之單體單位及源自乙二醇二(甲基)丙烯酸酯之單體單位中之1種以上。
[4]如上述[1]~[3]中任一項之多孔質擔體，其中成分B係源自單乙烯基單體之單體單位。
[5]如上述[1]~[4]中任一項之多孔質擔體，其中成分 B係選自源自具有碳數1~8之烷基之芳香族系單體之單體單位及源自具有碳數1~8之烷基之(甲基)丙烯酸烷酯之單體單位中之1種以上。
[6]如上述[1]~[5]中任一項之多孔質擔體，其中前述烷基係透過2價連結基鍵結於前述聚合物之主鏈。
[7]如上述[1]~[6]中任一項之多孔質擔體，其中前述烷基之碳數為2~8。
[8]如上述[1]~[7]中任一項之多孔質擔體，其中成分B係源自烷基乙烯基苯之單體單位。
[9]如上述[1]~[8]中任一項之多孔質擔體，其中前述聚合物進而含有(成分C)源自成分A及成分B除外之單官能單體之單體單位。
[10]如上述[9]之多孔質擔體，其中成分C之含量對於前述聚合物中之總單體單位為20~99.5質量%。
[11]如上述[9]或[10]之多孔質擔體，其中成分C係選自源自(甲基)丙烯酸縮水甘油酯之單體單位、源自甘油單(甲基)丙烯酸酯之單體單位、源自(甲基)丙烯酸4-羥基丁酯縮水甘油醚之單體單位、源自(甲基)丙烯酸3,4-環氧基環己基甲酯之單體單位、源自乙烯基苄基縮水甘油醚之單體單位、及源自苯乙烯之單體單位中之1種以上。
[12]如上述[1]~[11]中任一項之多孔質擔體，其係粒子狀、單塊(monolith)狀、板狀、纖維狀或膜狀。
[13]一種配體結合多孔質擔體(以下亦稱為 「本發明之配體結合多孔質擔體」)，其係於如上述[1]~[12]中任一項之多孔質擔體上結合親和性配體而成。
[14]一種標的物之純化方法，其係使用如上述[13]之配體結合多孔質擔體。
[15]一種標的物之純化方法，其包含使如上述[13]之配體結合多孔質擔體與前述親和性配體可捕捉之標的物接觸之步驟A，與使可使前述親和性配體與前述標的物解離之解離液與前述步驟A中已捕捉標的物之擔體接觸而使標的物解離之步驟B。
[16]如上述[15]之純化方法，其中前述步驟B係在使標的物自親和性配體解離之條件下，藉由使用2種以上之離子強度階段性變高之鹽濃度之逐步方式、或鹽濃度梯度變高之梯度方式而解離之步驟。
[17]一種抗體，其係藉由如上述[14]~[16]中任一項之純化方法純化者。
藉由本發明，可提供硬度與韌性之均衡優異之親和層析用多孔質擔體。且，藉由本發明，可提供硬度與韌性之均衡優異，且進而可獲得優異之凝集體去除效率之親和層析用多孔質擔體或配體結合多孔質擔體、純化方法。
<親和層析用多孔質擔體>
本發明之親和層析用多孔質擔體之特徵為包含具有(成分A)源自多乙烯基單體之單體單位、與(成分B)於側鏈具有碳數1~8之烷基之單體單位之聚合物，前述聚合物中之成分A與成分B之含有比例[(A)：(B)]以質量比計為95：5~50：50，成分A之含量對於前述聚合物中之總單體單位為0.5~40質量%。
以下，首先針對本發明之親和層析用多孔質擔體、配體結合多孔質擔體加以說明，隨後針對本發明之標的物之純化方法(以下，亦稱為本發明之純化方法)加以說明。又，本說明書中，表示數值範圍之a~b等之記載係與a以上、b以下同義，a及b包含於數值範圍內。
構成本發明之親和層析用多孔質擔體之聚合物較好為水中不溶者。且較好為合成高分子。
又，作為衍生上述聚合物之各單體舉例為苯乙烯類等之芳香族系單體；乙烯醇類；(甲基)丙烯酸酯類；(甲基)丙烯醯胺類；乙烯類；馬來酸酐類等(以下將該等總稱為單體群α)。且，聚合物可含源自該等單體之單體單位之1種，亦可含2種以上，且，本發明之親和層析用多孔質擔體可含1種該等聚合物，亦可含2種以上。
該等單體中，基於耐壓性之觀點，較好為選自芳香族系單體、乙烯醇類、(甲基)丙烯酸酯類及(甲基)丙烯醯胺類中之1種以上之單體，更好為選自芳香族系單體及(甲基)丙烯酸酯類中之1種以上之單體。
且，親和層析用多孔質擔體較好為以上述聚合物為主成分者，聚合物含量相對於親和層析用多孔質擔體總量，較好為70~100質量%，更好為90~100質量%。
(成分A)源自多乙烯基單體之單體單位
聚乙烯單體係1分子中具有2個以上之聚合性乙烯基(具有乙烯性不飽和鍵之基)的乙烯基單體。多乙烯基單體只要為1分子中具有相當於上述單體群α之單體中之2個以上之聚合性乙烯基者即可，但較好為選自芳香族系多官能單體、多官能(甲基)丙烯酸酯類及多官能(甲基)丙烯醯胺類中之1種以上之單體，更好為選自芳香族系單體及(甲基)丙烯酸酯類中之1種以上之單體。
以下，將該多乙烯基單體分為非含羥基之多乙烯基單體、含羥基之多乙烯基單體加以說明。又，多乙烯基單體可單獨使用1種亦可組合2種以上使用。
作為非含羥基之多乙烯基單體舉例為例如乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、1,4-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1,6-己二醇二(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯等之多官能(甲基)丙烯酸酯類；二乙烯基苯、二乙烯基萘等之芳香 族系多官能單體；丁二烯、異氰尿酸二烯丙酯、異氰尿酸三烯丙酯等之烯丙基化合物等，可單獨使用1種，亦可組合2種以上使用。
該等中，作為非含羥基之多乙烯基單體，較好為多官能(甲基)丙烯酸酯類、芳香族多官能單體。且作為多官能(甲基)丙烯酸酯類，較好為多元醇之多官能(甲基)丙烯酸酯類。
又，上述非含羥基之多乙烯基單體中所含之聚合性乙烯基之個數，於1分子中較好為2~5個，更好為2或3個。
作為含羥基之多乙烯基單體，較好為多元醇之(甲基)丙烯酸酯類、各種糖類之2取代以上之(甲基)丙烯酸酯類、多元醇之(甲基)丙烯醯胺類。
作為多元醇之(甲基)丙烯酸酯類，舉例為甘油二(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基乙烷二(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷二(甲基)丙烯酸酯、丁三醇二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇二(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇五(甲基)丙烯酸酯、肌醇二(甲基)丙烯酸酯、肌醇三(甲基)丙烯酸酯、肌醇四(甲基)丙烯酸酯等。
作為各種糖類之2取代以上之(甲基)丙烯酸酯類舉例為例如葡萄糖二(甲基)丙烯酸酯、葡萄糖三 (甲基)丙烯酸酯、葡萄糖四(甲基)丙烯酸酯、甘露醇二(甲基)丙烯酸酯、甘露醇三(甲基)丙烯酸酯、甘露醇四(甲基)丙烯酸酯、甘露醇五(甲基)丙烯酸酯等。
再者，作為含羥基之多乙烯基單體，除上述例示者以外，亦舉例為二胺基丙醇、三(羥甲基胺基)甲烷、葡萄糖胺等之胺基醇與(甲基)丙烯酸之脫水縮合反應物等。
且，上述含羥基之多乙烯基單體中所含之聚合性乙烯基個數，於1分子中較好為2~5個，更好為2或3個，特佳為2個。
該等中，作為多乙烯基單體，基於以比較少量使用可獲得良好多孔性與機械強度並將含環氧基之單乙烯基單體之使用量限制為較少等之觀點，較好為非含羥基之多乙烯基單體，更好為三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二乙烯基苯，特佳為三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、二乙烯基苯。
成分A含量，相對於聚合物中之總單體單位，為0.5~40質量%。源自多乙烯基單體之單體單位含量未達0.5質量%時，固相擔體的機械度變低或難以形成多孔質粒子。又，超過40質量%時，親水性降低，無法獲得HCP之減低效果，且有親和配體之活性降低之情況。
成分A含量，相對於聚合物中之總單體單位，較好為1質量%以上，更好為5質量%以上，特佳為10質量%以上，且，相對於聚合物總單體單位，較好為35質量%以下，更好為30質量%以下，又更佳為25質量%以下，特 佳為20質量%以下。
聚合物中之各單體單位之含量只要藉由NMR等測定即可。
(成分B)於側鏈具有碳數1~8之烷基之單體單位
成分B係源自於聚合時於成為側鏈之部分具有碳數1~8之烷基之單體。該單體之烷基碳數若超過8，則非特異吸附增加。
作為上述單體，基於防止純化時之雜質之非特異吸附之觀點，較好為非離子性單體。且較好為單乙烯基單體。
作為衍生成分B之單體舉例為例如具有碳數1~8之烷基之(甲基)丙烯酸酯類、具有碳數1~8之烷基之(甲基)丙烯醯胺類、具有碳數1~8之烷基之芳香族系單體，可單獨使用1種或組合2種以上使用。
該等中，較好為具有碳數1~8之烷基之(甲基)丙烯酸酯類、具有碳數1~8之烷基之芳香族系單體。
作為碳數1~8之烷基較好為碳數2~8之烷基。且烷基可為直鏈狀、分支狀、環狀之任一者。舉例為例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、環丁基、戊基、環戊基、己基、環己基、庚基、環庚基、辛基、環辛基等。
且，上述烷基較好為不具有親水性基等之取代基者。
又，上述烷基較好為透過2價連結基鍵結於聚合物主鏈上。作為2價連結基舉例為例如2價芳香族烴基(伸苯 基等)、酯鍵、醯胺鍵等。
作為具有碳數1~8之烷基之(甲基)丙烯酸酯類較好為具有碳數1~8之烷基之(甲基)丙烯酸烷酯類。舉例為例如(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸正丁酯、(甲基)丙烯酸4-第三丁酯、(甲基)丙烯酸異丁酯、(甲基)丙烯酸環己酯、(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸正辛酯等。該等中，較好為(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸正丁酯、(甲基)丙烯酸4-第三丁酯、(甲基)丙烯酸異丁酯、(甲基)丙烯酸環己酯、(甲基)丙烯酸正辛酯。
又，作為具有碳數1~8之烷基之芳香族系單體較好為具有碳數1~8之烷基之芳香族乙烯基單體，更好為具有碳數1~8之烷基之苯乙烯系單體。
又，作為源自上述芳香族系單體之單體單位，較好為以下述式(5)表示之單體單位。
[式(5)中R8表示氫原子或碳數1~4之烷基，R9表示碳數1~8之烷基，t表示1~5之整數]。
式(5)中，作為以R8表示之烷基之碳數，較好為1或2。且，該烷基可為直鏈狀、可為分支鏈狀、亦可為環狀。作為烷基舉例為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第三丁基等。
且作為R8較好為氫原子。
以R9表示之烷基碳數，基於抑制固相擔體之疏水性之觀點及展現適度之疏水性相互作用之觀點，較好為1~8，更好為1~6，特佳為1或2。
且，烷基可為直鏈狀、分支鏈狀、環狀之任一者。舉例為例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、環丁基、戊基、環戊基、己基、環己基、庚基、環庚基、辛基、環辛基等。
又，上述烷基較好為不具有親水性基等之取代基者。
又，t表示1~5之整數，但基於抑制固相擔體之疏水性之觀點及展現適度之疏水性相互作用之觀點，較好為1~3，更好為1。又，t為2~5之整數時，t個R9可為相同亦可不同。
作為衍生芳香族乙烯基化合物類之單體，特佳為烷基乙烯基苯，舉例為例如4-甲基苯乙烯、2,4-二甲 基苯乙烯；2,4,6-三甲基苯乙烯、乙基乙烯基苯(4-乙基苯乙烯)、4-正丁基苯乙烯；4-異丁基苯乙烯、4-第三丁基苯乙烯、4-異丙基苯乙烯等，該等可單獨使用1種，或可組合2種以上使用。
作為成分B之含量，相對於聚合物中之總單體單位，較好為40質量%以下。藉由將成分B之含量設為40質量%以下，而改善雜質之非特異吸附。
又，成分B含量，相對於聚合物中之總單體單位，較好為0.05質量%以上，更好為0.5質量%以上，且，相對於聚合物中之總單體單位，較好為35質量%以下，更好為30質量%以下，特佳為25質量%以下。此等成分B之含量為20質量%左右時，亦可獲得本發明期望之效果。
又，上述聚合物中之成分A與成分B之含有比例[(A)：(B)]以質量比計為95：5~50：50。成分A之含有比例超過95質量份時，(尤其為粒子狀時)多孔質擔體之脆性變高，容易發生龜裂。另一方面，成分A之含有比例未達50質量份時，於多孔質擔體表面存在多數源自成分B之烷基，易使夾雜物吸附於多孔質擔體表面。
亦即，含有比例[(A)：(B)]為95：5~50：50之範圍內時，不僅可抑制擔體龜裂，於使用抗體結合性之配體時，藉由成分B具有之烷基與抗體之相互作用，單體之抗體可更強地保持，可使凝集體優先溶出。
本發明中，含有比例[(A)：(B)]以質量比計較好 為90：10~55：45，更好為85：15~55：45，特佳為80：20~60：40。
(成分C)
又，上述聚合物，較好進而包含(成分C)源自成分A及成分B除外之單官能單體之單體單位。
成分C含量，相對於聚合物中之總單體單位，較好為20~99.5質量%。若為上述範圍，則可獲得親水性、機械強度優異之親和層析用多孔質擔體。
又，成分C含量，相對於聚合物中之總單體單位，更好為25質量%以上，又更好為30質量%以上，再更好為40質量%以上，特佳為50質量%以上，且相對於聚合物中之總單體單位，較好為95質量%以下，更好為90質量%以下，特佳為80質量%以下。
又，作為成分C，舉例為(成分C-1)源自含環氧基之單乙烯基單體之單體單位、(成分C-2)源自不含環氧基之單乙烯基單體之單體單位。上述聚合物可含有該等單體單位中之1種，亦可含2種以上。
(成分C-1)源自含環氧基之單乙烯基單體之單體單位
含環氧基之單乙烯基單體係1分子中具有1個聚合性乙烯基(具有乙烯性不飽和鍵之基)與1個以上環氧基之單體。含環氧基之單乙烯基單體係用以對固相擔體導入適切量環氧基、獲得適切配體結合量之成分。
作為含環氧基之單乙烯基單體舉例為例如(甲基)丙烯酸縮水甘油酯、(甲基)丙烯酸4-羥基丁酯縮水甘油醚、(甲基)丙烯酸3,4-環氧基環己基甲酯、α-(甲基)丙烯醯基-ω-縮水甘油基聚乙二醇等之非含羥基之(甲基)丙烯酸酯類；甘油單(甲基)丙烯酸酯縮水甘油醚等之含羥基之(甲基)丙烯酸酯類；乙烯基苄基縮水甘油醚、異丙烯基苄基縮水甘油醚、乙烯基苯基丁基縮水甘油醚、乙烯基苄氧基乙基縮水甘油醚等之芳香族單乙烯基化合物，此外舉例為烯丙基縮水甘油醚、3,4-環氧基-1-丁烯、3,4-環氧基-3-甲基-1-丁烯等。可單獨使用該等中之1種，亦可組合2種以上使用。
該等中，作為含環氧基之單乙烯基單體，更好為含環氧基之(甲基)丙烯酸酯類、含環氧基之芳香族單乙烯基化合物，更好為含環氧基之(甲基)丙烯酸酯類，特佳為(甲基)丙烯酸縮水甘油酯、(甲基)丙烯酸4-羥基丁酯縮水甘油醚，特佳為(甲基)丙烯酸縮水甘油酯。又，含環氧基之芳香族單乙烯基化合物中，較好為乙烯基苄基縮水甘油醚，特佳為(4-乙烯基苄基)縮水甘油醚。
又，作為含環氧基之芳香族單乙烯基化合物，較好為含環氧基之苯乙烯系單乙烯基化合物，具體而言，舉例為式(4)表示之化合物。
[式(4)中，R4表示取代或未取代之碳數1或2之烷二基，R5表示氫原子或碳數1~4之烷基，R6表示碳數2或3之烷二基，R7表示碳數1~10之烷基，m及n分別獨立表示0~6之整數，q表示0~4之整數]。
式(4)中，R4表示之烷二基可為直鏈狀亦可為分支狀，舉例為例如甲烷-1,1-二基、乙烷-1,1-二基、乙烷-1,2-二基。該等中，基於提高鍵結親和配體時之反應性之觀點，較好為甲烷-1,1-二基。又，作為烷二基可具有之取代基舉例為甲基、乙基等。
式(4)中，R5表示氫原子或碳數1~4之烷基。作為R5表示之烷基之碳數，較好為1或2。且該烷基可為直鏈狀亦可為分支狀。作為烷基舉例為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基等。
該等中，作為R5，基於聚合反應之反應性之觀點， 較好為氫原子。
又，作為R6表示之烷二基，舉例為乙烷-1,1-二基、乙烷-1,2-二基、丙烷-1,1-二基、丙烷-1,2-二基、丙烷-1,3-二基、丙烷-2,2-二基，較好為乙烷-1,1-二基、乙烷-1,2-二基。
又，R7表示之烷基碳數，基於抑制固相擔體之疏水性之觀點，較好為1~6，更好為1~3，又更好為1或2。
且，上述烷基可為直鏈狀亦可為分支狀。作為烷基舉例為例如與上述R5所示之烷基相同者。
m及n分別獨立表示0~6之整數，但作為m，較好為0~3之整數。且，作為n，較好為0~3之整數，更好為0或1。又，n為2~6之整數時，n個R6可相同亦可不同。
又，q表示0~4之整數，但基於抑制固相擔體之疏水性之觀點，較好為0或1。又，q為2~4之整數時，q個R7可相同亦可不同。
又，藉由順相懸浮聚合將多孔質擔體作成粒子狀時，作為含環氧基之單乙烯基單體，基於可容易地控制開環環氧基量，較好為水不溶性者。此處所謂水不溶性係指對於水100mL於室溫(25℃)不溶解10g以上。又，含環氧基之單乙烯基單體可使用市售品，亦可依據習知方法合成而使用。
作為成分C-1之含量，相對於聚合物中之總 單體單位，較好為20~99.5質量%。若為上述範圍，則可獲得親水性、機械強度優異之多孔質擔體。
又，成分C-1之含量，相對於聚合物中之總單體單位，更好為25質量%以上，又更好為30質量%以上，再更好為40質量%以上，特佳為50質量%以上，且，相對於聚合物中之總單體單位，較好為95質量%以下，更好為90質量%以下，特佳為80質量%以下。
(成分C-2)源自不含環氧基之單乙烯基單體之單體單位
不含環氧基之單乙烯基單體係1分子中具有1個聚合性乙烯基(具有乙烯性不飽和鍵之基)、不含環氧基之乙烯基單體。以下將該不含環氧基之單乙烯基單體分為不含環氧基之非含羥基之單乙烯基單體、與不含環氧基之含羥基之單乙烯基單體加以說明。
作為不含環氧基之非含羥基之單乙烯基單體，基於防止純化時之雜質之非特異吸附之觀點，較好為非離子性單體。作為此等非離子性單體，舉例為例如如苯乙烯、α-甲基苯乙烯之芳香族乙烯基化合物。
又，作為不含環氧基之含羥基之單乙烯基單體舉例為例如甘油單(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基乙烷單(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷單(甲基)丙烯酸酯、丁烷三醇單(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇單(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇單(甲基)丙烯酸酯、肌醇單(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羥基乙酯、(甲基)丙烯酸羥 基丙酯、聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯等之(甲基)丙烯酸酯類；羥乙基(甲基)丙烯醯胺等之(甲基)丙烯醯胺類等，可單獨使用1種，或可組合2種以上使用。
又，不含環氧基之含羥基之單乙烯基單體中所含之羥基個數，於1分子中，較好為1~5個，更好為1~3個。
該等中，作為不含環氧基之單乙烯基單體，較好為不含環氧基之含羥基之單乙烯基單體，更好為甘油單(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羥基乙酯、(甲基)丙烯酸羥基丙酯、羥基乙基(甲基)丙烯醯胺，特佳為甘油單(甲基)丙烯酸酯、羥基乙基(甲基)丙烯醯胺。
作為成分C-2之含量，相對於聚合物中之總單體單位，較好為40質量%以下。藉由將成分C-2含量設為40質量%以下，於含羥基之單乙烯基單體時，可提高多孔質擔體之親水性，抑制凝集，提高親和配體之活性並改善標的物之動態結合量。
作為成分C-2之含量，相對於聚合物中之總單體單位，更好為35質量%以下，又更好為30質量%以下，特佳為20質量%以下。且，成分C-2之含量亦可為0質量%，含有成分C-2時，相對於聚合物中之總單體單位，較好為5質量%以上。
(擔體之形狀)
本發明之親和層析用多孔質擔體，基於每單位時間之 處理容量之觀點，期望表面積較大，較好為具有多數適當大小之細孔的多孔質。
作為本發明之親和層析用多孔質擔體之形態，可為粒子狀、單塊狀、板狀、纖維狀、膜狀(包含中空絲)之任一者，可選擇任意形態。作為水不溶性擔體，較好為多孔性珠粒、單塊體或膜，尤其為了使配置於水不溶性擔體上之抗體親和配體與成分B中之烷基協調地發揮機能，較好為獲得固定滯留時間之多孔性珠粒(多孔質珠粒)。
作為本發明之親和層析用多孔質擔體之圓形度0.95以上之粒子分佈，較好為60~100%，更好為70~100%，特佳為80~100%。
又，圓形度意指其分佈係以實施例中記載之方法測定之值。
又，本發明之親和層析用多孔質擔體之體積平均粒徑，基於標的物之動態結合量與壓力特性之觀點，較好為35~100μm，更好為40~90μm，特佳為40~80μm。
上述體積平均粒徑意指藉由雷射繞射‧散射粒徑分佈測定等測定之值，具體而言意指藉實施例中記載之方法測定之值。
又，體積平均粒徑之變動係數較好為40%以下，更好為30%以下。
又，作為本發明之親和層析用多孔質擔體之比表面積，較好為70m2/g以上，更好為80m2/g以上，又更好為90m2/g以上。比表面積為如上述範圍時，成為標的物之動 態結合量提高，且凝集體脂去除能優異者。
又，作為本發明之親和層析用多孔質擔體之體積平均細孔徑，基於標的物之動態結合量與凝集體去除能之觀點，較好為10~300nm，更好為20~200nm，特佳為30~100nm。
上述變動係數、比表面積、體積平均細孔徑係藉由雷射繞射‧散射粒徑分佈測定等測定之值。
<配體結合多孔質擔體>
本發明之配體結合多孔質擔體係於本發明之親和層析用多孔質擔體上結合親和配體者。
作為本發明之配體結合多孔質擔體，較好圓形度0.95以上之粒子分佈、體積平均粒徑、變動係數、比表面積、體積平均細孔徑係與上述本發明之親和層析用多孔質擔體同樣之範圍者。
(親和配體)
本發明中所謂之親和配體表示基於以抗原與抗體之結合所代表之特異分子間之親和力而自某分子之集合選擇性捕集標的(目的)分子之物質。本發明中，親和配體若為與標的物特異性結合者即可，舉例為例如蛋白質、核酸、肽、酵素、螯合物化合物、受體、適體(aptamer)、抗體、抗原、維他命、金屬離子等。該種親和配體中，較好為蛋白質、肽、酵素、螯合劑化合物，更好為蛋白質、 肽。且純化標的物為抗體之親和配體中，更好為免疫球蛋白結合蛋白質。
本發明中可使用之抗體親和配體若為抗體恆定領域的含Fc分子、抗體之可變結構域之含Fab分子、或具有與抗體特異結合之特徵則未特別限制，但較好為肽性配體、蛋白質性配體、化學合成性配體(合成化合物)。基於對於標的分子之特異性之觀點，更好為肽性或蛋白質性配體。其中，作為抗體親和配體，較好為蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、蛋白質H、蛋白質D、蛋白質Arp、蛋白質FcγR、抗體結合性合成肽配體、駱駝科之動物的抗體或其片段、該等之類似物質。作為抗體親和配體更好為蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、該等之類似物質，最好為蛋白質A、其類似物質。抗體親和配體若具有標的分子結合結構域(肽單體或蛋白質、單結構域)則未特別限制，但較好為2個以上之結構域連結而成之多聚體肽或蛋白質(複數結構域)，更好為2~10個，又更好為2~8個，再更好為2~6個，特佳為3~6個結構域連結而成之多聚體蛋白質。該等多聚體蛋白質可為單一標的分子結合結構域之連結體的均二聚物、均三聚物等之均聚物，若標的分子相同，則亦可為複數種類之標的分子結合結構域的連結體的雜二聚物、雜三聚物等之雜聚物。
作為連結抗體親和配體之標的分子結合結構域之方法，較好為不使多聚物蛋白質之3次元立體構造不安定化之方法，例如透過結構域序列之末端胺基酸連結之 方法、不透過結構域序列之胺基酸殘基連結之方法、以1或複數之結構域序列以外之胺基酸殘基連結之方法等，不限定於該等方法者。
作為抗體親和配體，可使用將多聚體蛋白質作為1個構成成分，與機能不同之其他蛋白質融合之融合蛋白質。作為融合蛋白質，可舉例白蛋白或融合有GST(穀胱甘肽S-轉移酶)之蛋白質或DNA適體等之核酸、抗生物質等之藥物、融合有PEG(聚乙二醇)等之高分子之蛋白質等，但不限定於該等。
親和配體結合量，基於動態結合容量之觀點，多孔質擔體之每1g乾燥重量，較好為10~200mg，更好為25~160mg，又更好為30~140mg，特佳為40~100mg。親和配體結合量只要藉與後述實施例同樣方法測定即可。
作為將親和配體結合於親和層析用多孔質擔體之方法可使用一般方法。例如可將親和配體之胺基透過導入至擔體上之甲醯基結合於高分子合成支撐體，亦可將親和配體之胺基透過合成高分子支撐體上之活化羧基結合於擔體，亦可將親和配體之胺基透過合成高分子支撐體上之乙氧基結合於擔體上。
作為導入至合成高分子支撐體之官能基，若為可與親和配體形成共價鍵之官能基，則未特別限制，但可舉例為例如以環氧基(環氧氯丙烷)、溴化氰、N,N-二琥珀醯亞胺基碳酸鹽(DSC)等而活化之羥基、醛基或活 化羧酸基(例如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯、羰基二咪唑(CDI)活化酯)等之反應性官能基(r活化基)等(Hermanson G.T.等人著，rImmobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press，1992年、美國專利第5,874,165號、美國專利第3,932,557號、美國專利第4,772,653號、美國專利第4,210,723號、美國專利第5,250,6123號、歐洲專利公開第1352957號、WO2004/074471)。該等中，包含親和配體為與合成高分子支撐體直接共價鍵結者，與使用直鏈、分支鏈或環狀連結基或間隔基者。又，將導入親和配體之合成高分子支撐體活化時，較好為不與親和配體直接反應之活化方法。
親和配體中，將蛋白質性配體固定化於擔體之方法可使用將蛋白質之官能基之一部分與擔體之官能基之一部分反應之方法，該反應可利用之蛋白質側之主要官能基(活性基)有N末端胺基酸及離胺酸(Lys)側鏈之胺基；半胱胺酸(Cys)側鏈之硫醇基；C末端胺基酸或穀胺酸(Glu)側鏈、天門冬胺酸(Asp)側鏈之羧基等，但不限定於此。
又，作為將控制配體之配向性之蛋白質性抗體親和配體固定化於合成高分子支撐體之方法，提案有利用於C末端具有半胱胺酸之蛋白質A之方法(美國專利第6,399,750號、Ljunquist C.等人著，rEur.J.Biochem.，1989年，186卷，557-561頁)，亦可採用此。
作為利用連結基之固定化技術，除了確保合 成高分子支撐體與親和配體之距離，排除立體障礙而實現高性能化以外，舉例有於連結基或間隔基中賦予、形成官能基(例如帶電胺)之方法等。
又，已檢討於抗體親和配體之固定化時抗體親和配體有效地累積於連結基或間隔基部分，藉由提高固定化收率而提高分離性能。舉例為例如將蛋白質性配體對以作為連結基臂之一部分的NHS活性化羧酸衍生化之瓊脂糖擔體固定化技術(美國專利第5,260,373號、日本特開2010-133733號公報、日本特開2010-133734號公報)，亦可採用該等。
又，亦提案有與連結基或間隔基另外之對於擔體之締合性基，將親和配體累積於支撐體上後，不於締合性基與親和配體間形成共價鍵，而於支撐體上個別固定化抗體親和配體之方法(日本特開2011-256176號公報)，亦可採用該等。
<標的物之純化步驟>
本發明之純化方法之特徵為使用本發明之配體結合多孔質擔體者。本發明之純化方法除使用本發明之配體結合多孔質擔體以外，與常用方法同樣進行即可。
具體而言，舉例為包含使本發明之配體結合多孔質擔體與前述親和性配體可捕捉之標的物接觸之步驟A，與使可使前述親和性配體與前述標的物解離之解離液與前述步驟A中已捕捉標的物之擔體接觸而使標的物解離之步驟B 之方法。
且，例如於標的物為不易凝集之如抗體者時，有必要自標的物之單體與標的物之凝集體之混合物選擇性分離單體。該情況下，可利用本發明之配體結合多孔質擔體表面與標的物之單體或凝集體之物力相互作用之差異，選擇性分離標的物之單體。可以說，可使用本發明之配體結合多孔質擔體作為利用親和配體與烷基之混合模式用擔體。
作為其一實施形態，前述步驟B可較好地例示為在使標的物自親和配體解離之條件下，藉由使用2種以上之離子強度階段性變高之鹽濃度之逐步方式、或鹽濃度梯度變高之梯度方式(或該兩者之組合)而解離之步驟。藉此，即使離子強度不變化而保持一定之狀態，亦可使分離能稍降低者之單體與凝集體分離、溶出。
本發明之純化方法除了顯示單體與凝集體之分離特性以外，亦可以1步驟縮短親和純化步驟與藉由離子交換之純化步驟之2步驟之層悉操作，可期待所使用之緩衝液種類及使用量進而作業時間之縮短。
又，本發明之純化方法藉由於使標的分子自抗體親和配體解離之狹窄pH結構域(較好pH3~4，更好為pH3.1~3.9，再更好pH3.2~3.8)，設定離子強度(較好於10~500mM，更好15~400mM，又更好20~350mM，使用2種以上以前述範圍階段性變高之鹽濃度之「逐步方式」或以前述範圍梯度變高之鹽濃度之「梯度方式」)， 可獲得單體含量高的溶出區份。
尤其於單株抗體之純化中，由於該解離pH自標的分子之等電點大為偏離，故每抗體之解離離子強度幅度並無太大差異，而可期待可在狹窄範圍設定各種標的分子之使用條件。再者，作為抗體親和配體，除了可更狹窄地設定解離pH結構域以外，藉由使用鹼CIP洗淨，亦可有效地洗淨，故基於安定之製程架構之觀點，較好利用變質蛋白質A。
作為本發明中純化之標的分子，係例如免疫球蛋白G及其類似物(包含衍生物)，除一般稱為抗體之分子以外，亦包含免疫球蛋白分子之恆定結構域的Fc結構域與其他機能性蛋白質或肽融合之Fc融合蛋白質(含Fc分子)。該等可利用作為抗體醫藥品之原料。
以下，針對標的分子為免疫球蛋白G之情況例示本發明之純化方法之詳細說明，但本發明不限定於該等。
本發明之標的物之純化方法包含使本發明之配體結合多孔質擔體與前述親和性配體可捕捉之標的物接觸之步驟A。將含免疫球蛋白G之蛋白質溶液之pH調整為中性附近後，使該溶液通過填充本發明之配體結合多孔質擔體之管柱，透過親和配體將免疫球蛋白G特異地吸附於擔體。
例如蛋白質A設為親和配體時，其負載pH較好為6以上，更好為6.3以上且9以下，又更好為6.5以上且8.5 以下。由哺乳類培養細胞生產之免疫球蛋白G之純化中，沒有必要特別調整離子強度以外，亦可預先提高離子強度，而更抑制非特異吸附。
本發明中，較好進而具有洗淨步驟。洗淨步驟中，使親和配體發揮機能之條件範圍之緩衝液適量通過，而洗淨管柱內部。亦即，pH之較佳範圍亦可與前述負載時相同範圍(中性附近之pH)，例如較好為6以上。於該時點，標的分子的免疫球蛋白G吸附於本發明之配體結合多孔質擔體。此時，有藉由在中性附近之pH，使離子強度或組成物最適化，而有效去除雜質之情況。負載、洗淨時，較好處於中性附近之pH同時利用一定以上之離子強度之洗淨液，於該過程可洗淨該分離基質及/或透過免疫球蛋白G非特異殘留於管柱之雜質。離子強度較好為例如0.2M以上，更好為0.5M以上。
又，該純化方法包含上述步驟B時，與上述同樣，可為逐步方式、梯度方式、該等之組合之任一者。
於步驟B，具備以在中性附近離子強度較低之緩衝液置換管柱，藉由解離時之陽離子交換基展現離子強度依存之解離機能。
解離液之pH可適用自抗體親和配體解離免疫球蛋白G之pH。該pH係以由親和配體與免疫球蛋白G之種類決定之分離條件為中心加以決定。
抗體親和配體使用蛋白質A時，pH較好設定於2~6之間。惟，基於避免標的分子之酸變性之目的，更 好為pH3.0以上，又更好為pH3.3以上，特佳為pH3.5以上。pH較好為5.5以下，更好為5.0以下。使用鹼耐性型之蛋白質A配體時，一般其解離pH係與3.5~4.0之間為中心而設定，但不限定於此。
又，解離離子強度除了與抗體親和配體與源自成分B之烷基之導入比率相關以外，亦與每單位面積之免疫球蛋白G之負載量相關，可藉由梯度實驗或逐步解離實驗而容易地設定最適點。
自藉由本發明調製之本發明之配體結合多孔質擔體之抗體解離，可適用濃度梯度方式亦可適用逐步方式，但基於減低溶出液量之目的時，較好為利用離子強度之逐步方式。再者，為了操作之單純化，較好為可藉一步驟達成抗體之回收與高擔體含量化之條件設定。
使用藉由本發明調製之本發明之配體結合多孔質擔體而純化之免疫球蛋白G顯示高的單體選擇性，其溶出液中之單體含量高。
藉由使用本發明之配體結合多孔質擔體，由於可以維持高回收率之狀態以單一層析操作有效地達成特異性高的親和純化、與主要藉由陽離子交換層析達成之單體含量之提高，故可減低對後段製程之負荷，可貢獻於製程全體之收率提高與單體含量之提高。亦即，藉由本發明，可有助於抗體醫藥品之製造製程之生產性提高與高純度化。
〔實施例〕
以下列舉實施例詳細說明本發明，但本發明不限定於該等實施例。
(實施例1)
(1)於448g純水中添加聚乙烯醇(KURARAY公司製PVA-217)2.69g，加熱攪拌，使聚乙烯醇溶解，冷卻後，添加十二烷基硫酸鈉(和光純藥工業製)0.045g並攪拌，調製水溶液S。
另一方面，將由二乙烯基苯(和光純藥工業製)3.63g、1-乙基-4-乙烯基苯(ChemSam Co公司製)0.36g及苯乙烯(和光純藥工業製)14.15g所成之單體組成物溶解於二異丁基酮(三井化學公司製)29.38g，調製單體溶液。
其次，將前述水溶液S全量投入500mL可分離燒瓶中，安裝溫度計、攪拌翼及冷卻管，設於溫水浴中，以氮氣環境下開始攪拌。於可分離燒瓶內全量投入前述單體溶液，藉由溫水浴加溫使內溫達到85℃後，添加2,2’-二異丁腈(和光純藥工業製)1.34g，將內溫設為86℃。
(2)隨後，將溫度維持於86℃之狀態，進行3小時攪拌。其次，冷卻反應液後，將該反應液過濾，以純水與乙醇洗淨。經洗淨之粒子分散於純水中，進行3次傾析，去除小粒子。其次，將粒子分散於純水中以使粒子濃度成為10質量%，獲得多孔質粒子分散液。該分散液 中所含之多孔質粒子稱為「多孔質擔體V1」。
(3)隨後，於多孔質粒子分散液200mL中添加乙酸鈉28.0g，於5分鐘後，添加Br2/H2O(飽和濃度)85mL，反應15分鐘，添加甲酸鈉0.5g。其次，冷卻反應液，過濾該反應液，以純水洗淨，將粒子分散於純水中以使粒子濃度成為10質量%，獲得活化多孔質粒子分散液。
其次，將所得活化多孔質粒子5mL(沉降體積)進行抽吸，添加水作成合計7mL之懸浮液。於該懸浮液中添加5N氫氧化鈉水溶液0.8mL、NaBH4 24mg及環氧氯丙烷4mL，於25℃振盪8小時。上述反應液依序以純水、乙醇、純水進行過濾洗淨，獲得環氧化多孔質粒子。其次，將環氧化多孔質粒子分散於純水中以使粒子濃度成為10質量%，獲得環氧化多孔質粒子分散液。
(4)其次，將變質蛋白質A(Repligen製rSPA)0.15g分散於1.2M硫酸鈉/0.1M磷酸鈉緩衝液(pH6.6)40mL中獲得蛋白質A分散液，於該蛋白質A分散液中添加環氧化多孔質粒子分散液(以粒子乾燥質量換算相當1g)。將該分散液於25℃振盪攪拌5小時，將蛋白質A固定於粒子上。
其次，將生成之蛋白質A固定粒子分散於1.0M 2-巰基乙醇(和光純藥工業公司製)/0.1M硫酸鈉(pH8.3)40mL中，於25℃振盪攪拌17小時，而使未反應之環氧基開環。進而將所得未反應之環氧基開環之蛋白質A固定 粒子以0.1M磷酸鈉緩衝液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.2)洗淨，獲得含親和層析用填充劑之溶液。該溶液中所含之填充劑稱為「多孔質擔體W1」。
(實施例2)
於實施例1之步驟(1)中，除了將由二乙烯基苯(和光純藥工業製)3.63g、1-乙基-4-乙烯基苯(ChemSam Co公司製)0.36g及甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱瓦斯化學公司製)14.15g所成之單體組成物溶解於2-辛酮(東洋合成公司製)29.38g，調製單體溶液以外，進行與實施例1之步驟(1)及(2)之相同操作，獲得多孔質粒子分散液。該分散液中所含之多孔質粒子稱為「多孔質擔體V2」。
隨後，將變質蛋白質A(Repligen製rSPA)0.15g分散於1.2M硫酸鈉/0.1M磷酸鈉緩衝液(pH6.6)40mL中獲得蛋白質A分散液，於該蛋白質A分散液中添加上述多孔質粒子分散液(以粒子乾燥質量換算相當1g)。將該分散液於25℃振盪攪拌5小時，將蛋白質A固定於粒子上。
其次，將生成之蛋白質A固定粒子分散於1.0M 2-巰基乙醇(和光純藥工業公司製)/0.1M硫酸鈉(pH8.3)40mL中，於25℃振盪攪拌17小時，而使未反應之環氧基開環。進而將所得未反應之環氧基開環之蛋白質A固定 粒子以0.1M磷酸鈉緩衝液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.2)洗淨，獲得含親和層析用填充劑之溶液。該溶液中所含之填充劑稱為「多孔質擔體W2」。
(實施例3)
於實施例1之步驟(1)中，除了將由二乙烯基苯(和光純藥工業製)3.59g、1-乙基-4-乙烯基苯(ChemSam Co公司製)3.41g及甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱瓦斯化學公司製)10.94g所成之單體組成物溶解於二異丁基酮(三井化學公司製)29.39g，調製單體溶液以外，進行與實施例1之步驟(1)及(2)之相同操作，獲得多孔質粒子分散液。該分散液中所含之多孔質粒子稱為「多孔質擔體V3」。
隨後，藉由與實施例2相同操作實施蛋白質A之固定、未反應之環氧基之開環及洗淨，獲得含親和層析用填充劑之溶液。該溶液中所含之填充劑稱為「多孔質擔體W3」。
(實施例4)
於實施例1之步驟(1)中，除了將由二乙烯基苯(和光純藥工業製)6.29g、1-乙基-4-乙烯基苯(ChemSam Co公司製)5.39g及甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱瓦斯化學公司製)6.29g所成之單體組成物溶解於 二異丁基酮(三井化學公司製)29.39g，調製單體溶液以外，進行與實施例1之步驟(1)及(2)之相同操作，獲得多孔質粒子分散液。該分散液中所含之多孔質粒子稱為「多孔質擔體V4」。
隨後，藉由與實施例2相同操作實施蛋白質A之固定、未反應之環氧基之開環及洗淨，獲得含親和層析用填充劑之溶液。該溶液中所含之填充劑稱為「多孔質擔體W4」。
(實施例5)
於實施例1之步驟(1)中，除了將由三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(SARTOMER公司製)0.90g、丙烯酸正辛酯(共榮社化學公司製)0.72g及甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱瓦斯化學公司製)16.33g所成之單體組成物溶解於二異丁基酮(三井化學公司製)29.39g，調製單體溶液以外，進行與實施例1之步驟(1)及(2)之相同操作，獲得多孔質粒子分散液。該分散液中所含之多孔質粒子稱為「多孔質擔體V5」。
隨後，藉由與實施例2相同操作實施蛋白質A之固定、未反應之環氧基之開環及洗淨，獲得含親和層析用填充劑之溶液。該溶液中所含之填充劑稱為「多孔質擔體W5」。
(實施例6)
於實施例1之步驟(1)中，除了將由三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(SARTOMER公司製)6.41g、甲基丙烯酸環己酯(共榮社化學公司製)0.37g及丙烯酸4-羥基丁酯縮水甘油醚(日本化成公司製)11.54g所成之單體組成物溶解於苯乙酮(井上香料製作所公司製)29.37g，調製單體溶液以外，進行與實施例1之步驟(1)及(2)之相同操作，獲得多孔質粒子分散液。該分散液中所含之多孔質粒子稱為「多孔質擔體V6」。
隨後，藉由與實施例2相同操作實施蛋白質A之固定、未反應之環氧基之開環及洗淨，獲得含親和層析用填充劑之溶液。該溶液中所含之填充劑稱為「多孔質擔體W6」。
(實施例7)
於實施例1之步驟(1)中，除了將由二乙烯基苯(和光純藥工業製)3.62g、1-乙基-4-乙烯基苯(ChemSamp Co公司製)0.91g及甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱瓦斯化學公司製)13.58g所成之單體組成物溶解於二異丁基酮(三井化學公司製)29.38g，調製單體溶液以外，進行與實施例1之步驟(1)及(2)之相同操作，獲得多孔質粒子分散液。
隨後，將所得多孔質粒子5mL(沉降體積)進行抽吸，添加水作成合計7mL之懸浮液。於該懸浮液中添加5N氫氧化鈉水溶液0.8mL、NaBH4 24mg及環氧氯丙烷 4mL，於25℃振盪8小時。上述反應液依序以純水、乙醇、純水進行過濾洗淨，獲得環氧化多孔質粒子。其次，將環氧化多孔質粒子分散於純水中以使粒子濃度成為10質量%，獲得環氧化多孔質粒子分散液。該分散液中所含之多孔質粒子稱為「多孔質擔體V7」。
隨後，藉由與實施例2相同操作實施蛋白質A之固定、未反應之環氧基之開環及洗淨，獲得未反應之環氧基開環之蛋白質A固定粒子。
其次，將未反應之環氧基開環之蛋白質A固定粒子分散於1.0M 2-巰基丙烷磺酸鈉(東京化成工業公司製)/0.1M硫酸鈉(pH8.3)40mL中，於25℃振盪攪拌17小時，而使未反應之環氧基開環。進而將所得未反應之環氧基開環之蛋白質A固定粒子以0.1M磷酸鈉緩衝液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.2)洗淨，獲得含親和層析用填充劑之溶液。該溶液中所含之填充劑稱為「多孔質擔體W7」。
(實施例8)
於實施例1之步驟(1)中，除了將由二乙烯基苯(和光純藥工業製)2.70g、1-乙基-4-乙烯基苯(ChemSamp Co公司製)1.80g及(4-乙烯基苄基)縮水甘油醚(東麗精密化學公司製)13.49g所成之單體組成物溶解於苯乙酮(井上香料製作所公司製)21.52g及2-辛酮(東洋合成公司製)7.35g之混合液中，調製單體溶液以 外，進行與實施例1之步驟(1)及(2)之相同操作，獲得多孔質粒子分散液。該分散液中所含之多孔質粒子稱為「多孔質擔體V8」。
隨後，藉由與實施例2相同操作實施蛋白質A之固定、未反應之環氧基之開環及洗淨，獲得含親和層析用填充劑之溶液。該溶液中所含之填充劑稱為「多孔質擔體W8」。
(比較例1)
於實施例1之步驟(1)中，除了將由二乙烯基苯(和光純藥工業製)5.49g及甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱瓦斯化學公司製)12.80g所成之單體組成物溶解於苯乙酮(井上香料製作所公司製)21.52g及2-辛酮(東洋合成公司製)7.35g之混合液中，調製單體溶液以外，進行與實施例1之步驟(1)及(2)之相同操作，獲得多孔質粒子分散液。該分散液中所含之多孔質粒子稱為「多孔質擔體X1」。
隨後，藉由與實施例2相同操作實施蛋白質A之固定、未反應之環氧基之開環及洗淨，獲得含親和層析用填充劑之溶液。該溶液中所含之填充劑稱為「多孔質擔體Y1」。
(比較例2)
於實施例1之步驟(1)中，除了將由二乙烯基苯 (和光純藥工業製)5.34g、甲基丙烯酸異丁酯(共榮社化學公司製)7.11g及丙烯酸4-羥基丁酯縮水甘油醚(日本化成公司製)5.34g所成之單體組成物溶解於苯乙酮(井上香料製作所公司製)21.50g及2-辛酮(東洋合成公司製)7.34g之混合液中，調製單體溶液以外，進行與實施例1之步驟(1)及(2)之相同操作，獲得多孔質粒子分散液。該分散液中所含之多孔質粒子稱為「多孔質擔體X2」。
隨後，藉由與實施例2相同操作實施蛋白質A之固定、未反應之環氧基之開環及洗淨，獲得含親和層析用填充劑之溶液。該溶液中所含之填充劑稱為「多孔質擔體Y2」。
(比較例3)
於實施例1之步驟(1)中，除了將由三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(SARTOMER公司製)6.29g、甲基丙烯酸月桂酯(共榮社化學公司製)5.39g及(4-乙烯基苄基)縮水甘油醚(東麗精密化學公司製)6.29g所成之單體組成物溶解於苯乙酮(井上香料製作所公司製)21.50g及2-辛酮(東洋合成公司製)7.34g之混合液中，調製單體溶液以外，進行與實施例1之步驟(1)及(2)之相同操作，獲得多孔質粒子分散液。該分散液中所含之多孔質粒子稱為「多孔質擔體X3」。
隨後，藉由與實施例2相同操作實施蛋白質A之固 定、未反應之環氧基之開環及洗淨，獲得含親和層析用填充劑之溶液。該溶液中所含之填充劑稱為「多孔質擔體Y3」。
(比較例4)
於實施例1之步驟(1)中，除了將由三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(SARTOMER公司製)6.41g、甲基丙烯酸異丁酯(共榮社化學公司製)0.18g及(4-乙烯基苄基)縮水甘油醚(東麗精密化學公司製)11.73g所成之單體組成物溶解於苯乙酮(井上香料製作所公司製)21.50g及2-辛酮(東洋合成公司製)7.34g之混合液中，調製單體溶液以外，進行與實施例1之步驟(1)及(2)之相同操作，獲得多孔質粒子分散液。該分散液中所含之多孔質粒子稱為「多孔質擔體X4」。
隨後，藉由與實施例2相同操作實施蛋白質A之固定、未反應之環氧基之開環及洗淨，獲得含親和層析用填充劑之溶液。該溶液中所含之填充劑稱為「多孔質擔體Y4」。
試驗例1(粒徑之測定)
藉由雷射繞射散射式粒度分佈測定裝置(BECKMAN COULTER公司製LS13320)測定各實施例及比較例所得之多孔質擔體V1~V8、W1~W8、X1~X4、Y1~Y4之平均粒徑。結果示於表1、2。又，表中之數值係小數點以下 四捨五入之值。
試驗例2(圓形度分佈之評價)
以純水將各實施例及比較例所得之多孔質擔體V1~V8、W1~W8、X1~X4、Y1~Y4調整為固體成分濃度10質量%，使用定量控制隔膜泵(TACMINA公司製)以6L/min之吐出速度進行60次循環處理。
隨後，將循環處理後之多孔質擔體以水稀釋成固體成分濃度為2.5質量%，使用SYSMEX公司製流式粒子像分析裝置(型號FPIA-3000)設定於總計數500個測定各粒子之圓形度(=(與粒子投影面積相同面積之圓的圓周長/粒子頭影像之圓周長)×100)。
其次，藉由將全部測定對象粒子中之圓形度0.95以上之粒子個數除以全部測定粒子數，算出圓形度0.95以上之粒子分佈(=圓形度0.95以上之粒子數/測定粒子數×100)，藉以下基準評價。結果示於表1、2。
(圓形度分佈之評價基準)
80%以上：良
未達80%：不良
試驗例3(蛋白質A結合量之測定)
使用二喹啉甲酸(BCA)試藥定量結合於各實施例及比較例所得之多孔質擔體W1~W8、Y1~Y4之配體的蛋白 質A結合量。具體而言，將以固體成分換算為1mg之多孔質擔體採取至試管中，以Thermo Fisher Scientific公司之BCA蛋白質分析套組對於該等定量蛋白質A之結合量。反應藉由在37℃倒轉混合30分鐘而進行。使用與擔體結合之蛋白質同樣者作成校正線。結果示於表1、2。
試驗例4(DBC之測定)
使用GE Healthcare公司製AKTAprime plus，測定各實施例及比較例所得之多孔質擔體W1~W8、Y1~Y4對於線流速300cm/hr下之蛋白質(人類IgG抗體，Equitech Bio公司製HGG-1000)之DBC。管柱容器使用容量4mL(5mm ×200mm長)者，蛋白質使用將蛋白質以5mg/mL溶解於20mM磷酸鈉/150mM氯化鈉水溶液(pH7.5)者，自溶出前面10%穿透時之蛋白質捕捉量與管柱填充體積求出DBC，藉以下基準評價。結果示於表1、2。
(DBC之評價基準)
35mg/mL以上：良
未達35mg/mL：不良
試驗例5(HCP與凝集體之定量)
於管柱容器(GE Healthcare公司製Tricorn 10/50管柱)中以填充高度約5cm填充各實施例及比較例所得之多 孔質擔體W1~W8、Y1~Y4製作管柱。將所得管柱分別連接於GE Healthcare公司製AKTAprime plus，以5管柱容量(管柱容積之5倍)、流速1mL/分鐘通入20mM磷酸鈉緩衝液(pH7.5)予以平衡化。
其次，將含有單株抗體Trastuzumab之CHO細胞培養上澄液以約23mg抗體/mL擔體之負載量，以流速1mL/分鐘通入管柱中。
其次，分別以5管柱容量、流速1mL/分鐘對管柱依序通入20mM磷酸鈉緩衝液(pH7.5)、20mM磷酸鈉/1M氯化鈉緩衝液(pH7.5)及20mM磷酸鈉緩衝液(pH7.5)。
隨後，以流速1mL/分鐘對管柱通入50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH3.2)，將管柱內捕捉之單株抗體溶出，回收Abs.280>100mAu之溶出區份。
接著，使用分光光度計，測定回收之區份中含有之抗體濃度(mg/mL)。且使用Cygnus Technologies公司製CHO HCP ELISA kit,3G，測定回收之區份中含有之宿主細胞蛋白質(Host Cell Protein)(HCP)濃度(ng/mL)。進而藉由將HCP濃度除以抗體濃度，算出每單位抗體量之HCP量，藉以下基準評價。結果示於表1、2。
又以凝膠過濾層析分析各溶出液，自各溶出區份(Fraction)之蛋白質峰面積值求出抗體含量與抗體收率(Yield)。且，自蛋白質峰分析求出單體(Monomer)與 凝集體(多聚物)等之比率。由純化前後之單體與凝集體比率算出凝集體去除率。結果示於表1、2。
(HCP之評價基準)
4000ppm以下：良
超過4000ppm：不良
(凝集體去除率之評價基準)
80%以上：良
未達80%：不良
試驗例6(壓密線流速之測定)
將各實施例及比較例所得之多孔質擔體V1~V8、W1~W8、X1~X4、Y1~Y4以成為內徑16mm、填充高度100mm之方式填充於管柱容器中，將該管柱連接於GE Healthcare公司製AKTAprime plus。其次，以線流速100cm/hr開始通入純水，將線流速以50cm/hr每分鐘階段性提高，以一定線流速流動之1分鐘期間見到超過0.05MPa之經時壓力增加時之線流速作為壓密流速予以記錄。即使為3000cm/hr未見到此壓力增加時，停止測定，記錄為>3000cm/hr。且，管柱絕對壓力到達1.9MPa時，未見到如上述之經時壓力增加時，亦停止測定，記錄到達1.9MPa時之線流速。接著，針對壓密線流速，藉以下基準予以評價。結果示於表1、2。
(壓密線流速之評價基準)
2000cm/hr以上：良
未達2000cm/hr：不良
表1、2中之各記號意指以下化合物。
(A)DVB：二乙烯基苯、TMP：三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯
(B)EVB：1-乙基-4-乙烯基苯、OCAC：丙烯酸正辛酯、CHMA：甲基丙烯酸環己酯、IBMA：甲基丙烯酸異丁酯
(B’)LauMA：甲基丙烯酸月桂酯
(C)ST：苯乙烯、GMA：甲基丙烯酸縮水甘油酯、HBAGE：丙烯酸4-羥雞丁酯縮水甘油醚、GLM：甘油單甲基丙烯酸酯、VBGE：(4-乙烯基苄基)縮水甘油醚

Claims (17)

  1. 一種親和層析用多孔質擔體，其特徵係包含具有(成分A)源自多乙烯基單體之單體單位、與(成分B)於側鏈具有碳數1~8之烷基之單體單位之聚合物，前述聚合物中之成分A與成分B之含有比例[(A)：(B)]以質量比計為95：5~50：50，成分A之含量對於前述聚合物中之總單體單位為0.5~40質量%。
  2. 如請求項1之多孔質擔體，其中成分A係選自源自芳香族系多官能單體之單體單位及源自多官能(甲基)丙烯酸酯類之單體單位中之1種以上。
  3. 如請求項1之多孔質擔體，其中成分A係選自源自二乙烯基苯之單體單位、源自三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯之單體單位及源自乙二醇二(甲基)丙烯酸酯之單體單位中之1種以上。
  4. 如請求項1之多孔質擔體，其中成分B係源自單乙烯基單體之單體單位。
  5. 如請求項1之多孔質擔體，其中成分B係選自源自具有碳數1~8之烷基之芳香族系單體之單體單位及源自具有碳數1~8之烷基之(甲基)丙烯酸烷酯之單體單位中之1種以上。
  6. 如請求項1之多孔質擔體，其中前述烷基係透過2價連結基鍵結於前述聚合物之主鏈。
  7. 如請求項1之多孔質擔體，其中前述烷基之碳數 為2~8。
  8. 如請求項1之多孔質擔體，其中成分B係源自烷基乙烯基苯之單體單位。
  9. 如請求項1之多孔質擔體，其中前述聚合物進而含有(成分C)源自成分A及成分B除外之單官能單體之單體單位。
  10. 如請求項9之多孔質擔體，其中成分C之含量對於前述聚合物中之總單體單位為20~99.5質量%。
  11. 如請求項9之多孔質擔體，其中成分C係選自源自(甲基)丙烯酸縮水甘油酯之單體單位、源自甘油單(甲基)丙烯酸酯之單體單位、源自(甲基)丙烯酸4-羥基丁酯縮水甘油醚之單體單位、源自(甲基)丙烯酸3,4-環氧基環己基甲酯之單體單位、源自乙烯基苄基縮水甘油醚之單體單位、及源自苯乙烯之單體單位中之1種以上。
  12. 如請求項1之多孔質擔體，其係粒子狀、單塊(monolith)狀、板狀、纖維狀或膜狀。
  13. 一種配體結合多孔質擔體，其係於如請求項1之多孔質擔體上結合親和性配體而成。
  14. 一種標的物之純化方法，其係使用如請求項13之配體結合多孔質擔體。
  15. 一種標的物之純化方法，其包含使如請求項13之配體結合多孔質擔體與前述親和性配體可捕捉之標的物接觸之步驟A，與使可使前述親和性配體與前述標的物解離之解離液與 前述步驟A中已捕捉標的物之擔體接觸而使標的物解離之步驟B。
  16. 如請求項15之純化方法，其中前述步驟B係在使標的物自親和性配體解離之條件下，藉由使用2種以上之離子強度階段性變高之鹽濃度之逐步方式、或鹽濃度梯度變高之梯度方式而解離之步驟。
  17. 一種抗體，其係藉由如請求項14~16中任一項之純化方法純化者。
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